專(zhuān)利名稱(chēng)：：朝鮮紫菀提取物，以及含有該提取物的藥物組合物和功能食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種朝鮮紫菀(Aster)的葉和莖提取物，一種朝鮮紫菀的根提取物，一種朝鮮紫菀的花提取物，以及一種用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物和功能食品，其至少含有一種所述提取物作為活性成分，尤其是葉和莖提取物，根提取物和花提取物，其不僅具有抑制作為誘導(dǎo)糖尿病并發(fā)癥重要因子的晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生的作用，還具有抑制醛糖還原酶活性的作用，從而有效預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)癥，并作為一種藥物組合物和功能食品用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥。
背景技術(shù)：
：糖尿病是世界上主要的成人病之一，最近，隨著經(jīng)濟(jì)的快速增長(zhǎng)，其在韓國(guó)的發(fā)病率達(dá)到7至8%。特別是，自從普遍壽命增長(zhǎng)直到糖尿病引發(fā)，糖尿病患者不能避免糖尿病并發(fā)癥的痛苦。一般地，在糖尿病發(fā)病1020年內(nèi)，身體的大部分器官都受損，進(jìn)而引起糖尿病性視網(wǎng)膜病變，糖尿病性白內(nèi)障，糖尿病腎病，糖尿病神經(jīng)病變等病。慢性糖尿病腎病是導(dǎo)致血液透析和終末期腎衰的關(guān)鍵原因，并且糖尿病性白內(nèi)障引起失明，導(dǎo)致死亡。誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥的機(jī)制主要解釋為蛋白質(zhì)的非酶糖基化，多元醇通路以及氧化應(yīng)激。蛋白質(zhì)的非酶糖基化是由于蛋白質(zhì)的氨基酸成員(例如賴(lài)氨酸殘基)在缺乏酶作用的還原糖條件下進(jìn)行的非酶縮合，也就是美拉德反應(yīng)。反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)的非酶糖基化包括2步。第一步，蛋白質(zhì)的氨基酸成員(例如賴(lài)氨酸殘基)，與還原糖的醛基或酮基，在沒(méi)有酶反應(yīng)的情況下易于發(fā)生親核加成反應(yīng)，因而形成作為早期產(chǎn)物的席夫堿，與席夫堿毗鄰的酮胺加合物與之彼此縮合產(chǎn)生可逆的阿馬杜型早期糖基化產(chǎn)物。第二步，在持續(xù)高血糖的狀態(tài)下，可逆的阿馬杜型早期糖基化產(chǎn)物發(fā)生重構(gòu)而不發(fā)生降解，并與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，從而產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物。與可逆的阿馬杜型早期糖基化產(chǎn)物不同的是，AGEs是不可逆產(chǎn)物。因此，即使血糖濃度恢復(fù)到正常水平，終末產(chǎn)物，一旦產(chǎn)生，在蛋白質(zhì)存在期間蓄積在組織內(nèi)而不發(fā)生降解，導(dǎo)致組織的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變(Vinson,J.A.等，1996,J.NutritinalBiochemistry7:559-663;Smith,P.R.等，1992，Eur.J.Biochem.,210:729-739)。例如，由糖原與不同蛋白反應(yīng)產(chǎn)生的晚期糖基化終末產(chǎn)物的糖基化白蛋白是引起慢性糖尿病腎病的一個(gè)重要因子。糖基化白蛋白比非糖基化正常白蛋白更易進(jìn)入到腎小球細(xì)胞，高濃度的葡萄糖刺激腎小球細(xì)胞增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成。糖基化白蛋白的過(guò)量導(dǎo)入以及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)量增加導(dǎo)致腎小球細(xì)胞纖維化。通過(guò)這些機(jī)制，腎小球遭到持續(xù)損壞，最終不得不使用極端的治療方法，因此諸如血液透析或器官移植的極端治療方法不可避免。同時(shí)，據(jù)報(bào)道，由于慢性糖尿病，動(dòng)脈壁的膠原蛋白以及腎小球的基底膜蛋白與AGEs結(jié)合并蓄積在組織內(nèi)(Brownlee，M.,等，1986,Sciences,232,1629-1632)。如上所述，非酶蛋白質(zhì)糖基化導(dǎo)致基底膜，血清白蛋白，晶狀體蛋白質(zhì)，血纖維蛋白，膠原蛋白等的糖基化，并且晚期糖基化終末產(chǎn)物引起組織的結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，導(dǎo)致慢性糖尿病并發(fā)癥諸如糖尿病性視網(wǎng)膜病變，糖尿病性白內(nèi)障，糖尿病腎病，糖尿病神經(jīng)病變等的發(fā)生。同時(shí)，有報(bào)道表明，在高血糖狀態(tài)下產(chǎn)生AGEs期間，血脂發(fā)生異常，同時(shí)抵抗有害氧自由基的防御系統(tǒng)功能惡化，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激(Yol垂wa,T.,等，2001,J.ofTrad.Med.,18:107-112)。