專利名稱：：lgE分子的結(jié)合成員的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及IgE的結(jié)合成員，特別是抗體分子。結(jié)合成員尤其可用于治療IgE介導(dǎo)的疾病，包括過(guò)敏碎和津喘。IgE是免疫球蛋白家族的成員，能介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)如哮喘、食物過(guò)敏、I型超敏反應(yīng)和鼻竇炎。IgE由B細(xì)胞分泌和表達(dá)在其表面上。簡(jiǎn)言之，IgE通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在B細(xì)胞膜中，^爭(zhēng)膜結(jié)構(gòu)域通過(guò)短的膜結(jié)合區(qū)域與成熟IgE分子鏈接。IgE還可通過(guò)其Fc區(qū)，經(jīng)由低親和力IgE受體(FcsRII，也稱CD23)，與B細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和血小板結(jié)合。在暴露于過(guò)^:原時(shí)，能產(chǎn)生過(guò)壽t原特異性IgE的B細(xì)胞被克隆擴(kuò)增。過(guò)敏原特異性IgE然后被B細(xì)胞釋放到循環(huán)中，它在循環(huán)中又通過(guò)FceRII被B細(xì)胞結(jié)合，和通過(guò)高親和力受體(FcsRI)被肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合。這些肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞因此變得對(duì)過(guò)敏原敏感。隨后暴露于過(guò)敏原就會(huì)交聯(lián)肥大細(xì)胞和嗜^喊性粒細(xì)胞上的FcsRI,從而激活這些細(xì)胞釋放出造成臨床超敏反應(yīng)和過(guò)敏性反應(yīng)的組胺和其他因子。能抑制與/^E^/的結(jié)合和通過(guò)R必W發(fā)生的功能活性、并且有或沒(méi)有同時(shí)抑制FcERII的作用的結(jié)合成員，可用于抑制IgE介導(dǎo)的疾病狀況，如過(guò)敏癥和哮喘。通常認(rèn)為，F(xiàn)ceRI和FcsRII結(jié)合IgE恒定(Fc)結(jié)構(gòu)域中的識(shí)別位點(diǎn)。已進(jìn)行了各種鑒定這些識(shí)別位點(diǎn)的研究。例如，對(duì)應(yīng)于IgE分子的特異性部分的肽已被用作IgE-受體結(jié)合的竟?fàn)幮砸种苿?Burt等人,Eur.J.Immun,17:437-440[1987];Helm等人，Nature,331:180-183[1988];Helm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,86:9465-9469[1989〗；6Vercelli等人,Nature,338:649-651[1989];Nio等人，PeptideChemistry:203-208[1990]),或者用來(lái)引發(fā)可阻斷IgE-受體相互作用的抗IgE抗體(Burt等人，Molec.Immun.24:379-389[1987];Robertson等人，Molec.Immun.,25:103-113[1988];Baniyash等人，Molec.Immun.25:705-711[1988])。最近，Xolair⑧(奧馬佐單抗)已生產(chǎn)并上市，用來(lái)治療哮喘患者。Xolair⑧是人源化IgGlk單克隆抗體，它能選擇性結(jié)合人IgE,從而降低IgE與至少肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面上的FceRI的結(jié)合。通過(guò)降低帶有FcsRI的細(xì)胞上的表面結(jié)合IgE，Xolair⑧能一定程度地降低變態(tài)反應(yīng)介導(dǎo)物的釋放程度。Xolair⑧在國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO93/04173和WO97/04807中公開(kāi)。但是，還需要其他的IgE結(jié)合成員，例如那些親和力和/或效價(jià)(potency)比Xolair⑧高的結(jié)合成員，來(lái)推進(jìn)這個(gè)有前途的治療策略。發(fā)明簡(jiǎn)述通過(guò)采用適當(dāng)設(shè)計(jì)的選擇技術(shù)和測(cè)定法，我們開(kāi)發(fā)了能抑制與Fc五^/(肥大細(xì)胞上存在的高親和力IgE受體)的結(jié)合和通過(guò)Fc五^/發(fā)生的功能活性、并且有或沒(méi)有同時(shí)抑制FcERII的作用的結(jié)合成員。本發(fā)明的結(jié)合成員能抑制與/^Ei/的結(jié)合和通過(guò)Fc5^/發(fā)生的功能活性、并且有或沒(méi)有同時(shí)抑制FcERII的作用。對(duì)結(jié)合的抑制可以是通過(guò)直接抑制進(jìn)行，例如通過(guò)中和IgE進(jìn)行。由例如RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定法測(cè)出，本發(fā)明的結(jié)合成員通常以小于約10nM的IC50中和人IgE。在某些實(shí)施方案中，由RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定法測(cè)出，本發(fā)明的結(jié)合成員以小于約lnM、或者小于約0.5nM、或者小于約0.2nM的IC50中和人IgE。本發(fā)明的結(jié)合成員還可結(jié)合和中和非人IgE,即在人類以外的物種中天然存在的IgE直向同源物(ortholog)。本發(fā)明的結(jié)合成員對(duì)IgE的特異性通常高于對(duì)其他免疫球蛋白的特異性，因此能選擇性結(jié)合IgE。這種選擇性可例如在標(biāo)準(zhǔn)的竟?fàn)帨y(cè)定中測(cè)出或顯示出。結(jié)合成員可用于治療和/或預(yù)防IgE介導(dǎo)的疾病，特別是過(guò)敏癥和哮喘。和用于抑制過(guò)敏原引起的肥大細(xì)胞脫粒。結(jié)合成員進(jìn)一步可在體內(nèi)或體外用于抑制與尸C五W結(jié)合的IgE所介導(dǎo)的生物反應(yīng)，并且有或沒(méi)有同時(shí)抑制與FcERII結(jié)合的IgE所介導(dǎo)的生物反應(yīng)的作用。本發(fā)明的結(jié)合成員還具有診斷用途，如用于檢測(cè)目的樣品如哞喘或過(guò)敏癥患者樣品中IgE的存在與否或數(shù)量，或者過(guò)敏原特異性IgE的存在與否或數(shù)量?？捎萌魏魏线m的方法測(cè)定被結(jié)合成員結(jié)合的殘基的序列。例如，可使用肽結(jié)合掃描法，如本文別處詳細(xì)描述的基于PEPSCAN的酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)。在肽結(jié)合掃描如PEPSCANSystems所提供的那種肽結(jié)合掃描中，對(duì)衍自抗原的短重疊肽進(jìn)行系統(tǒng)篩選，確定是否能與結(jié)合成員結(jié)合?？蓪㈦墓矁r(jià)偶聯(lián)到載體表面以形成肽陣列。肽可以處于線性構(gòu)象或約束構(gòu)象(constrainedconformation)。約束構(gòu)象可用在肽序列的每一端具有末端Cys殘基的肽產(chǎn)生?？蓪ys殘基直接或間接地共價(jià)偶聯(lián)到載體表面，使得肽保持處于成環(huán)構(gòu)象(loopedconformation)。因此，該方法中使用的肽可在對(duì)應(yīng)于抗原的片斷的肽序列的每一端加上Cys殘基。還可使用雙環(huán)肽，其中另外有一個(gè)Cys殘基位于肽序列中部或中部附近?？蓪ys殘基直接或間接地共價(jià)偶聯(lián)到載體表面，使得肽形成雙環(huán)構(gòu)象，中央Cys殘基的每一側(cè)各有一個(gè)環(huán)。肽可以合成產(chǎn)生，因此可將Cys殘基工程設(shè)計(jì)在期望的位置，盡管這在IgE序列中不天然出現(xiàn)。任選地，可在肽結(jié)合測(cè)定中同時(shí)篩選線性肽和約束肽。肽結(jié)合掃描可涉及到鑒定(例如使用ELISA)結(jié)合成員所結(jié)合的一組肽，其中這些肽具有對(duì)應(yīng)于IgE的各片斷的氨基酸序歹'K例如IgE的約5、10或15個(gè)連續(xù)殘基的肽)，和將各肽進(jìn)行比對(duì)以確定被結(jié)合成員結(jié)合的殘基的足跡(footprint),其中該足跡包含各重疊肽共有的殘基。抑或或者另外，肽結(jié)合掃描方法可涉及鑒定結(jié)合成員以至少給定信噪比所結(jié)合的肽。用于測(cè)定結(jié)合情況的合適的肽結(jié)合掃描方法的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域知道的。其他本領(lǐng)域公知和可用來(lái)測(cè)定被抗體結(jié)合的殘基和/或確認(rèn)肽結(jié)合掃描結(jié)果的方法，包括定點(diǎn)誘變、氳氖交換、質(zhì)譜、NMR和X射線結(jié)晶學(xué)。本發(fā)明的結(jié)合成員可以或可不結(jié)合和/或中和IgE變體。因此，或沒(méi)有同時(shí)抑制FcERII的作用?？刹捎肐gE的線性表位序列，例如是包含它們的分離肽片斷或多肽，來(lái)鑒定、產(chǎn)生、分離和/或試驗(yàn)本發(fā)明的結(jié)合成員。如下文更詳細(xì)地描述，已證實(shí)本發(fā)明的結(jié)合成員能以高效價(jià)中和IgE。中和是指IgE的生物活性的抑制。本發(fā)明的結(jié)合成員可中和IgE的一種或多種生物活性，但通常抑制IgE與Fc五^/的結(jié)合，且有或沒(méi)有同時(shí)抑制與FcERII的結(jié)合的作用。對(duì)IgE與FcERI的結(jié)合的中和作用并且有或沒(méi)有對(duì)FcERII的同時(shí)抑制作用，可任選作為受體的生物活性如過(guò)敏原引起的肥大細(xì)胞脫粒的函數(shù)進(jìn)行測(cè)量。用于測(cè)量本發(fā)明結(jié)合成員對(duì)IgE的中和作用的合適測(cè)定法，包括例如配體受體生化測(cè)定法和表面等離振子共振(SPR)(例如BIACORE)。生物活性的抑制可以是部分抑制或全部抑制。對(duì)于IgE生物活性如受體結(jié)合或肥大細(xì)胞脫粒，相比于結(jié)合成員不存在下的該活性，結(jié)合成員可抑制該活性達(dá)100%，或者達(dá)至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。結(jié)合成員的中和效價(jià)通常用ICso值(單位nM)表示，除非另有規(guī)9定。在功能測(cè)定中，ICso是能使生物反應(yīng)減少達(dá)其最大值的50°/。的結(jié)合成員濃度。在配體結(jié)合研究中，ICso是能使受體結(jié)合減少達(dá)其最大特異性結(jié)合水平的50%的濃度。ICso可如下計(jì)算將°/。最大生物反應(yīng)作為結(jié)合成員濃度對(duì)數(shù)的函數(shù)進(jìn)行作圖，使用諸如Prism(GraphPad)的軟件程序?qū)igmoidal函數(shù)與數(shù)據(jù)擬合，以得到ICso值。效價(jià)可用技術(shù)人員知道的和/或本文描述或提到的一種或多種測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定或測(cè)量。結(jié)合成員的中和效價(jià)可用幾何平均值(geomean，也稱geometricmean)表示。本文所用的幾何平均值是指數(shù)據(jù)集的對(duì)數(shù)值的平均值，換算回底數(shù)10數(shù)字。這要求有至少兩個(gè)測(cè)量值，例如至少2次、優(yōu)選至少5次、更優(yōu)選至少10次重復(fù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，重復(fù)次數(shù)越多，幾何平均值值將越可靠。重復(fù)次數(shù)的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員決定。在本文描述的測(cè)定中結(jié)合成員對(duì)IgE活性的中和作用，表示結(jié)合成員能結(jié)合和中和IgE。其他可用來(lái)測(cè)定結(jié)合成員與IgE的結(jié)合的方法，包括ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀法、親和層析法和生化測(cè)定法。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，該結(jié)合成員結(jié)合血清中免疫球蛋白E的IC50比Xolair低至少10倍，或者低至少20倍、低至少50倍、低至少75倍、低至少100倍、低至少125倍、低至少150倍、低至少200倍、低至少300倍、低至少400倍或者低至少500倍?？蓪⑹褂脕?lái)自第一物種(例如人類)的IgE在某測(cè)定中計(jì)算出的結(jié)合成員中和效價(jià)，與使用來(lái)自第二物種(例如食蟹猴)的IgE在相似測(cè)定中在相似條件下得出的結(jié)合成員中和效價(jià)進(jìn)行比較，以評(píng)估結(jié)合成員對(duì)兩種物種的IgE的交叉反應(yīng)性程度?；蛘撸绫疚膭e處更詳細(xì)描述的，可在竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定中評(píng)估交叉反應(yīng)性。本發(fā)明的結(jié)合成員在人IgE結(jié)合或生物測(cè)定中的中和效價(jià)，可大于在使用來(lái)自人類以外的物種的IgE進(jìn)行的相似測(cè)定中的中和效價(jià)。因此，結(jié)合成員在某測(cè)定中與人IgE的中和效價(jià)，可大于在相似測(cè)定中與人類以外的物種的IgE的中和效價(jià)。在人IgE結(jié)合或生物測(cè)定中的效價(jià)，可例如比采用食蟹猴IgE的相似測(cè)定中的效價(jià)高約5倍，或者在另一個(gè)實(shí)施方案中，可高約15或20倍。更具體的說(shuō)，對(duì)于25ng/ml的人IgE的濃度，可測(cè)定在人RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定中的效價(jià)，并與用100ng/ml食蟹猴IgE在其他方面相似的條件下所得的效價(jià)進(jìn)行比較。表2b顯示了用人IgE和食蟹猴IgE在相似的RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例。本發(fā)明的結(jié)合成員對(duì)人IgE的親和力可比對(duì)其他物種IgE的親和力強(qiáng)。結(jié)合成員對(duì)人IgE的親和力可例如比對(duì)食蟹猴IgE的親和力強(qiáng)約5或10倍，或者在另一個(gè)實(shí)施方案中，可強(qiáng)約100倍。表2a和b顯示了人和食蟹猴IgE所獲得的數(shù)據(jù)的實(shí)例。本發(fā)明的結(jié)合成員在例如RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定中，在25ng/ml的人IgE濃度下，可具有約10nM或以下的IgE中和效價(jià)或IC5o?；蛘撸琁C5o小于約3nM。在其他實(shí)施方案中，IC5o小于約1nM,或者小于約0.5nM,或者小于約0.2nM。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，該結(jié)合成員對(duì)RBL-ER51細(xì)胞中25ng/mlIgE所誘導(dǎo)的鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制的IC50幾何平均值小于lnM，或者小于0.6nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM或小于O.lnM。人IgE的IgE結(jié)合成員的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力(以平衡解離常數(shù)KD表示)，可利用表面等離振子共振(BIACORE)進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明的結(jié)合成員對(duì)人IgE的親和力(KD)通常小于約10nM,在一些實(shí)施方案中KD小于約5nM,在其他實(shí)施方案中KD小于2nM。對(duì)食蟹猴IgE的親和力通常小于約20nM,在一些實(shí)施方案中KD小于約10nM。有多種方法可供用來(lái)測(cè)量抗體與其抗原的結(jié)合親和力，其中一種方法是KinExA。動(dòng)力學(xué)排除測(cè)定(KineticExclusionAssay,KinExA)是一種通用的免疫測(cè)定平臺(tái)(基本上是流式分光熒光計(jì))，它能夠測(cè)量抗原/抗體相互作用的平衡解離常數(shù)及締合和解離速率常數(shù)。由于KinExA是在達(dá)到平衡后進(jìn)行的，它是用來(lái)測(cè)量多價(jià)抗原/mAb相互作用的KD的有利技術(shù)?？贵w與IgE分子的結(jié)合是與多價(jià)抗原的結(jié)合的一個(gè)實(shí)例。當(dāng)多價(jià)抗原意味著形成包含超過(guò)一個(gè)抗體和超過(guò)一個(gè)抗原的抗體和抗原多聚體時(shí)，使用KinExA特別適宜。在這種復(fù)雜相互作用模型中，準(zhǔn)確估計(jì)Ko可能很困難。KinExA方法可按Drake等人，(2004)AnalyticalBiochemistry328,35-43中所述進(jìn)行。由KinExA方法測(cè)出，抗體11的K。為6.3pM,比Xolair丁M的353pM的K。低得多。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其Kd用KinExA方法測(cè)出為300pM或更低?；蛘?，KD為200pM或以下、100pM或以下、50pM或以下、20pM或以下或者10pM或以下。體內(nèi)的內(nèi)源IgE可被糖基化，因此糖基化人IgE是人類治療的治療耙標(biāo)。雖然重組人IgE——其可能由細(xì)菌所衍生和沒(méi)有糖基化——可用于本文描述的測(cè)定中，但本發(fā)明的結(jié)合成員可結(jié)合糖基化人IgE,例如由骨髓瘤細(xì)胞系如U266.B1產(chǎn)生的IgE。這代表著本發(fā)明結(jié)合成員的顯著優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)閷?duì)于人體內(nèi)應(yīng)用而言糖基化人IgE是靶標(biāo)抗原。本發(fā)明的結(jié)合成員可包含抗體分子，優(yōu)選人抗體分子或人源化抗體分子。在本發(fā)明的一個(gè)方面，抗體分子是單克隆抗體?？乖Y(jié)合位點(diǎn)通常由可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域形成，其中抗原結(jié)合界面由六個(gè)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的表面多肽環(huán)形成。每個(gè)VH和每個(gè)VL都有三個(gè)CDR,分別為HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3,還有構(gòu)架區(qū)(FR)。本發(fā)明的結(jié)合成員通常包含抗體VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域包含一組HCDR,VL結(jié)構(gòu)域包含一組LCDR。抗體分子可包含抗體VH結(jié)構(gòu)域和構(gòu)架，其中VH結(jié)構(gòu)域包含VHCDR1、CDR2和CDR3。抑或或者另外，它可包^^抗體VL結(jié)構(gòu)域和構(gòu)架，其中VL結(jié)構(gòu)域包含VLCDRl、CDR2和CDR3。本發(fā)明的抗體VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192、202、212、222、232、242、252、262、272、282、288、300和306)和抗體VL結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378和380)以及CDR(SEQIDNO:3-5、8-10、13-15、18-20、23-25、28-30、33-35、38-40、43-45、48-50、53-55、58-60、63-65、68-70、73-75、78-80、83-85、88-90、93-95、98-100、103-105、108-110、113-115、118-120、123-125、128-130、133-135、138-140、143-145、148-150、153-155、158-160、163-165、168-170、173-175、178-180、183-185、188-190、193-195、198-200、203-205、208-210、213-215、218-220、223-225、228-230、233-235、238-240、243-245、248-250、253-255、258-260、263-265、268-270、273-275、278-280、283-285、296-298、289-291、296-298、301-303、307-309和314-316)的實(shí)例，在構(gòu)成本公開(kāi)內(nèi)容的一部分的所附序列表中列出(另見(jiàn)表3a)。更多的CDR在下文和表1中公開(kāi)。所有本文公開(kāi)的VH和VL序列、CDR序列、各組CDR和各組HCDR和各組LCDR，代表了本發(fā)明的各個(gè)方面和各個(gè)實(shí)施方案。如本文所述，"一組CDR，，包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，一組HCDR是指HCDR1、HCDR2和HCDR3，一組LCDR是指LCDR1、LCDR2和LCDR3。除另有規(guī)定外，"一組CDR，，包括HCDR和LCDR?；蛘?，本發(fā)明的結(jié)合成員可包含非抗體分子當(dāng)中的抗原結(jié)合位點(diǎn)，通常由非抗體蛋白質(zhì)支架(scaffold)中的一個(gè)或多個(gè)CDR例如一組CDR提供，這在下文進(jìn)一步討論。13如本文所述，分離了具有表l所示的那組CDR序列的親本抗體分子(見(jiàn)抗體l)。通過(guò)優(yōu)化方法，我們產(chǎn)生了編號(hào)2-28的一批抗體克隆，其中CDR序列衍自親本CDR序列，且在表l指出的位置處具有修飾。因此例如可從表1看出，抗體2具有親本HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，和具有這樣的親本HCDR3序列其中Kabat殘基96被S置換，Kabat殘基97被L置換，Kabat殘基99被S置換，和Kabat殘基100被A置換。本文描述了包含表1所示的那組親本CDR的結(jié)合成員(抗體1),其中HCDR1是SEQIDNO:3(Kabat殘基31-35),HCDR2是SEQIDNO:4(Kabat殘基50-65),HCDR3是SEQIDNO:5(Kabat殘基95-102),LCDR1是SEQIDNO:8(Kabat殘基24-34)，LCDR2是SEQIDNO:9(Kabat殘基50-56)和LCDR3是SEQIDNO:10(Kabat殘基89-97)。本發(fā)明的結(jié)合成員還可以是表l所示的親本結(jié)合成員，其中一個(gè)或多個(gè)CDR具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、置換、缺失和/或插入。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合成員包含相對(duì)于抗體ll的親本序列而言具有1-10個(gè)添加、置換、缺失和/或插入的一組CDR。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于抗體11而言具有l(wèi)-10個(gè)置換。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于抗體1的親本序列而言具有1-11個(gè)添加、置換、缺失和/或插入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于抗體1而言具有l(wèi)-10個(gè)置換。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合成員包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3;其中HCDR3具有SEQIDNO:5的氨基酸序列，該序列任選具有1-5個(gè)氨基酸添加、置換、缺失和/或插入；LCDR3具有SEQIDNO:10的氨基酸序列，該序列任選具有l(wèi)-6個(gè)氨基酸添加、置換、缺失和/或插入。在這些實(shí)施方案中，HCDR1可具有SEQIDNO:3的氨基酸序列；HCDR2可具有SEQIDNO:4的氨基酸序列；LCDR1可具有SEQIDNO:8的氨基酸序列；和LCDR2可具有SEQIDNO:9的氨基酸序列。或者，、HCDR2、LCDR1和LCDR2相對(duì)于親本序列(抗體l)而言還可共同具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、置換、缺失和/或插入，如1-10個(gè)置換。本發(fā)明的結(jié)合成員可包含本文所述的一個(gè)CDR或CDR的組合。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員可包含具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的HCDR1;具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的HCDR2;具有選自SEQIDNO:5、15、25、65、75、85、95、145、155、175和255的氨基酸序列的HCDR3;具有SEQIDNO:8的氨基酸序列的LCDR1;具有SEQIDNO:9的氨基S吏序列的LCDR2;具有選自SEQIDNO:10、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、l卯、200、210、220、230、240、250、260、270和280的氨基酸序列的LCDR3。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域包含具有一個(gè)或多個(gè)以下置換的親本HCDR3(SEQIDNO:5):Kabat殘基96被S、M或T置換；Kabat殘基97被L或G置換；Kabat殘基98被K置換；Kabat殘基99被S、W、A、T或E置換；Kabat殘基100被A或I置換。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合成員或其VL結(jié)構(gòu)域可包含其中Kabat殘基94被T、R、D、P、E、N、H、Q或A置換的親本LCDR3(SEQIDNO10)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域包含具有一個(gè)或多個(gè)以下置換的親本LCDR3(SEQIDNO:10):Kabat殘基94被T、R、D、P、E、N、H、Q或A置換；Kabat殘基95被T、K、S、I、G、H、M、F、R、N、K或Q置換；Kabat殘基95A被L、H、D、G、R、N、Q、K或E置換；Kabat殘基95B被T、H、S、Y、L或N置換；Kabat殘基96一皮G或A置換；Kabat殘基97被P、S或G置換。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是這樣的結(jié)合成員，其中HCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:103,HCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:104，HCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:105,LCDR1具有氨基酸序列SEQIDNO:108，LCDR2具有氨基酸序列SEQIDNO:109,和LCDR3具有氨基酸序列SEQIDNO:110。例如參見(jiàn)表1的抗體11。本發(fā)明的還其他的實(shí)施方案，是能夠與本發(fā)明的抗體如表1的抗體11竟?fàn)幣c人IgE的結(jié)合的結(jié)合成員如抗體分子，所述結(jié)合成員在本文描述的測(cè)定中以小于約1riM的IC50中和人IgE,或者以小于約0.5nM的IC50中和人IgE。在一些實(shí)施方案中，IC50小于約0.2nM。本發(fā)明提供包含抗體1-28中任一個(gè)抗體的HCDR1和/或HCDR2和/或HCDR3和/或抗體1-28中任一個(gè)抗體的LCDR1和/或LCDR2和/或LCDR3,例如表1所示抗體1-28中任一個(gè)抗體的一組CDR的結(jié)合成員。結(jié)合成員可包含這些抗體中的一個(gè)抗體的一組VHCDR。任選地，它還可包含這些抗體中的一個(gè)抗體的一組VLCDR，所述VLCDR可來(lái)自與VHCDR相同或不同的抗體。本發(fā)明還提供包含抗體1-28中任一個(gè)抗體的一組HCDR的VH結(jié)構(gòu)域，和/或包含抗體1-28中任一個(gè)抗體的一組LCDR的VL結(jié)構(gòu)域。通常，將VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)以提供抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，不過(guò)如下文所進(jìn)一步討論，也可單獨(dú)使用VH或VL結(jié)構(gòu)域來(lái)結(jié)合抗原?？蓪⒖贵w1VH結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)表l)與抗體1VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)，使得形成包含抗體1VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于本文公開(kāi)的其他VH和VL結(jié)構(gòu)域，提供了類似的實(shí)施方案。在其他實(shí)施方案中，將抗體1VH與抗體1VL以外的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)。輕鏈雜交(promiscuity)在本領(lǐng)域中已確立。同樣，對(duì)于本文公開(kāi)的其他VH和VL結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明提供了類似的實(shí)施方案。因此，可將親本或抗體2-28中任一個(gè)抗體的VH與親本或抗體2-28中任一個(gè)抗體的VL閨己對(duì)。結(jié)合成員可包含親本抗體或抗體2-28中任一個(gè)抗體的一組H和/或LCDR,其中在所公開(kāi)的該組H和/或LCDR當(dāng)中具有多達(dá)20、16、10、9個(gè)或更少個(gè)例如1、2、3、4或5個(gè)氨基酸添加、置換、缺失和/或插入?；蛘撸Y(jié)合成員可包含親本抗體或抗體2-28中任一個(gè)抗體的一組H和/或LCDR，其中在所7>開(kāi)的該組H和/或LCDR當(dāng)中具有多達(dá)20、16、10、9個(gè)或更少個(gè)例如1、2、3、4或5個(gè)氨基酸置換。這種ff飾可潛在地在該組CDR當(dāng)中的任何殘基處作出。例如，如表l所示，可在抗體2-28中的任一個(gè)抗體中被修飾的位置處作出修飾。因此，所述一個(gè)或多個(gè)修飾可包含在以下殘基處的一個(gè)或多個(gè)置換HCDR中的Kabat殘基96、97、98、99和100;和LCDR中的Kabat殘基94、95、95A、95B、96和97。結(jié)合成員可包含在抗體構(gòu)架當(dāng)中具有一個(gè)或多個(gè)CDR例如一組CDR的抗體分子。例如，可將抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR或者一組CDR移植到構(gòu)架(例如人構(gòu)架)中，以提供抗體分子。構(gòu)架區(qū)可以源于人種系基因序列，或者是非種系化的(non-germlined)。因此，構(gòu)架可以是種系化的(germlined)，其中構(gòu)架當(dāng)中的一個(gè)或多個(gè)殘基被改變，以匹配大多數(shù)相似的人種系構(gòu)架中的對(duì)等位置處的殘基。因此，本發(fā)明的結(jié)合成員可以是具有包含人種系構(gòu)架例如人種系IgGVH構(gòu)架中的一組HCDR的VH結(jié)構(gòu)域的分離人抗體分子。結(jié)合成員還具有包含例如人種系IgGVL構(gòu)架中的一組LCDR的VL結(jié)構(gòu)域。VH和/或VL構(gòu)架殘基可如本文所討^侖和例示進(jìn)行修飾，例如用定點(diǎn)誘變進(jìn)行修飾。本發(fā)明的VH或VL結(jié)構(gòu)域，或者包含這種VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員，優(yōu)選具有表3的抗體的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域序列。非種系化的抗體分子與種系化的抗體分子相比，具有相同的CDR，但具有不同的構(gòu)架。種系化的抗體可通過(guò)對(duì)本文所示的這些抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域序列的構(gòu)架區(qū)進(jìn)行種系化來(lái)產(chǎn)生。本發(fā)明的結(jié)合成員，可以是與任何既能結(jié)合IgE又包含結(jié)合成員如本文7>開(kāi)的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、CDR例如HCDR3和/或一組CDR的結(jié)合成員竟?fàn)幣cIgE的結(jié)合的結(jié)合成員。