專利名稱：：用于治療眼部病癥的pai-1結(jié)合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及眼部病癥的治療，并且更特別地涉及降低IOP和/或治療或預(yù)防青光眼的試劑的用途。
背景技術(shù)：
：原發(fā)型開角型青光眼(P0AG)，也稱為慢性或單純性青光眼，代表了美國(guó)所有青光眼中的大部分。青光眼的大部分形式起因于具有解剖學(xué)、生物化學(xué)或生理基礎(chǔ)的眼房水的流動(dòng)中的擾亂。以及在青光眼患者的眼房水中檢測(cè)到纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)水平的升高(Danetal.，ArchOpthalmol，2005)。PAI-1水平被細(xì)胞因子TGFp(Binderetal.，NewsPhysiolSci,2002)等內(nèi)源刺激所升高。PAI-1抑制組織纖溶酶原激活物(tPA)和尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)兩者的活性。tPA和uPA兩者都催化纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，后者是纖維蛋白溶解級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵中間體(Wuetal.，CurrDrugTargets,2002)。已知纖溶酶促進(jìn)某些前間質(zhì)金屬蛋白酶(醒P)轉(zhuǎn)化成其活性、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解形式(Heetal.，PNAS,1989)。PAI-1也調(diào)控玻連蛋白(一種ECM成分)與以粘著受體發(fā)揮作用的細(xì)胞表面整合素的連接(Zhouetal.，NatureStruturalBiology,2003)。因此，已經(jīng)將PAI-1與非眼部組織中細(xì)胞的粘著降低和分離升高相聯(lián)系。已經(jīng)證明有效用于降低I0P(I0P)和/或用于P0AG的治療的藥物治療包括降低眼房水產(chǎn)生的試劑和升高外流便利的試劑。通常通過局部(直接應(yīng)用至眼睛)或口服這2種可能途徑中的一種施用這些治療。然而，藥學(xué)眼部抗高壓方法已經(jīng)顯示出多種不希望的副作用。例如，縮瞳劑(如匹魯卡品)可引起視覺模糊、頭痛和其他負(fù)面的視覺副作用。全身性使用碳酸酐酶抑制劑可引起惡心、消化不良、疲勞和代謝性酸中毒。某些前列腺素引起、眼部搔癢以及睫毛和眼窩皮膚的變深。這些負(fù)面的副作用可導(dǎo)致患者依從性降低，或者導(dǎo)致治療的終止從而視覺繼續(xù)惡化。另外，有些個(gè)體當(dāng)用某些已有的青光眼療法治療時(shí)，完全沒有反應(yīng)。因此，需要其他治療性試劑用于治療眼部病癥，例如青光眼和眼部高壓。發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方式認(rèn)識(shí)到調(diào)控PAI-1與玻連蛋白的結(jié)合可以用于治療眼部疾病和/或降低IOP。一個(gè)實(shí)施方式提供了治療患者青光眼或IOP升高的方法，其包括對(duì)患者施用有效量的組合物，所述組合物包含調(diào)控PAI-1與玻連蛋白的結(jié)合的試劑。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是治療PAI-1相關(guān)眼部病癥的方法，其包括施用有效量的組合物，所述組合物包含調(diào)控PAI-1與玻連蛋白的結(jié)合的試劑。在這些實(shí)施方式中，所述試劑是ZK4044、PAI-039、WAY-140312、HP-129、T-686、XR5967、XR334、XR330、XR5U8、PAI-1抗體、PAI-1肽模擬物及其組合。另一個(gè)實(shí)施方式是制備用于治療青光眼和升高的I0P的化合物的方法，其包括提供懷疑調(diào)節(jié)PAI-1結(jié)合的候選物質(zhì)、通過評(píng)估該候選物質(zhì)降低患青光眼或升高的PAI-1的患者的小梁網(wǎng)中的活性PAI-1的量來選擇所述化合物，以及制備所選擇的化合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物還包含選自如下的化合物眼科用可接受的防腐劑、表面活性劑、增稠劑、滲透促進(jìn)劑、凝膠劑、疏水基質(zhì)、栽體、緩沖劑、氯化鈉、水及其組合。在其他實(shí)施方式中，可以將選自如下的化合物作為所迷組合物的部分或作為單獨(dú)的施用來施用p阻斷劑、前列腺素類似物、碳酸酐酶抑制劑、(X2激動(dòng)劑、縮瞳劑、神經(jīng)保護(hù)劑、rho激酶抑制劑及其組合。上述簡(jiǎn)要概述廣泛地描述了本發(fā)明某些實(shí)施方式的特性和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。