因此，非酶糖基化反應(yīng)是與氧化應(yīng)激的作用機(jī)制相關(guān)聯(lián)的。.多元醇通路包括2步。第一步，醛糖或酮糖在醛糖還原酶(AR)作用下形成山梨醇。第二步，山梨醇被山梨醇脫氫酶氧化產(chǎn)生果糖。高血糖水平激活多元醇通路，據(jù)此山梨醇和果糖大量產(chǎn)生并蓄積在組織內(nèi)，從而增加組織的滲透壓。由于滲透壓增加，水進(jìn)入組織引起糖尿病性視網(wǎng)膜病變，糖尿病性白內(nèi)障以及糖尿病性神經(jīng)病變等等(diabetics,EungjinKim等，Koreandiabetesassociation,Koreamedical,483p;Soulis-Liparota,T.，等，1995，Di隱abetologia，38:357-394)。據(jù)報(bào)道AGEs激活醛糖還原酶(AR)，醛糖還原酶是人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中多元醇通路中的一種關(guān)鍵酶(Nakamura,N.，等，2000，F(xiàn)reeRadicBiol.Med.,29:17-25)。在正常狀態(tài)下，AR對(duì)葡萄糖親和力低，但是在高葡萄糖濃度下，AR被激活，大量的葡萄糖被還原為山梨醇，接著山梨醇在山梨醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為果糖。果糖的非酶糖基化率比葡萄糖高大約10倍。因此，高濃度的果糖與蛋白結(jié)合，進(jìn)而加速了AGEs的形成。如上所述，非酶糖基化，多元醇通路以及氧化應(yīng)激機(jī)制相互作用誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥。因此，抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物形成的同時(shí)抑制醛糖還原酶的活性對(duì)預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥，或推遲其發(fā)病是非常重要的(Brownlee，M.，etal.,1988,N.Engl.Med，318,1315-1321)。當(dāng)糖尿病剛發(fā)病時(shí)，血液中葡萄糖的水平并不立即降低，這時(shí)為了預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生必須給藥預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。氨基胍是一種親核肼，其是目前用作蛋白糖基化抑制劑的唯一合成藥。它通過(guò)與阿馬杜產(chǎn)物結(jié)合，抑制阿馬杜產(chǎn)物與蛋白的交聯(lián)，因而抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生，進(jìn)而推遲或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展(Brownlee，M.,等，1986,Sciences,232，1629-1632;Eddstein,D.等，1992,Diabetes,41,26-29)。氨基胍是最有希望用于預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)癥的候選合成藥物，目前已進(jìn)入第三階段的臨床試驗(yàn)，但是存在長(zhǎng)期服用引起毒性的問(wèn)題。因此，目前需要研發(fā)安全的藥物。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物和朝鮮紫菀的花提取物能夠抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生以及醛糖還原酶的活性，因而可以用于預(yù)防糖尿病發(fā)癥的治療，從而完成本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明一方面提供一種朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物和朝鮮紫菀的花提取物，它們具有抑制引起糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生以及醛糖還原酶的活性的作用。本發(fā)明另一方面提供所述每種提取物依次用正己垸、乙酸乙酯、正丁醇和水分餾得到的餾分。本發(fā)明再--方面還提供一種用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，一種用于改善糖尿病并發(fā)癥的保健功能噙品，一種用于預(yù)防或延緩衰老的藥物組合物以及保健功能食品，所述的每種組合物以及食品含有至少一種所述提取物或餾分作為活性成分。技術(shù)方案依據(jù)本發(fā)明，通過(guò)將朝鮮紫菀的葉和莖部分，朝鮮紫菀的根和花精細(xì)分類(lèi)，用乙醇或乙醇水溶液提取切碎植物，提取液過(guò)濾并將濾液在減壓下的濃縮，獲得各種提取物，其可以用作用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，用于預(yù)防衰老的組合物，或用于改善糖尿病并發(fā)癥的保健功能食品。