結(jié)合成員之間的竟?fàn)幙扇菀椎卦隗w外測(cè)定，例如用ELISA和/或通過(guò)將特異性報(bào)道分子標(biāo)記(tagging)到一個(gè)結(jié)合成員來(lái)測(cè)定，所述一個(gè)結(jié)合成員能在一個(gè)或多個(gè)其他未標(biāo)記的(untagged)結(jié)合成員的存在下被纟企測(cè)，以使得可以鑒定能結(jié)合相同表位或重疊表位的各個(gè)結(jié)合成員。這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易知道的，在本文中有更詳細(xì)的描述。因此，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供包含這樣的人抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合成員，該人抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)能與抗體分子例如特別是包含親本抗體或抗體1-28中任一個(gè)抗體的VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、CDR如HCDR3或者一組CDR的抗體分子竟?fàn)幣c人IgE的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合成員與表l的抗體11竟?fàn)?。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供能結(jié)合IgE的特定區(qū)域的結(jié)合成員。結(jié)合情況可例如通過(guò)檢測(cè)或者觀察結(jié)合成員與IgE的殘基之間的特異性相互作用來(lái)測(cè)定，所述相互作用例如在可例如用X射線晶體學(xué)方法測(cè)定的結(jié)合成員:IgE復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中。用X射線晶體學(xué)方法測(cè)定的與人IgECs3-Cs4結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體11的結(jié)構(gòu)，給研究晶體當(dāng)中抗體11Fab與IgE的兩個(gè)相互作用提供了機(jī)會(huì)。IgE是二價(jià)抗原，因?yàn)榇嬖谥鴥蓷l輕鏈和兩條重鏈。X射線晶體學(xué)研究證實(shí)，與表位結(jié)合的Fab跨越兩條IgE重鏈。第一個(gè)相互作用表明，抗體11的相互作用位點(diǎn)包含一條IgE重鏈的殘基Glu390至Asn394包括端點(diǎn)在內(nèi)和糖部分(sugarmoiety)GlcNAcl和Man6，和另一條IgE重鏈的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Glu472和糖部分Man5。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員能結(jié)合免疫球蛋白E中的包含以下殘基的表位第一IgE重鏈中的殘基Glu390至Asn394包括端點(diǎn)在內(nèi)，和第二IgE重鏈中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Glu472;18在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位進(jìn)一步包含第一IgE重鏈的糖部分GlcNAcl和Man6和第二IgE重鏈的糖部分Man5。第二個(gè)相互作用表明，抗體11的相互作用位點(diǎn)包含第一IgE重鏈的殘基Glu390、Gln392至Asn394包括端點(diǎn)在內(nèi)和糖部分GlcNAcl和Man6,和第二IgE重鏈的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Glu472。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其中所迷結(jié)合成員能結(jié)合免疫球蛋白E中的包含以下殘基的表位第一IgE重鏈中的殘基Glu390、Gln392至Asn394包括端點(diǎn)在內(nèi)，和第二IgE重鏈中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Glu472;在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位進(jìn)一步包含第一IgE重鏈中的糖部分GlcNAcl和Man6。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員能結(jié)合免疫球蛋白E中的包含以下殘基的表位第一IgE重鏈中的殘基Glu390、Gln392至Asn393包括端點(diǎn)在內(nèi)，和第二IgE重鏈中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Gu472;在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位進(jìn)一步包含第一IgE重鏈中的糖部分GlcNAcl和Man6。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，所述結(jié)合成員能結(jié)合包含來(lái)自第一IgE重鏈的元件和來(lái)自第二IgE重鏈的元件的表位。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供包含與抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)竟?fàn)幣c人IgE的結(jié)合的人抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合成員，其中所述抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成，且其中所述VH和VL結(jié)構(gòu)i或包含本文所公開(kāi)的親本抗體(抗體l)或者抗體2-28中任一個(gè)抗體的一組CDR。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明的結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的序列的分離核酸。例如，SEQIDNO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191、201、211、221、231、241、251、261、271、281、287、299和305編碼本發(fā)明的示例性VH結(jié)構(gòu)域，SEQIDNO:317,319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377和379編碼本發(fā)明的示例性VL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還包括制備本發(fā)明的結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括在能導(dǎo)致產(chǎn)生所述結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的條件下表達(dá)所述核酸，和通過(guò)分離或純化該結(jié)合成員進(jìn)行回收。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供編碼本文所公開(kāi)的VHCDR或VLCDR序列的核酸，通常是分離核酸。又一個(gè)方面提供含有或轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的進(jìn)一步的方面提供含有本發(fā)明的結(jié)合成員的組合物，和它們?cè)谝种坪?或中和IgE的方法中的用途，所述方法包括通過(guò)療法治療人或動(dòng)物身體的方法。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員可用于人或動(dòng)物身體中(例如人患者中)或者體外的生物反應(yīng)、疾病、病患或病癥的治療和/或預(yù)防的方法中，或者用于所述生物反應(yīng)、疾病、病患或病癥的診斷方法中。治療和/或預(yù)防的方法可包括將本發(fā)明的結(jié)合成員以足以可測(cè)量地中和IgE的量給予所述患者?？砂幢景l(fā)明進(jìn)行治療的病癥包括任何其中IgE起作用的病癥，如過(guò)敏癥和哮喘。本發(fā)明的這些和其他的方面在下文中作更詳細(xì)的描述。在這里要順便指出的是，本文所使用的"和/或"要認(rèn)為是明確公開(kāi)兩個(gè)指定的特征(feature)或成分(component)中的每一個(gè)加上或不加上另一個(gè)。例如"A和/或B，，要認(rèn)為是明確公開(kāi)(i)A、(ii)B及(iii)A和B中的每一個(gè)，猶如每一個(gè)都在本文中單獨(dú)提出。IgE是免疫球蛋白E。人IgE恒定區(qū)的氨基酸序列是可公開(kāi)獲得的。在一些實(shí)施方案中，IgE可以是人或食蟹猴IgE。如本文別處所述，IgE可以是重組的，和/或可以是糖基化的或非糖基化的。IgE在體內(nèi)天然以糖基化形式表達(dá)，例如在U266.B1細(xì)胞中。糖基化IgE還可在重組系統(tǒng)中表達(dá)。結(jié)合成員通常指能互相結(jié)合的一對(duì)分子中的一個(gè)成員。結(jié)合對(duì)的各成員可以是天然衍生的，或者完全或部分合成產(chǎn)生的。該對(duì)分子的一個(gè)成員在其表面上具有能結(jié)合從而互補(bǔ)于該對(duì)分子的另一個(gè)成員的特定空間和極性構(gòu)造(spatialandpolarorganization)的區(qū)域，或者說(shuō)空穴(cavity)。結(jié)合對(duì)的類型的實(shí)例有抗原-抗體、生物素-親和素、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本發(fā)明主要涉及抗原-抗體類型的反應(yīng)。結(jié)合成員通常包含具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。例如，結(jié)合成員可以是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子或非抗體蛋白質(zhì)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可通過(guò)將CDR安排在非抗體蛋白質(zhì)支架如纖連蛋白或細(xì)胞色素B等之上來(lái)提供[參考文獻(xiàn)1，2,3]，或者通過(guò)將蛋白質(zhì)支架當(dāng)中的環(huán)的氨基酸殘基隨機(jī)化或突變以賦予對(duì)期望靶標(biāo)的結(jié)合特異性來(lái)提供。Nygren等人[參考文獻(xiàn)3]已詳細(xì)綜述了用于將新的結(jié)合位點(diǎn)工程摻入(engineer)到蛋白質(zhì)中的支架。用于抗體模擬物的蛋白質(zhì)支架在WO/0034784中7>開(kāi)(該專利通過(guò)引用全文并入本文)，在該專利中發(fā)明人描述了包括具有至少一個(gè)隨機(jī)化環(huán)的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(抗體模擬物)。其中移植一個(gè)或多個(gè)CDR例如一組HCDR的合適支架，可由免疫球蛋白基因超家族的任何結(jié)構(gòu)域成員提供。支架可以是人或非人蛋白質(zhì)。非抗體蛋白質(zhì)支架的優(yōu)點(diǎn)是，它可在比至少一些抗體分子更小和/或更容易制造的支架分子中提供抗原結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合成員的小尺寸可賦予有用的生理特性，如能夠進(jìn)入細(xì)胞、深入滲透到組織中或到達(dá)其他結(jié)構(gòu)當(dāng)中的靶標(biāo)，或者在靶標(biāo)抗原的蛋白質(zhì)空穴當(dāng)中結(jié)合。Wess,2004[參考文獻(xiàn)4]綜述了抗原結(jié)合位點(diǎn)在非抗體蛋白質(zhì)支架中的應(yīng)用。典型的是具有穩(wěn)定骨架和一個(gè)或多個(gè)可變環(huán)的蛋白質(zhì)，其中該(一個(gè)或多個(gè))環(huán)的氨基酸序列專門地或隨機(jī)地進(jìn)行突變，以產(chǎn)生能結(jié)合靶標(biāo)抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這種蛋白質(zhì)包括金黃色葡萄球菌(S.aureus)A蛋白的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)鐵蛋白、四連蛋白、纖連蛋白(例如第IO個(gè)纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域)、脂籠蛋白以及Y-晶體蛋白和其他AffilinTM支架(ScilProteins)。其他方法的實(shí)例包括基于環(huán)肽(cyclotide)(具有分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白質(zhì))的合成"微體"、微蛋白質(zhì)(Versabodies,Amunix)和錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins,MolecularPartners)。這些蛋白質(zhì)還包括小的工程改造的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，例如免疫結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)例如美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2003082630和2003157561)。免疫結(jié)構(gòu)域含有抗體的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。除了抗體序列和/或抗原結(jié)合位點(diǎn)外，本發(fā)明的結(jié)合成員還可包含其他的氨基酸，例如形成肽或多肽如折疊結(jié)構(gòu)域的氨基酸，或者賦予該分子除結(jié)合抗原的能力之外的另一功能特性的氨基酸。本發(fā)明的結(jié)合成員可帶有可檢測(cè)標(biāo)記，或者可與毒素或靶向作用部分(targetingmoiety)或酶(例如通過(guò)肽鍵或接頭)綴合。例如，結(jié)合成員可包含催化位點(diǎn)(例如在酶結(jié)構(gòu)域中)以及抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中抗原結(jié)合位點(diǎn)能結(jié)合抗原從而將催化位點(diǎn)耙向抗原。催化位點(diǎn)可例如通過(guò)切割作用抑制抗原的生物功能。雖然如所述，CDR可由非抗體支架攜帶，但攜帶本發(fā)明CDR或一組CDR的結(jié)構(gòu)通常會(huì)是抗體重鏈或輕鏈序列或它們的實(shí)質(zhì)部分(substantialportion),其中該CDR或該組CDR位于與由重排免疫球CDR對(duì)應(yīng)的位置處。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置可參考Kabat等人，1987[參考文獻(xiàn)5](以及可用任何互聯(lián)網(wǎng)搜索引擎以"Kabat"找到的更新內(nèi)容)進(jìn)行測(cè)定。所謂CDR區(qū)域或CDR是指由Kabat等人，1991[參考文獻(xiàn)6]和之后的各版本所定義的免疫球蛋白重鏈和輕鏈超可變區(qū)?？贵w通常含有3個(gè)重鏈CDR和3個(gè)輕鏈CDR。本文中使用術(shù)語(yǔ)CDR,目的是視情況而定表示這些區(qū)域中的一個(gè)或者這些區(qū)域中的幾個(gè)乃至全部，所述這些區(qū)域含有負(fù)責(zé)結(jié)合的氨基酸殘基的大部分，所述結(jié)合是通過(guò)抗體對(duì)其識(shí)別的抗原或表位的親和力進(jìn)行。在六個(gè)短的CDR序列當(dāng)中，重鏈的第三個(gè)CDR(HCDR3)具有較大的尺寸可變性(較大的多樣性，基本上由產(chǎn)生它的基因的重排機(jī)制所致)。它可短至2個(gè)氨基酸，不過(guò)已知的最長(zhǎng)尺寸為26個(gè)氨基酸。CDR長(zhǎng)度還可根據(jù)可由特定的基礎(chǔ)構(gòu)架(underlyingframework)容納的長(zhǎng)度而變。在功能上，HCDR3在決定抗體的特異性方面起到部分作用[見(jiàn)參考文獻(xiàn)7，8,9，10,11,12,13,14]。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供包含選自表3a的HCDR3序列的分離結(jié)合成員。抗體分子指免疫球蛋白，不管是天然的還是部分或全部合成產(chǎn)生的。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋任何包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽或蛋白質(zhì)。這里必須理解的是，本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，也就是說(shuō)抗體不處在它們的天然環(huán)境中，而是已通過(guò)純化從天然來(lái)源分離或獲得，要不然就是通過(guò)遺傳重組或通過(guò)化學(xué)合成獲得，包括用非天然氨基酸修飾在內(nèi)。包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片斷，包括但不限于諸如Fab、Fab，、Fab，-SH、scFv、Fv、dAb和Fd的分子。已工程構(gòu)建出各種其他的包含一個(gè)或多個(gè)抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，包括例如Fab2、Fab3、雙抗體、三抗體、四抗體和微型抗體?？贵w分子及它們的構(gòu)建和使用方法在[參考文獻(xiàn)15]中描述。有可能采取單克隆抗體和其他抗體，使用重組DNA技術(shù)的方法，來(lái)產(chǎn)生其他能結(jié)合靶標(biāo)抗原的抗體或嵌合分子。這種方法可涉及到將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或CDR的DNA導(dǎo)入到另一免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加構(gòu)架區(qū)。參見(jiàn)例如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400以及眾多后續(xù)文獻(xiàn)。可使產(chǎn)生抗體的雜交瘤或其他細(xì)胞經(jīng)歷遺傳突變或其他變化，這可能改變或不改變所產(chǎn)生的抗體的結(jié)23合特異性。由于抗體可用多種方式進(jìn)行修飾，術(shù)語(yǔ)"抗體分子"應(yīng)被解釋為涵蓋任何具有帶有所需的抗原特異性和/或結(jié)合力的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，這個(gè)術(shù)語(yǔ)涵蓋包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片斷和衍生物，包括任何多肽在內(nèi)，不管是天然的還是完全或部分合成的。因此，本發(fā)明包括包含與另一多肽(例如衍自另一物種或者屬于另一抗體種類或亞類)融合的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)或等價(jià)物的嵌合分子。嵌合抗體的克隆和表達(dá)在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及眾多后續(xù)文獻(xiàn)中描述?？贵w工程領(lǐng)域中更多的可利用的技術(shù)使得有可能分離人抗體和人源化抗體。例如，可按Kontermann&Dubel[參考文獻(xiàn)16]所述制備人雜交瘤。噬菌體展示——另一種確立的用以產(chǎn)生結(jié)合成員的技術(shù)，在許多出版物中有詳細(xì)描述，如Kontermann&Dubel[參考文獻(xiàn)16]和WO92/01047(下文進(jìn)一步討論)，以及美國(guó)專利US5,969,108、US,5,565,332、US5,733,743、US5,858,657、US5,871,907、US5,872,215、US5,885,793、US5,962,255、US6,140,471、US6,172,197、US6,225,447、US6,291,650、US6,492,160和US6,521,404。其中小鼠抗體基因被失活而功能替換上人抗體基因、同時(shí)小鼠免疫系統(tǒng)的其他成分保持完整的轉(zhuǎn)基因小鼠，可用于分離人抗體[參考文獻(xiàn)17]。人源化抗體可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)產(chǎn)生，如在例如WO91/09967、US5,585,089、EP592106、US5,565,332和WO93/17105中公開(kāi)的那些技術(shù)。此外，WO2004/006955描述了基于/AA抗體基因選擇可變區(qū)構(gòu)架序列將抗體人源化的方法，所述選擇是通過(guò)將非人抗體的可變區(qū)的CDR序列的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型，與一文庫(kù)的(alibraryof)人抗體序列例如種系抗體基因區(qū)段的相應(yīng)CDR的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行比較來(lái)選擇。與非人CDR具有相似的規(guī)范CDR結(jié)構(gòu)類型的人抗體可變區(qū)，構(gòu)成了可從中選擇人構(gòu)架序列的人抗體序列成員亞組。亞組各成員可通過(guò)人和非人CDR序列之間的氨基酸相似性進(jìn)行進(jìn)一步的分等級(jí)(ranked)。在WO2004/006955的方法中，選擇高等級(jí)的人序列來(lái)提供構(gòu)架序列，用以構(gòu)建采用選定的亞組成員人構(gòu)架、以非人CDR對(duì)等序列功能性替換人CDR序列的嵌合抗體，從而提供高親和力和低免疫原性的人源化抗體，而不需要比較非人抗體和人抗體之間的構(gòu)架序列。還公開(kāi)了按該方法制備的嵌合抗體。合成的抗體分子可例如按Knappik等人[參考文獻(xiàn)18]或Krebs等人[參考文獻(xiàn)19]所述，由通過(guò)在合適表達(dá)載體當(dāng)中合成和裝配的寡核芬酸所產(chǎn)生的基因表達(dá)生產(chǎn)。已證實(shí)完整抗體的片斷能執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片斷的實(shí)例有(i)由VL結(jié)構(gòu)域、VH結(jié)構(gòu)域、恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域(CL)和恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1(CH1)組成的Fab片斷；(ii)由VH結(jié)構(gòu)域和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片斷；(iii)由單一抗體的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片斷；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成的dAb片斷[參考文獻(xiàn)20,21,22];(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab')2片斷，由兩個(gè)連才妻的Fab片斷組成的二價(jià)片斷；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)肽接頭連接，該接頭能讓這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生締合而形成抗原結(jié)合位點(diǎn)[參考文獻(xiàn)23,24];(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)"雙抗體，，，通過(guò)基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片斷(WO94/13804;[參考文獻(xiàn)25])。Fv分子、scFv分子或雙抗體分子可通過(guò)摻入將VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域連接在一起的二硫鍵來(lái)穩(wěn)定化[參考文獻(xiàn)26]。還可制備出包含與CH3結(jié)構(gòu)域連接的scFv的微型抗體[參考文獻(xiàn)27]。結(jié)合片斷的其他實(shí)例有Fab，和Fab，-SH,前者與Fab片斷差別在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端處添加有幾個(gè)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸，后者是其中恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基帶有游離硫醇基團(tuán)的Fab，片斷。個(gè)分子出發(fā)，通過(guò)諸如以下的方法來(lái)獲得酶消化如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，和/或通過(guò)化學(xué)還原進(jìn)行的二硫#:切割。按另一種方式，傳重組的技術(shù)獲得，要不然就是通過(guò)借助例如自動(dòng)肽合成儀(如AppliedBiosystems等公司提供的合成儀)進(jìn)行的肽合成來(lái)獲得，或者通過(guò)核酸合成和表達(dá)來(lái)獲得。本發(fā)明的功能抗體片斷包括任何其半壽期通過(guò)化學(xué)^f飾(特別是通過(guò)PEG化)或者通過(guò)摻入脂質(zhì)體來(lái)延長(zhǎng)的功能片斷。dAb(結(jié)構(gòu)域抗體)是抗體的小單聚抗原結(jié)合片斷，即抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)[參考文獻(xiàn)22]。VHdAb天然出現(xiàn)在駱駝科動(dòng)物(camelid)(例如駱駝(camel)、美洲駝(llama)),可通過(guò)用靶標(biāo)抗原免疫駱駝科動(dòng)物、分離抗原特異性B細(xì)胞和從B細(xì)胞個(gè)體直接克隆dAb基因來(lái)產(chǎn)生。dAb也可在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生。它們的小尺寸、良好溶解性和溫度穩(wěn)定性使得它們特別在生理上有用和適合于選擇和親和力成熟。駱駝科動(dòng)物VHdAb正以"nanobodies"的商品名開(kāi)發(fā)用于治療用途。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是包含基本上如本文所給出的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的dAb,或者是包含基本上如本文所給出的一組CDR的VH結(jié)構(gòu)i或或VL結(jié)構(gòu)i或。雙特異性抗體或雙功能抗體構(gòu)成第二代單克隆抗體，其中兩個(gè)不同的可變區(qū)結(jié)合在同一分子中[參考文獻(xiàn)28]。它們的用途已在診斷領(lǐng)域和在治療領(lǐng)域中，由它們募集新的效應(yīng)子功能或者靶向腫瘤細(xì)胞表面上的幾種分子的能力得到證明。在要使用雙特異性抗體的情形中，這些抗體可以是通過(guò)多種方式制造[參考文獻(xiàn)29]，例如化學(xué)法制備或從雜合雜交瘤制備的常規(guī)雙特異性抗體，或者可以是任何上文提到的雙特異性抗體片斷。這些抗體可通過(guò)化學(xué)方法[參考文獻(xiàn)30,31]或者體細(xì)胞方法(somaticmethod)[參考文獻(xiàn)32,33]獲得，但同樣地和優(yōu)先地通過(guò)能讓異型二聚化(heterodimerization)被迫進(jìn)行從而有助于所要的抗體的純化過(guò)程的遺傳工程技術(shù)獲得[參考文獻(xiàn)34]。雙特異性抗體的實(shí)例包括BiTETM技術(shù)獲得的那些雙特異性抗體，其中兩個(gè)具有不同特異性的抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被使用并通過(guò)短的柔性肽直接連接在一起。這將兩個(gè)抗體組合在一條短的單一多肽鏈上。可僅使用可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)建出沒(méi)有Fc區(qū)的雙抗體和scFv,這能潛在地減少抗獨(dú)特型反應(yīng)的作用。雙特異性抗體可構(gòu)建成完整IgG、雙特異性Fab'2、Fab'PEG、雙抗體或者雙特異性scFv。此外，兩個(gè)雙特異性抗體可用本領(lǐng)域知道的常規(guī)方法連接在一起形成四價(jià)抗體。與雙特異性的完整抗體不同，雙特異性的雙抗體還可因?yàn)樗鼈兡苋菀椎卦诖竽c桿菌(E.coli)中構(gòu)建和表達(dá)而特別有用。具有適宜的結(jié)合特異性的雙抗體(和許多其他多肽，如抗體片斷)可容易地用噬菌體展示法(WO94/13804)從文庫(kù)選擇。如果雙抗體的一個(gè)臂(arm)要保持恒定，例如對(duì)IgE的特異性，則可制備出其中另一個(gè)臂有變化的文庫(kù)，并選出具有適宜特異性的抗體。雙特異性的完整抗體可通過(guò)Ridgeway等人，1996[參考文獻(xiàn)35]中所述的替代工程方法(altemativeengineeringmethod)來(lái)制備。本領(lǐng)域有多種方法可用來(lái)獲得抗IgE抗體?？贵w可以是單克隆抗體，尤其是人來(lái)源、鼠來(lái)源、嵌合來(lái)源或人源化來(lái)源的單克隆抗體，它們可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。一般來(lái)說(shuō)，為制備單克隆抗體或者它們的功能片斷，尤其是鼠來(lái)源的，可以參考在《抗體》手冊(cè)[參考文獻(xiàn)36]中具體描述的技術(shù)，或者參考K6hler和Milstein所描述的從雜交瘤的制備技術(shù)[參考文獻(xiàn)37〗。單克隆抗體可例如從針對(duì)IgE或其含有被所述單克隆抗體識(shí)別的表位的片斷之一進(jìn)行了免疫的動(dòng)物細(xì)胞獲得。合適的片斷和包含它們的肽或多肽可用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗IgE抗體。所述IgE或其片斷之一尤其可按照通常的工作方法，通過(guò)從含在編碼IgE或其片斷的cDNA序列中的核酸序列開(kāi)始進(jìn)行的遺傳重組，通過(guò)從包含在IgE和/或其片斷的肽序列中的氨基酸的序列開(kāi)始進(jìn)行的肽合成，來(lái)產(chǎn)生。單克隆抗體可例如在之前已固定化了含有#:所述單克隆抗體識(shí)別的表位的IgE或其片斷之一的親和柱上純化。更具體的說(shuō)，單克隆抗體可這樣純化在A蛋白和/或G蛋白上進(jìn)行層析，接著進(jìn)行或不進(jìn)行旨在消除殘余蛋白質(zhì)污染物及DNA和LPS本身的離子交換層析，再接著進(jìn)行或不進(jìn)行旨在消除因二聚體或其他多聚體的存在所致的潛在聚集體的瓊脂糖凝膠排阻層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，全部這些技術(shù)可同時(shí)使用或者相續(xù)使用?？乖Y(jié)合位點(diǎn)是分子中的能結(jié)合和互補(bǔ)于靶標(biāo)抗原的全部或部分的那部分。在抗體分子中，它被稱為抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，包含抗體中的能結(jié)合和互補(bǔ)于靶標(biāo)抗原的全部或部分的那部分?？乖^大時(shí)，抗體可能只結(jié)合抗原的特定部分，該部分被稱為表位。抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)可由一個(gè)或多個(gè)抗原可變結(jié)構(gòu)域提供。抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)可包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。"分離的"是指本發(fā)明的結(jié)合成員或者編碼這些結(jié)合成員的核酸一般會(huì)符合本發(fā)明的這么一種狀態(tài)。因此,本發(fā)明的結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域及編碼核酸分子和載體，可以例如從它們的天然環(huán)境分離和/或純化而以基本上純的或同質(zhì)的(homogeneous)形式提供，或者在核酸的情形中，不含或基本上不含其來(lái)源不同于編碼具有所需功能的多肽的序列的核酸或基因。分離的成員和分離的核酸將不含或基本上不含它們天然相伴的物質(zhì)，如在它們的天然環(huán)境中或者制備它們的環(huán)境(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)(當(dāng)這種制備是通過(guò)體外或體內(nèi)實(shí)施的重組DNA技術(shù)進(jìn)行時(shí))中與它們一起存在的其他多肽或核酸。