以下詳細(xì)的說明書中將描述其他特性和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。從本發(fā)明的詳細(xì)說明書中，結(jié)合任何附圖可以更好的理解那些被認(rèn)為是本發(fā)明特征的新特性，然而，本文提供的附圖旨在幫助示例說明本發(fā)明或者輔助理解本發(fā)明，而不旨在限定本發(fā)明的范圍。附圖簡(jiǎn)述通過參考如下說明書，并參考附圖可以更完全地理解本發(fā)明及其優(yōu)點(diǎn)，其中圖1顯示TGF卩2(24h)對(duì)人小梁網(wǎng)(GTM-3)細(xì)胞上清液中PAI-1水平的濃度依賴作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為平均和SEM，n=3。通過單向(one-way)AN0VA，其后通過Dunnett測(cè)試，相對(duì)相應(yīng)的載體組,p〈0.05;圖2顯示用或不用TGFp2(5ng/ml)處理多種時(shí)間段的GTM-3細(xì)胞上清液中PAI-1水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)表示為平均和SEM，n=3。通過學(xué)生t檢驗(yàn)，相對(duì)相應(yīng)的栽體時(shí)間點(diǎn)組的,p〈0.05;圖3是柱形圖，顯示野生型PAI-1(1jig/ml，2h)和TGF卩2(5ng/ml，2h)對(duì)轉(zhuǎn)化的(GTM-3)和未轉(zhuǎn)化的(GTM730)細(xì)胞與玻連蛋白底物粘著的作用。數(shù)據(jù)表示為平均和SEM，n-12-44。通過單向(one-way)ANOVA,其后通過Dunnett測(cè)試，相對(duì)相應(yīng)的未處理組的*p<0.05;圖4顯示野生型PAI-1(2h)對(duì)GTM-3細(xì)胞與玻連蛋白底物粘著的濃度依賴形式作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為平均和SEM,n=4。通過單向(one-way)AN0VA，其后通過Dunnett測(cè)試，相對(duì)相應(yīng)的未處理組的豐p〈0.05;圖5顯示野生型PAI-1(1pg/ml)對(duì)GTM-3細(xì)胞與玻連蛋白底物粘著的時(shí)間依賴作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為平均和SEM，n=12-44;圖6是柱形圖，顯示野生型PAI-l(lng/ml，lh)對(duì)比穩(wěn)定的、抗降解的PAI-1突變體(1ng/ml，lh)對(duì)GTM-3和GTM730細(xì)胞與玻連蛋白底物粘著的作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為平均和SEM，n=4。通過學(xué)生t檢驗(yàn)，相對(duì)相應(yīng)的未處理組的,p〈0.05。通過學(xué)生t檢驗(yàn)，相對(duì)相應(yīng)的PAI-1(野生型)處理組的"p〈0.05;圖7是柱形圖，顯示野生型PAI-1(1fig/ml，2h)對(duì)比非玻連蛋白結(jié)合PAI-1突變體(1ng/ml，2h)對(duì)GTM-3與玻連蛋白底物粘著的作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為平均和SEM，n-4-24。通過單向(one-way)ANOVA,其后通過D畫ett測(cè)試，相對(duì)未處理組的*。<0.05;以及圖8顯示野生型PAI-1(4h)對(duì)GTM-3細(xì)胞遷移到濃度依賴作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為平均和SEM，n=4-32。通過單向(oneiay)ANOVA,其后通過Dunnett測(cè)試，相對(duì)載體組的+p〈0.05。發(fā)明詳述已經(jīng)將PAI-1和非眼睛組織中細(xì)胞的粘著降低和脫離(detachment)增加相聯(lián)系。對(duì)本文公開數(shù)據(jù)的查閱得到如下結(jié)論在青光眼房水中PAI-1水平的升高是源于TGF&2對(duì)小梁網(wǎng)(trabecularmeshwork)細(xì)胞的作用。PAI-1誘導(dǎo)的TM細(xì)胞粘著的降低似乎是源于PAI-1干擾細(xì)胞與胞外基質(zhì)組分玻連蛋白的結(jié)合。另外，PAI-1誘導(dǎo)的TM細(xì)胞粘著的降低有助于TM細(xì)胞從網(wǎng)狀環(huán)境遷移。因此，PAI-1誘導(dǎo)的TM細(xì)胞粘著的降低和TM細(xì)胞遷移的增加是在青光眼患者眼睛中觀察到的TM多孔性(cellularity)降低的重要因素。本發(fā)明某些實(shí)施方式認(rèn)識(shí)到PAI-1引起小梁網(wǎng)(TM)組織中的這種作用。循環(huán)中的PAI-1通常以潛伏形式(latentform)存在，這是因?yàn)榛钚訮AI-1快速自發(fā)轉(zhuǎn)化成其非活性構(gòu)型。