成員和核酸可用稀釋劑或佐劑配制，且出于實(shí)用目的仍是分離的，例如所述成員如果用來(lái)包被用于免疫測(cè)定的微量滴定板的話，通常會(huì)用明膠或其他載體混合,或者當(dāng)用于診斷或治療時(shí)，將與藥物可接受的載體或稀釋劑混合。結(jié)合成員可以天然糖基化或通過(guò)異源真核細(xì)胞(例如CHO或NS0(ECACC85110503)細(xì)胞)的系統(tǒng)糖基化，或者它們可以是(例如如果在原核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生的話)未糖基化的。包含抗IgE抗體分子的異質(zhì)制品(heterogeneouspreparation)也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。例如，這種制品可以是具有全長(zhǎng)重鏈和缺乏C末端賴氨酸的重鏈、具有不同程度的糖基化和/或具有衍生化氨基酸(如N末端谷氨酸環(huán)化形成焦谷氨酸殘基)的抗體的混合物。本文所用的詞語(yǔ)"基本上如...所給出"是指本文所述結(jié)合成員的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的相關(guān)CDR的特性，將是相同于或高度類似于其序列在本文中給出的指定區(qū)域。本文針對(duì)一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的指定區(qū)域所述的詞語(yǔ)"高度類似"，是設(shè)想到可在CDR和/或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中作出1至約6個(gè)，例如l-5個(gè)，包括l-3個(gè)或者1或2個(gè)或者3或4個(gè)氨基酸置換。發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明的結(jié)合成員能調(diào)節(jié)和可中和IgE的生物活性。如本文所述，可對(duì)本發(fā)明的IgE結(jié)合成員優(yōu)化中和效價(jià)。一般來(lái)說(shuō)，效價(jià)優(yōu)化涉及到將選定的結(jié)合成員的序列(通常是抗體的可變結(jié)構(gòu)域序列)突變，以產(chǎn)生一文庫(kù)的結(jié)合成員，然后測(cè)定它們的效價(jià)，選出效價(jià)更高的結(jié)合成員。這樣選出的"效價(jià)優(yōu)化的"結(jié)合成員趨向于具有比產(chǎn)生該文庫(kù)的結(jié)合成員更高的效價(jià)。不過(guò)不進(jìn)行優(yōu)化也可獲得高效價(jià)結(jié)合成員，例如可直接從初始篩選如生化中和測(cè)定直接獲得高效價(jià)結(jié)合成員。"效價(jià)優(yōu)化的"結(jié)合成員指具有經(jīng)優(yōu)化的對(duì)特定活性或下游功能的中和效價(jià)的結(jié)合成員。本文別處對(duì)測(cè)定法和效價(jià)有更詳細(xì)的描述。本發(fā)明提供效價(jià)優(yōu)化的結(jié)合成員和非效價(jià)優(yōu)化的結(jié)合成員，以及用以從選定的結(jié)合成員進(jìn)行效價(jià)優(yōu)化的方法。本發(fā)明因此使得技術(shù)人員能產(chǎn)生具有高效價(jià)的結(jié)合成員。盡管可采用效價(jià)優(yōu)化從給定的結(jié)合成員產(chǎn)生更高效價(jià)的結(jié)合成員，但還要指出的是甚至不用進(jìn)行效價(jià)優(yōu)化，也可獲得高效價(jià)結(jié)合成口貝。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供獲得一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合抗原的結(jié)合成員的方法，所述方法包括使本發(fā)明的一文庫(kù)結(jié)合成員與所述抗原接觸，和選擇該文庫(kù)的一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合所述抗原的結(jié)合成員?？蓪⑽膸?kù)展示在顆粒或分子復(fù)合物上，例如可復(fù)制的遺傳組件(geneticpackage),如酵母、細(xì)菌或噬菌體(例如T7)顆粒、病毒、細(xì)胞或者共價(jià)的、核糖體的或其他的體外展示系統(tǒng)，每個(gè)顆?；蚍肿訌?fù)合構(gòu)域(如果存在的話)的核酸。噬菌體展示描述于WO92/01047和例如美國(guó)專利US5,969,108、US5,565,332、US5,733,743、US5,858，657、US5,871,907、US5,872,215、US5,885,793、US5,962,255、US6,140,471、US6,172,197、US6,225,447、US6,291,650、US6,492,160和US6，521，404(每個(gè)專利都通過(guò)引用全文并入本文)。選擇了能夠結(jié)合抗原且^^L示在噬菌體或其他文庫(kù)顆?；蚍肿訌?fù)合物上的結(jié)合成員后，可從展示選定的結(jié)合成員的噬菌體或其他顆?；蚍肿訌?fù)合物獲取核酸。這種核酸可用于隨后產(chǎn)生結(jié)合成員或抗體VH或VL可變結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生的方式是用獲自展示所述選定結(jié)合成員的噬菌體或其他顆粒或分子復(fù)合物的核酸的序列進(jìn)行核酸表達(dá)。具有所述選定結(jié)合成員的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的抗體VH可變結(jié)構(gòu)域，如包含這種VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員一樣，可以以分離形式提供?？蛇M(jìn)一步試驗(yàn)IgE結(jié)合能力，還有與例如親本抗體分子或抗體分子2-28(例如為scFv形式和/或IgG形式，例如IgGl)竟?fàn)幣cIgE的結(jié)合的能力?？稍囼?yàn)IgE中和能力，這在本文別處進(jìn)一步討論。本發(fā)明的結(jié)合成員可以以親本或其他抗體分子(例如scFv)或者抗體2-28中的一個(gè)(例如IgGl)的親和力，或者以更好的親和力，來(lái)結(jié)合IgE。本發(fā)明的結(jié)合成員可以以親本或其他抗體分子或者抗體2-28中的一個(gè)(例如scFv或IgGl)的效價(jià)，或者以更好的效價(jià)，來(lái)中和IgE的生物活性?？蓪⒉煌Y(jié)合成員的結(jié)合親和力和中和效價(jià)在適當(dāng)條件下進(jìn)行30比較。本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域和CDR的變體，包括本文給出了氨基S吏序列的那些變體和可應(yīng)用于IgE結(jié)合成員的那些變體，可通過(guò)序列變化或突變方法及篩選具有期望特性的抗原結(jié)合成員的方法來(lái)獲得。期望特性的實(shí)例包括但不限于'相對(duì)于對(duì)抗原有特異性的已知抗體，對(duì)該抗原的結(jié)合親和力提高.如果活性已知的話，相對(duì)于對(duì)該抗原有特異性的已知抗體，對(duì)該抗原活性的中和作用提高.以特定的摩爾比與該抗原的已知抗體或配體的指定竟?fàn)幠芰?使復(fù)合物發(fā)生免疫沉淀的能力，結(jié)合指定表位的能力o線性表位，例如用本文所述的肽結(jié)合掃描所鑒定的肽序列，例如^f吏用以線性構(gòu)象和/或約束構(gòu)象篩選的肽。由非連續(xù)殘基形成的構(gòu)象表位調(diào)節(jié)IgE或下游分子的新的生物活性的能力。這些方法在本文中也提供。可產(chǎn)生本文公開(kāi)的抗體分子的變體并在本發(fā)明中使用。可效法計(jì)算化學(xué)將多元數(shù)據(jù)分析技術(shù)應(yīng)用到結(jié)構(gòu)/性質(zhì)-活性相互關(guān)系[參考文獻(xiàn)38]，采用公知的數(shù)學(xué)技術(shù)如統(tǒng)計(jì)回歸、模式識(shí)別和分類，來(lái)得出抗體的定量活性—性質(zhì)相互關(guān)系[參考文獻(xiàn)39,40,41,42,43，44]?？贵w的性質(zhì)可從抗體序列、功能結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗(yàn)和理^侖;漠型(例如，可能接觸殘基的分析或者計(jì)算的理化性質(zhì))得出，且這些性質(zhì)可單獨(dú)考慮或組合考慮。由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，通常由以下六個(gè)多肽環(huán)形成三個(gè)來(lái)自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，三個(gè)來(lái)自重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。對(duì)已知原子結(jié)構(gòu)的抗體的分析，已揭示了抗體結(jié)合位點(diǎn)的序列和三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系[參考文獻(xiàn)45,46]。這些關(guān)系暗示，除了VH結(jié)構(gòu)域的三個(gè)區(qū)域(環(huán))之外，結(jié)合位點(diǎn)環(huán)具有少數(shù)的主鏈構(gòu)象之一規(guī)范結(jié)構(gòu)(canonicalstructure)。已證實(shí)，在特定環(huán)中形成的規(guī)范結(jié)構(gòu)是由其大小和在環(huán)和在構(gòu)架區(qū)中關(guān)鍵位點(diǎn)處的某些殘基的存在所決定[參考文獻(xiàn)45,46]。序列-結(jié)構(gòu)關(guān)系的這個(gè)研究，可用于預(yù)測(cè)序列已知但三維結(jié)構(gòu)未知的抗體中，那些在維持其CDR環(huán)的三維結(jié)構(gòu)方面重要從而能維持結(jié)合特異性的殘基。這些預(yù)測(cè)可通過(guò)將預(yù)測(cè)結(jié)果與先導(dǎo)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(leadoptimizationexperiment)的結(jié)果進(jìn)行比較而得到支持。在結(jié)構(gòu)方法中，可用任何自由獲取的或商業(yè)的軟件包如WAM[參考文獻(xiàn)48]來(lái)產(chǎn)生抗體分子[參考文獻(xiàn)47]的模型。接著可用蛋白質(zhì)可視化和分析軟件包如InsightII(Accelrys,Inc.)或DeepView[參考文獻(xiàn)49]來(lái)評(píng)估CDR中每個(gè)位置處的可能置換。然后可用這個(gè)信息來(lái)作出可能對(duì)活性具有最低限度的影響或有利影響的置換。在CDR、抗體VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員的氨基酸序列當(dāng)中作出置換所需要的技術(shù)，一般是本領(lǐng)域可獲得的?？勺鞒鼍哂锌杀换虿槐活A(yù)測(cè)到對(duì)活性有最低限度影響或有利影響的置換的變體序列，并試驗(yàn)其結(jié)合和/或中和IgE的能力和/或試驗(yàn)任何其他期望的性質(zhì)。如所討論，任何其序列在本文中明確公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列變體，都可按本發(fā)明采用。本發(fā)明的又一個(gè)方面是包含與表3和所附序列表所示的抗體1-28中任一個(gè)抗體的VH結(jié)構(gòu)域，或者與表1所示的HCDR(例如HCDR1、HCDR2或HCDR3)有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列同一性的VH結(jié)構(gòu)域的抗體分子。該抗體分子任選還可包含與抗體1-28中任一個(gè)抗體的VL結(jié)構(gòu)域或者與表1所示的LCDR(例如LCDR1、LCDR2或LCDR3)有至少60、70、80、85、90、95、98或99%氨基酸序列同一性的VL結(jié)構(gòu)域。可用來(lái)計(jì)算兩個(gè)氨基酸序列的。/。同一性的算法，包括例如BLAST[參考文獻(xiàn)50]、FASTA32[參考文獻(xiàn)51]或Smith-Waterman算法[參考文獻(xiàn)52]，這些算法例如采用默認(rèn)參數(shù)。具體的變體可包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列變更(氨基酸殘基的添加、缺失、置換和/或插入)。在某些實(shí)施方案中，變體具有不到約20個(gè)這些變更。-可在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)CDR中作出變更。變更通常不導(dǎo)致功能的喪失，因此包含如此變更的氨基酸序列的結(jié)合成員可保持結(jié)合和/或中和IgE的能力。例如如在本文所述的測(cè)定中測(cè)出，它可保持與其中沒(méi)有作出變更的結(jié)合成員相同的定量結(jié)合和/或中和能力。包含如此變更的氨基酸序列的結(jié)合成員可具有改進(jìn)的結(jié)合和/或中和IgE的能力。變更可包括用非天然或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基修飾成非天然或非標(biāo)準(zhǔn)形式，或者將一個(gè)或多個(gè)非天然或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸插入到序列中。本發(fā)明的序列中的變更的數(shù)量和位置的實(shí)例，在本文別處描述。天然氨基酸包括20個(gè)"標(biāo)準(zhǔn)的"L-氨基酸，它們由其標(biāo)準(zhǔn)的單字母代號(hào)表示為G、A、V、L、I、M、P、F、W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸包括任何其他可摻入到多肽骨架中或者可由現(xiàn)有氨基酸殘基的修飾產(chǎn)生的殘基。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以是天然的或非天然的。有幾個(gè)天然的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸是本領(lǐng)域知道的，如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、3-甲基組氨酸、N-乙酰絲氨酸等[參考文獻(xiàn)53]。那些在其N-a位置被衍生化的氨基酸殘基，將只位于氨基酸序列的N末端。通常在本發(fā)明中，氨基酸是L-氨基酸，但它也可以是D-氨基酸。因此變更包括將L-氨基酸修飾成D-氨基酸，或者用D-氨基酸置換L-氨基酸。曱基化、乙?；?或磷酸化形式的氨基酸也是為人所知的，本發(fā)明的氨基酸可進(jìn)行這種修飾。本發(fā)明的抗體結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員中的氨基酸序列可包含上述的非天然或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(例如D-氨基酸)可在合成過(guò)程中摻入到氨基酸序列中，或者在氨基酸序列合成后通過(guò)修飾或置換"原始的"標(biāo)準(zhǔn)氨基酸來(lái)?yè)饺?。非?biāo)準(zhǔn)和/或非天然氨基酸的使用能增加結(jié)構(gòu)和功能多樣性，因此可提高在本發(fā)明的結(jié)合成員中實(shí)現(xiàn)期望的IgE結(jié)合和中和性質(zhì)的潛在可能性。另外，已證實(shí)D-氨基酸和類似物具有比標(biāo)準(zhǔn)的L-氨基酸更好的藥代動(dòng)力學(xué)概況，因?yàn)榫哂蠰-氨基酸的多肽在給予動(dòng)物如人之后會(huì)發(fā)生體內(nèi)降解。攜帶本發(fā)明的CDR衍生序列的新型VH區(qū)或VL區(qū)，可采耳又對(duì)一個(gè)或多個(gè)選定的VH基因和/或VL基因進(jìn)行隨機(jī)誘變以在整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域當(dāng)中產(chǎn)生突變來(lái)產(chǎn)生。這種技術(shù)由Gram等人描述[參考文獻(xiàn)54]，他們使用了易錯(cuò)PCR。在一些實(shí)施方案中，在整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或整組CDR當(dāng)中作出一個(gè)或兩個(gè)氨基酸置換。另一可使用的方法是將誘變導(dǎo)入VH基因或VL基因的CDR區(qū)。這種技術(shù)由Barbas等人[參考文獻(xiàn)55]和Schier等人[參考文獻(xiàn)56]公開(kāi)。所有上述技術(shù)本身在本領(lǐng)域中是為人所知的，技術(shù)人員將能夠采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法，應(yīng)用這些技術(shù)來(lái)提供本發(fā)明的結(jié)合成員。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供獲得針對(duì)IgE的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的方法，所述方法包括通過(guò)在本文給出的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、缺失、置換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)提供VH結(jié)構(gòu)域；任選將這樣提供的VH結(jié)構(gòu)域與一個(gè)或多個(gè)VL結(jié)構(gòu)域結(jié)合；和對(duì)VH結(jié)構(gòu)域或VH/VL組合(一個(gè)或多個(gè)組合)進(jìn)行試驗(yàn)，以鑒定針對(duì)IgE和任選具有一個(gè)或多個(gè)期望性質(zhì)(例如中和IgE活性的能力)的結(jié)合成員或抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。所述VL結(jié)構(gòu)域可具有基本上如本文所給出的氨基酸序列。有類似的方法可使用，其中將本文公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)序列變體與一個(gè)或多個(gè)VH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行組合。如上所述，基本上如本文所給出的CDR氨基酸序列，可在人抗體可變結(jié)構(gòu)域或其實(shí)質(zhì)部分中作為CDR攜帶。基本上如本文所給出的HCDR3序列是本發(fā)明的實(shí)施方案的代表，這些序列的每一個(gè)都可在人重鏈可變結(jié)構(gòu)域或其實(shí)質(zhì)部分中作為HCDR3攜帶。本發(fā)明中采用的可變結(jié)構(gòu)域可獲自或衍自任何種系或重排的人可變結(jié)構(gòu)域，或者可以是基于已知的人可變結(jié)構(gòu)域的共有序列或?qū)嶋H序列的合成可變結(jié)構(gòu)域。可變結(jié)構(gòu)域可衍自非人抗體?？墒褂弥亟MDNA技術(shù)，將本發(fā)明的CDR序列(例如CDR3)導(dǎo)入到一整庫(kù)(arepertoireof)缺乏CDR(例如CDR3)的可變結(jié)構(gòu)域中。例如，Marks等人[參考文獻(xiàn)57]描述了產(chǎn)生成整庫(kù)的(repertoiresof)抗體可變結(jié)構(gòu)域的方法，其中將定向在或鄰近于可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域的5'末端的共有引物與人VH基因的第三構(gòu)架區(qū)的共有引物聯(lián)合使用，以提供一整庫(kù)缺乏CDR3的VH可變結(jié)構(gòu)域。Marks等人進(jìn)一步描述了這整庫(kù)如何可與特定抗體的CDR3進(jìn)行組合。使用類似的技術(shù)，本發(fā)明的CDR3衍生序列可用成整庫(kù)的缺乏CDR3的VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改組(shuffle)，并將改組的完全VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域與同族的(cognate)VL結(jié)構(gòu)域或VH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行組合，以提供本發(fā)明的結(jié)合成員。該整庫(kù)然后可在合適的宿主系統(tǒng)，如WO92/01047(通過(guò)引用全文并入本文)和后續(xù)大量文獻(xiàn)中的任何一篇(包括Kay,Winter&McCafferty[58]在內(nèi))的噬菌體展示系統(tǒng)中展示，使得可選擇出合適的結(jié)合成員。一整庫(kù)可由104個(gè)以上的成員個(gè)體組成，例如至少105個(gè)、至少106個(gè)、至少107個(gè)、至少108個(gè)、至少109個(gè)或至少10"個(gè)成員或更多。其他合適的宿主系統(tǒng)包括但不限于酵母展示、細(xì)菌展示、T7展示、病'毒展示、細(xì)胞展示、核糖體展示和共價(jià)展示。本發(fā)明提供制備IgE抗原的結(jié)合成員的方法，所述方法包括(a)提供起始的一整庫(kù)編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸，所述核酸包括要被置換的CDR3或者缺乏CDR3編碼區(qū)；(b)將所述的整庫(kù)與編碼基本上如本文對(duì)VHCDR3所給出的氨基酸序列的供體核酸進(jìn)行組合，使得所述供體核酸被插入到該整庫(kù)中的CDR3區(qū)中，以j是供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸產(chǎn)物整庫(kù)(aproductrepertoireofnucleicacids)。(c)表達(dá)所述產(chǎn)物整庫(kù)的核酸；(d)選出針對(duì)IgE的結(jié)合成員；和(e)回收所述結(jié)合成員或編碼它的核酸。同樣有類似的方法可使用，其中將本發(fā)明的VLCDR3與一整庫(kù)編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸進(jìn)行組合，所述核酸包括要被置換的CDR3或者缺乏CDR3編碼區(qū)。類似地，可將一個(gè)或多個(gè)或者所有三個(gè)CDR移^i到一整庫(kù)VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中，然后篩選出IgE的結(jié)合成員(一個(gè)或多個(gè))。例如，可采用親本或抗體2-28HCDR1、HCDR2和HCDR3或者親本或抗體2-28各組HCDR中的一個(gè)或多個(gè)，和/或采用親本或抗體2-28LCDR1、LCDR2和LCDR3或者親本或抗體2-28各組LCDR中的一個(gè)或多個(gè)。類似地，也可采用本文公開(kāi)的其他VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域、各組CDR和各組HCDR和/或各組LCDR。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的實(shí)質(zhì)部分可包含至少三個(gè)CDR區(qū)以及它們的間插構(gòu)架區(qū)。該部分還可包括第一和第四構(gòu)架區(qū)之一或兩者的至少約50%,所述50%是第一構(gòu)架區(qū)的C末端50%和第四構(gòu)架區(qū)的N末端50%?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的實(shí)質(zhì)部分的N末端或C末端處的另外殘基，可以是通常不與天然可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域有關(guān)的那些殘基。例如，通過(guò)重組DNA技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的結(jié)合成員，可導(dǎo)致被引入來(lái)促進(jìn)克隆或其他操作步驟的接頭所編碼的N末端或C末端殘基的引入。其他操作步驟包括引入接頭來(lái)將本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域與更多的蛋白質(zhì)序列連接，所述蛋白質(zhì)序列包括抗體恒定區(qū)、其他可變結(jié)構(gòu)域(例如在雙抗體的生產(chǎn)中)或可檢測(cè)標(biāo)記/功能標(biāo)記，這在本文別處作更詳細(xì)的討論。在本發(fā)明的一些方面，結(jié)合成員包含一對(duì)VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域，不過(guò)基于VH結(jié)構(gòu)域序列或VL結(jié)構(gòu)域序列的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)36成本發(fā)明的進(jìn)一步的方面。已知單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域特別是VH結(jié)構(gòu)域能夠以特異性方式結(jié)合靶標(biāo)抗原。例如參見(jiàn)上文對(duì)dAb的討論。對(duì)于任一個(gè)單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可用來(lái)篩選能夠形成能結(jié)合IgE的兩結(jié)構(gòu)域結(jié)合成員的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域。這可通過(guò)采用WO92/01047(通過(guò)引用全文并入本文)中公開(kāi)的所謂的等級(jí)二元組合法(hierarchicaldualcombinatorialapproach)的遵菌體展示篩選方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，在該等級(jí)二元組合法中，用含有H鏈克隆或L鏈克隆的單個(gè)菌落來(lái)感染一完整文庫(kù)的(acompletelibraryof)編碼另一鏈(L或H)的克隆，所得的兩鏈結(jié)合成員按噬菌體展示技術(shù)(如在該專利文獻(xiàn)中描述的那些技術(shù))進(jìn)行選擇。這個(gè)技術(shù)在Marks等人(出處同上)中也有公開(kāi)。本發(fā)明的結(jié)合成員可進(jìn)一步包含抗體恒定區(qū)或其部分，例如人抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL結(jié)構(gòu)域可在其C末端連接到抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，包括人CK或CX鏈。同樣，基于VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員可在其C末端連接到書1"自任何抗體同種型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)及任何同種型亞類(特別是IgGl和IgG2)的免疫球蛋白重鏈的全部或部分(例如CH1結(jié)構(gòu)域)。IgGl由于其制備容易和穩(wěn)定性例如半壽期，是有利的。任何具有這些性質(zhì)和能使可變區(qū)穩(wěn)定化的合成的或其他的恒定區(qū)變體，也可用于本發(fā)明。本發(fā)明的結(jié)合成員可用可檢測(cè)標(biāo)記或功能標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。因此，結(jié)合成員或抗體分子可以以免疫綴合物的形式存在，以獲得可檢測(cè)信號(hào)和/或可定量信號(hào)。免疫綴合物可包含與可^f企測(cè)標(biāo)記或功能標(biāo)記綴合的本發(fā)明抗體分子。標(biāo)記可以是任何能產(chǎn)生或者可被誘導(dǎo)產(chǎn)生信號(hào)的分子，包括但不限于熒光劑、放射標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光劑或光敏劑。因此，可通過(guò)檢測(cè)焚光或發(fā)光、放射性、酶活性或吸光度來(lái)檢測(cè)和/或測(cè)量結(jié)合情況。合適的標(biāo)記包括以下標(biāo)記，它們是以舉例方式給出，并非限制本發(fā)明37-酶，例如堿性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氬酶("G6PDH")、a-D-半乳糖香酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸肝酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氳酶和過(guò)氧化物酶如辣才艮過(guò)氧化物酶；-染料；-熒光標(biāo)記或焚光劑，如熒光素及其衍生物、熒光染料(fluorochrome)、羅丹明化合物及其衍生物、GFP(GFP是指"綠色熒光蛋白，，)、丹磺酰、傘形酮、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺；熒光團(tuán)如鑭系元素穴狀化合物和螯合物，例如銪等(PerkinElmer禾口CisBiointernational)，-化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(chemiluminescer)，如異魯米諾、魯米諾和二氧雜環(huán)丁烷；-生物發(fā)光標(biāo)記，如螢光素酶和螢光素；-敏化劑；-輔酶;-酶底物；隱放射性標(biāo)記，包括但不限于澳77、碳14、鈷57、氟8、鎵67、鎵68、氬3(氖)、銦lll、銦113m、硤123m、碘125、碘126、碘131、硪133、汞107、汞203、磷32、錸99m、錸101、錸105、釕95、釕97、釕103、釕105、鈧47、硒75、硫35、锝99、锝99m、碲121m、碲122m、碲125m、銩165、銩167、銩168、釔199和本丈提到的其他放射性標(biāo)記；、-顆粒物，如乳膠或碳顆粒；金屬溶膠；微晶；脂質(zhì)體；細(xì)胞，等等，顆粒物可進(jìn)一步用染料、催化劑或其他可檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記；-分子，如生物素、地高辛或5-溴脫氧尿苷；-毒素部分，例如選自以下的毒素部分4i單胞桿菌屬外毒素(Pseudomonasexotoxin)(PE或其細(xì)胞毒性片段或突變體)、白喉毒素或其細(xì)胞毒性片段或突變體、肉毒桿菌毒素A,B,C,D,E或F、蓖麻毒蛋白(ricin)或其細(xì)胞毒性片段如蓖麻毒蛋白A、相思豆毒蛋白(abrin)或其細(xì)胞毒性片段、肥皂草毒蛋白(saporin)或其細(xì)胞毒性片段、美洲商陸(pokeweed)抗病毒毒素或其細(xì)胞毒性片段及異抹瀉根毒蛋白(bryodin)1或其細(xì)胞毒性片段。合適的酶和輔酶公開(kāi)于Litman,等人，US4，275，149和Boguslaski,等人，US4318980，每個(gè)專利通過(guò)引用全文并入本文。合適的熒光劑和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)公開(kāi)于Litman,等人，US4275149，該專利通過(guò)引用全文并入本文。標(biāo)記還包括化學(xué)部分，如可通過(guò)與特異性關(guān)聯(lián)(cognate)可才企測(cè)部分的結(jié)合來(lái)^r測(cè)的生物素，例如經(jīng)標(biāo)記的親和素或鏈霉親和素?？蓹z測(cè)標(biāo)記可用本領(lǐng)域知道的常規(guī)化學(xué)法連接到本發(fā)明的抗體。免疫綴合物或其功能片段可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法來(lái)制備。它們可直接地，或者通過(guò)間隔基團(tuán)或連接基團(tuán)如聚醛(比如戊二醛)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DPTA),或者在偶聯(lián)劑(如上對(duì)治療性綴合物所迷的那些偶聯(lián)劑)的存在下，偶聯(lián)到酶或熒光標(biāo)記。含有熒光素類型的標(biāo)記的綴合物可通過(guò)與異硫氰酸反應(yīng)來(lái)制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的現(xiàn)有的將治療性放射性同位素直接地或通過(guò)螯合劑(如以上提到的EDTA、DTPA)偶聯(lián)到抗體的方法，可應(yīng)用在可用于診斷的放射性元素上。同樣可以通過(guò)氯胺T方法[參考文獻(xiàn)59]用鈉125進(jìn)行標(biāo)記，或者通過(guò)Crockford等人的4支術(shù)(US4424200，通過(guò)引用全文并入本文)用锝99m進(jìn)行標(biāo)記，或者按Hnatowich(US4,479,930,通過(guò)引用全文并入本文)的描述通過(guò)DTPA進(jìn)行連接。有多種方法可使標(biāo)記能產(chǎn)生可通過(guò)外部手段檢測(cè)的信號(hào)，例如通過(guò)肉眼檢驗(yàn)、電磁輻射、熱和化學(xué)試劑來(lái)檢測(cè)。也可使標(biāo)記結(jié)合到另一種能結(jié)合本發(fā)明抗體的結(jié)合成員，或者結(jié)合到載體。標(biāo)記可直接產(chǎn)生信號(hào)，因此不需要另外的成分以產(chǎn)生信號(hào)。有許多有機(jī)分子例如熒光劑能夠吸收紫外光和可見(jiàn)光，吸收的光將能量轉(zhuǎn)移到這些分子，從而使它們躍遷到激發(fā)能態(tài)。這個(gè)吸收的能量然后通過(guò)以第二波長(zhǎng)進(jìn)行的光發(fā)射而散發(fā)。這個(gè)第二波長(zhǎng)發(fā)射也可將能量轉(zhuǎn)移到經(jīng)標(biāo)記的接納分子(acceptormolecule),結(jié)果接納分子又通過(guò)光發(fā)射例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)散發(fā)能量。其他能直接產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)記包括放射性同位素和染料?；蛘?，標(biāo)記可能需要其他成分以產(chǎn)生信號(hào)，這樣信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)將包括所有為產(chǎn)生可測(cè)量信號(hào)所需的成分，這些成分可包括底物、輔酶、增強(qiáng)劑、另外的酶、能與酶制品反應(yīng)的物質(zhì)、催化劑、激活劑、輔因子、抑制劑、清除劑(scavenger)、金屬離子及信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的結(jié)合所需的特定結(jié)合物質(zhì)。有關(guān)合適的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的詳細(xì)討論可見(jiàn)于Ullman,等人US5,185,243,該專利通過(guò)引用全文并入本文。本發(fā)明提供這樣的方法，它包括引起或允許本文所提供的結(jié)合成員與IgE的結(jié)合。如所指出，這種結(jié)合可在體內(nèi)發(fā)生，例如在將結(jié)合成員或編碼核酸給予人或動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)后發(fā)生，或者可在體外發(fā)生，例如在ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀法、親和層析和生化測(cè)定或基于細(xì)胞的測(cè)定中發(fā)生。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明結(jié)合成員與IgE之間的復(fù)合物，可通過(guò)酶聯(lián)免疫測(cè)定、放射測(cè)定、免疫沉淀法、熒光免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定、免疫印跡測(cè)定、側(cè)向流測(cè)定(lateralflowassay)、凝集測(cè)定和基于微粒的測(cè)定(particulate-basedassay)等測(cè)定法來(lái)檢測(cè)。本發(fā)明還提供通過(guò)例如在生物傳感器系統(tǒng)中采用本發(fā)明的結(jié)合成員來(lái)直接測(cè)量抗原的水平。例如，本發(fā)明包括檢測(cè)和/或測(cè)量與IgE的結(jié)合的方法，所述方法包括(i)將所述結(jié)合成員暴露于IgE,和(ii)檢測(cè)所述結(jié)合成員與IgE的結(jié)合,其中結(jié)合是用本文描述的任何方法或可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)檢測(cè)。本文描述的這個(gè)和任何其他的結(jié)合檢測(cè)方法，可由執(zhí)行該方法的人員例如通過(guò)目測(cè)觀察可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)直接闡釋?；蛘?，本文描述的這個(gè)和任何其他的結(jié)合檢測(cè)方法可以如下形式產(chǎn)生報(bào)告放射自顯影圖、照片、計(jì)算機(jī)打印輸出、流式細(xì)胞術(shù)報(bào)告、圖(graph)、圖表(chart)、含有結(jié)果的試管或容器或孔(well)，或者該方法的結(jié)果的任何其他可視或物理表示法?？蓽y(cè)定結(jié)合成員與IgE的結(jié)合的量?？蓪⒍繑?shù)量與試驗(yàn)樣品中可能具有診斷意義的抗原的量關(guān)聯(lián)起來(lái)。對(duì)IgE結(jié)合和/或其定量的篩選，可用于例如篩選患者是否有本文所指的疾病或病恙，和/或任何其他涉及異常IgE產(chǎn)生、表達(dá)和/或活性的疾病或病恙。本發(fā)明的診斷方法可包括(i)從受試者獲得組織或流體樣品，(ii)將所述組織或流體樣品暴露于本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合成員，和(iii)與對(duì)照樣品相比較檢測(cè)結(jié)合的IgE，其中與對(duì)照樣品相比較IgE結(jié)合的量的增加可表示IgE產(chǎn)生、表達(dá)或活性的異常水平。待測(cè)的組織或流體樣品包括血液、血清、尿液、活組織檢查材料、腫瘤或者任何懷疑含有異常IgE水平的組織。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異常IgE水平或活性陽(yáng)性的受試者，也可受益于本文后面所公開(kāi)的治療方法。的復(fù)合物。例如，可將抗原固定化在側(cè)條帶分析(lateralstripassay)上，來(lái)捕捉目的樣品中的抗原特異性IgE。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠按照本文公開(kāi)的方法，根據(jù)他們的偏好和常識(shí)，來(lái)選擇測(cè)定結(jié)合成員與抗原的結(jié)合的合適方式。免疫測(cè)定(RIA)是一種可能的方式。將放射性標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原(試驗(yàn)樣品)混合，讓它們與結(jié)合成員結(jié)合。采用物理方式將結(jié)合的抗原與未結(jié)合的抗原分離開(kāi)來(lái)，測(cè)定與結(jié)合成員結(jié)合的方文射性抗原的量。試驗(yàn)樣品中抗原越多，與結(jié)合成員結(jié)合的放射性抗原將越少。竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定也可與非放射性抗原一起使用，使用的是與報(bào)道分子連接的抗原或類似物。報(bào)道分子可以是具有光譜上分離的(spectrallyisolated)吸收或發(fā)射特征的熒光染料、磷或激光染料。合適的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白和德克薩斯紅以及鑭系元素螯合物或穴狀化合物。合適的發(fā)色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。其他的報(bào)道分子包括有色的、磁性的或順磁性的大分子膠體顆?；蛭⒘２牧先缒z乳珠(latexbead),和能直接或間接造成可檢測(cè)信號(hào)被目測(cè)觀察到、以電子方式檢測(cè)到或以別的方式記錄到的生物活性或化學(xué)活性物質(zhì)。這些分子可以是催化反應(yīng)的酶，這些反應(yīng)例如能顯示顏色或改變顏色，或者引起電學(xué)性質(zhì)的改變。它們可以是在分子上可激發(fā)的，使得各能態(tài)之間的電子躍遷會(huì)導(dǎo)致特征性光譜吸收或發(fā)射。它們可包括與生物傳感器聯(lián)用的化學(xué)實(shí)體(chemicalentity)?？刹捎蒙锼?親和素或生物素/鏈霉親和素和堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)。各個(gè)結(jié)合成員-報(bào)道分子綴合物所產(chǎn)生的信號(hào)，可用來(lái)導(dǎo)出樣品(正常樣品和試驗(yàn)樣品)中相關(guān)結(jié)合成員的可定量絕對(duì)或相對(duì)數(shù)據(jù)。作為本發(fā)明的一個(gè)方面，還提供了包含根據(jù)本發(fā)明任何方面或?qū)嵤┓桨傅慕Y(jié)合成員的試劑盒。在試劑盒中，可對(duì)結(jié)合成員進(jìn)行標(biāo)記以讓其在樣品中的反應(yīng)性得以檢測(cè)，例如如下文所進(jìn)一步描述。此外，結(jié)合成員可連接或不連接到固相載體。試劑盒的各成分通常是無(wú)菌的，裝在密閉小瓶或其他容器中。試劑盒可應(yīng)用在診斷分析或者其他能用得上結(jié)合成員的方法中。試劑盒可包括關(guān)于各成分在方法例如本發(fā)明的方法中的使用的說(shuō)明書。在本發(fā)明的試劑盒中可包括有助于或者使得能夠執(zhí)行這種方法的輔助材料。輔助材料包括能結(jié)合第一結(jié)合成員并與可檢測(cè)標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記、；改射性同位素或酶)綴合的不同的第二結(jié)合成員。基于抗體的試劑盒也可包含用于進(jìn)行免疫沉淀法的珠粒(bead)。試劑盒的每個(gè)成分通常裝在其自身合適的容器中。因此，這些試劑盒通常包括適合于每個(gè)結(jié)合成員的不同容器。此外，試劑盒的方法的說(shuō)明書。本發(fā)明還提供如上所述的結(jié)合成員用于在竟?fàn)幮詼y(cè)定申測(cè)量抗原水平的用途，也就是說(shuō)通過(guò)在竟?fàn)幮詼y(cè)定中采用本發(fā)明所提供的結(jié)合成員來(lái)測(cè)量樣品中的抗原水平的方法。這可能是不需要將結(jié)合的抗原與未結(jié)合的抗原進(jìn)行物理分離的情況。一種可能的做法是，將報(bào)道分子連接到結(jié)合成員，以使得在結(jié)合時(shí)出現(xiàn)物理或光學(xué)變化。報(bào)道分子可直接或間接產(chǎn)生可定量的可檢測(cè)信號(hào)。報(bào)道分子的連接可以是直接或間接地、共價(jià)地(例如通過(guò)肽鍵)或非共價(jià)地連接。通過(guò)肽鍵的連接可以是因編碼抗體和報(bào)道分子的基因融合物的重組表達(dá)而產(chǎn)生。在各個(gè)方面和實(shí)施方案中，本發(fā)明擴(kuò)展到能與任何本文所定義的結(jié)合成員竟?fàn)幣cIgE的結(jié)合的結(jié)合成員，所述本文所定義的結(jié)合成員例如親本抗體或抗體2-28中任一個(gè)抗體，例如為IgGl形式。各結(jié)合成員之間的竟?fàn)幙扇菀椎卦隗w外進(jìn)行測(cè)定，例如這樣測(cè)定將特異性報(bào)道分子標(biāo)記到一個(gè)能在其他未加標(biāo)記的結(jié)合成員存在下進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)合成員，以使得可以鑒定能結(jié)合同一表位或重疊表位的各結(jié)合成員。竟?fàn)幙衫缬肊LISA來(lái)測(cè)定，其中IgE固定化到板上，將加標(biāo)記的(tagged)或標(biāo)記的(labelled)第一結(jié)合成員連同一個(gè)或多個(gè)其他未力口標(biāo)記的(untagged)或未標(biāo)記的(unlabelled)結(jié)合成員加到該才反。能與力口標(biāo)記的結(jié)合成員竟?fàn)幍奈醇訕?biāo)記的竟?fàn)幊蓡T，其存在由加標(biāo)記的結(jié)合成員所發(fā)射的信號(hào)的減少來(lái)觀察到。例如，本發(fā)明包括鑒定IgE結(jié)合化合物的方法，所述方法包括(i)將IgE固定化到載體，(ii)使所述固定化IgE同時(shí)或以逐步方式與至少一個(gè)加標(biāo)記的或標(biāo)記的本發(fā)明結(jié)合成員和一個(gè)或多個(gè)未加標(biāo)記的或未標(biāo)記的受試結(jié)合化合物接觸，和(iii)通過(guò)觀察來(lái)自加標(biāo)記的結(jié)合成員的結(jié)合標(biāo)記(boundtag)的量的減少，來(lái)鑒定出新的IgE結(jié)合化合物。這種方法可用多孔板(multiwell)或陣列形式以高通量方式進(jìn)行。這種測(cè)定還可在溶液中進(jìn)行。參見(jiàn)例如U.S.5,814,468，該專利通過(guò)引用全文并入本文。如上所述，對(duì)結(jié)合的檢測(cè)可由執(zhí)行該方法的人員直接闡釋，例如通過(guò)目測(cè)觀察可檢測(cè)標(biāo)記或者標(biāo)記存在量的減少來(lái)闡釋。或者，本發(fā)明的結(jié)合方法可以如下形式產(chǎn)生4艮告放射自顯影圖、照片、計(jì)算機(jī)打印輸出、流式細(xì)胞術(shù)報(bào)告、圖(graph)、圖表(chart)、含有結(jié)果的試管或容器或孔(well),或者該方法的結(jié)果的任何其他可視或物理表示法。竟?fàn)幮詼y(cè)定還可用于表位作圖。在一個(gè)例子中，可用表位作圖來(lái)鑒定被任選可具有優(yōu)化的中和和/或調(diào)節(jié)特性的IgE結(jié)合成員所結(jié)合的表位。這種表位可以是線性的或者有構(gòu)象的。構(gòu)象表位可包含IgE的至少兩個(gè)不同片段，其中所述片段在IgE折疊成其三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)而形成可被IgE抑制劑如IgE結(jié)合成員識(shí)別的構(gòu)象表位時(shí)，被定位成互相靠近在一起。在試驗(yàn)竟?fàn)幥闆r時(shí)，可采用抗原的肽片段，特別是包括目的表位或者基本上由目的表位組成的肽?？墒褂镁哂斜砦恍蛄屑由显谌我荒┒擞幸粋€(gè)或多個(gè)氨基酸的肽。本發(fā)明的結(jié)合成員可以是，其對(duì)抗原的結(jié)合可被具有或包括給定序列的肽所抑制。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼本發(fā)明結(jié)合成員的分離核酸。核酸可包括DNA和/或RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼如上定義的本發(fā)明CDR或一組CDR或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體分子如scFv或IgGl的核酸。本發(fā)明還提供包含至少一個(gè)如上所述多核苷酸的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄盒或表達(dá)盒形式的構(gòu)建物。本發(fā)明還提供包含一個(gè)或多個(gè)如上所述的構(gòu)建物的重組宿主細(xì)胞。編碼本發(fā)明所提供的任何CDR或一組CDR或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn)或抗體分子如scFv或IgGl的核酸，其本身構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面，而產(chǎn)生編碼產(chǎn)物的方法也構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面，所述方法包括從編碼核酸進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)可便利地通過(guò)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)含有核酸的重組宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)后，化，然后加以適當(dāng)使用。本發(fā)明的核酸可包含DNA或RNA，且可以是完全或部分合成的。若提到本文所給出的核苷S殳序列，則涵蓋具有指定序列的DNA分子，和涵蓋具有其中U置換T的指定序列的RNA分子，除非上下文另有要求。-又一方面是提供產(chǎn)生抗體VH可變結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括引起從編碼核酸的表達(dá)。這種方法可包括在用于生產(chǎn)所述抗體VH可44變結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。作為本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，提供了用于生產(chǎn)VL可變結(jié)構(gòu)域以及包含VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員的類似方法。生產(chǎn)方法可包括分離和/或純化產(chǎn)物的步驟。生產(chǎn)方法可包括將產(chǎn)物配制成包括至少一種另外的成分如藥物可接受賦形劑的組合物。用于在多種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是7>知的。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、絲狀真菌、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物?？贵w和抗體片段在原核細(xì)胞中的表達(dá)是本領(lǐng)域已確立的。有關(guān)綜述參見(jiàn)例如Pmckthun[參考文獻(xiàn)60]。通用的細(xì)菌宿主是大腸桿菌(Eco/z')。在培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞中的表達(dá)，也可作為生產(chǎn)結(jié)合成員的可選方法供本領(lǐng)域技術(shù)人員^f吏用[參考文獻(xiàn)61，62,63]。本領(lǐng)域可供用來(lái)表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、NS0小鼠黑素瘤細(xì)胞、YB2/0大鼠黑素瘤細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞、人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞和許多其他細(xì)胞。合適的載體可進(jìn)行選擇或構(gòu)建，含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其他視所需而定的序列。載體纟見(jiàn)所需而定可以是質(zhì)粒如噬菌?；蛘卟《救缡删w[參考文獻(xiàn)64]。在Ausubel等人[參考文獻(xiàn)65]中，詳細(xì)描述了許多已知的用來(lái)操縱核酸和分析蛋白質(zhì)的技術(shù)和方案，所述操縱核酸例如是制備核酸構(gòu)建物、誘變、測(cè)序、將DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中及基因表達(dá)。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供含有本文所公開(kāi)的核酸的宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞可以是體外的和可以是在培養(yǎng)物中的。這種宿主細(xì)胞可以是體內(nèi)的。宿主細(xì)胞的體內(nèi)存在可使得本發(fā)明的結(jié)合成員作為"胞內(nèi)抗體，，或者說(shuō)細(xì)胞內(nèi)部的抗體進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)。胞內(nèi)抗體可用于基因治療。本發(fā)明再一個(gè)方面提供這樣的方法，它包括將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。導(dǎo)入可采用任何可用的技術(shù)進(jìn)行。對(duì)于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和用反轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒(例如牛痘，或者對(duì)于昆蟲(chóng)細(xì)胞用桿狀病毒)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。將核酸導(dǎo)入在宿主細(xì)胞特別是真核細(xì)胞中，可使用基于病毒或質(zhì)粒的系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可以附加型形式保持，或者可摻入到宿主細(xì)胞中或者摻入到人工染色體中。摻入可通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)拷貝隨機(jī)或定向整合在單個(gè)或多個(gè)基因座來(lái)進(jìn)行。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和用噬菌體轉(zhuǎn)染。導(dǎo)入后，接著例如通過(guò)在適于基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，來(lái)引起或允許從核酸的表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物的純化可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的核酸可整合到宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。可通過(guò)按標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)添加能促進(jìn)與基因紐的重組的序列，來(lái)促進(jìn)整合。本發(fā)明還提供這樣的方法，它包括在表達(dá)系統(tǒng)中使用如上所述的構(gòu)建物，以表達(dá)上述的結(jié)合成員或多肽。本發(fā)明的結(jié)合成員可用于診斷或治療人或動(dòng)物受試者特別是人的方法中。IgE結(jié)合成員可用來(lái)治療以IgE介導(dǎo)的生物效應(yīng)為特征的病恙，特別是過(guò)敏癥和哮喘。例如，本發(fā)明的結(jié)合成員可用來(lái)治療過(guò)敏性鼻炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏反應(yīng)、食物過(guò)敏、蕁麻瘆、炎性腸病、嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎、藥源性皮疹、過(guò)敏性眼病或過(guò)敏性結(jié)膜炎。粒，減少FcsRl介導(dǎo)的體內(nèi)或體外生物應(yīng)答，以及減少人或動(dòng)物患者中的循環(huán)IgE。因此，本發(fā)明提供抑制哺乳動(dòng)物中過(guò)敏原引起的肥大細(xì)胞脫粒的方法，所述方法包括將本發(fā)明的結(jié)合成員，例如抗體、VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域，以足以中和IgE的量給予所述哺乳動(dòng)物。本發(fā)明還提供減少FcsRI-生物應(yīng)答并有或沒(méi)有同時(shí)減少FcsRII46介導(dǎo)的生物應(yīng)答的作用的方法，所述方法包括使表達(dá)FcsRI和/或FcsRII的細(xì)胞與本發(fā)明的結(jié)合成員，例如抗體、VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域，在IgE的存在下進(jìn)行接觸。本發(fā)明還提供減少Fc必i/介導(dǎo)的生物應(yīng)答并有或沒(méi)有同時(shí)減少FcERII介導(dǎo)的生物應(yīng)答的作用的方法，所述方法包括使表達(dá)FcsRI和/或FcsRII的細(xì)胞與本發(fā)明的結(jié)合成員，例如抗體、VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域，在IgE的存在下進(jìn)行接觸。當(dāng)試驗(yàn)細(xì)胞與本發(fā)明的結(jié)合成員在體外接觸時(shí)，還可將對(duì)照細(xì)胞用于陽(yáng)性對(duì)照(例如不含結(jié)合成員的反應(yīng))和/或陰性對(duì)照(例如不含IgE和/或抗原的反應(yīng))。當(dāng)細(xì)胞在體內(nèi)被結(jié)合成員接觸時(shí)，例如通過(guò)將本發(fā)明的結(jié)合成員給予顯示FcsRI和/或FcsRII介導(dǎo)的生物應(yīng)答的哺乳動(dòng)物來(lái)進(jìn)行接觸時(shí)，本發(fā)明的結(jié)合成員是以足以中和IgE的量給予。此外，本發(fā)明還提供減少哺乳動(dòng)物如人中的循環(huán)IgE的方法，所述方法包括將本發(fā)明的結(jié)合成員，例如抗體、VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域，以足以中和和減少循環(huán)游離1gE的量給予。種或多種疾病或病恙過(guò)4文性鼻炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏反應(yīng)、食物過(guò)敏、蕁麻滲、炎性腸病、嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎、藥源性皮滲、過(guò)敏性眼病、鼻結(jié)膜炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、支氣管哮喘、氣道高反應(yīng)性、化妝品過(guò)敏、藥源性過(guò)敏、藥源性超敏性綜合癥、金屬過(guò)敏、職業(yè)性超敏性肺炎、慢性超敏性肺炎、冷超敏性、蠕蟲(chóng)感染引起的超敏性、乳膠過(guò)敏和枯草熱。本文針對(duì)IgE的結(jié)合和中和所給出的數(shù)據(jù)因此表明，本發(fā)明的結(jié)合成員可用來(lái)治療或預(yù)防這些病恙，包括減輕病恙的嚴(yán)重性。因此，本發(fā)明提供治療或減少任何本文所述病恙的至少一個(gè)癥狀的嚴(yán)重性的方法，所述方法包括將有效量的一種或多種本發(fā)明結(jié)合成員單獨(dú)地或者在與本領(lǐng)域知道的或本文所述的另一適當(dāng)藥物的組合治療方案47中，給予有需要的患者，使得任何上述病恙的至少一個(gè)癥狀的嚴(yán)重性得到減少。本發(fā)明的結(jié)合成員可用于適當(dāng)?shù)膭?dòng)物和用于疾病的動(dòng)物模型特別是猴子中。因此，本發(fā)明的結(jié)合成員可在涉及IgE,例如IgE產(chǎn)生、表達(dá)和/或活性特別是異常產(chǎn)生、表達(dá)或活性的疾病或病恙的治療中用作治療劑。治療方法可包括將有效量的本發(fā)明結(jié)合成員給予有需要的患者，其中IgE的產(chǎn)生、表達(dá)和/或活性因此得到降低。治療方法可包括(i)例如使用上述的診斷方法，鑒定出顯示IgE水平或活性提高的患者，和(ii)將有效量的本發(fā)明結(jié)合成員給予該患者，其中IgE的提高的產(chǎn)生、表達(dá)和/或活性得到降低。另選的治療方法可包括(i)鑒定出IgE水平?jīng)]有明顯提高、但據(jù)認(rèn)為能受益于本發(fā)明IgE的給予的患者，和(ii)將有效量的本發(fā)明結(jié)合成員給予該患者。本發(fā)明的有效量，是能降低IgE的提高的產(chǎn)生、表達(dá)和/或活性，從而降低或減輕所治療的特定疾病或病恙的至少一個(gè)癥狀的嚴(yán)重性，^^未必治愈該疾病或病恙的這么一個(gè)量。本發(fā)明還提供拮抗IgE的至少一個(gè)效應(yīng)的方法，所述方法包括接觸或給予有效量的一種或多種本發(fā)明結(jié)合成員，使得IgE的所述至少一個(gè)效應(yīng)得到拮抗?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明方法拮抗的IgE效應(yīng)，包括FcsRI和/或FcsRII介導(dǎo)的生物應(yīng)答，和因?yàn)檫@些結(jié)合反應(yīng)而出現(xiàn)的任何下游效應(yīng)》因此，本發(fā)明的更多方面提供本發(fā)明的分離結(jié)合成員，如抗體、VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域用于制造供治療如本文所討論與IgE有關(guān)或由IgE介導(dǎo)的病恙的藥物的用途。藥物或藥物組合物的這種用途或制造方法，包括將結(jié)合成員與藥物可接受的賦形劑進(jìn)行配制。藥物可接受的賦形劑可以是這樣的化合物或者化合物的組合，它進(jìn)入到藥物組合物中，但沒(méi)有引起次生反應(yīng)，能例如促進(jìn)活性化合物的給予、提高活性化合物在體內(nèi)的有效期和/或功效、提高活性化合物在溶液中的溶解度，或者改善活性化合物的保存。這些藥物可接受的介質(zhì)是公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)根據(jù)所選的活性化合物的性質(zhì)和給予方式進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的結(jié)合成員通常會(huì)以藥物組合物的形式給予，該藥物組合物除了結(jié)合成員外還可包含至少一種成分。因此，根據(jù)本發(fā)明且供按本發(fā)明使用的藥物組合物，除了活性成分外，還可包含藥物可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他材料。這些材料應(yīng)當(dāng)是無(wú)毒的，不應(yīng)干擾活性成分的功效。載體或其他材料的明確性質(zhì)要取決于給予途徑，給予途徑如下所述可以是口服、吸入、氣管內(nèi)、局部、嚢內(nèi)給予或注射給予。本發(fā)明也設(shè)想到了供口服給予的藥物組合物，例如單結(jié)構(gòu)域抗體分子(例如"nanobodiesTM")等。這種口服制劑可以為片劑、膠嚢劑、散劑、液體劑或半固體劑形式。片劑可包含固體載體，如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包含液體載體，如水、石油、動(dòng)物或植物油、礦物油或合成油。可包括生理鹽水溶液、右旋糖或其他糖'溶液或二醇，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。對(duì)于靜脈內(nèi)注射或者在患病部位的注射，活性成分將是無(wú)熱原且具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性的胃腸外可接受水溶液的形式。本領(lǐng)域具有相關(guān)技能的人員完全有能力用例如等滲介質(zhì)制備出合適的溶液，如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液?？砂葱钁?yīng)用防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑，包括緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，如抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二曱基節(jié)基氯化銨、六曱氯銨、苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；對(duì)羥基苯曱酸烷基酯，如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或?qū)αu基苯曱酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3，-戊醇；和間曱酚)；低分子量多肽；蛋白質(zhì)，如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化49合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA;糖類，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反荷離子，如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，如TWEENTm、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。視分子的理化性質(zhì)和遞送途徑而定，本發(fā)明的結(jié)合成員可以以液體、半固體或固體形式配制。制劑可包括賦形劑或賦形劑的組合，例如糖類、氨基酸和表面活性劑。液體制劑可包括^f艮寬范圍的抗體濃度和pH。固體制劑可例如通過(guò)冷凍干燥、噴霧干燥或超臨界流體技術(shù)進(jìn)行的干燥來(lái)產(chǎn)生?？笽gE的制劑要取決于預(yù)定的遞送途徑例如，肺部遞送制劑可由具有能確保在吸入時(shí)滲入肺部深處的物理性質(zhì)的顆粒組成；局部制劑(例如用于治療疤痕，如皮膚疤痕)可包括能延長(zhǎng)藥物停留在作用部位的時(shí)間的稠度調(diào)節(jié)劑。結(jié)合成員可用能保護(hù)結(jié)合成員不被快速釋放的載體制備，如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到?、生物相容性的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、月交原、聚原酸酯和聚乳酸。許多制備這些制劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的[參考文獻(xiàn)66]?？笽gE治療可口服給予(如單結(jié)構(gòu)域抗體分子(例如"nanobodies")),注射給予(例如皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射)，吸入給予，氣管內(nèi)給予，嚢內(nèi)途徑給予(滴注到膀胱)，或者局部給予(例如眼內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸內(nèi)、傷口內(nèi)、皮膚上)。治療可通過(guò)脈沖式灌注來(lái)給予，特別是以結(jié)合成員劑量逐漸減低的方式灌注。給予途徑可由治療的理化特性、由對(duì)疾病的特殊考慮或者由優(yōu)化功效或使副作用減至最低的要求來(lái)決定。一個(gè)特定的給予途徑是靜脈內(nèi)給予。另一個(gè)給予本發(fā)明藥物組合物的途徑是皮下給予。設(shè)想到，抗IgE治療不會(huì)局限于臨床使用。因此，使用無(wú)針頭裝置進(jìn)行的皮下注射也是有利的。