然而，結(jié)合玻連蛋白的PAI-1變?yōu)榉€(wěn)定在其活性形式，得到長(zhǎng)得多的半衰期。因此，降低活性PAI-1的有害作用的一個(gè)方法是使用調(diào)節(jié)PAI-1和玻連蛋白相互作用的試劑。這樣的試劑從而使得ECM中的未結(jié)合玻連蛋白與其細(xì)胞表面受體(整連蛋白)相連接，從而增強(qiáng)細(xì)胞粘著并降低從TM組織的細(xì)胞損失。調(diào)節(jié)PAI-1結(jié)合玻連蛋白可以提供處理青光眼的可行治療方法。本發(fā)明的某些實(shí)施方式是靶向眼部病癥(例如青光眼)中PAI-l下游作用的方法，通過如下設(shè)計(jì)圖干擾PAI-1與玻連蛋白的結(jié)合，<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image>其中PAI-1小梁網(wǎng)(TM)細(xì)胞表面粘著受體(整連蛋白)與玻連蛋白(胞外基質(zhì)組分)的結(jié)合。結(jié)果是，細(xì)胞從TM上脫離并通過水流清除到TM的管旁(juxtacanulicular)區(qū)域。脫離的TM細(xì)胞及其碎片的這種積累有助于提高外流阻力和I0P的升高。PAI-1結(jié)合玻連蛋白的調(diào)節(jié)從而降低TM細(xì)胞的脫離并降低外流阻力的增加和10P的升高。備選地，TM組織的多孔性從而升高，阻止作為吞噬作用的重要功能。PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑本領(lǐng)域已知多種PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑。例如Jensen等人記錄了對(duì)野生型PAI-1具有強(qiáng)親和力的小肽的發(fā)現(xiàn)，該小肽抑制uPA-PAI-1復(fù)合物與低密度脂蛋白受體家族成員的連接(Jensenetal.，Inhibitionofplasminogenactivatorinhibitor-lbindingtoendocytosisreceptorsofthelow-density—lipoproteinreceptorfamilybyapeptideisolatedfromaphagedisplaylibrary,BiochemJ.，2006，Vol.399(3):387-396)。改變PAI-1抑制組織纖溶酶原激活物(tPA)和/或尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)的試劑也可以調(diào)節(jié)PAI-1的結(jié)合。這樣的試劑包括但不局限于ZK4044(Liangetal.，CharacterizationofasmallmoleculePAI-linhibitor,ZK4044,ThrombRes.，2005，Vol.115(4):341-50))、PAI-039(tiplaxtinin)(Weisbergetal.，Pharmacologicalinhibitionandgeneticdeficiencyofplasminogenactivatorinhibitor-lattenuatesangiotensinIl/salt—inducedaorticremodeling.ArteriosclerThrombVaseBiol.，2005Feb,Vol.25(2):365-71;Hennanetal.，EvaluationofPAI-039[U-benzy卜5-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]-lH-indol-3-yl)(oxo)aceticacid],anovelplasminogenactivatorinhibitor-linhibitor,inacaninemodelofcoronaryarterythrombosis.JPharmacolExpTher.，2005Aug,Vol-314(2):710-6.Epub，2005Apr28;Elokdahetal.，Anovel,orallyefficaciousinhibitorofplasminogenactivatorinhibitor-l:design,synthesis,andpreclinicalcharacterization.JMedChem.，2004Jul1,Vol.47(14):3491-4)、WAY140312(Crandalletal.，CharacterizationandcomparativeevaluationofastructurallyuniquePAI-linhibitorexhibitingoralin-vivoefficacy.JThrombHaemost.，2004Aug,Vol.2(8):1422-8;Crandalletal.,WAY-140312reducesplasmaPAI-lwhilemaintainingnormalplateletaggregation,BiochemBiophysResCommun.，2003Nov28，Vol.311(4):904—8)、HP129(fendosal)(Yeetal.，Synthesisandbiologicalevaluationofmenthol-basedderivativesasinhibitorsofplasminogenactivatorinhibitor-l(PAI-1),BioorgMedChemLett.,2003Oct6，Vol.13(19):336卜5)和T—686(Murakamietal.，Protectiveeffectofinhibitorofplasminogenactivatorinhibitor-lproduction,againstthelethaleffectoflipopolysaccharideinmice.JpnJPharmacol.，1997Nov,Vol.75(3):291-4);Ohtanietal，，T-686，anovelinhibitorofplasminogenactivatorinhibitor-1，inhibitsthrombosiswithoutimpairmentofhemostasisinrats.EurJPharmacol.，1997Jul9，Vol.330(2-3):151—6;Vinogradskyetal.，Anewbutadienederivative,T-686,inhibitsplasminogenactivatorinhibitortype-lproductioninvitrobyculturedhumanvascularendothelialcellsanddevelopmentofatheroscleroticlesionsinvivoinrabbits.ThrombRes.，1997Feb15，Vol.85(4):305-14;Ohtanietal.，Inhibitoryeffectofanewbutadienederivativeontheproductionofplasminogenactivatorinhibitor-linculturedbovineendothelialcells.JBiochem(Tokyo),1996Dec,Vol,120(6):1203-8),Bryansetal.，Inhibitionofplasminogenactivatorinhibitor-lactivitybytwodiketopiperazines，XR330andXR334,TheJournalofAntibiotics,1996October,Vol.49(10):1014-1021，XR5118.Einholmetal.，Biochemicalmechanismofactionofadiketopiperazineinactivatorofplasminogenactivatorinhibitor-l，XR5118,BiochemJ，2003，Vol.373:723-732。備選地，PAI-1抑制劑例如Ye所教授的那些(Yeetal，，Synthesisandbiologicalevaluationofpiperazine-basedderivativesasinhibitorsofplasminogenactivatorinhibitor-l(PAI-l).BioorgMedChemLett.,2004Feb9，Vol.14(3):761-5;Yeetal.，Synthesisandbiologicalevaluationofmenthol-basedderivativesasinhibitorsofplasminogenactivatorinhibitor-l(PAI-l).BioorgMedChemLett.,2003Oct6，Vol.13(19):3361-5)，以及基于抗體的抑制劑例如Verbeke所教授的那些(Verbekeetal.，Cloningandparatopeanalysisofanantibodyfragment,arationalapproachforthedesignofaPAI-linhibitor.JThrombHaemost,，2004Feb,Vol.2(2):289-97)和vanGiezen所教授的那些(vanGiezenetal.，TheFab-frag邁entofaPAI-linhibitingantibodyreducesthrombussizeandrestoresbloodflowinaratmodelofarterialthrombosis.ThrombHaemost.，1997May,Vol.77(5):964-9)也調(diào)節(jié)PAI-1的結(jié)合。其他PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑包括PAI-1肽模擬物。在"PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑，，部分中引用的所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用將其全部并入本文。遞送方式本發(fā)明的PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑可并入用于遞送的多種類型的眼科制劑。