靜脈內(nèi)制劑的實(shí)例包括制劑(i:i包含本發(fā)明的分離結(jié)合成員(任選10、50、100或150mg/ml的所述結(jié)合成員，例如抗體)50mM乙酸鈉lOOmMNaClpH5.5制劑C2)包含本發(fā)明的分離結(jié)合成員(任選10、50、IOO或150mg/ml的所述結(jié)合成員，例如抗體)20mM琥珀酸鹽105mMNaCl10mM精氨酸pH6.00組合物可以單獨(dú)給予或者與其他治療法組合給予，組合給予時(shí)視所要治療的病癥而定同時(shí)給予或依次給予。IgE的結(jié)合成員可用作與另外的醫(yī)藥成分聯(lián)用的組合療法的一部分。組合治療可用來(lái)提供顯著的協(xié)同作用，特別是抗IgE結(jié)合成員與一種或多種其他藥物的組合。IgE的結(jié)合成員可與另一治療劑或幾種治療劑同時(shí)地或者依次地或者作為組合制劑進(jìn)行給予，以治療一種或多種本文所列的病癥。本發(fā)明的結(jié)合成員可與其他可用的針對(duì)哮喘和過(guò)敏性疾病或其他涉及IgE介導(dǎo)效應(yīng)的病恙的治療法進(jìn)行聯(lián)合配制和/或使用。本發(fā)明的結(jié)合成員可與一種或多種以下藥劑組合提供，或者提供本發(fā)明的結(jié)合成員時(shí)另外提供一種或多種以下藥劑-細(xì)胞因子或者細(xì)胞因子功能的激動(dòng)劑或拮抗劑(例如作用于細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的藥劑，如SOCS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑)，如a-,(3-和/或？干擾素；胰島素樣生長(zhǎng)因子I型(IGF-1),其受體和相關(guān)結(jié)合蛋白；白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1至33中的一個(gè)或多個(gè)，和/或白細(xì)胞介素拮抗劑或抑制劑，如阿那白滯素(anakinra);白細(xì)胞介素家族成員的受體的抑制劑或者這種受體的特異性亞單位的抑制劑，腫瘤壞死因子a(TNF-oc)抑制劑，如抗TNF單克隆抗體(例如英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗和/或CDP-870)和/或TNF受體拮抗劑，例如免疫球蛋白分子(如依那西普)和/或低分子量藥劑，如已酮可可豆堿；-B細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑，例如靶向B淋巴細(xì)胞(如CDM(利妥昔單抗)或MRA-alL16R)或者T淋巴細(xì)胞(例如CTLA4-Ig、HuMax11-15或Abatacept)的單克隆抗體；-抑制破骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)劑，例如抗RANXL抗體；-趨化因子或趨化因子受體功能的調(diào)節(jié)劑，如CCR1、CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO和CCRll(對(duì)于C-C家族)；CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4和CXCR5和CXCR6(對(duì)于C-X-C家族)和CX3CR1(對(duì)于C-X3-C家族)的拮抗劑;-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的抑制劑，例如多西環(huán)素之類的藥劑，所述酶即以下酶中的一個(gè)或多個(gè)溶基質(zhì)素、膠原酶和明膠酶以及聚集蛋白聚糖酶，特別是膠原酶-1(MMP-1)、膠原酶-2(MMP-8)、膠原酶-3(MMP-13)、溶基質(zhì)素-1(MMP-3)、溶基質(zhì)素-2(MMP-10)和/或溶基質(zhì)素-3(MMP-11)和/或MMP-9和/或MMP-12;-白三烯生物合成抑制劑、5-脂肪加氧酶(5-LO)抑制劑或5-脂肪加氧酶激活蛋白(FLAP)拮抗劑，如齊留通；ABT-761;芬留頓；替泊沙林；Abbott-79175;Abbott-85761;N-(5-取代)-漆吩-2-烷基磺酰胺；2，6-二叔丁基苯腙；曱氧基四氫吡喃如ZenecaZD-2138;化合物SB-210661;吡咬基取代的2-氰基萘化合物，如L-739,010;2-氰基唾啉化合物，如L-746，530;巧l哚和/或喹啉化合物，如MK-591、MK-886和/或BAYx1005;畫白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4的受體拮抗劑，選自吩p塞溱-3畫ls,如L-651,392;脒基化合物，如CGS腸25019c;benzoxalamine，如昂唑司特；苯曱脒，如BIIL284/260;和諸如以下的化合物扎魯司特、阿魯司特、孟魯司特、普侖司特、維魯司特(MK-679)、RG-12525、Ro畫245913、伊拉司特(CGP45715A)和BAYx7195;-磷酸二酯酶(PDE)抑制劑，如曱基黃噤呤(methykanthanine),例如茶堿和/或氨茶石咸；和/或選擇性PDE同工酶抑制劑，例如PDE4抑制劑和/或同種型PDE4D的抑制劑和/或PDE5的抑制劑；-組胺l型受體拮抗劑，如西替利嗪、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿伐斯汀、特非那定、阿司咪唑、氮卓斯汀、左卡巴斯汀、氯苯那敏、異丙嗪、賽克力嗪和/或咪唑斯汀(通?？诜?、局部或胃腸外應(yīng)用)。-質(zhì)子泵抑制劑(如奧美拉唑)或胃保護(hù)性組胺2型受體拮抗劑；-組胺4型受體的拮抗劑；-ot-l/oc-2腎上腺素受體激動(dòng)劑血管收縮劑擬交感神經(jīng)劑，如六氬脫氧麻黃堿、苯腎上腺素、苯丙醇胺、麻黃堿、偽麻黃堿、鹽酸萘甲唑啉、鹽酸羥甲唑啉、鹽酸四氬唑啉、鹽酸賽洛唑啉、鹽酸萘胺唑啉和鹽酸乙諾那林；-抗膽堿能劑，例如毒蕈堿性受體(M1、M2和M3)拮抗劑，如阿托品、東t菪堿、格隆銨、異丙托溴銨、噻托溴銨、氧托溴銨、哌侖西平和替侖西平；-卩-腎上腺素受體激動(dòng)劑(包括(3受體亞型1-4)，如異丙腎上腺素、沙丁胺醇、福莫特羅、沙美特羅、特布他林、奧西那林、曱磺酸比托特羅和/或吡布特羅，例如它們的手性對(duì)映異構(gòu)體；-色酮，例如色甘酸鈉和/或奈多羅米納；-糖皮質(zhì)類固醇，如氟尼縮松、曲安萘德、二丙酸倍氯米松、布地奈德、丙酸氟替卡松、環(huán)索奈德和/或糠酸莫米松；-調(diào)節(jié)核激素受體的藥劑，如PPAR;-免疫球蛋白(Ig)或Ig制品或者調(diào)節(jié)Ig功能的拮抗劑或抗體，如其所結(jié)合的表位與本發(fā)明結(jié)合成員相同或不同的抗IgE;-其他全身應(yīng)用或局部應(yīng)用的抗炎劑，例如沙利度胺或其衍生物、類視色素、地蒽酚和/或卡泊三醇；-對(duì)氨基水楊酸和磺胺吡啶的組合，如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪、巴柳氮和奧沙拉嗪；和免疫調(diào)節(jié)劑，如硫嘌呤；和皮質(zhì)類固醇，如布地奈德；畫抗細(xì)菌劑，例如青霉素彩亍生物、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、(3-內(nèi)酰胺、氟p奎諾酮、曱硝唑和/或吸入的氨基糖苷；和/或抗病毒劑，例如阿昔洛韋、泛昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋、金剛烷胺、金剛乙胺；利巴韋林；扎那米韋和/或奧司他韋；蛋白酶抑制劑，如茚地那韋、奈非那韋、利托那韋和/或沙奎那韋；核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如去羥肌苷、拉米夫定、司他夫定、扎西他濱、齊多夫定；非核苦反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，如奈偉拉平、依法韋侖；-心血管劑，如鉤通道阻斷劑、p-腎上腺素受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑、血管緊張素-2受體拮抗劑；降脂劑，如抑制素和/或fibmte;血細(xì)胞形態(tài)的調(diào)節(jié)劑，如已酮可可豆堿；溶解血栓劑和/或抗凝劑，例如血小板聚集抑制劑；-CNS劑，如抗抑郁劑(如舍曲林)、抗帕金森病藥物(如立司吉林(deprenyl)、L-多巴、羅匹尼羅、普拉克索；MAOB抑制劑,如司立吉林和雷沙吉林；comP抑制劑，如托卡朋(tasmar);A-2抑制劑、多巴胺重?cái)z取抑制劑、NMDA拮抗劑、煙堿、尼古丁激動(dòng)劑和/或神經(jīng)元氧化氮合酶的抑制劑)和抗阿爾茨海默病藥物，如多奈哌齊、利凡斯的明、他克林、COX-2抑制劑、丙戊茶堿或美曲膦酯；-治療急性和慢性疼痛的藥劑，例如作用于中樞系統(tǒng)或外周系統(tǒng)的止痛劑，如阿片類似物或衍生物、卡巴米。秦、苯妥英、丙戊酸鈉、amitryptiline或其它抗抑郁劑、樸熱息痛或非甾體抗炎藥；-胃腸外或局部應(yīng)用的(包括吸入)局部麻醉劑，如利諾卡因或其類54似物；-抗骨質(zhì)疏松劑，例如激素劑，如雷洛昔芬，或者二膦酸鹽，如阿侖膦酸；-(i)類胰蛋白酶抑制劑；(ii)血小板激活因子(PAF)拮抗劑；(iii)白細(xì)胞介素轉(zhuǎn)換酶(ICE)抑制劑；(iv)IMPDH抑制劑；(v)黏著分子抑制劑，包括VLA-4拮抗劑；(vi)組織蛋白酶；(vii)激酶抑制劑，例如以下激酶的抑制劑酪氨酸激酶(如Btk、Itk、Jak3MAP,抑制劑的實(shí)例可包括吉非替尼、甲磺酸伊馬替尼)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(例如MAP激酶如p38、JNK、蛋白激酶A，B和C及IKK的抑制劑)，或者參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的激酶(例如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脫氫酶抑制劑；(ix)激肽B.subl.-和/或B.sub2.-受體拮抗劑；(x)抗痛風(fēng)劑，例如秋水仙》威；(xi)黃嘌呤氧化酶抑制劑，例如別噪醇；(xii)促尿酸尿劑，例如丙磺舒、磺吡酮和/或苯溴馬??；(xiii)生長(zhǎng)激素促分泌素；(xiv)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFP);(xv)血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF);(xvi)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF);(xvii)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF);(xviii)辣椒素軟膏；(xix)速激肽NK.subl.和/或NK.sub3.受體拮抗劑，如NKP-608C、SB-233412(他奈坦)和/或D-4418;(xx)彈性蛋白酶抑制劑，例如UT-77和/或ZD-0892;(xxi)TNF-a轉(zhuǎn)換酶抑制劑(TACE);(xxii)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抑制劑或者(xxiii)在TH2細(xì)胞上表達(dá)的化學(xué)引誘物受體同源物分子(如CRTH2拮抗劑)；(xxiv)P38的抑制劑；(xxv)調(diào)節(jié)Toll樣受體(TLR)的功能的藥劑和(xxvi)調(diào)節(jié)嘌呤能受體的活性的藥劑，如P2X7;(xxvii)轉(zhuǎn)錄因子激活的抑制劑，如NPkB、API和/或STATS。抑制劑可以是特異性的，或者可以是混合抑制劑，例如靶向超過(guò)一個(gè)上述分子(例如受體)或分子類別的抑制劑。結(jié)合成員還可與化學(xué)治療劑如酪氨酸激酶抑制劑if關(guān)合，以共給予或免疫綴合物的形式使用。所述抗體的片段還可用于通過(guò)重組機(jī)制或生化偶if關(guān)獲得的雙特異性抗體，然后將上述抗體的特異性與其他能夠識(shí)別參與涉及IgE的活性的其他分子的抗體的特異性相關(guān)聯(lián)。對(duì)于治療炎性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、過(guò)敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(COPD)或牛皮癬，可將本發(fā)明的結(jié)合成員與一種或多種藥劑進(jìn)行組合，例如非甾體抗炎藥劑(下文稱NSAIDs)，包括非選擇性環(huán)氧合酶(COX)-l/COX-2抑制劑，不管是局部應(yīng)用還是全身應(yīng)用，如吡羅昔康、雙氯芬酸、丙酸如萘普生、氟比洛芬、非諾洛芬、酮洛芬和布洛芬、芬那酸如曱芬那酸、巧l。朵美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑啉酮如苯基丁氮酮、水楊酸如阿司匹林)；選擇性COX-2抑制劑(如美洛昔康、塞來(lái)考昔、羅非考昔、伐地考昔、lumarocoxib、帕瑞考昔和依托考昔)；環(huán)氧合酶抑制性氧化氮供體(cyclo-oxygenaseinhibitingnitricoxidedonors，CINODs);4唐皮質(zhì)類固醇(不管通過(guò)局部、口服、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)還是關(guān)節(jié)內(nèi)途徑)；曱氨喋呤、來(lái)氟米特；羥氯喹、d-青霉胺、金諾芬(auranofm)或其他胃腸外或口服金制品；止痛劑；雙醋瑞因；關(guān)節(jié)內(nèi)治療，如透明質(zhì)酸衍生物；和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物如葡糖胺。本發(fā)明的結(jié)合成員和一種或多種上述的另外醫(yī)藥成分可用于藥物的制造中。藥物可供單獨(dú)或組合給予個(gè)體，因此可包含結(jié)合成員和另外成分作為組合制品或作為單獨(dú)制品。單獨(dú)制品可用來(lái)幫助單獨(dú)的和依次的或同時(shí)的給予，使得各成分可通過(guò)不同的途徑來(lái)給予，例如口服和胃腸外給予。根據(jù)本發(fā)明，可將所提供的組合物給予哺乳動(dòng)物。給予通常是以"治療有效量，，給予，這足以顯示對(duì)患者的好處。這種好處可以至少是至少一種癥狀的改善。實(shí)際的給予量、給予的速度和時(shí)程，要取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性、所治療的具體哺乳動(dòng)物、患者個(gè)體的臨床狀況、病恙的原因、組合物的遞送部位、結(jié)合成員的類型、給予方法、給予時(shí)序安排和執(zhí)業(yè)醫(yī)生知道的其他因素。治療的處方，例如有關(guān)劑量等的決定，是在一般執(zhí)業(yè)者和其他醫(yī)師的責(zé)任范圍內(nèi)，可根據(jù)癥狀的嚴(yán)重性和/或所治療疾病的進(jìn)展而定?？贵w的適當(dāng)劑量是本領(lǐng)域公知的[參考文獻(xiàn)67,68]?？梢允褂帽疚闹谢蛘逷hysician'sDeskReference(2003)中所指明的對(duì)所給予的藥物的類型適當(dāng)?shù)木唧w劑量。本發(fā)明結(jié)合成員的治療有效量或合適劑量，可通過(guò)在動(dòng)物模型中比較其體外活性和體內(nèi)活性來(lái)確定。將小鼠和其他試驗(yàn)動(dòng)物中的有效劑量外推到人類的方法是公知的。精確的劑量要取決于多個(gè)因素，包括抗體是用于診斷、預(yù)防還是用于治療、要治療的區(qū)域的大小和位置、抗體的準(zhǔn)確性質(zhì)(例如完全抗體、片段或雙抗體)和任何可才企測(cè)標(biāo)記或與抗體連接的其他分子的性質(zhì)。典型的抗體劑量，對(duì)于全身應(yīng)用而言會(huì)在100pg-lg的范圍，對(duì)于局部應(yīng)用而言在1嗎-1mg的范圍。一開(kāi)始可給予較高的負(fù)荷劑量(loadingdose),然后給予一個(gè)或多個(gè)較低的劑量。通常，抗體將是完全抗體，例如IgGl同種型、IgG2同種型、IgG3同種型或IgG4同種型。這是對(duì)于成人患者的單次治療的劑量，對(duì)于兒童和嬰兒可按比例調(diào)整，對(duì)于其他抗體形式也可按分子量比例調(diào)整。治療可由醫(yī)生處置，按每日一次、每周兩次、每周一次或每月一次的時(shí)間間隔重復(fù)進(jìn)行。治療可以是對(duì)于皮下給予而言每?jī)傻剿闹苓M(jìn)行，對(duì)于靜脈內(nèi)給予而言每四到八周進(jìn)行。治療可以是周期性的，各次給予之間的時(shí)間為約兩周或更長(zhǎng)時(shí)間，例如約三周或更長(zhǎng)時(shí)間，約四周或更長(zhǎng)時(shí)間，或者約一個(gè)月。治療可以在手術(shù)之前和/或之后給予，和/或可以直接在手術(shù)治療的解剖部位給予或應(yīng)用。表格和附圖的簡(jiǎn)述表1列出抗體1-28中每一個(gè)抗體的重鏈CDR和輕鏈CDR的氨基酸序列。表2a顯示在受體-配體結(jié)合HTRF⑧測(cè)定法中試驗(yàn)時(shí)從定向誘變文庫(kù)鑒定的克隆的示例性效價(jià)。表2b顯示用SPR(BIACORE)獲得的示例性的本發(fā)明結(jié)合成員與人IgE和食蟹猴IgE的結(jié)合親和力(KD)。表2b進(jìn)一步顯示示例性的本發(fā)明結(jié)合成員在RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定(25ng/ml人或100ng/ml食蟹猴IgE,在4小時(shí)時(shí))中的效價(jià)，以IC50表示。列，序列表中的SEQIDNO與表3a中所示的對(duì)應(yīng)。表3b顯示所附序列表中所示的、來(lái)自臨時(shí)申請(qǐng)的示例性的本發(fā)明結(jié)合成員的VLDNA和VL氨基酸序列，序列表中的SEQIDNO與表3b中所示的對(duì)應(yīng)。表4.種系化抗體用BIAcore得到的示例性結(jié)合親和力計(jì)算值和用RBL-ER51鉤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定法得到的效價(jià)測(cè)量值。表5顯示在對(duì)相互作用1的X射線晶體學(xué)研究中IgECs3-Cs4和抗體11Fab之間的直接相互作用。表6顯示在對(duì)相互作用2的X射線晶體學(xué)研究中IgECs3-Cs4和抗體11Fab之間的直接相互作用。表7顯示X射線晶體學(xué)研究的晶體參數(shù)和X射線數(shù)據(jù)處理和精確統(tǒng)計(jì)(RefinementStatistics)。表8顯示安全性研究中的研究設(shè)計(jì)概要(實(shí)施例8)。圖1代表實(shí)施例2.7,在x軸上顯示以log表示的抗體摩爾濃度，在y軸上顯示在RBL-ER51釣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定中的峰高。空心正方形指抗體ll，十字號(hào)指不相關(guān)的IgGl對(duì)照抗體，空心倒三角形指抗IgE交if關(guān)抗體(Biosource)。注意在本圖中空心正方形和十字號(hào)互相重疊。圖2顯示食蟹猴Cs3-4FLAGHislO的序列。圖3顯示編碼人抗雌二醇scFv(D12J/H)和食蟹猴IgHE基因單元型(hapIotype)之一(cylgHETQ)的可變重鏈的序列。圖4顯示編碼人抗雌二醇scFv(D12—VH)和食蟹猴IgHE基因單元型之一(cylgHEME)的可變重鏈的序列。圖5顯示人抗雌二醇scFv(D12一VL)和食蟹猴人恒定區(qū)基因cylGLC4的可變輕鏈的序列，序列范圍1-708。58圖6顯示人抗雌二醇scFv(D12—VL)和食蟹猴、恒定區(qū)基因cyIGLC7的可變輕鏈的序列。圖7涉及實(shí)施例3,顯示在沒(méi)有用封閉性抗IgE處理的B細(xì)胞中最大IgE表達(dá)的抑制百分?jǐn)?shù)，其中x軸是抗體11的濃度(nM)，y軸是抑制百分?jǐn)?shù)。上曲線指抗體ll,下曲線指對(duì)照抗體。圖8涉及實(shí)施例4,顯示(3己糖胺酶的總釋放的抑制百分?jǐn)?shù)+/-SEM,其中x軸是抗體11的濃度(nM),y軸是抑制百分?jǐn)?shù)。上曲線指抗體ll,下曲線指對(duì)照抗體。圖9涉及實(shí)施例5。該圖顯示隨著抗IgE抗體即抗體11的濃度的提高，人血清中結(jié)合的IgE的百分?jǐn)?shù)。x軸表示抗體11的濃度(微克/ml),y軸顯示結(jié)合的IgE的量(以作為總IgE的函數(shù)分析和作圖的游離IgE的百分?jǐn)?shù)表示)。圖10涉及實(shí)施例7，顯示a)IgECs3-Cs4二聚體的帶狀顯示圖(ribbonrepresentation)，其中兩個(gè)單體示為igEl和lgE2，與兩個(gè)抗體11Fab分子發(fā)生相互作用。Asn394處的糖基化以球棍模型顯示；和b)90。旋轉(zhuǎn)俯視圖，顯示出來(lái)自Fab片段的與IgE的相互作用大部分是由重鏈提供。該圖是用PyMOL程序(DeLanoScientificLLC,SanCarlos，California,U.S.A)產(chǎn)生。圖11涉及實(shí)施例7，顯示IgE的位置Asn394處的糖基化。圖12涉及實(shí)施例8,顯示抗體11IgG?？贵w11IgGz和E48在食蟹猴中投與1mg/kg(第1天)、30mg/kg(第8天)和100mg/kg(第16天及以后)劑量后的平均毒性動(dòng)力學(xué)曲線。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。y軸是抗體的血清濃度，x軸是第一次投與后的時(shí)間(天數(shù))。組l(抗體11IgG1)用實(shí)心圓圏表示，組2(抗體11IgG2)用空心三角形表示，組3(另外的抗IgE分子E48)用實(shí)心正方形表示。圖13涉及實(shí)施例8,顯示每周投與抗體11IgG,、抗體11IgG2和E48(第1天1mg/kg、第8天30mg/kg和第16天及以后100mg/kg)方形表示。圖14涉及實(shí)施例8，顯示組1動(dòng)物(用抗體11處理)的血小板數(shù)目(x109/L,以相對(duì)于2個(gè)投與前數(shù)值的平均值的變化百分?jǐn)?shù)表示)對(duì)血漿濃度的曲線。該曲線代表了3個(gè)組中沒(méi)有顯示對(duì)血小板的顯著作用的其他16只動(dòng)物。x軸顯示時(shí)間(小時(shí))，左y軸顯示血小板水平(以相對(duì)于處理前平均水平的變化百分?jǐn)?shù)表示)，左y軸顯示抗IgE抗體的濃度(nmol/L)。封閉(closed)正方形表示血小板濃度，實(shí)心菱形表示抗IgE抗體的濃度。封閉三角形表示抗IgE抗體的投與量(mg/kg)。圖15涉及實(shí)施例8,顯示組1某只動(dòng)物(用抗體11IgGl處理)的血小板數(shù)目(x109/L,以相對(duì)于2個(gè)投與前數(shù)值的平均值的變化百分?jǐn)?shù)表示)對(duì)血漿濃度的曲線，該只動(dòng)物在第29天顯示出血小板數(shù)目的短暫顯著下降(比基線值低35%)。x軸顯示時(shí)間(小時(shí))，左y軸顯示血小板水平(以相對(duì)于處理前平均水平的變化百分?jǐn)?shù)表示)，左y軸顯示抗lgE抗體的濃度(nmol/L)。封閉正方形表示血小板濃度，實(shí)心菱形表示抗IgE抗體的濃度。封閉三角形表示抗IgE抗體的投與量(mg/kg)。圖16涉及實(shí)施例9,顯示抗體11對(duì)IgE/FceRI介導(dǎo)的細(xì)月包毒性的抑制。x軸是抗體11的摩爾濃度，y軸是細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)。在圖中，空心三角形和實(shí)心圓圈代表Movl8IgE實(shí)驗(yàn)，其中空心三角形是同種型對(duì)照，實(shí)心圓圈是抗體ll,且在圖中，粗體空心三角形(隱藏在圖的右手邊的各點(diǎn)下方)和空心圓圏表示NIPIgE對(duì)照，其中空心粗體三角形是同種型對(duì)照，空心圓圈是抗體ll。圖17涉及實(shí)施例9,顯示抗體11對(duì)IgE/CD23介導(dǎo)的吞噬作用的抑制。x軸是抗體11的摩爾濃度，y軸是吞噬作用百分?jǐn)?shù)。在圖中，三角形和實(shí)心圓圏代表Movl8IgE實(shí)驗(yàn)，其中空心三角形是同種型對(duì)照，實(shí)心圓圏是抗體ll，且在圖中，粗體空心三角形和空心圓圏表示NIPIgE對(duì)照，其中空心粗體三角形是同種型對(duì)照，空心圓圈是抗體11。實(shí)施例使用克隆到基于絲狀噬菌體M13的噬菌粒載體的幼稚人單鏈Fv(scFv)噬菌體展示文庫(kù)，來(lái)進(jìn)行選擇[參考文獻(xiàn)69，70]。在重組人IgE上使用一系列的選擇循環(huán)，從噬菌體展示文庫(kù)分離抗IgE特異性scFv抗體。對(duì)選出的scFv抗體在與人IgE的結(jié)合和/或效價(jià)方面進(jìn)行優(yōu)化，并重形成(reformat)IgG抗體。序列示例性的本發(fā)明結(jié)合成員的序列在所附序列表中顯示，其中SEQIDNO對(duì)應(yīng)于下表3a中所示，其中i)在抗體編號(hào)后跟著GL的情況中，例如8GL,這是指其中一個(gè)或多個(gè)殘基已被突變回到種系構(gòu)型的抗體，一般來(lái)說(shuō)，在使用GL的情況中，所有的能突變回到種系而沒(méi)有可觀的活性損失的非種系殘基已被種系化；和ii)在抗體編號(hào)后跟著PGL的情況中，例如11PGL,這是指其中一個(gè)或多個(gè)殘基已被突變回到種系構(gòu)型的抗體，一般來(lái)說(shuō)，在使用PGL的情況中，有比GL更多的殘基已被突變回到種系，但導(dǎo)致與非種系化者相比有一定的活性損失。表3a<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>HCDR21095HCDR310335VL脂A10336VL/氨基酸1098LCDRI1099LCDR210100LCDR311101VH/DNA11102VH/氨基酸1103HCDR111104HCDR2n105HCDR3ii337VL/DNAii338VL/氨基酸ii108LCDR1ii109LCDR2ii1101XDR312111VH/DNA12112VH/氨基酸12113HCDR112114HCDR212115HCDR312339VL/DNA12340VL/氨基酸12118LCDR112119LCDR212120LCDR313121VH扁A13122VH/氨基酸13123HCDR113-124HCDR213125HCDR313341VL脂A13342VL/氨基酸13128LCDR113129LCDR213130LCDR3143VH細(xì)A14132VH/氨基酸14133HCDR114134HCDR214135HCDR314343VL纖A14344VL/氨基酸14138LCDR164<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>11PGL315LCDR2和在本公司進(jìn)行了修飾)一起在溶液中溫育。然后，按珠粒生產(chǎn)商的建議,將結(jié)合抗原的scFv-噬菌體捕捉在鏈霉親和素包被的順磁性珠粒(DynabeadsM280)上。然后按之前的描述(Vaughan等人，NatureBiotechnology14:309-314(1996))將所選的scFv-噬菌體顆粒回收，在遞減濃度的生物-人IgE的存在下重復(fù)進(jìn)行選擇過(guò)程((250nM-25pM,5輪選擇)。完成5輪選擇后，將VH和VL隨機(jī)化文庫(kù)進(jìn)行組合，形成其中各克隆含有隨機(jī)配對(duì)的個(gè)體隨機(jī)化VH和VL序列的單一文庫(kù)。然后按之前的描述在遞減濃度的生物人IgE的存在下繼續(xù)進(jìn)行選擇(100pM-lpM,再進(jìn)行3輪選擇)。2.2^戎傳-鉱傳^^溯Ot法姿;t^;t命謬^r攻遽^^發(fā)將來(lái)自定向誘變選擇結(jié)果(selectionoutput)的scFv表達(dá)在細(xì)菌周質(zhì)中，在表位竟?fàn)嶩TRF(均相時(shí)間分辨熒光)測(cè)定模式中對(duì)其進(jìn)行篩選，確定其對(duì)標(biāo)記上銪穴狀化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的人IgE(U266形r生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167頁(yè)])與抗人IgE的結(jié)合(抗體1,在實(shí)施例1分離)的抑制作用。詳細(xì)的測(cè)定方法在"材料和方法，，章節(jié)中提供。將顯示顯著抑制作用的scFv進(jìn)行DNA測(cè)序，將獨(dú)特的scFv制備成純化制品。23趟必^^cFv乂,/g五^Fcei/^潛合^/伊教在受體-配體結(jié)合HTRF(均相時(shí)間分辨熒光)測(cè)定才莫式中，試驗(yàn)純化的scFv對(duì)標(biāo)記上銪穴狀化合物(CISbioInternational62JEUSPEA)的人IgE(U266書亍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第p"9-167頁(yè)])或食蟹猴IgE(重組的，參見(jiàn)"材料和方法，，)與人FcsRl-Fc(本公司NSOcell所產(chǎn)生)的結(jié)合的抑制作用。示例性的scFv效價(jià)數(shù)據(jù)在表2a中列出。表2a:在受體-配體結(jié)合HTRF⑧測(cè)定中試驗(yàn)時(shí)從定向誘變文庫(kù)鑒定到的克隆的示例性效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>抗體281(n=l)7(n=l)么4趟必W/gG^"i^Z-五/"勿f哞辨/,#脊^^#賴在重形成IgG后，用改進(jìn)的RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定法，測(cè)出優(yōu)化的克隆的效價(jià)。這個(gè)測(cè)定法是從先導(dǎo)分離時(shí)所使用的方法改進(jìn)而來(lái)，以改善效價(jià)更高的抗體的檢測(cè)靈敏度。該方案的詳細(xì)描述在"材料和方法，，章節(jié)中提供。對(duì)人和食蟹猴IgE的IC5Q效價(jià)的數(shù)據(jù)在表2b中給出。表2b:對(duì)優(yōu)化抗體用BIAcore進(jìn)行的結(jié)合親和力計(jì)算和用RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定進(jìn)行的效價(jià)測(cè)量RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)BiacoreKD(nM)IC50(nM)抗體(幾何平均值)幾何平均值(95%CI)人IgE食蟹猴IgE人IgE食蟹猴IgE42.18.00扁0.151(0.039-0.199)(0.086-0.265)2.47.90.091(0.005-1.79)0.18162.13.70.0960.16882.66.30.112(0.02-0.62)0.188(0.103-0.340)111.69.30細(xì)(0.042-0.12)0.153(0.068-0.34)122.32300.1340.334132.39.90駕(0.038-0.02)0.244(0.134-0.43)164.6620.292(0.10-0.85)4.38188.00.5322.97192.57.90.095(0.043-0.21)0,111(0.008-1.55)203.310.50.1910.31210.3063.58220.2622.66232.74.30.1090.523260.3985.1283.27.20.0990.253(0.017-0.586)782.5.神,秀化fGWvn/z'油gj將優(yōu)化的抗IgE抗體的Vh和Vi結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，與VBASE數(shù)據(jù)庫(kù)(Tomlinson1997;JournalofMolecularbiology,224.487-499)中的已知的人種系序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)序列相似性鑒定出最接近的種系。對(duì)于抗體1語(yǔ)系的VH結(jié)構(gòu)域，最接近的種系是VhlDP-3(l-f)。對(duì)于VL結(jié)構(gòu)域，最接近的種系VXlDPL8(le)。不考慮保持不變的Vernier殘基(Foote&Winter1992),在抗體1的VH結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架中有10個(gè)偏離種系的變化，在VL結(jié)構(gòu)域中有2個(gè)。將VH結(jié)構(gòu)域中的5個(gè)變化和VL結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)變化回復(fù)到最接近的種系序列，以相同地(identically)匹配人抗體。VH結(jié)構(gòu)域的Kabat編號(hào)l、20、82a、83和89處的變化保持不變，以保留效價(jià)(抗體8GL和抗體11GL)。以適當(dāng)?shù)恼T變引物，用標(biāo)準(zhǔn)的定點(diǎn)誘變技術(shù)，對(duì)這些氨基酸殘基進(jìn)行種系化。然后對(duì)種系化的IgG進(jìn)行再評(píng)估，以確認(rèn)親和力或效價(jià)沒(méi)有降低。種系化(GL)抗體的示例性親和力和效價(jià)在表4中提供。4('W神^必W戎琳^5"co"迷/fW^"辨遂潛合黃和力伊岸弄^及i5i:-五i5J^/,子脊^抓定遽斤W妓汾浙量<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>2.6銷^^/g(^/7g￡與CD"^錯(cuò)吾^^伊浙用之前描述的IM9結(jié)合測(cè)定法，對(duì)一些優(yōu)化的抗體評(píng)估其對(duì)IgE/CD23相互作用的抑制作用。發(fā)現(xiàn)在這個(gè)系統(tǒng)中試驗(yàn)的抗體能抑制gE/CD23相互作用?？贵w8和抗體11的ICso值分別為16.5nM和23nM。2.7FcsW潛合的/g五的Jt炎用RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定法，評(píng)估了一些優(yōu)化抗體與FcsRI結(jié)合的IgE交聯(lián)的潛力。給"材料和方法"中描述的RBL-ER51細(xì)胞最大地負(fù)荷IgE。將優(yōu)化抗體與IgE荷載細(xì)胞一起溫育，評(píng)估它們刺激4丐應(yīng)答的能力。沒(méi)能檢測(cè)到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖1)。2.&D五ZJ^Z4(^衷在f爭(zhēng)JV定哞的遂舉嫂和類fit義^^'勝用如前所述的DELFIA⑧表位竟?fàn)帨y(cè)定法(參見(jiàn)1.6節(jié)和"材料和方法")，對(duì)先導(dǎo)抗體的選擇性和類型交叉反應(yīng)性進(jìn)行再評(píng)估。在每個(gè)測(cè)定中試驗(yàn)了純化的IgA、IgM、IgD和IgG(均獲自Calbiochem)的被滴定液，以確定在測(cè)定中由IC50值測(cè)量出的每個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白的特異性概況。在每個(gè)測(cè)定中試^r了IgE各類型的被滴定液，這些類型包括人IgE入(U266衍生的)、人IgEK(Calbiochem)、食蟹猴IgECe3-Cs4結(jié)構(gòu)域(本公司HEK-EBNA衍生的)和人IgECe3-Cs4結(jié)構(gòu)域(本公司HEK-EBNA衍生的)，以確定抗體的類型交叉反應(yīng)性。全長(zhǎng)人IgE入和K以及人和食蟹猴IgECs3-Cs4結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了抑制曲線。對(duì)于任何結(jié)構(gòu)相關(guān)人蛋白(IgA、IgM、IgD和IgG)，沒(méi)有觀察到抑制情況。這些數(shù)據(jù)證明，所試驗(yàn)的一批抗體能結(jié)合人IgEX和K、IgE的Cs4-Ce4結(jié)構(gòu)域，對(duì)食蟹猴IgE有交叉反應(yīng)性。但是，這些抗體不能結(jié)合與IgE最相關(guān)的蛋白質(zhì)。-^岸炎'必義J^么黃和力炎茲基本上按Karisson等人,1991;JournalofImmunologicalMethods145(1-2)229-240的描述，用BIAcore2000生物傳感器(BIAcoreAB)，通過(guò)表面等離振子共振，測(cè)定代表性數(shù)目的克隆的純化IgG樣品對(duì)人和食蟹猴IgE的結(jié)合親和力。筒單的說(shuō)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書80(BIAcore),用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)試劑將G蛋白(SigmaAldrich,P4689)共價(jià)結(jié)合到CM5傳感器芯片的表面。用這個(gè)G蛋白表面通過(guò)Fc結(jié)構(gòu)域捕捉純化的抗IgE抗體，以提供50RU的表面密度。使在HBS-EP緩沖液(BIAcoreAB)中以125nM和7.6nM之間的一系列濃度制備的人IgEX或食蟹猴IgE經(jīng)過(guò)傳感器芯片表面。在各次抗體注射之間，用lOmM甘氨酸，pH1.75使表面再生。所得的傳感圖譜用BIA評(píng)估3.1軟件進(jìn)行評(píng)估，并擬合二價(jià)分析物模型(bivalentanalytemodel),以提供相對(duì)結(jié)合數(shù)據(jù)。試驗(yàn)的IgE的示例性親和力在表2b和表4中顯示。材料和方法-實(shí)施例1和2采趁化的scFv乂,/g五與Fcs/7的潛合的,尸斜在基于受體-酉己體結(jié)合均相FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的測(cè)定模式中，對(duì)選擇結(jié)果篩選其是否能抑制標(biāo)記上銪螯合物(PerkinElmer1244-302)的人IgE(Calbiochem401152)與人FcsRI-Fc(本公司NSO細(xì)胞所產(chǎn)生)的結(jié)合。先導(dǎo)分離期間的結(jié)果作為含有未純化scFv的未稀釋細(xì)胞周質(zhì)提取物進(jìn)行篩選，制備于50mMMOPS緩沖液pH7.4，0.5mMEDTA和0.5M山梨糖醇中。將15(il的未純化scFv樣品加到384孔測(cè)定板(PerkinElmer6006280)。接著加入15(il的llnM人FcsRI-Fc(基于260kDa的分子量)、15pi的40nM標(biāo)記上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的抗人FcIgG，然后加入15|il的0.75nM銪標(biāo)記人IgE。用300nM人IgE(Calbiochem)定義非特異性對(duì)照結(jié)合。所有稀釋都在含有250mM氯化鈉和0.05%Tween20(測(cè)定緩沖液)的50mMTris-HCl(pH7.8)中進(jìn)行。接著將各測(cè)定板在室溫下溫育1.5小時(shí)，然后用VICTOR2讀板器(PerkinElmer)在615nm和665nm發(fā)射波長(zhǎng)處依次讀取時(shí)間分辨熒光。數(shù)據(jù)通過(guò)VICTOR2軟件歸一化，以計(jì)算每秒計(jì)數(shù)(CPS)。隨后用CPS值如方程1所迷計(jì)算％特異性結(jié)合。方程1:%特異性結(jié)合=(樣品的CPS-非特異性結(jié)合對(duì)照的CPS)X100(總結(jié)合^j"照-非特異性結(jié)合對(duì)照的CPS)磁^的scFv乂:/7g五與FceW的/#合的#尸#在基于受體-配體結(jié)合均相FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的測(cè)定模式中，對(duì)來(lái)自篩選工作所鑒定到的陽(yáng)性克隆的純化scFV，試驗(yàn)其對(duì)標(biāo)記上銪螯合物(PerkinElmer1244-302)的人IgE(Calbiochem401152)與人FcsRI-Fc(本公司NSO細(xì)胞所產(chǎn)生)的結(jié)合的抑制作用。利用scFv濃度的滴定，以確定在測(cè)定中由IC5o值測(cè)量的scFv效價(jià)。將15ial的純化scFv樣品被滴定液加到384孔測(cè)定板(PerkinElmer6006280)。接著加入15pi的llnM人FceRI-Fc(基于260kDa的分子量)、15pl的40nM標(biāo)記上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的抗人FcIgG,然后加入15|al的0.75nM銪標(biāo)記人IgE。用300nM人IgE(Calbiochem)定義非特異性對(duì)照結(jié)合。所有稀釋都在含有250mM氯化鈉和0.05%Tween20(測(cè)定緩沖液)的50mMTris-HCl(pH7.8)中進(jìn)行。接著將各測(cè)定板在室溫下溫育1.5小時(shí)，然后用VICTOR2讀板器(PerkinElmer)在615nm和665nm發(fā)射波長(zhǎng)處依次讀取時(shí)間分辨焚光。數(shù)據(jù)通過(guò)VICTOR2軟件歸一化，以計(jì)算每秒計(jì)數(shù)(CPS)。隨后用CPS值如方程1所述計(jì)算％特異性結(jié)合。方程1:%特異性結(jié)合=82f樣品的CPS-非特異性結(jié)合對(duì)照的CPS)X100(總結(jié)合對(duì)照-非特異性結(jié)合對(duì)照的CPS)使用GraphPadPrism軟件，用四參數(shù)logistic方程(方程2)通過(guò)曲線擬合測(cè)定ICs。值。方程2:Y:最小值(bottom)+(最大值(top)-最小值)/(l+10A((LogEC50-Xy斜率(HillSlope)))X是濃度的對(duì)數(shù)。Y是特異性結(jié)合。Y從最小值開(kāi)始，以S形狀到達(dá)最大值。遂化^scFvf口/g(在處定脊染^"乂Fcei/勿/《^isu/B勿應(yīng)^^tv^t^脊^^#浙用RBL-ER514丐信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定法，評(píng)估純化的scFv和IgG制品對(duì)通過(guò)FcsRI介導(dǎo)的人IgE生物活性的中和效價(jià)。將人FceRI從人外周血淋巴細(xì)胞克隆到pcDNA3.1載體中，用標(biāo)準(zhǔn)的電穿孔方法轉(zhuǎn)染到RBL-2H3細(xì)胞(大鼠嗜堿性細(xì)胞系)中。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過(guò)有限稀釋進(jìn)行克隆，分析表面FcsRI表達(dá)情況。將所得的RBL-ER51細(xì)胞維持在含有G418(Invitrogen10131-027)的培養(yǎng)基中，以保持穩(wěn)定的受體表達(dá)。細(xì)胞附近的游離IgE會(huì)結(jié)合FcsRI,受體結(jié)合的IgE隨后的交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致能用熒光成像讀板器(FLIPR)檢測(cè)的鈣動(dòng)員。將RBL-ER51細(xì)胞以5xl0Vl00iil/孔的密度接種到96孔黑壁平底的姐織培養(yǎng)處理過(guò)的板(Costar),其中的各孔在培養(yǎng)基[DMEM(Invitrogen41966)，含9%v/v非熱滅活FBS(Invitrogen10100-147)和400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，接著在370C,5%C02下溫育18-24小時(shí)。這個(gè)時(shí)間后，將培養(yǎng)基吸出，保持細(xì)胞單層完整，換上100uL/孔的FLUO-4AM荷載緩沖液[DMEM,含0.1%FBS,20mM說(shuō)明書第79/122頁(yè)HEPES,2.5mM丙磺舒(probenicid)和2ug/mLFLUO-4AM(TeffLabs)]在37°C，5%C02下保持1-2小時(shí)。將荷載緩沖液吸出,用200uL/孔的PBS洗滌細(xì)胞3次。將最終洗滌液吸出，換上70uL/孔的FLIPR緩沖液[125mMNaCl2,5nMKCl，lmMMgCl2，1.5mMCaCl2，30mMHepes,2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01%v/vFCS]。將各板在37°C,5%C02下溫育5-45分鐘。將純化的scFv或IgG的試驗(yàn)溶液(一式兩份)在V底板(Greiner)中稀釋在FLIPR緩沖液中至期望的濃度。不抗IgE的非相關(guān)抗體用作陰性對(duì)照。將IgE(Calbiochem或U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167頁(yè)])在FLIPR緩沖液中制備，與適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)抗體混合，產(chǎn)生在40(il/孔的總體積中3.33pg/mL的最終IgE濃度。將測(cè)定中所使用的IgE的濃度，選擇成在最終測(cè)定濃度下產(chǎn)生最大鈣應(yīng)答的大約80%的這么一個(gè)劑量。所有樣品在室溫下溫育30分鐘，然后將的IgE/抗體混合物轉(zhuǎn)移到以上制備的荷載染料的細(xì)胞中。將各測(cè)定板在37。C下溫育10分鐘，讓游離IgE結(jié)合RBL-ER51細(xì)胞。為測(cè)量加入交聯(lián)性抗IgE后的鈣動(dòng)員，將FLIPR(MolecularDevices)按照生產(chǎn)商說(shuō)明書校準(zhǔn)以進(jìn)行合適的暴露。將稀釋于FLIPR緩沖液的抗IgE(BiosourceAffl0501)加到測(cè)定板中，至lOug/mL的最終濃度。以1秒的間隔時(shí)間進(jìn)行80次測(cè)量，然后以8秒的時(shí)間間隔進(jìn)行40次測(cè)量，記錄FLUO-4AM染料的熒光。輸出每個(gè)孔的峰值應(yīng)答，然后用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)。i^丄-五i57敘應(yīng)#^我/g￡Jt^的^/量為測(cè)量純化的IgG交聯(lián)FcsRI結(jié)合的IgE的能力，按抑制測(cè)定中所述制備RBL-ER51細(xì)胞并荷載染料。將細(xì)胞在稀釋于FLIPR緩沖液的1OOuL的lug/mL人IgE(Calbiochem或U266書亍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167頁(yè)])中溫育10分鐘，以讓IgE結(jié)合細(xì)胞表面上的FcsRI。將測(cè)定中所使用的IgE的濃84度，選擇成產(chǎn)生最大鈣應(yīng)答的大約80%的這么一個(gè)劑量。為測(cè)量加入交聯(lián)性抗IgE后的鈣動(dòng)員，將FLIPR(MolecularDevices)按照生產(chǎn)商說(shuō)明書校準(zhǔn)以進(jìn)行合適的暴露。將在FLIPR緩沖液中稀釋至適當(dāng)濃度的30uL試驗(yàn)抗體加到荷載IgE的測(cè)定板。用抗IgE(BiosourceAHI0501)作為陽(yáng)性對(duì)照。以1秒的間隔時(shí)間進(jìn)行80次測(cè)量，然后以8秒的時(shí)間間隔進(jìn)行40次測(cè)量，記錄FLUO-4AM染料(TeffLabs)的焚光。輸出每個(gè)孔的峰值應(yīng)答，然后用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)。戎傳在/)￡丄尸"@《扭^爭(zhēng)W/;t^w這舉^和類型x叉^:,^將純化的IgG以這樣一個(gè)濃度吸附到96孔Maxisorp微量滴定板(Nunc)(于PBS中)上，該濃度是當(dāng)將生物素?；娜薎gE以大約其對(duì)該特定IgG的估計(jì)KD加入時(shí)，產(chǎn)生出顯著的信號(hào)。用PBS-Tween(0.1%v/v)洗去過(guò)量的IgG,并用PBS-Marvel(3%w/v)封閉各孔1小時(shí)。以生物素?；薎gE與分別的IgG之間的相互作用KD值的大約1000倍的濃度開(kāi)始，在PBS中制備每個(gè)以下竟?fàn)幬?competitor)的稀釋系列人IgEX(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986,MolecularImmunology23(2);第pl59-167頁(yè)])、人IgEK(Calbiochem)、人IgECe3-Ce4結(jié)構(gòu)域(本公司HEK-EBNA衍生的)、食蟹猴IgECs3-Cs4結(jié)構(gòu)域(本公司HEK-EBNA衍生的)、人IgA、IgM、IgD和IgD(均獲自Calbiochem)。向這個(gè)系列加入等體積的濃度大約在KD的生物素?；薎gE(產(chǎn)生出以竟?fàn)幙乖?生物素?；薎gE為大約1000:1的這么一個(gè)比例開(kāi)始的系列)。然后將這些混合物轉(zhuǎn)移到被封閉的IgG，讓它們平衡1小時(shí)。用PBS-Tween(0.1%v/v)洗滌除去未結(jié)合的抗原，而剩余的生物素?；薎gE通過(guò)鏈霉親和素-銪3+綴合物進(jìn)行檢測(cè)(DELFIA⑧檢測(cè)，PerkinElmer)。在EnVision讀板器(PerkinEImer)上620nm處測(cè)量時(shí)間分辨熒光。用GraphpadPrism或Microsoft"Excel軟件分析熒光數(shù)據(jù)。^在傳-豕傳^必解定法#定^遽嫂《^以表位竟?fàn)嶩TRF(均相時(shí)間分辨熒光)測(cè)定模式，對(duì)選擇輸出(selectionoutput)篩選其對(duì)標(biāo)記上銪穴狀化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的穴狀化合物標(biāo)記人IgE(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pi59-167頁(yè)])與抗人IgE抗體(抗體)的結(jié)合的抑制作用。在先導(dǎo)優(yōu)化過(guò)程中，選擇輸出作為含有未純化scFv的未稀釋或稀釋細(xì)胞周質(zhì)提取物進(jìn)行篩選，制備于50mMMOPS緩沖液pH7.4,0.5mMEDTA和0.5M山梨糖醇中。，將4nM抗人IgE抗體與標(biāo)記上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的20nM抗人FcIgG進(jìn)行預(yù)混合。將10jul的未純化的scFv樣品加到384孔低容量測(cè)定板(Costar3676)。接著加入5(il的抗人IgE抗體抗Fc-XL665混合物(mix),然后加入5)il的穴狀化合物標(biāo)記人IgE(大約2.3nM穴狀化合物標(biāo)記人IgE)的1/245稀釋液。用300nM人IgE(U266書f生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167頁(yè)])定義非特異性對(duì)照結(jié)合。所有稀釋都在含有0.4M氟化鉀和0.1%BSA的磷酸緩沖鹽水(PBS)(測(cè)定緩沖液)中進(jìn)行。然后將測(cè)定板在室溫下lOOOrpm離心1分鐘，在室溫下溫育3小時(shí)，接著用EnVision讀板器(PerkinElmer)于620nm和665nm發(fā)射波長(zhǎng)處讀取時(shí)間分辨熒光。通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品的％DeltaF值對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。DeltaF按照方程1進(jìn)行測(cè)定。方程1:%DeltaF=(樣品665nm/620nm比值)-C非特異性對(duì)照665nm/620nm比值)X100(非特異性對(duì)照665nm/620nm比值)隨后用％DeltaF值按方程2所述計(jì)算。/。特異性結(jié)合。方程2:0/0特異性結(jié)合=_樣品的％DeltaFX100總結(jié)合對(duì)照的％DeltaF攻遽的scFvf磁化^j^/"/g五與FcgW的潛合^#斜以受體-配體結(jié)合HTRF⑧(均相時(shí)間分辨焚光)測(cè)定模式，對(duì)純化的scFv試驗(yàn)其對(duì)標(biāo)記上銪穴狀化合物(CISbioInternational62EUSPEA)的人IgE(U266衍生的[Ikeyama等人.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167頁(yè)])或食蟹猴IgE(重組的，參見(jiàn)"材料和方法，，)與人FcsRl-Fc(本公司NS0細(xì)胞產(chǎn)生的)的結(jié)合的抑制作用。利用scFv濃度的滴定，以確定在測(cè)定中由IC5o測(cè)量出的scFv功效。將1.9nM人FcsRl-Fc(基于260kDa的分子量)與標(biāo)記上XL665(CISBioInternational61HFCXLA)的20nM抗人FcIgG進(jìn)行預(yù)混合。將10)ul的純化scFv樣品被滴定液加到384孔低容量測(cè)定板(Costar3676)。接著加入5pi的FcsRl-Fc抗Fc-XL665混合物，然后加入5pi的穴狀化合物標(biāo)記的人或食蟹猴IgE的1/197稀釋液(大約2.9nM穴狀化合物標(biāo)記的人或食蟹猴IgE)。用300nM的人或食蟹猴IgE(本公司衍生的)定義非特異性對(duì)照結(jié)合。所有稀釋都在含有0.4M氟化鉀和0.1%BSA的磷酸緩沖鹽水(PBS)(測(cè)定緩沖液)中進(jìn)行。然后將測(cè)定板在室溫下lOOOrpm離心1分鐘，在室溫下溫育3小時(shí)，接著用EnVision讀板器(PerkinElmer)于620nm和665nm發(fā)射波長(zhǎng)處讀JF又時(shí)間分辨熒光。通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品的。/。DeltaF值對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。DeltaF按照方程l進(jìn)行測(cè)定。方程l:%DeltaF=(樣品665nm/620nm比值〗-(非特異性對(duì)照665nm/620nm比值)X00(非特異性對(duì)照665nm/620nm比值)隨后用％DeltaF值按方程2所述計(jì)算％特異性結(jié)合。方程2:%特異性結(jié)合=_樣品的％DeltaF_X100總結(jié)合對(duì)照的％DeltaF使用GraphPadPrism軟件，用四參數(shù)logistic方程進(jìn)行曲線擬合，測(cè)定IC5。值(方程3)。方程3:Y二最小值+(最大值-最小值)/(l+10A((LogEC50-Xf斜率》X是濃度的對(duì)數(shù)。Y是特異性結(jié)合。Y從最小值開(kāi)始，以S形狀到達(dá)最大值。^/^Hi5/辨/,##^浙定#婆定攻遽^^/^以對(duì)先導(dǎo)分離所述的RBL-ER51鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定法的修正版本，評(píng)估來(lái)自改進(jìn)的抗體的純化IgG制品的中和功效。將RBL-ER51細(xì)胞以5xl0Vl00jil/孔的密度接種到96孔黑壁平底的組織培養(yǎng)處理過(guò)的板(Costar),其中的各孔在培養(yǎng)基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非熱滅活FBS(Invitrogen10100-147)和400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，并在37。C,5%C02下溫育18-24小時(shí)。這個(gè)時(shí)間后，將培養(yǎng)基吸出，換上50uL/孔的試驗(yàn)抗體(6.67nM-1.33pM)于測(cè)定培養(yǎng)基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非熱滅活的FBS(Invitrogen10100-147)、400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)和1.6%青霉素/鏈霉素(Invitrogen15140-122)]中的稀釋液，然后加入稀釋于測(cè)定培養(yǎng)基中以分別產(chǎn)生25ng/mL和lOOng/ml的最終IgE濃度的IgE[人(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167頁(yè)])或食蟹猴(重組的，參見(jiàn)"材料和方法")]。將各測(cè)定板在37°C,5%C02下溫育4小時(shí)。這個(gè)時(shí)間后，將抗體/IgE混合物吸出，保持細(xì)胞單層完整，換上100uL/孔的FLUO-4AM荷載緩沖液[DMEM,含0.1%FBS,20mMHEPES,2.5mM丙磺舒和2ug/mLFLUO-4AM(Invitrogen)]在37°C，5%C02下保持1-2小時(shí)。將荷載緩沖液吸出,用200uL/孔的PBS洗滌細(xì)胞3次。將最終洗滌液吸出，換上100uL/孔的FLIPR緩沖液[125mMNaCl2,5nMKC1,lmMMgCl2,1.5mMCaCl2，30rnMHepes,2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01%v/vFCS]。將各板在37°C,5%C02下溫育5-45分鐘。為測(cè)量加入交聯(lián)性抗IgE后的4丐動(dòng)員，將FLIPR(MolecularDevices)按照生產(chǎn)商說(shuō)明書校準(zhǔn)以進(jìn)行合適的暴露。將稀釋于FLIPR緩沖液的抗IgE(BiosourceAffl0501)加到測(cè)定板中，至2.3ug/mL(以交聯(lián)人IgE)或20ug/mL(以交聯(lián)食蟹猴IgE)的最終濃度。以1秒的間隔時(shí)間進(jìn)行80次測(cè)量，然后以3秒的時(shí)間間隔進(jìn)行40次測(cè)量，記錄FLUO-4AM染料的焚光。輸出每個(gè)孔的峰值應(yīng)答，然后用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)。說(shuō)'化我傳J^Fce//潛合W/g5^x^的^/量為測(cè)量純化的IgG交聯(lián)FceRI結(jié)合的IgE的能力，按抑制測(cè)定中所述制備RBL-ER51細(xì)胞以評(píng)估改進(jìn)的抗體。將RBL-ER51細(xì)胞以5xl(yVl00^d/孔的密度接種到96孔黑壁平底的組織培養(yǎng)處理過(guò)的板(Costar),其中的各孔在培養(yǎng)基[DMEM(Invitrogen41966)，含9%v/v非熱滅活FBS(Invitrogen10100-147)和400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)]中，并在37。C，5。/。C02下溫育18-24小時(shí)。這個(gè)時(shí)間后，將培養(yǎng)基吸出，換上100uL/孔的于測(cè)定培養(yǎng)基[DMEM(Invitrogen41966),含9%v/v非熱滅活FBS(Invitrogen10100-147)、400ug/mLG418(Invitrogen10131-027)和1.6%青霉素/鏈霉素(Invitrogen15140-122)]中稀釋至lug/mL的人IgE(U266衍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-167頁(yè)])。選定IgE濃度，以產(chǎn)生RBL-ER51細(xì)胞的最大負(fù)荷。將各測(cè)定板在37QC,5%C02下溫育4小時(shí)。這個(gè)時(shí)間后，將IgE溶液吸出，保持細(xì)胞單層完整，換上100uL/89孔的FLUO-4AM荷載緩沖液[DMEM，含0.1%FBS，20mMHEPES,2.5mM丙磺舒和2ug/mLFLUO-4AM(Invitrogen)]在37°C，5%C02下保持1-2小時(shí)。將荷載緩沖液吸出,用200uL/孔的PBS洗滌細(xì)胞3次。將最終洗滌液吸出，換上100uL/孔的FLIPR緩沖液[125mMNaCl2，5nMKC1,lmMMgCl2,1.5mMCaCl2,30mMH印es，2.5mM丙磺舒，5mM葡萄糖，0.01°/。v/vFCS]。將各板在37°C,5%C02下溫育5-45分鐘。為測(cè)量加入交聯(lián)性抗IgE(1.53uM-2.33nM)后的鉤動(dòng)員，將FLIPR(MolecularDevices)按照生產(chǎn)商說(shuō)明書校準(zhǔn)以進(jìn)行合適的暴露。將30uL的在FLIPR緩沖液中稀釋至適當(dāng)濃度的試驗(yàn)抗體加到測(cè)定板中。用抗IgE(BiosourceAHI0501)作為陽(yáng)性對(duì)照。以l秒的間隔時(shí)間進(jìn)行80次測(cè)量，然后以3秒的時(shí)間間隔進(jìn)行40次測(cè)量，記錄FLUO-4AM染料(Invitrogen)的熒光。輸出每個(gè)孔的峰值應(yīng)答，然后用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)。磁化的/gG對(duì)/g五與/M9細(xì)/《J:的CD"的潛合的一伊浙用IM9細(xì)胞結(jié)合測(cè)定法，評(píng)估抗體是否能抑制IgE/CD23相互作用。用標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)程序，將IM9細(xì)胞(人B細(xì)胞系)保持在培養(yǎng)基[RPMI1640glutamax(Invitrogen61870-010);9%v/v熱滅活FBS(Invitrogen10100-147)]。'為試驗(yàn)優(yōu)化的IgG,將IM9細(xì)胞用25ng/ml人IL-4(Peprotech,200-04)在37。C/5。/。C02下預(yù)處理3天，以上調(diào)CD23表達(dá)。收獲IM9鈿胞，以lxl(^個(gè)細(xì)胞/mL重懸在流動(dòng)緩沖液[PBS,含10/o山羊血清(Sigma)和0.1。/oBSA流份V(Sigma)]。通過(guò)加入Fc片段(TEBU-bio)至5ug/mL的最終濃度，進(jìn)行Fc受體封閉。將這個(gè)細(xì)胞懸浮液以100uL/孔接種在U形底聚丙烯板(Greiner)中，在冰上溫育30分鐘。在U形底聚丙烯板(Greiner)中制備抗體稀釋液(667nM-lnM),并與IgE(U266書亍生的[Ikeyamaet.al.1986.MolecularImmunology23(2);第pl59-l67頁(yè)])混合至10ug/mL的最終IgE濃度，在室溫下保持30分鐘。將各細(xì)胞板在2000rpm下離心2分鐘，吸出上清液，保持細(xì)胞沉淀完整。將細(xì)胞重懸在100uL/孔的抗體/IgE混合物中，在冰上溫育1小時(shí)。將各細(xì)胞^l在2000rpm下離心2分鐘，吸出抗體/IgE上清液。細(xì)胞通過(guò)重懸在200uL/孔的流動(dòng)緩沖液中進(jìn)行洗滌，如上進(jìn)行離心。用稀釋1/30，v/v,100uL/孔的抗IgE藻紅蛋白(Caltag)檢測(cè)與細(xì)胞表面結(jié)合的IgE。將各測(cè)定板在冰上黑暗溫育20分鐘，然后在2000rpm下離心2分鐘，如上所述用2x200uL的流動(dòng)緩沖液進(jìn)行洗滌。將細(xì)胞重懸在100uL細(xì)胞固定液(CellFix,BDbiosciences),用FACSCalibur(BDBiosciences)分析以檢測(cè)FL2染色。數(shù)據(jù)用CellQuest軟件(BDbiosciences)進(jìn)行分析。輸出FL2幾何平均^f直焚光，然后用MicrosoftExcel和GraphpadPrism專欠件分析凄丈氺居。C^威標(biāo)記才FL」G歷WO乂/g五CW一的/^人IgECs3-4的片段如之前在Wurzburga/.(2000)StructureoftheHumanIgE-FcCs3-C4RevealsConformationalFlexibilityintheAntibodyEffectorDomains(人IgE-FcCs3-C4的結(jié)構(gòu)揭示抗體效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象撓性)中所述。用RT-PCR從IL13剌激的PBMC的總RNA擴(kuò)增涵蓋核苷酸2135-2868(GenBank登錄號(hào)J00222)的cDNA片段。將這個(gè)PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1TA(Invitrogen)中。為使表達(dá)的蛋白質(zhì)能分泌出來(lái)，和為產(chǎn)生摻入了符合讀框的C末端FLAG表位和聚組氨酸標(biāo)簽(HislO)的序列，將IgECs3-4片段用摻入了5，BssHII位點(diǎn)和3，F(xiàn)LAG表位、聚組氨酸標(biāo)簽(HislO)和XbaI位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后插入到pEU8.2載體中。該經(jīng)修飾的pEU8.2載體含有EF-1啟動(dòng)子、鼠IgGl前導(dǎo)肽的基因組序列、oriP復(fù)制起點(diǎn)，該復(fù)制起點(diǎn)使得載體轉(zhuǎn)染到表達(dá)EBNA-1基因產(chǎn)物的細(xì)胞系(如HEK293-EBNA細(xì)胞)中時(shí)能進(jìn)行附加型質(zhì)粒復(fù)制。用IMAC層析法將蛋白質(zhì)從條件培養(yǎng)基純化，然后進(jìn)行尺寸排阻91層析(SEC)純化。C^媒標(biāo)記才尸L4(7/^^的斧黌^^五通過(guò)對(duì)用包含人IgHE(IgE的重鏈)基因座的核苷酸l174-2989(GenBank登錄號(hào)J00222)的引物從基因組DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，測(cè)定食蟹猴IgE恒定區(qū)。外顯子通過(guò)與人序列的同源性進(jìn)行鑒定，因此可以預(yù)測(cè)食蟹猴IgE重鏈恒定區(qū)的cDNA序列。合成出編碼鼠IgGl前導(dǎo)肽的序列、食蟹猴Cs3-4(圖2)及C末端FLAG表位和聚組氨酸標(biāo)簽的cDNA(DNA2.0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。然后使用LRGateway⑧反應(yīng)(Invitrogen),將目的基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體pDEST12.2(Invitrogen)中，該表達(dá)載體通過(guò)插入來(lái)自pCEP4載體(Invitrogen)的oriP復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行修飾，以使得轉(zhuǎn)染到表達(dá)EBNA-1基因產(chǎn)物的細(xì)胞系(如HEKW3-EBNA細(xì)胞)中時(shí)能進(jìn)行附加型質(zhì)粒復(fù)制。用IMAC層析法將蛋白質(zhì)從條件培養(yǎng)基純化，然后進(jìn)行尺寸排阻層析純化。嵌合的D12可變區(qū)和食蟹猴IgE恒定區(qū)的產(chǎn)生合成出編碼可變重鏈區(qū)域(其編碼人抗雌二醇scFv(D12—VH)和兩個(gè)不同的單元型食蟹猴IgHE基因(cyIGHETQ和cyIGHEME)之一的cDNA(DNA2,0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。還合成出代表可變輕鏈人抗雌二醇scFv(Dl2一VL)和兩個(gè)食蟹猴、恒定區(qū)基因(cylGLC4和cylGLC7)之一的cDNA(DNA2.0),并克隆到pDONR221(Invitrogen)中。