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述化合物直接遞送到眼部(例如局部的眼部滴劑或軟骨劑；植入常隆(cul-de-sac)或植入臨近鞏膜或在眼內(nèi)的緩釋裝置，例如藥物遞送海綿；眼周的、結(jié)膜的、筋膜下(sub-tenons)、前目艮房?jī)?nèi)(intracameral)、玻璃體內(nèi)、或小管內(nèi)注射)或者全身性的遞送(例如口服；靜脈內(nèi)的、皮下的或肌肉內(nèi)的注射；腸胃外的、皮膚或鼻部遞送)。還包括本發(fā)明的PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑可配制在眼內(nèi)插入物或可植入裝置中。本文公開的PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑優(yōu)選地并入局部眼用制劑用于遞送至眼睛。所述化合物可以與眼科用可接受的防腐劑、表面活性劑、增稠劑、滲透促進(jìn)劑、緩沖劑、氯化鈉、或水組合形成一種水相的無菌的眼用混懸液或溶液。眼用溶液制劑可通過將化合物溶解在生理可接受的等滲水緩沖劑中來制備。另外，所述眼用溶液可包括眼科用可接受的表面活性劑來輔助溶解所述化合物，而且，所述眼用溶液可含有如下試劑以增加粘度，如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等，以增強(qiáng)所述制劑在結(jié)膜嚢內(nèi)的保留。也可以使用凝膠試劑，包括但不限于gellari和黃芪膠。為了制備無菌的眼用軟骨制劑，將活性成分與在合適栽體(如礦物油、液態(tài)羊毛脂或白礦脂)中的防腐劑組合。依據(jù)用于類似眼用制劑的發(fā)表的方法，無菌的眼用凝膠制劑可通過將所述化合物懸浮在親水基質(zhì)中制備，所述親水基質(zhì)從例如carbopol-974或諸如此類的組合中制備而成；可并入防腐劑和彈性試劑。PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑優(yōu)選地被制成局部眼用混懸液或溶液，其pH為約4-8。所述化合物以足以降低IOP升高的患者的10P和/或維持青光眼患者的正常IOP水平的量包含在局部混懸液或溶液中。這樣的量在本文中被稱為"有效控制IOP的量"，或更簡(jiǎn)單地"有效量"。所述化合物通常以0.01-5%重量/體積("w/v%")的量，但優(yōu)選0.25-2w/v°/。的量包含在這些制劑中。因此對(duì)于局部遞呈，根據(jù)有經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師的判斷，將1-2滴這些制劑遞送至眼睛的表面，每日1-4次。PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑液可與其他IOP升高或青光眼治療劑組合使用，所述治療劑例如但不局限于rho激酶抑制劑、p-阻斷劑、前列腺素類似物、碳酸酐酶抑制劑、(X2激動(dòng)劑、縮瞳劑、5-羥色胺能激動(dòng)劑和神經(jīng)保護(hù)劑。如本文使用的，"PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑"包括這類調(diào)節(jié)劑及其藥學(xué)可接受的鹽。PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑的藥學(xué)可接受的鹽是保留PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)活性并被人體所接受的鹽。鹽可以是酸式鹽或堿式鹽，因?yàn)楸疚牡脑噭┚哂邪被〈螋然〈?。與如下所述酸制備鹽醋酸、苯曱酸、桂皮酸、檸檬酸、乙磺酸、反丁烯二酸、羥基乙酸、氫溴酸、鹽酸、馬來酸、扁桃酸、甲磺酸、硝酸、草酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、琥珀酸、磺酸、酒石酸、對(duì)甲苯磺酸、三氟醋酸等等。與如下所述堿制備鹽伯胺、仲胺、叔胺、鋁、銨、鈣、銅、鐵、鋰、鎂、錳、鉀、鈉、鋅等等。生物活性的測(cè)定可使用結(jié)合測(cè)定法或功能測(cè)定法來選擇PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑，所述測(cè)定法也用于測(cè)定其生物活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用上文所述的方法開發(fā)這樣的測(cè)定法。其他測(cè)定法來自或可以來自下文實(shí)施例中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)。例如，下文描述的TM細(xì)胞遷移測(cè)定法可以用于其中將假定PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑作為測(cè)試試劑加入。體內(nèi)生物活性測(cè)試通過使用新西蘭白兔和/或食蟹猴(Cynomo1gusmonkey)的體內(nèi)測(cè)定法的某些實(shí)施例中，評(píng)估某些PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑安全降低IOP的能力。新西蘭白兔中眼部安全性評(píng)估對(duì)新西蘭白兔的兩只眼睛都局部給藥一等份30jiL的載體中的測(cè)試化合物。給藥后O.5小時(shí)內(nèi)，以及然后在2小時(shí)內(nèi)每0.5小時(shí)或直到作用不再出現(xiàn)為止連續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物。新西蘭白兔中的急性IOP反應(yīng)在用0.1%的丙對(duì)卡因輕微角膜麻醉后，用MentorClassic30氣壓式眼壓計(jì)(Pneufflatonoffleter)測(cè)定眼內(nèi)壓(IOP)。每次測(cè)量后，用1-2滴鹽水清洗眼睛。在基線I0P測(cè)量之后，將一等份30jiL的測(cè)試化合物滴入每只動(dòng)物的兩只眼睛中，或者化合物滴入一只眼睛而載體滴入對(duì)側(cè)的眼睛。在O.5、1、2、3、4和5小時(shí)進(jìn)行隨后的IOP測(cè)量。食蟹猴中的急性I0P反應(yīng)如上所述在用0.1%的丙對(duì)卡因輕微角膜麻醉后，用Alcon氣壓式眼壓計(jì)(Pneumatonometer)測(cè)定眼內(nèi)壓(IOP)(Sharifetal，J.OcularPharmacol.Ther.，2001,Vol.17:305-317;Mayetal，J.Pharmacol.Exp,Ther.，2003，Vol.306:301-309)。每次測(cè)量后，用1-2滴鹽水清洗眼睛。在基線IOP測(cè)量之后，將1或2等份30jiL的測(cè)試化合物滴入食蟹猴的所選眼睛中。在1、3和6小時(shí)進(jìn)行隨后的IOP測(cè)量。所有動(dòng)物的右眼進(jìn)行激光小梁以誘導(dǎo)眼高壓。所有的左眼是正常的，并因此具有正常的IOP。實(shí)施例包括以下實(shí)施例以顯示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到遵循本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表技術(shù)的實(shí)施例中公開的技術(shù)在實(shí)施本發(fā)明中發(fā)揮良好功能，并因此被認(rèn)為構(gòu)成其實(shí)施的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明公開的指導(dǎo)下，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到在公開的某些實(shí)施方式中可以產(chǎn)生許多變化，并仍然獲得類似或相似的結(jié)果而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例l-TGFp2升高TM細(xì)胞中的PAI-1含量圖1顯示了TGFp2升高小梁網(wǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物(GTM-3)中的PAI-1含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PAI-1介導(dǎo)的作用有助于之前觀察到的在包括TM組織的多種組織中，胞外基質(zhì)材料的TGFp2介導(dǎo)的積累。圖2顯示了這樣的TGFp2介導(dǎo)的PAI-1升高在用TGFp2處理的細(xì)胞培養(yǎng)物中是持久的。TGFp2處理導(dǎo)致TM細(xì)胞上清中PAI-1的濃度依賴方式和時(shí)間依賴方式的積累(圖1和2)。PAI-1水平響應(yīng)TGFp2而逐漸升高，在處理后大約24小時(shí)達(dá)到恒定水平。實(shí)施例2-野生型PAI-1降低TM細(xì)胞的粘著圖3顯示了重組人PAI-1(處理2h)降低培養(yǎng)的人TM細(xì)胞與玻連蛋白底物粘著的能力；在同樣的模型中，不結(jié)合玻連蛋白的突變PAI-1不影響粘著(圖7)。圖4顯示了PAI-1濃度升高對(duì)TM細(xì)胞粘著的作用。PAI-1對(duì)粘著的作用是劑量依賴方式的，具有估計(jì)的ECs。為大約0.6jiM。對(duì)TM細(xì)胞粘著的這種干擾因此觸發(fā)了TM細(xì)胞的加速損失，例如在青光眼，特別是P0AG中觀察到的。脫離的TM細(xì)胞有助于對(duì)房水外流的阻礙，據(jù)信該過程導(dǎo)致外流阻力的增加和IOP的升高。TM細(xì)胞從網(wǎng)狀組織的損失也導(dǎo)致受損碎片的清除，這是吞噬能力降低的結(jié)果。參考圖3，與對(duì)照相比，用TGFp2處理2小時(shí)的細(xì)胞不具有可測(cè)量的粘著損失。短期用TGFp2處理所缺少的作用似乎是源于在2小時(shí)的處理期間不充分的TGFp2介導(dǎo)的PAI-1誘導(dǎo)(可見圖2)。