然后使用LRGateway⑧反應(yīng)(Invitrogen),將目的基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體pDEST12.2(Invitrogen)中，該表達(dá)載體通過(guò)插入來(lái)自pCEP4載體(Invitrogen)的oriP復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行修飾，以使得轉(zhuǎn)染到表達(dá)EBNA-1基因產(chǎn)物的細(xì)胞系(如HEK293-EBNA細(xì)胞)中時(shí)能進(jìn)行附加型質(zhì)粒復(fù)制。使用Ikeyam等人(1986)MolImmunol23pl59-67中所述的方法純化重組嵌合IgE蛋白，該重組嵌合IgE蛋白代表著與食蟹猴IgECsl-4融合的人抗雌二醇scFv的可變重鏈區(qū)(圖3和4)和與食蟹猴人恒定區(qū)融合的人抗雌二醇scFv的可變輕鏈區(qū)(圖5和6)，從HEK293EBNA細(xì)胞表達(dá)。人FcsRI-Fc(本公司NSO細(xì)胞產(chǎn)生的)將包含核苷酸67-711(GenBank登錄號(hào)NMJ)02001)的FcsRI克隆在人IgGlFc的基因組區(qū)域的上游，如同來(lái)自Persic等人(1997)187;9-18首次描述的pEU1.2。將這克隆到pcDNA3.1EcoRI-Xbal(SEQIDNO:391和392)中。通過(guò)用pcDNA3.1FcsRI—Fc構(gòu)建物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NSO細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)重組融合蛋白FcsRI_Fc的表達(dá)。如下建立穩(wěn)定表達(dá)用G418進(jìn)行選擇，通過(guò)有限稀釋分離克隆，和鑒定具有高表達(dá)水平的克隆。然后用A蛋白親和層析法將FcsRI—Fc融合蛋白從條件培養(yǎng)基純化，接著進(jìn)行制備型尺寸排阻層析純化。實(shí)施例3:人B細(xì)胞-胞內(nèi)IgE的抑制通過(guò)在Ficoll-Paque梯度(Pharmacia)上進(jìn)行離心，從人肝素化全血分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。隨后采用使用磁珠(Miltenyi)進(jìn)行的陽(yáng)性抗CD19選擇，從PBMC群體分離B細(xì)胞。在細(xì)胞通過(guò)磁性柱過(guò)程中，收集陽(yáng)性和陰性B細(xì)胞流份。將來(lái)自除B細(xì)胞外含有所有PBMC細(xì)胞的陰性B細(xì)胞流份的細(xì)胞用絲裂霉素C處理，以防止增殖。將細(xì)胞與50|ag/mL絲裂霉素C溫育30分鐘，然后用組織培養(yǎng)基(RPMI1640，含有Glutamax(Gibco)/10%FCS(Gibco)/50U/mL青霉素/50pg/mL鏈霉素(Gibco》進(jìn)行洗滌，接著與PBS溫育70分鐘后進(jìn)行最后洗滌，以確保所有的絲裂霉素C被去除。為誘導(dǎo)B細(xì)胞的分化，將4xl(^個(gè)B細(xì)胞和來(lái)自B細(xì)胞陰性流份的9.2x105個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中，該板在補(bǔ)充有3.5|_iMp-巰基乙醇(Sigma)和20|ig/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白(Chemicon)的組織培養(yǎng)基中，接著與0.001-1OOnM的抗IgE單克隆抗體或?qū)φ湛贵w預(yù)溫育30分鐘，然后加入10ng/mL的人白細(xì)胞介素-4(IL_4)。隨后將細(xì)胞在加濕的C02培養(yǎng)箱中溫育12-14天。在第12-14天，對(duì)各板稍作離心，收集上清液，用以下方案對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，確定是否存在胞內(nèi)IgE。首先將細(xì)胞與含1%人血清的PBS—起溫育10分鐘，以封閉Fc受體結(jié)合。接著用BectonDickinson的Cytofix/Cytoperm試劑盒，將細(xì)胞在水上固定并透化處理。然后洗滌細(xì)胞，加入1:6最終稀釋的多克隆兔抗人IgE-FITC抗體(DAKO)和1:10最終稀釋的單克隆小鼠抗人CD19-RPE/Cy5抗體(DAKO)。重要的是將細(xì)胞徹底洗滌，以避免殘余的抗IgE單克隆抗體的干擾。溫育30分鐘后，洗滌細(xì)胞，樣品在使用HTS96孔板荷載裝置(loaderdevice)的FACSCalibur上進(jìn)行分析。然后記錄CD19+群體中共表達(dá)IgE的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，胞內(nèi)IgE的表達(dá)以不用封閉性抗IgE單克隆抗體處理的細(xì)胞中的最大IgE表達(dá)的％抑制表示?？贵w11以1.6nM的IC50抑制了IgE陽(yáng)性細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖7-上曲線)。相同形式的非相關(guān)抗體用作陰性對(duì)照(CAT-002)，它沒(méi)有抑制IgE陽(yáng)性細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖7-下曲線)。實(shí)施例4:肥大細(xì)胞系(XAD2)-p-己糖胺酶釋放的抑制將LAD2細(xì)月包[v4.51.A7ra/7e打6aww等人丄ewfewz.amsearc/z27p00"]以0.25-0.6x1(^個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度，在補(bǔ)充有StemPro-34營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、2mML-谷氨酰胺和100ng/mL重組人干細(xì)胞因子(rhSCF,R&D)的無(wú)血清培養(yǎng)基(StemPro-34，LifeTechnologies)中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于p-己糖胺酶測(cè)定，將細(xì)胞以2.5x104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種，在96孔聚丙烯板中與在0.0001-100nM濃度范圍的封閉性抗IgE單克隆抗體一起預(yù)溫育。將細(xì)胞在37。C下溫育30分鐘，然后加入0.15nM濃度的IgE,再將細(xì)胞溫育4小時(shí)。與IgE溫育后，用緩沖液洗滌細(xì)94胞以除去任何過(guò)量的IgE,隨后將結(jié)合LAD2細(xì)胞上的FceR的IgE與otlgE(600pg/mL山羊抗人IgE,Sigma)在37。C下交聯(lián)30分鐘。通過(guò)冷凍離心停止溫育，收集細(xì)胞上清液，轉(zhuǎn)移到96孔板。用Smith等人，[5"m她《/爭(zhēng)乂7!(7卯7J323，W7-WS]所公布的方法的稍作改進(jìn)的版本，分析(3-己糖胺酶含量。簡(jiǎn)單的說(shuō)，用2mMp-硝基苯基-N-乙酰-D-氨基葡糖苷(于0.2M檸檬酸鹽緩沖液，pH4.5中)作為己糖胺酶的底物。加入1MTris緩沖液pH9.0停止反應(yīng)。用MolecularDevices的Spectramax讀數(shù)器，于405^處分光光度測(cè)量光密度(減去570nm處的數(shù)值)。計(jì)算出抗IgE單克隆抗體抑制P-己糖胺酶的釋放的作用，以總釋放的抑制百分?jǐn)?shù)+ASEM表示?？贵wll以0.04nM的IC50抑制了(3-己糖胺酶(圖8-上曲線)，而相同形式的非相關(guān)單克隆抗體(CAT-002)沒(méi)有抑制f3-己糖胺酶(圖8-下曲線)。實(shí)施例5:用ELISA測(cè)定抗IgE抗體與血清中IgE的結(jié)合測(cè)定法說(shuō)明從來(lái)自人供體的血液樣品制備血清樣品。用150[J/孔的稀釋于PBS的1嗎/mlFcERI-Fc-His包凈皮96孑LELISA板(NuncMaxisorp,No.442404),在4°C下溫育過(guò)夜。過(guò)夜溫育后，將各板用含有0.05%Tween20(PBST,Medicago09-9401-100)的PBS洗滌三次。為減少背景結(jié)合，隨后將各板與200pl/孔的由含有0.5%BSA的PBS組成的封閉緩沖液一起，在室溫下溫育2小時(shí)，如上所述用PBST洗滌三次。將各樣品(含有不同數(shù)量的抗IgE抗體即抗體11的人血清或血漿)和標(biāo)準(zhǔn)樣(ImmunoCAP總IgE(人)校準(zhǔn)品，Phadia,Uppsala)在舍有0.05%Tween20的PBS中稀釋，在冰上保持，直到將它們以150pl/孔的體積施加到測(cè)定板。將各板密封，各樣品在室溫下溫育2小時(shí)。為除去未結(jié)合的樣品，如上所述用PBST洗滌各板三次。隨后加入150(il/孔的以0.25昭/ml濃度稀釋于PBST中的兔抗人IgE(D€l,30-1917-00,420036-02,841204,9911302,獲自Phadia，Uppsala),以檢測(cè)結(jié)合的人IgE。然后將各板再次密封，在室溫下溫育l小時(shí)。為除去未結(jié)合的兔抗人IgE抗體，如上所述用PBST洗滌各板三次。用HRP綴合的第二抗體(山羊抗兔IgG,HRP綴合.Pierce.0.8mg/ml)檢測(cè)兔抗人IgE。將綴合物1:25000稀釋于PBST,每孔加入150將各板密封，在室溫下溫育l小時(shí)。然后如上所述用PBST洗滌各板三次。然后向每個(gè)孔加入TMB-底物溶液(DAKO底物-色原，No.S1599),150)ul/孔，將各板在室溫下溫育IO分鐘。通過(guò)力口入150lal/孔的終止溶液(2MH2S04)停止反應(yīng)，在TecanSAFIRE儀上讀取450nm吸光度。由于IC50的測(cè)量取決于測(cè)定中的配體(即IgE)濃度，在本測(cè)定中，ICso將隨人血清樣品中存在的IgE配體量而變。在代表性的實(shí)驗(yàn)中，抗體11具有202pM的IC50[圖9]。在同一實(shí)驗(yàn)中，XoIairTM具有57nM的IC50。實(shí)施例6:IgE和純化的IgG之間的復(fù)合物形成的測(cè)量通過(guò)高效尺寸排阻液相層析法，對(duì)純化的人IgE和純化的抗IgEIgG(抗體ll)之間形成的免疫復(fù)合物進(jìn)行表征。另外，用在線多角度光散射(MALS)估計(jì)復(fù)合物大小。復(fù)合物是通過(guò)將IgE和IgG以三個(gè)不同的摩爾比(分別為3:1、1:1和l:3)在Dulbecco，sPBS中18。C溫育1小時(shí)來(lái)形成。對(duì)于l:l摩爾比，每個(gè)蛋白質(zhì)的濃度為2.5|iM。更高的比例是通過(guò)將相關(guān)蛋白質(zhì)的濃度增加到7.5pM來(lái)達(dá)到。將這些樣品在兩根串聯(lián)的Bio-S印-SEC-S4000柱(300x.8mm)上進(jìn)行分析。對(duì)柱子進(jìn)行平衡，樣品在AgilentHP1100HPLC系統(tǒng)上以1ml/min的流速在Dulbecco，sPBS中進(jìn)行分析。用二極管陣列檢測(cè)器于220和280nm處檢測(cè)各峰，還^吏洗脫液通過(guò)WyattTechnologiesDAWNEOS(MALS)和OptilabrEX(折光指數(shù))檢測(cè)器。l:l摩爾比樣品的層析產(chǎn)生出沒(méi)有完全分開(kāi)的、對(duì)應(yīng)于13.88分鐘和14.9分鐘保留時(shí)間的雙峰(由UV吸光度檢測(cè))。這些保留時(shí)間表明了IgE與IgG的非共價(jià)復(fù)合物的形成。MALS分析得出1，085kDa(13.88min峰)和702kDa(14.9min峰)的分子量。這些質(zhì)量與對(duì)應(yīng)于異型四聚體(預(yù)測(cè)質(zhì)量674kDa,2IgE:2IgG)和異型六聚體(預(yù)測(cè)質(zhì)量1010kDa，3IgE:3IgG)的復(fù)合物相一致。3:1和1:3(IgE:IgG)摩爾比樣品的層析分析和MALS分析得出與1:1樣品相似的譜圖，其中對(duì)應(yīng)于異型四聚體和異型六聚體的峰可由UV吸光度檢測(cè)。檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于樣品中過(guò)量IgE或IgG的另外的峰。實(shí)施例7:被種系化抗體ll結(jié)合的表位的測(cè)定使用X射線晶體學(xué)以原子分辨率測(cè)定蛋白質(zhì)的精確3維結(jié)構(gòu)，這是本領(lǐng)域公知的，已被用來(lái)使與抗體發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)的各部分得到詳細(xì)可視化(Padavattanetal,2007;Karpusasetd.，2001)。這是最權(quán)威性的表位作圖技術(shù)，但要求相當(dāng)?shù)墓ぷ髁亢陀匈囉谀軌颢@得質(zhì)量足夠高的晶體，而這又取決于蛋白質(zhì)樣品的純度和質(zhì)量以及能夠找到適當(dāng)結(jié)晶條件的竅門。一旦獲得蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物的晶體，用X射線對(duì)它們進(jìn)行輻照以產(chǎn)生衍射圖樣，這取決于精確的原子分布。衍射圖樣可由結(jié)晶學(xué)家分析，以確定結(jié)構(gòu)中的原子的三維位置坐標(biāo)。這使得可以詳細(xì)研究蛋白質(zhì)和抗體之間的相互作用位點(diǎn)。7J/g￡C^-CW在謬！合參的Z射i4'^傳潛栂^/定出于結(jié)構(gòu)測(cè)定的目的，將IgE結(jié)構(gòu)域Ce2-Ce3克隆、表達(dá)和純化。同樣，通過(guò)對(duì)開(kāi)發(fā)來(lái)結(jié)合IgE的完全抗體ll進(jìn)行消化和純化，制備Fab片段。復(fù)合物是這樣形成的混合，并通過(guò)尺寸排阻層析進(jìn)行純化以除去非復(fù)合的IgE結(jié)構(gòu)域和Fab分子。獲得了IgECe3-Cs4/Fab復(fù)合物的晶體，它們屬于三方晶系空間群P3221。將它們?cè)谖挥诜▏?guó)格勒諾布爾市(Grenoble)的歐洲同步輻射實(shí)驗(yàn)室(EuropeanSynchrotronRadiationFacility,ESRF)進(jìn)行分析。獲得了至2.85A分辨率的完全衍射數(shù)據(jù)?？墒褂肍ab片段的可變和恒定部分作為分別的搜索才莫型，通過(guò)分子置換(MolecularReplacement,Rossman,1972)對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，從而對(duì)晶體學(xué)不對(duì)稱單元中的Fab片段進(jìn)行定向和定97位。在非對(duì)稱單元中總共鑒定出三個(gè)Fab片段。隨后，可將三個(gè)IgECe3-Cs4分子放置在不對(duì)稱中心中。每個(gè)IgE二聚體能結(jié)合兩個(gè)Fab分子，從而不對(duì)稱單元總共包含一個(gè)半的完全I(xiàn)gE/Fab復(fù)合物。7.7j7g￡Ce3-CW/^傳/7FW復(fù)合參^全面^多迷晶體結(jié)構(gòu)表明，每個(gè)igECs3-Cs4二聚體以對(duì)稱或接近對(duì)稱的方式結(jié)合兩個(gè)Fab片段(圖10)。由于晶體的不對(duì)稱單元包含一個(gè)半的IgE/Fab復(fù)合物，此不完全復(fù)合物能通過(guò)二重軸與毗鄰的不對(duì)稱單元中的對(duì)稱相關(guān)伴侶形成二聚體。IgE二聚體的兩個(gè)分子(表示為IgEl和IgE2)能與抗體11的Fab片段發(fā)生相互作用。大部分的相互作用是由能與IgEl和IgE2兩者發(fā)生相互作用的Fab重鏈提供，而輕鏈僅被觀察到與IgEl發(fā)生相互作用?？乖谋砦恢饕挥诮Y(jié)構(gòu)域Cs3，其中位于結(jié)構(gòu)域C"中的鉸鏈近鄰的一個(gè)氨基酸作出了貢獻(xiàn)。晶體的不對(duì)稱單元中的IgECe3-Ce4和Fab之間的三個(gè)相互作用位點(diǎn)非常相似。但是，進(jìn)行精修(refinement)后清楚知道，有一個(gè)Fab分子其有序性比其他兩個(gè)Fab分子低得多。這在晶體結(jié)構(gòu)中是常見(jiàn)的，可由如下事實(shí)解釋在晶體當(dāng)中，特定的區(qū)域是柔韌的，能呈現(xiàn)不同的取向，使得電子密度不太明晰(wdldefined)。因此，在分析中不考慮這個(gè)Fab分子和它與IgECe3-Ce4分子所發(fā)生的相互作用。已知IgE在Fc區(qū)殘基Asn394處發(fā)生糖基化(Wurzburg等人)。在胰蛋白酶消化后通過(guò)質(zhì)譜分析對(duì)Fc糖基化的表征，顯示了三個(gè)不同的與Asn394結(jié)合的聚糖變體，組成核心結(jié)構(gòu)Man3GlcNAc2,并有2、3或4個(gè)己糖延伸出來(lái)，或許都是甘露糖(圖11)。的確，從所有三個(gè)IgECs3IgE結(jié)構(gòu)域的殘基Asn394,有延伸的電子密度突出到二聚體中的兩個(gè)IgE分子之間的空穴。該電子密度提示高甘露糖類型的結(jié)構(gòu)，每條鏈中可見(jiàn)兩個(gè)N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)和三個(gè)或四個(gè)甘露糖單元，這與質(zhì)譜分析相一致。在核心結(jié)構(gòu)外部只有一個(gè)己糖即與Man4偶聯(lián)的Man6在電子密度中可見(jiàn)，這表明其余的1-3個(gè)己糖是柔韌的。7.7.2羞在^g一/份p眞topg)^潛迷這個(gè)晶體結(jié)構(gòu)使得IgECs3-Cs4和Fab之間的表位相互作用得以在原子細(xì)節(jié)上進(jìn)行研究。在所解析的結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)獨(dú)立的IgE/Fab相互作用，排除了第三個(gè)Fab分子，因?yàn)樗碾娮用芏葓D4艮不清晰，對(duì)此將作描述。由用Cs位置(重疊，CCP41994)計(jì)算出的兩個(gè)相當(dāng)?shù)腇ab可變鏈片段之間0.31A的均方根差，和相當(dāng)?shù)母鱅gE單體之間分別為0.82和0.96A的均方根差表明，它們是十分相似的。盡管這個(gè)高相似性，兩個(gè)相互作用將分別進(jìn)行描述，并將分別表示為IgE/Fabl和IgE/Fab2。有關(guān)相互作用的細(xì)節(jié)收錄在表5和表6中，其中殘基號(hào)碼含有鏈代號(hào)(HC:Fab重鏈，LC:Fab輕鏈，IgEl，IgE2)。抗體11的氨基酸殘基的編號(hào)是根據(jù)Kabat體系(Kabat等人，1991)。距離是用CCP4程序CONTACT(CCP4,1994)獲得。兩個(gè)相互作用都涉及來(lái)自抗體片段的重鏈和輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、來(lái)自構(gòu)架(Fab的CDR外部的區(qū)域)的殘基和來(lái)自IgECs3-Cs4單體中的兩個(gè)單體的氨基酸殘基?？贵w輕鏈與IgECs!3-Cs々二聚體中的IgEl發(fā)生相互作用，而重鏈與兩個(gè)單體都發(fā)生相互作用。但是，大部分的接觸是在抗原的重鏈和單體IgE2之間。這兩個(gè)相互作用在下文作詳細(xì)描述。7.1.3Fabl和IgE的相互作用-相互作用1的詳細(xì)描述定義IgECs3-Cs4的表位的相互作用位點(diǎn)覆蓋著1100人2的面積(用程序areaimol計(jì)算，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)CCP4，1994)，由IgEl的氨基酸殘基Glu390至Asn394包括端點(diǎn)在內(nèi)和抗原的IgE2中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Glu472組成。另夕卜，糖部分即IgEl中的GlcNAcl和Man6和IgE中的Man5與Fab分子發(fā)生接觸。與抗原相互作用的重鏈的氨基酸殘基，包括糖部分在內(nèi)，來(lái)自CDRl:Tyr32,來(lái)自CDR2:Asp53和Asn54，來(lái)自CDR3:Va95、Met96、IelOO、GlylOOb、GlylOOc、AsplOl和Tyrl02,和來(lái)自構(gòu)架Glul、Lys23、Thr30、Ala71至Arg77包括端點(diǎn)在內(nèi)和Tyr79。由Fab輕鏈貢獻(xiàn)的殘基是來(lái)自CDR2的Asp50和Ser56和來(lái)自構(gòu)架的Leu46和Tyr49。相互作用除了非極性范德華接觸外,還包括19個(gè)氫鍵。7.1.4Fabl和IgE的相互作用——^目互作用2的詳細(xì)描述定義IgECs3-Cs4的表位的相互作用位點(diǎn)覆蓋著1165A2的面積(用程序areaimol計(jì)算，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)CCP4，1994),由IgEl的氨基酸殘基Glu390、Gln392至Asn394包括端點(diǎn)在內(nèi)和抗原的IgE2中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Glu472組成。另夕卜，糖部分即IgEl中的GlcNAcl和Man6與Fab重鏈發(fā)生接觸。與抗原相互作用的重鏈的氨基酸殘基，包括糖部分在內(nèi)，來(lái)自CDR1:Tyr32，來(lái)自CDR2:Pro52a、Asp53和Asn54,來(lái)自CDR3:Val95、Met96、IlelOO、Glyl00b、Glyl00c、AsplOl和Tyrl02，和來(lái)自構(gòu)架Glul、Lysl9、Lys23、Thr30、Ala71至Ser75包括端點(diǎn)在內(nèi)、Arg77和Tyr79。由Fab輕鏈貢獻(xiàn)的殘基是來(lái)自CDR2的Ser56和來(lái)自構(gòu)架的Tyr49。相互作用除了非極性范德華接觸外，還包括19個(gè)氫鍵。表5:IgECs3-Cs4和抗體llFab之間的直接相互作用，相互作用1鏈Fab殘基Fab單體IgE殘基IgE距離(A)Tyr32OHIgElGlcNAc1072.58Met960IgElAsn394ND23.08GlylOObOIgElArg393NH12.60Gly100c0IgElArg393NE2.80Tyr102OHIgElGlcNAc1063.08Asp530IgE2Met430N2.83Asp530IgE2Arg431NHl2.67Asp53OD1IgE2Arg431NH12.77Asp53OD1IgE2Arg431NH22.60Ala710IgE2Ser432OG2.64Asp72OD2IgE2Arg342NH13.06Asp72OD2IgE2Thr434N3.02Asp72OD2IgE2Thr43402.97Thr73OG1IgE2Ser432N2,79鍵cccccccccccccc々^HHHHHHHHHHHHH鏈Fab殘基Fab單體IgE殘基IgE距離(A)HCThr73OG1IgE2Ser43203.05HCSer74NIgE2Ser43203.08HCSer74OGIgE2Arg342NH13.10HCSer74OGIgE2Thr433OG12.87HCArg77NH1IgE2Glu472OE22.56非極性接觸〈4ALeu46IgElArg3933.79LCTyr49IgElGln3923.85Tyr49IgElArg3933.66LCAsp50IgElArg3933.71IXSer56IgElGlu3903.47LCSer56IgElLys3913.87HCGlu1IgElMair63.40HCVal95IgElArg3933.49HCHe100IgElArg3933.55HCAsp101IgElArg3933.50HCMet96IgElGlcNAc13.67HCLys23IgE2Glu4723.43HCThr30IgE2Arg4313.80HCAsp53IgE2Leu4293.34HCAsn54IgE2Ala4283.45HCAsp72IgE2Ser4323.22HCAsp72IgE2Thr4333.53HCThr73IgE2Met4303.98HCThr73IgE2Arg4313.22HCSer74IgE2Leu3403.33HCSer75IgE2Arg3423.32HCAsp76IgE2Man53.27HCArg77IgE2Thr4363.84HCTyr79IgE2Thr4363.43HCTyr79IgE2Ser4373.27用于氫鍵的距離截值(cut-off)是3.2A,用于非極性相互作用的是4.0A表6:IgECs3-Cs4和抗體11Fab之間的直接相互作用，相互作用2鏈Fab殘基Fab單體IgE殘基IgE距離(A)氫鍵ECSer56OGIgElGlu390OE12.44Ser56OGIgElGlu390OE22.99HCTyr32OHIgElGlcNAc1072.41HCGly100b0IgElArg393NH22.58HCGly100c0IgElArg393NE3.011鏈Fab殘基Fab單體IgE殘基IgE^巨離(A)HCTyr102OHIgElGlcNAc1062.73HCAsp530IgE2Met430N2.74HCAsp530IgE2Arg431NH12.62HCAsp53OD1IgE2Arg431NH12.88HCAsp53OD1IgE2Arg431NH22.65HCAla710IgE2Ser432OG2.87HCAsp72OD1IgE2Ser432O3.〗3HCAsp72OD2IgE2Arg342NH13.17HCAsp72OD2IgE2Thr434O3.UHCThr73OG1IgE2Ser432N2.94HCSer74NIgE2Ser432O3.17HCSer74OGIgE2Arg342細(xì)3.00HCSer74OGIgE2Thr433OG12.77HCTyr79OHIgE2Ser437N3.09非極性接觸<4ALCTyr49IgElGin3923.76LCTyr49IgElArg3933.63IXSer56IgElGln3923.89HCGlulIgElMan63.25HCVal95IgElArg3933.48HCMet96IgElGlcNAc13.68HCMet96IgElAsn3943.31HCHe100IgElArg3933.44HCAsp101IgElArg3933.81HCLys19IgE2Ser4373.53HCLys23IgE2GIu4723.70HCThr30IgE2Arg4313.88HCPro52aIgE2Met4303.95HCAsp53IgE2Leu4293.51HCAsn54IgE2Met4303.90HCAsn54IgE2Ala4283.47HCAsp72IgE2Thr4333.61HCThr73IgE2Arg4313.26HCSer74IgE2Leu3403.30HCSer75IgE2Arg3423.55HCArg77IgE2Thr4363.88HCArg77IgE2Glu4723.27HCTyr79IgE2Thr4363.37用于氫鍵的距離截值(cut-off)是3.2A,用于非極性相互作用的是4.0A實(shí)施例7的材料和方法IgECs3-C"的過(guò)量表達(dá)102勿腐和絲差在本研究中，使用了穩(wěn)定表達(dá)EpsteinBarr病毒核抗原-l基因的原始貼壁細(xì)胞系HEK293-EBNA(Invitrogen,斯德哥爾摩，瑞典)。使細(xì)胞適應(yīng)懸浮生長(zhǎng)，然后通過(guò)逐步培養(yǎng)基置換轉(zhuǎn)移(Davies等人2005)到DHI培養(yǎng)基。所用的Dffl培養(yǎng)基與原先描述的稍有不同之處在于不含CA2+。在適應(yīng)后，制備工作細(xì)胞庫(kù)，將兩個(gè)細(xì)胞系在無(wú)CA2+的Dffl培養(yǎng)基中常規(guī)生長(zhǎng)多達(dá)20代，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有4mM谷氨酰胺、2%v/v超低IgG胎牛血清、250jig/mlG418(均獲自Invitrogen,斯德哥爾摩:瑞典)和0.1%w/vPluronicF68(Sigma-Aldrich，斯德哥爾摩，瑞典)。絲餅在水中制備線性25kDa聚乙烯亞胺(PolysciencesEurope,Eppenheim,德國(guó))的lmg/ml儲(chǔ)備溶液，pH調(diào)至7.0，無(wú)菌過(guò)濾，以小等分試樣保藏在-80。C下備用。在轉(zhuǎn)染前不久，在非補(bǔ)加DHI培養(yǎng)基中，以相當(dāng)于十分之一轉(zhuǎn)染體積的體積，制備轉(zhuǎn)染混合液(cocktail)。為制備轉(zhuǎn)染混合液，將Dffl培養(yǎng)基分成兩半。將0,8jugDNA/ml轉(zhuǎn)染體積加到一半的DHI培養(yǎng)基，向另一半培養(yǎng)基加入2嗎PEI/ml轉(zhuǎn)染體積。對(duì)兩個(gè)溶液稍作振蕩并將它們溫育5分鐘后，將DNA溶液慢慢加到PEI溶液。將轉(zhuǎn)染混合液在室溫下溫育20-30分鐘，然后加到Wave生物反應(yīng)器(WaveBiotechAG,Tagelswangen，瑞士)。轉(zhuǎn)染后四小時(shí)，將培養(yǎng)4勿用才卜力口DHI培養(yǎng)基和HypPep1510(KerryBio-Sciences，Almere,荷蘭)加到最終生產(chǎn)體積至0.3%(w/v)的最終濃度。為擴(kuò)增種子培養(yǎng)物，將細(xì)胞在放在定軌振蕩器培養(yǎng)箱(InforsAG，Bottmingen，瑞士)中的塑料振蕩瓶中37。C，5%0)2氣氛下生長(zhǎng)。細(xì)胞每周兩次常規(guī)進(jìn)行傳代，達(dá)到大約2x106個(gè)細(xì)胞/1111,再進(jìn)行分割。Cedex自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器(InnovatisAG,Bielefeld,德國(guó))評(píng)估細(xì)胞密度和活力。對(duì)于Wave培養(yǎng)物，在轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞分割成lxl(^個(gè)細(xì)力包/ml，以確保它們?cè)趯?shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。Wave培養(yǎng)物直接從振蕩器接種。所有種子培養(yǎng)物都通過(guò)離心進(jìn)行濃縮，重懸在新鮮的培養(yǎng)基中，然后加到生物反應(yīng)器中。在Wave生物反應(yīng)器(WaveBiotechAG，Tagelswangen，瑞士)中以10L的工作體積進(jìn)行表達(dá)。給Wave生物反應(yīng)器的4.5L補(bǔ)加Dffl培養(yǎng)基接種至lx106個(gè)細(xì)胞/1111。2小時(shí)適應(yīng)期后，用0.5L轉(zhuǎn)染混合液轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染后四小時(shí)，將培養(yǎng)物用補(bǔ)加Dffl培養(yǎng)基和HypPepl510加到10L總體積至0.3。/。(w/v)的最終濃度。每日提取樣品，測(cè)定細(xì)胞密度、活力和蛋白質(zhì)濃度。表達(dá)載體表達(dá)具有C末端Flag標(biāo)簽和10組氨酸標(biāo)簽的人IgECs3-Cs4載體，衍自Persic等人(1997)所描述的載體。該系統(tǒng)處于EFl-a啟動(dòng)子的控制下。IgECs3-Cs4的純化將20L的細(xì)胞上清液濃縮五倍，用10kDa分子量截?cái)噱e(cuò)流膜(Pellicon2，Mmipore)透析到2xPBS(308mMNaCl,20mM磷酸鹽，pH7,4)。將培養(yǎng)基在4。C下與30mLNiSepharose(GEHealthcare)批量結(jié)合兩小時(shí)，用五體積的2xPBS洗滌，裝到XK26柱中。然后將柱子用五柱體積的40mM咪唑(于2xPBS中)洗滌，以洗去污染性蛋白質(zhì)。最后用400mM咪唑(于2xPBS中)洗脫IgE。集合液(pool)含有高純度的IgE,將其濃縮約四倍(至5mg/mL),然后用2xPBS作為運(yùn)行緩沖液使其流過(guò)Superdex20050/60SEC柱(1200mL，GEHealthcare)。一些較大的蛋白質(zhì)被分離出來(lái)，IgE存在于主峰中。只將主峰流份進(jìn)行集合，因?yàn)槠渌麅蓚€(gè)流份中有污染。這個(gè)步驟將樣品的純度提高到~99%。所產(chǎn)生的總量為42mg,純化的IgE具有2mg/mL的濃度。IgECs3-Cs4的糖基化的分析^應(yīng)奢冷滲^溶^哞凍必將人IgE最小結(jié)構(gòu)域，IgECe3-Ce4,2mg/ml，于2xPBS(組成308mMNaCl，20mM磷酸鹽，pH7.4)中，與100|al胰蛋白酶0.02mg/ml于25mMNH4HC03中進(jìn)行混合。在37°C下過(guò)夜進(jìn)行消化，用2Jul曱酸水溶液(67%)終止。7V譜-丄CMS/MSV在與LTQ-Orbitrap質(zhì)i普儀(Thermo)連接的、裝有ReproSil-PurC18-AQ3jum多孔顆粒的20cmx50inm內(nèi)徑熔融二氧化硅柱上進(jìn)行分析。進(jìn)行8iul樣品注射(Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器)，分離前使肽捕集在4.5cmxlOOjum內(nèi)徑的前柱上。用0.1。/。曱酸線性運(yùn)行5分鐘后，在5-30分鐘期間梯度為10-50%乙腈(Agilent),200nl/min,洗脫液/人發(fā)射極尖端(emittertip)進(jìn)行電噴霧。儀器以數(shù)據(jù)依賴性模式操作，以在三種最豐富的多重質(zhì)子化離子的Orbitrap(FT-MS)全譜掃描(surveyscan)和離子阱(IT-MS/MS)之間切換。靜態(tài)電噴霧MS/MS:為驗(yàn)證糖肽片段的電荷狀態(tài)，將選定的前體用ESI針在1.6kV下分析，在與nano-LC分析中的線性離子阱相對(duì)的Orbitrap中片段化和檢測(cè)。糖肽數(shù)據(jù)分析用GlycoMod工具(http:expasy.org/tools/glycomod)(Cooper等人，2001)檢查可能的糖肽的計(jì)算MH"質(zhì)量，確定是否存在糖基化。