SV40轉(zhuǎn)化的(GTM-3)細(xì)胞的反應(yīng)與未轉(zhuǎn)化(GTM730)細(xì)胞的反應(yīng)高度相似。14實(shí)施例3-野生型PAI-1隨時(shí)間降解圖5顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明野生型PAI-1介導(dǎo)的粘著損失是瞬時(shí)的，并且在24小時(shí)后粘著水平恢復(fù)到接近對(duì)照水平。圖6是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖，顯示了野生型PAI-1(lng/mL，lh)對(duì)比穩(wěn)定的、抗降解PAI-1突變體(lpg/mL，lh)對(duì)GTM-3和GTM730細(xì)胞與玻連蛋白底物粘著的作用?？紤]到圖5的內(nèi)容，所述數(shù)據(jù)證明野生型PAI-1似乎隨時(shí)間降解。因此使用穩(wěn)定的PAI-1突變體(K154T、Q139L、M354I和H150H突變的混合)來增強(qiáng)PAI-1的作用，穩(wěn)定的PAI-1突變體比野生型蛋白更抗降解。實(shí)施例4-野生型PAI-1對(duì)粘著的作用是玻連蛋白介導(dǎo)的圖7是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖，顯示了野生型PAI-1(lpg/mL，2h)對(duì)比非玻連蛋白結(jié)合PAI-1突變體(lng/mL,2h)對(duì)GTM-3細(xì)胞與玻連蛋白底物粘著的作用。不結(jié)合玻連蛋白仍已知具有其他功能的突變體PAI-1，沒有對(duì)TM細(xì)胞與玻連蛋白底物粘著的作用，而野生型玻連蛋白結(jié)合PAI-1降低粘著至對(duì)照水平的大約50%。圖8顯示了野生型PAI-1(4h)對(duì)GTM-3細(xì)胞遷移的濃度依賴作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相似與降低TM細(xì)胞粘著的濃度的野生型PAI-1誘導(dǎo)了TM細(xì)胞的遷移。實(shí)施例1-4的方法人TM細(xì)胞的培養(yǎng):如上所述從死后人供體組織分離人TM細(xì)胞，并定性和培養(yǎng)。也如上所述傳代和定性轉(zhuǎn)染(GTM-3)細(xì)胞系。(Pangetal.，Preliminarycharacterizationofatransformedcellstrainderivedfromhumantrabecularmeshwork.Curr.EyeRes.，1994，Vol.13:51-63)。PAI-1ELISA:24孔板的TM細(xì)胞培養(yǎng)物去血清24小時(shí)，其后在無血清培養(yǎng)基中與TGFp2溫育另外的24小時(shí)(或如指示)。使用人PAI-1ELISA試劑盒(AmericanDiagnostica)就分泌的PAI-1含量對(duì)來自處理的培養(yǎng)物的等量上清定量。TM細(xì)胞粘著通過InnoCyteECMCellAdhesionAssay(Calbiochem)測(cè)定TM細(xì)胞粘著。將TM細(xì)胞(20，000/孔；無血清培養(yǎng)基)涂布在玻連蛋白涂敷的96孔板上。然后添加測(cè)試試劑，其后在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育指定的時(shí)間。通過用PBS的傾注并溫和洗滌孔來去除未粘著的細(xì)胞。通過熒光染料(calcein-AM)攝取來測(cè)定相對(duì)細(xì)胞結(jié)合。TM細(xì)胞遷移:通過InnoCyteCellMigrationAssay(Calbiochem)評(píng)估TM細(xì)胞的遷移。將TM細(xì)胞(50，000/孔；無血清培養(yǎng)基)涂布在所述試劑盒提供的遷移小室的上孔組裝中。下孔裝填測(cè)試試劑的溶液，隨后將小室在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育。4小時(shí)后，去除上孔組裝，將上清溫和倒出以去除未結(jié)合的細(xì)胞。隨后將上孔組裝放置到含有脫離緩沖液和calcein-AM混合物的新鮮下板上。60分鐘后，將等份試樣從每一個(gè)下孔轉(zhuǎn)移到新鮮的、黑色96孔板，測(cè)定相對(duì)熒光。實(shí)施例5-8的制劑實(shí)施例5成分濃度(w/v%)PAI-1結(jié)合調(diào)節(jié)劑0,01-254羥丙基曱基纖維素0.5%磷酸氬二鈉(無水)0.2%氯化鈉0.5%EDTA二鈉(依地酸二鈉)0.01%聚山梨酯800.05%苯扎氯胺0,01%氬氣化鈉/鹽酸用于調(diào)節(jié)pH到7.3-7.4純水適量至100%<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>已經(jīng)對(duì)本發(fā)明及其實(shí)施方式進(jìn)行了詳細(xì)的描述。然而，本發(fā)明的范圍不旨在局限于說明書中所描述的任何過程、制備、物質(zhì)的組成、化合物、方式、方法和/或步驟的具體實(shí)施方式?？蓪?duì)公開的材料產(chǎn)生多種修飾、替換和變體而不脫離本發(fā)明的精神和/或關(guān)鍵特征。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員從所公開的內(nèi)容中容易理解，實(shí)施基本上相同的功能或者實(shí)現(xiàn)基本上相同的結(jié)果的后述修飾、替換和/或變體可以根據(jù)本發(fā)明那些相關(guān)的實(shí)施方式而使用。因此，下述權(quán)利要求書旨在在其范圍內(nèi)包括對(duì)本文公開的過程、制備、物質(zhì)的組成、化合物、方式、方法和/或步驟的修飾、替換和變體。權(quán)利要求1.一種治療患者的青光眼或IOP升高的方法，其包括對(duì)所述患者施用有效量的組合物，所述組合物包含調(diào)節(jié)PAI-1與玻連蛋白結(jié)合的試劑。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物還包含選自如下的化合物眼科用可接受的防腐劑、表面活性劑、增稠劑、滲透促進(jìn)劑、凝膠劑、疏水基質(zhì)、載體、緩沖劑、氯化鈉、水及其組合。3.權(quán)利要求1的方法，其還包括作為所述組合物的部分施用或者分別施用選自如下的化合物P阻斷劑、前列腺素類似物、碳酸酐酶抑制劑、(X2激動(dòng)劑、縮瞳劑、神經(jīng)保護(hù)劑、rho激酶抑制劑及其組合。4.權(quán)利要求l的方法，其中所述組合物包含約0.01%重量/體積-約5%重量/體積的所述試劑。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包含約0.25%重量/體積-約2%重量/體積的所迷試劑。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述試劑選自ZK4044、PAI-039、WAY-140312、HP-129、T-686、XR5967、XR334、XR330、XR5118、PAI-1抗體、PAI-1肽模擬物及其組合。7.在有此需要的受試者中治療PAI-1相關(guān)眼部病癥的方法，其包括對(duì)所述患者施用有效量的組合物，所述組合物包含調(diào)節(jié)PAI-1與玻連肇白結(jié)合的試劑。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述受試者患眼高壓或青光眼或處于患眼高壓或青光眼的風(fēng)險(xiǎn)中。9.權(quán)利要求7的方法，其中所述施用降低所述受試者內(nèi)的活性PAI-1的量。10.權(quán)利要求7的方法，其中所述組合物還包含選自如下的化合物眼科用可接受的防腐劑、表面活性劑、增稠劑、滲透促進(jìn)劑、凝膠劑、疏水基質(zhì)、栽體、緩沖劑、氯化鈉、水及其組合。11.權(quán)利要求7的方法，其還包括作為所述組合物的部分施用或者分別施用選自如下的化合物P阻斷劑、前列腺素類似物、碳酸酐酶抑制劑、a2激動(dòng)劑、縮瞳劑、神經(jīng)保護(hù)劑、rho激酶抑制劑及其組合。12.權(quán)利要求7的方法，其中所述組合物包含約0.01%重量/體積-約5%重量/體積的所述試劑。13.權(quán)利要求7的方法，其中所述組合物包含約0.25%重量/體積-約2%重量/體積的所述試劑。14.權(quán)利要求7的方法，其中所述試劑選自ZK4044、PAI-039、WAY-140312、HP-129、T-686、XR5967、XR334、XR330、XR5118、PAI-1抗體、PAI-1肽模擬物及其組合。15.制備用于治療青光眼或IOP升高的化合物的方法，其包括提供懷疑調(diào)節(jié)PAI-1結(jié)合的候選物質(zhì)；通過評(píng)估所述候選物質(zhì)降低患青光眼或PAI-1升高的受試者的小梁網(wǎng)中活性PAI-1的量的能力來選擇所述化合物；以及制備所選的化合物。全文摘要本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方式中涉及在患者中治療青光眼和升高的IOP的方法，其包括對(duì)患者施用有效量的組合物，所述組合物包含調(diào)控PAI-1與玻連蛋白的結(jié)合的試劑。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備用于治療青光眼和升高的IOP的化合物的方法，其包括提供懷疑調(diào)節(jié)PAI-1結(jié)合的候選物質(zhì)、通過評(píng)估該候選物質(zhì)降低患青光眼或升高的PAI-1的患者的小梁網(wǎng)中的活性PAI-1的量來選擇所述化合物，以及制備所選擇的化合物。文檔編號(hào)A61K31/122GK101588798SQ200780040797公開日2009年11月25日申請(qǐng)日期2007年10月31日優(yōu)先權(quán)日2006年10月31日發(fā)明者A·克拉克,D·弗里諾,彭玉豪申請(qǐng)人:愛爾康研究有限公司