輸入蛋白質(zhì)序列和10ppm的質(zhì)量偏差。對(duì)所有提議的糖肽檢查是否存在105含聚糖的片段?？贵w11Fab的產(chǎn)生/gG趟必用MabSelectSuRe(GEHealthcare)A蛋白層析介質(zhì)，從CHO-EBNA瞬態(tài)物質(zhì)純化抗體11。用PD-10柱(GEHealthcare)將A蛋白洗脫液進(jìn)行緩沖液交換到PBS,pH7.2,然后用Millex-GP注射針頭濾器(Millipore)進(jìn)4亍0.22jam過(guò)濾?？孰u和遂必制備了30mMDL-鹽酸半胱氨酸溶于GIBCOPBS(Invitrogen)的消化緩沖液。將來(lái)自木瓜乳的木瓜蛋白酶(Sigma)在消化緩沖液中復(fù)溶，產(chǎn)生10mg/mL溶液，使用前在室溫下保持最少30分鐘。將半胱氨酸加到抗體11IgG,產(chǎn)生30mM溶液，并將木瓜蛋白酶以lmg木瓜蛋白酶比lOOmgIgG的比例加入。在90分鐘后，通過(guò)加入0.5M碘代乙酰胺(Sigma)以在最終消化混合物中產(chǎn)生50mM碘代乙酰胺，來(lái)終止消化。用MabSelectSuRe(GEHealthcare)A蛋白層析介質(zhì)，以非結(jié)合模式從消化混合物純化Fab。用PD-10柱(GEHealthcare)將得自MabSelectSuRe步驟的Fab流份進(jìn)行緩沖液交換成50mM乙酸鈉/100mMNaCl,pH5.5，然后用AmiconUltra-155kDaMWCO離心過(guò)濾器裝置(Millipore)濃縮至10mg/mL。將最終產(chǎn)物用MustangQacrodisc(Pall)進(jìn)一步純化，然后用Millex-GP注射針頭濾器(Millipore)進(jìn)行0.22,過(guò)濾。/g￡CW-在傳J7尸"6茇合參將2mg/mL的IgECs3-Cs4溶液(于308mMNaCl和20mM磷酸鹽，pH7.4緩沖液中)與10.6mg/mL的抗體11Fab溶液(于50mM乙酸鈉，100mMNaCl,pH5.5中)，以IgEFc3-4同型二聚體分別和抗體11Fab異型二聚體的1-1.1的化學(xué)計(jì)量比例進(jìn)行混合。將混合液水中放置過(guò)夜，然后在平#]"于20mMTrisHC1pH7.6和0.15MNaCl的HiLoadSuperdex20016/60柱(GEHealthcare)上進(jìn)行凝膠過(guò)濾。收集含有復(fù)合物的主峰，濃縮至10.4mg/mL,以備用于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。/g五Cd-CW戎傳〃Fa6復(fù)合參^潛^結(jié)晶按照設(shè)置液滴蒸汽擴(kuò)散的方法進(jìn)行。液滴含有等體積的蛋白質(zhì)和儲(chǔ)存溶液(reservoirsolution)(150+150nL)，建立具有80uL儲(chǔ)存體積(reservoirvolume)的CrystalQuick96孑L;f反(GreinerBio-one)中。使復(fù)合物晶體在具有100mMMgCl2,100mM檸檬酸鈉pH5.0和15%PEG4000的儲(chǔ)存溶液的液滴中4°C下生長(zhǎng)2-3周時(shí)間。將晶體收獲到抗凍溶液(100mMMgCl2,100mM檸4象酸鈉pH5.0和15%PEG4000，通過(guò)添加100%甘油制備20%甘油(made20%glycerolbyadditionof100%glycerol)),在液氮中快速冷卻。/gECW-CW戎#尸a6,^參^炎拔炎桌*潛<###在法國(guó)格勒諾布爾市的歐洲同步輻射實(shí)驗(yàn)室(ESRF)，以光束線(beamline)ID-29從單晶收集衍射數(shù)據(jù)。初始數(shù)據(jù)集(數(shù)據(jù)集1，表7)記錄至3A分辨率，然后更高分辨率數(shù)據(jù)集收集至2.85A分辨率，兩者均屬空間群P3221。數(shù)據(jù)用autoPROC(GlobalPhasingLimitedGPhL，Cambridge,英國(guó))進(jìn)行加工。從數(shù)據(jù)加工獲得的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)在表7中給出。不對(duì)稱單元含有三個(gè)Fab分子和三個(gè)對(duì)應(yīng)于54%的溶劑含量的IgECs3-Cs4分子。用程序PHASER(Read2001,Storoni等人，2004,McCoy等人，2005)通過(guò)分子置換的方法對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。Fab片段和IgEFc結(jié)構(gòu)域的初始模型從之前報(bào)道的結(jié)構(gòu)1AQK(Faber等人:1998)和1FP5(Wurzburg等人，2000)產(chǎn)生。因?yàn)榭勺兘Y(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈區(qū)中的角度的變化，使用整個(gè)Fab作為搜索模型失敗了。相反，在PHASER(Read2001,Storoni等人，2004,McCoy等人，2005)的初次運(yùn)行中，制備和鑒定了兩個(gè)單獨(dú)的由可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域分別組成的搜索^^莫型。隨后將這兩個(gè)模型連接以完成Fab片段。以這種方式總共鑒定了兩個(gè)Fab片段和一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域。隨后運(yùn)行幾次分子置換定位了三個(gè)IgECs3-Cs4分子，其中一個(gè)必須進(jìn)行削減(trimback)以僅包含結(jié)構(gòu)域4。在這個(gè)階段，已收集到更好質(zhì)量的數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)集2，表7),用程序autoBUSTER(GlobalPhasingLimitedGPhL,Cambridge,英國(guó))將這個(gè)模型對(duì)新數(shù)據(jù)進(jìn)行精修。隨后，用圖形程序COOT(Emsley&Cowtan2004)將Fab分子的氨基酸人工改成抗體11的正確序列。用Refmac(CCP41994)中的各向同性B因子作第二輪的約束最大或然性精修(restrainedmaximum-likelihoodrefinement)后,將最后的Fab和IgE分子的其余結(jié)構(gòu)域人工擬合到電子密度。觀察到伸長(zhǎng)的電子密度的兩個(gè)額外特征，即從氨基酸殘基Asn394突出到IgE分子之間的空穴中。這被解釋為糖基化，因此將兩個(gè)N-乙酰-葡糖胺和三至四個(gè)甘露糖單元加到IgE模型。更多輪精修包括在COOT(Emsley&Cowtan2004)中人工重建環(huán)區(qū)，并間以在autoBUSTER(GlobalPhasingLimitedGPhL,Cambridge,UK)或Refmac5(Murshudov等人，1997)中將TLS應(yīng)用于各個(gè)結(jié)構(gòu)域和將非晶體學(xué)對(duì)稱性(NCS)約束應(yīng)用于IgE分子進(jìn)行精修。用Refmac5(Murshudov等人，1997)中的"裝水(waterpicking)"選項(xiàng)共裝入213個(gè)水分子，然后進(jìn)行人工檢查。在最后一輪精修，解除NCS約束，產(chǎn)生出最終模型，其中R=20.0%和Rfree-27.00/。。表7:晶體參數(shù)和X射線數(shù)據(jù)-加工和精修統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)__數(shù)據(jù)集..l數(shù)據(jù)集2空間群^"~波長(zhǎng)(A)0.97<5ft976細(xì)胞常數(shù)a(A)b(A)爐62",5(52c(A)分辨率范圍(A)—7卯."分辨率最高殼(shdl)(A)這-292完全性總體(％)，/歸完全性最高殼(％)皿0反射，獨(dú)特多樣性10.7多樣性最高殼11.0Rmerge總體C5/0)10.1330.099Rmerge最高殼(％)0.9140.75平均值(I)/標(biāo)準(zhǔn)偏差(1)13.120.2平均值(iy標(biāo)準(zhǔn)偏差(i)最高殼R值匿al1(0/0)2編扁R值free(0/0)柳27.01EmergefSM/[(S,:|/,-</>|)/&力]2lvaluell尸obsl_l尸calcll/4/|F0bs|^free是對(duì)5%獨(dú)特反射的試驗(yàn)集計(jì)算的交叉驗(yàn)證R因子實(shí)施例7中引用的參考文獻(xiàn)DaviesA.GreeneA.LullauE.AbbottWM.Optimisationandevaluationofahigh-throughputmammalianproteinexpressionsystem(高通量哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化和評(píng)估).Prate/"五xpmw/o"&Pwn;/ca"o".42(1):111-21.(2005)CCP4(CollaborativeComputationalProject,Number4)(1994)TheCCP4suite:programsforproteincrystallography(CCP4套4牛蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)的程序).^ctoCoAyto〃ogrD50:760—763CooperC.A.,GasteigerE.,PackerN.GlycoMod-AsoftwareToolforDeterminingGlycosylationCompositionsfromMassSpectrometricData(GlycoMod-從質(zhì)譜數(shù)據(jù)測(cè)定糖基化組成的軟件工具)Prafeom/cs1:340-349(2001).Emsley,P.&Cowtan,K.Coot:model-buildingtoolsformoleculargraphics(分子圖形學(xué)的建模工具).^ctoO^to//ogrD60:2126-2132(2004)Faber,C.,Shan,L.,Fan,Z.,Guddat,L.W.,Furebring，C.,Ohlin,M.,Borrebaeck,C.A.,Edmundson,A.B.Three-dimensionalstructureofa'humanFabwithhighaffinityfortetanustoxoid(對(duì)破傷風(fēng)類毒素有高親和力的人Fab的三維結(jié)構(gòu))./m,"otec/z"o/og^J.253-270(1998)Kabat，E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.和Foeller,C.(1991)iSe《Mewc&yo/o/7mm柳o/og7:ca//wfez-e"(《免疫相關(guān)蛋白質(zhì)的序列》)，F(xiàn)ifthEdition.NIHPublicationNo.91-3242.Karpusas，M.,Lucci,J.,Ferrant，J.,Benjamin,C.,Taylor,F.R.，Strauch,K.,Garber,E.,Hsu,Y.M.(2001)StructureofCD40ligandincomplexwiththeFabfragmentofaneutralizinghumanizedantibody(與中和性人源化抗體的Fab片段復(fù)合的CD40配體的結(jié)構(gòu)).5Vra"臟9,321，(2001)LeslieA.(1991)Macromoleculardataprocessing(大分子數(shù)據(jù)處理).InMoras,D.,Podjarny,A.D.和Thierry,J.C.(eds)，C，to〃ogra盧.cC師pi"zVgOxfordUniversityPress,Oxford,UK,pp.27—38McCoy,A丄，Grosse-Kunstleve，R.W.，Storoni,L.C.&Read,R丄Likelihood-enhancedfasttranslationfunctions(或然'寸生i曾強(qiáng)的'l"夬速翁3i奪'功能).」cto458-464(2005)Murshudov,G.N.,Vagin,A.A.,和Dodson,E.J.(1997)RefinementofMacromolecularstructuresbythemaximum-likelihoodmethod(用最大或然性法精修大分子結(jié)構(gòu)),爿cto0^^//0^053:240-255Padavattan，S.,Schirmer,T.，Schmidt,M.,Akdis,C.,Valenta,R.,Mittermann,I.,Soldatova,L.,Slater,J.,Mueller,U.&Markovic-Housley:Z.IdentificationofaB-cellEpitope'ofHyaluronidase,aMajorBeeVenomAllergen,fromitsCrystalStructureinComplexwithaSpecificFab(從透明質(zhì)酸酶這種主要蜂毒過(guò)敏原的B細(xì)胞表位與特異性Fab110復(fù)合的晶體結(jié)構(gòu)對(duì)該表位的鑒定).J"Mo/5z'o/368,742-752.(2007)PersicL.RobertsA.WiltonJ.CattaneoA.BradburyA.HoogenboomHR.Anintegratedvectorsystemfortheeukaryoticexpressionofantibodiesortheirfragmentsafterselectionfromphagedisplaylibraries(從噬菌體展示文庫(kù)選擇后用于抗體或它們的片段的真核生物表達(dá)的集成載體系統(tǒng)).187(1):9-18.(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(shù)目(x109/L,以相對(duì)于2個(gè)投與前數(shù)值的平均值的變化百分?jǐn)?shù)表示)對(duì)血漿濃度的曲線圖。這個(gè)曲線圖代表了3個(gè)組中其他16只沒(méi)有顯示對(duì)血小板的顯著作用的動(dòng)物[抗體11動(dòng)物的變化]。圖15顯示在第29天呈現(xiàn)血小板數(shù)目短暫顯著下降(比基線值低35°/。)的組1動(dòng)物(用抗體11IgGl處理)的相同曲線圖。有趣的是，在第29天投藥后呈現(xiàn)血小板數(shù)目短暫降低的用抗體11IgGl處理的猴子，在這個(gè)時(shí)間具有最高的Cmax值(29400nmol/L)(但不暴露)。血漿水平隨后劇烈下降，血小板計(jì)數(shù)回復(fù)到投藥前數(shù)值。這暗示這樣的可能性，即可能需要更高的血漿濃度閾值來(lái)引起血小板數(shù)目的下降。但是，有一只用E48處理的動(dòng)物達(dá)到類似的水平(28500nm/L),沒(méi)有相應(yīng)的血小板作用(圖l4)。其他血液學(xué)作用除了血小板計(jì)數(shù)外(見(jiàn)下文)，在大多數(shù)的血液學(xué)參數(shù)(血紅蛋白濃度、細(xì)胞密實(shí)體積、平均細(xì)胞體積、平均細(xì)胞血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度、血小板比積、血小板分布寬度、紅血細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均細(xì)胞血紅蛋白、血紅蛋白分布寬度、平均血小板體積、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、總體和差異白血病計(jì)數(shù))和凝血參數(shù)(凝血素時(shí)間、活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間)上，沒(méi)有記錄到單克隆抗體治療的一致性作用。在所有的組中觀察到網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)目的增加，但是這個(gè)變化不是劑量/暴露相關(guān)性的，在組中不一致(組中的各動(dòng)物具有相比于投藥前數(shù)值更高、更低或不變的水平)或者在動(dòng)物中不一致(在各時(shí)間點(diǎn)之間動(dòng)物中的數(shù)值不依賴于暴露而升降)，且在平行對(duì)照組不存在下，在這個(gè)時(shí)間不能完全確定與單克隆抗體治療的關(guān)系。任何這種變化在恢復(fù)期結(jié)束時(shí)通常已逆轉(zhuǎn)。沒(méi)有記錄到對(duì)補(bǔ)體激活(C5a、C3a或BB片段)的顯著治療相關(guān)作用。討論和結(jié)論本研究證實(shí)，抗IgE單克隆抗體即抗體11IgG,、抗體11IgG2和E48當(dāng)以反復(fù)的高劑量水平(最高達(dá)100mg/kg)給予幼齡食蟹猴時(shí)，受到很好地耐受，沒(méi)有顯著的不良毒理學(xué)作用。在18只猴子當(dāng)中只有1只在投與100mg/kg抗體11IgG,后的單個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯示出顯著的血小板數(shù)目下降，此時(shí)單克隆抗體的血漿濃度達(dá)到幾乎30000nmol/L。本研究中所有三種單克隆抗體所達(dá)到的血漿Cmax濃度，預(yù)期遠(yuǎn)超過(guò)在臨床中將會(huì)達(dá)到的濃度(例如200nmol/L)。實(shí)施例9:IgE對(duì)FcgRI和CD23的作用的功能抑制在文編自Bracher等人，(JournalImmunol.Methods2007323:160-171)的IgE介導(dǎo)細(xì)胞殺滅測(cè)定中，評(píng)估優(yōu)化的抗體11在功能上抑制IgE與FceRI和CD23的相互作用的能力。證實(shí)用IL-4預(yù)處理的U937細(xì)胞能表達(dá)FceRI和CD23。當(dāng)在對(duì)IGROVl細(xì)胞上表達(dá)的抗原有特異性的IgE存在下與卵巢腫瘤細(xì)胞IGROVl共培養(yǎng)時(shí)，U937細(xì)胞能夠殺滅腫瘤細(xì)胞。該殺滅是通過(guò)細(xì)胞毒性和吞噬作用這兩種機(jī)制介導(dǎo)的，這兩種機(jī)制被證實(shí)通過(guò)IgE分別與U937效應(yīng)細(xì)胞上的FceRI和CD23的相互作用引發(fā)。在本測(cè)定中評(píng)估了抗體11和同種型對(duì)照是否能抑制通過(guò)FceRI或CD23進(jìn)行的IgE介導(dǎo)殺滅。這個(gè)程序的詳細(xì)方案在"材料和方法"中提供。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將試驗(yàn)IgG的被滴定液與靶標(biāo)特異性(MOvl8)或非相關(guān)(NIP)IgE混合，然后與IL-4刺激的U937效應(yīng)細(xì)胞和標(biāo)記的IGROVl耙標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行溫育。溫育2.5小時(shí)后，將細(xì)胞洗滌，用抗CD89-藻紅蛋白抗體(BDBiosciences)和硪化丙錠(MolecularProbes)染色。洗滌后，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BDBiosciences)分析細(xì)胞焚光。上述熒光染料用來(lái)將活細(xì)胞與被細(xì)胞毒性殺滅的細(xì)胞和被吞噬作用殺滅的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。與同種型對(duì)照抗體相反，抗體ll能夠同時(shí)抑制IgE/FcsRI介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(圖16)和IgE/CD23介導(dǎo)的吞噬作用(圖17)。材詳+和方法-實(shí)施例9評(píng)估抗體是否能抑制U937細(xì)胞的IgE介導(dǎo)IGROVl肺瘤細(xì)胞殺滅。采用標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)程序，將IGROVl細(xì)胞(人卵巢癌細(xì)胞系)和U937細(xì)胞(人骨髓單核細(xì)胞系)保持在培養(yǎng)基[RPMI1640，10%v/vFCS:2mM谷氨酰胺，5000U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素(均獲自Invitrogen)]中?？笽GROVl細(xì)胞上表達(dá)的FBP(葉酸結(jié)合蛋白)的MOvl8IgE用作肺瘤特異性抗體。NIP(半抗原4-羥基-3-硝基-苯乙酰)特異性IgE用作對(duì)照非相關(guān)抗體。MOvl8和NIP抗體按Gould等人，(1999)Eur.J.Immunol.29:3527-3537中所述制備。在殺滅實(shí)驗(yàn)前用10ng/ml重組人IL-4(R&DSystems)對(duì)IJ937細(xì)胞預(yù)處理4天，以上調(diào)CD23的表達(dá)。在殺滅實(shí)驗(yàn)前一天，將IGROV1把標(biāo)細(xì)胞用熒光染料CFSE(羧基-二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯，MolecularProbes)進(jìn)行標(biāo)記。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將細(xì)胞用胰蛋白酶處理(胰蛋白酶/EDTA,Gibco),在培養(yǎng)基中洗滌，以50xl06個(gè)細(xì)胞/ml重懸于PBS中。然后將細(xì)胞與0.01mM的CFSE在37。C下溫育IO分鐘。標(biāo)記后，將細(xì)胞在冰冷的培養(yǎng)基中洗滌一次，然后在37°C,5%C02下溫育過(guò)夜。為評(píng)估抗體11的抑制作用，在12x75mm管子(Falcon，BDBiosciences)中制備抗體稀釋液，加入2ug的MOvl或NIPIgE,產(chǎn)生80ul的最終體積。將此混合物在不加細(xì)胞情況下溫育30分鐘。將IL-4刺激的U937細(xì)胞在培養(yǎng)基中洗滌一次，以1.33xl()S個(gè)細(xì)胞/ml重懸。將CFSE標(biāo)記的IGROV1細(xì)胞用胰蛋白酶處理，在培養(yǎng)基中洗滌一次，以4xl()S個(gè)細(xì)胞/ml重懸。將細(xì)胞加到含有抗體(對(duì)于U937細(xì)胞為120ul,對(duì)于IGR0V1細(xì)胞為200ul)的管子中，混合，在37°C,5%C02下溫育2.5小時(shí)。然后將細(xì)胞在冰冷的FACS緩沖液(無(wú)鈣/^美的PBS,5%正常山羊血清)中洗滌，與抗CD89-藻紅蛋白抗體(BDBiosciences,10ug/ml)—起溫育25分鐘，以標(biāo)記U937效應(yīng)細(xì)胞。將細(xì)胞在冰冷的FACS緩沖液再洗滌一次，加入0.25ug/ml石輿化丙錠(MolecularProbes)對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色。在4GC下15分鐘后，將細(xì)胞在水冷的FACS緩沖液中洗滌，重懸在250ul冰冷的FACS緩沖液中，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BDBiosciences)按照生產(chǎn)商說(shuō)明書分析焚光。用具有相關(guān)單一染色的細(xì)胞調(diào)整檢測(cè)通道(FL1、FL2和FL3)的電壓和補(bǔ)償。本測(cè)定中所用的熒光染料的組合使得可以對(duì)不同的細(xì)胞群體進(jìn)行門選(gating)[活效應(yīng)細(xì)胞(藻紅蛋白陽(yáng)性)、被吞噬的IGROV1腫瘤細(xì)胞(藻紅蛋白和CFSE陽(yáng)性)、活肺瘤細(xì)胞(CFSE陽(yáng)性)、死腫瘤細(xì)胞(CFSE和硤化丙錠陽(yáng)性)、死效應(yīng)細(xì)胞(藻紅蛋白和碘化丙錠陽(yáng)性)]。這些門(gate)用來(lái)計(jì)算被FcsRI介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(方程l)和被CD23介導(dǎo)的吞噬作用(方程2)殺滅的靶標(biāo)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。方程l:%細(xì)胞毒性"[(R1SL對(duì)照—R1)+R3]/R1SL}x100式中Rl=CFSE陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的總數(shù)R3=被殺滅但完整的腫瘤細(xì)胞(無(wú)片段化或吞噬)的數(shù)目R1SL對(duì)照=無(wú)抗體的效應(yīng)細(xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞的3個(gè)對(duì)照樣品的平均R1(Rl自發(fā)損失對(duì)照)。方程2:%吞噬作用(R2/RlSL對(duì)照)x100式中R2=被效應(yīng)細(xì)胞吞噬的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目R1SL對(duì)照=無(wú)抗體的效應(yīng)細(xì)胞和靶標(biāo)細(xì)胞的3個(gè)對(duì)照樣品的平均R1(R1自發(fā)損失對(duì)照)。參考文獻(xiàn)本說(shuō)明書引述的所有參考文獻(xiàn)，包括上文引述的參考文獻(xiàn)，都通過(guò)引用整體地和為所有目的并入本文。1Haan&Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1漏A62Koideetal.(1998)JournalofMolecularBiology,284:1141-1151.3Nygrenetal.(1997)CurrentOpinioninStructuralBiology,7:463-4694Wess,L.In:BioCentury,TheBernsteinReportonBioBusiness,12(42),A1-A7,20045Kabat，E.A.etal,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest她Edition.USDepartmentofHealthandHumanServices.1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成員包含一組CDR:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該組CDR相比于參考組的CDR具有10個(gè)或更少個(gè)氨基酸添加、置換、缺失和/或插入，其中HCDR1具有SEQ.ID.NO:103的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ.ID.NO:104的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ.ID.NO:105的氨基酸序列；LCDRl具有SEQ.ID.NO:108的氨基酸序列;LCDR2具有SEQ,ID.NO:109的氨基酸序列；LCDR3具有SEQ.ID.NO:110的氨基酸序列。6.權(quán)利要求5的對(duì)人免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其中所述氨基酸置換包含6個(gè)或更少個(gè)氨基酸置換。7.—種分離結(jié)合成員，所述分離結(jié)合成員包含一組CDR:HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2和LCDR3，其中HCDR3包含SEQ.ID.NO:105的氨基齡列。8.權(quán)利要求5的分離結(jié)合成員，所述分離結(jié)合成員包含一組CDR:HCDRl、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該組CDR包含HCDR1具有SEQ.ID.NO:103的氨基酸序列；HCDR2具有SEQ.ID.NO:104的氨基酸序列；HCDR3具有SEQ.ID.NO:105的氨基酸序列；LCDR1具有SEQ.ID.NO:108的氨基酸序列;LCDR2具有SEQ.ID.NO:109的氨基酸序列；LCDR3具有SEQ.ID.NO:110的氨基酸序列。9.一種分離結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域，所述分離結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域包含具有一個(gè)或多個(gè)以下置換的抗體1HCDR3(SEQIDNO:5):Kabat殘基96被S、M或T置換；Kabat殘基97被L或G置換；Kabat殘基98,皮K置換；Kabat殘基99被S、W、A、T或E置換；Kabat殘基100被A或I置換。10.—種分離結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域，所述分離結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域包含具有一個(gè)或多個(gè)以下置換的抗體1LCDR3(SEQIDNO:10):Kabat殘基94被T、R、D、P、E、N、H、Q或A置換；Kabat殘基95^皮T、K、S、I、G、H、M、F、R、N、K或Q置換；Kabat殘基95A被L、H、D、G、R、N、Q、K或E置換；Kabat殘基95B被T、H、S、Y、L或N置換；Kabat殘基96被G或A置換；Kabat殘基97被P、S或G置換。11.一種對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，所述結(jié)合成員能結(jié)合包含來(lái)自第一IgE重鏈的元件和來(lái)自第二IgE重鏈的元件的表位。12.—種對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員能結(jié)合免疫球蛋白E中包含以下殘基的表位第一IgE重鏈中的殘基Glu390至Asn394包括端點(diǎn)在內(nèi)，和第二IgE重鏈中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Glu472。13.權(quán)利要求12的對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其中所述表位還包含第一IgE重鏈中的糖部分GIcNAc1和Man6和第二IgE重鏈中的糖部分Man5。14.一種對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員能結(jié)合免疫球蛋白E中包含以下殘基的表位第一IgE重鏈中的殘基Glu390、Gln392至Asn394包括端點(diǎn)在內(nèi)，和第二IgE重鏈中的Leu340、Arg342、Ala428至Thr434包括端點(diǎn)在內(nèi)、Thr436、Ser437和Glu472。15.權(quán)利要求14的對(duì)免疫球蛋白E有特異性的分離結(jié)合成員，其中所述表位還包含第一IgE重鏈中的糖部分GIcNAc1和Man6。16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的結(jié)合成員，其中所述結(jié)合成員是單克隆抗體。17.—種編碼權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的分離結(jié)合成員的分離核酸分子。18.—種轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求17的核酸分子的宿主細(xì)胞。19.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的分離結(jié)合成員的方法，所述方法包括在適于產(chǎn)生所述結(jié)合成員的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞。20.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的結(jié)合成員和藥物可接受賦形劑。21.權(quán)利要求20的藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-16中《壬一項(xiàng)的分離結(jié)合成員；20mM琥珀酸鹽；105mMNaCl;10mM精氨酸；pH6氛22.權(quán)利要求20或21的組合物，所述組合物用作藥物。23.權(quán)利要求22的組合物用于治療與IgE有關(guān)的疾病的用途。24.權(quán)利要求20或21的組合物的用途，其中所述疾病是過(guò)敏癥、哮喘或支氣管炎中的一種或多種。25.權(quán)利要求20或21的組合物的用途，其中所述疾病是以下疾病中的一種或多種過(guò)敏性鼻炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏反應(yīng)、食物過(guò)^t、蕁麻滲、炎性腸病、嗜酸性粒細(xì)胞性胃腸炎、藥源性皮滲、過(guò)敏性眼病、過(guò)敏性結(jié)膜炎、支氣管哮喘、氣道高反應(yīng)性、化妝品過(guò)敏、藥源性過(guò)敏、藥源性超敏性綜合癥、金屬過(guò)敏、職業(yè)性超敏性肺炎、慢性超敏性肺炎、冷超敏性、蠕蟲(chóng)感染引起的超敏性、乳膠過(guò)敏和枯草熱。全文摘要本發(fā)明涉及IgE的結(jié)合成員，特別是抗體分子。結(jié)合成員尤其可用于治療IgE介導(dǎo)的疾病，包括過(guò)敏癥和哮喘。文檔編號(hào)A61P11/00GK101675079SQ200880012211公開(kāi)日2010年3月17日申請(qǐng)日期2008年2月15日優(yōu)先權(quán)日2007年2月15日發(fā)明者C·L·多布森,D·科克蘭,K·馮-瓦申費(fèi)爾特,P·D·蒙克,P·-O·F·埃里克森,S·科亨申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司;免疫醫(yī)療有限公司