同時(shí)，通過(guò)將每種所述葉和莖提取物，根提取物和花提取物依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水分僧得到的僧分，可以用作用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，用于預(yù)防衰老的組合物，或用于改善糖尿病并發(fā)癥的保健功能食品。有益效果如上所述，朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，以及各種提取物的乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分，能夠抑制引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時(shí)抑制醛糖還原酶的活性，并且所述的提取物和餾分與陽(yáng)性對(duì)照氨基胍和3，3-四甲烯戊二酸相比，抑制活性更好。因此，朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，以及各種提取物的乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分能夠用作藥物組合物和功能性食品，用于預(yù)防或治療由于晚期糖基化終末產(chǎn)物產(chǎn)生和醛糖還原酶激活引起的糖尿病并發(fā)癥，包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變，糖尿病性白內(nèi)障，糖尿病腎病和糖尿病神經(jīng)病變。同時(shí)，如果抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生和醛糖還原酶活性，那么氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)率將會(huì)降低。因此，所述的提取物和提取物餾分可以用作藥物組合物和功能性食品，用于預(yù)防或延緩由于氧化應(yīng)激引起的衰圖l是朝鮮紫菀的提取和分餾示意圖。圖2是朝鮮紫菀的葉和莖提取物對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物抑制效果圖。圖3是朝鮮紫菀的根提取物對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物抑制效果圖。圖4.是朝鮮紫菀的花提取物對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物抑制效果圖。圖5是氨基胍的花提取物對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物抑制效果圖。圖6是朝鮮紫菀的葉和莖提取物對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖7是朝鮮紫菀的根提取物對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖8是朝鮮紫菀的花提取物對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖9是3，3-四甲烯戊二酸對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖10是朝鮮紫菀的葉和莖提取物的乙酸乙酯餾分對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖11是朝鮮紫菀的葉和莖提取物的正丁醇餾分對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖12是朝鮮紫菀的葉和莖提取物的水餾分對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖13是朝鮮紫菀的根提取物的乙酸乙酯餾分對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖14是朝鮮紫菀的根提取物的正丁醇餾分對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖15是朝鮮紫菀的花提取物的乙酸乙酯餾分對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖16是朝鮮紫菀的花提取物的正丁醇餾分對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果圖。圖17是通過(guò)ELISA分析朝鮮紫菀的根提取物對(duì)AGEs-BSA產(chǎn)物圖18是通過(guò)ELISA分析朝鮮紫菀的莖和葉提取物對(duì)AGEs-BSA圖19是通過(guò)ELISA分析朝鮮紫菀的花提取物對(duì)AGEs-BSA產(chǎn)物具體實(shí)施例方式為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種朝鮮紫菀的葉和莖提取物，通過(guò)將朝鮮紫菀的葉和莖，根和花干燥和細(xì)切，用乙醇或乙醇水溶液提取，過(guò)濾提取液并將濾液濃縮獲得。另一方面，本發(fā)明還提供所述朝鮮紫菀的各種提取物通過(guò)分餾獲得的乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分。再一方面，本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，一種可以改善糖尿病并發(fā)癥的保健功能食品，以及一種用于預(yù)防或延緩衰老的藥物組合物和保健功能食品，所述的每種組合物和食品至少含有一種所述提取物和餾分作為活性成分。朝鮮紫菀是一種菊科多年生草本植物，高50-60cm,—般生長(zhǎng)在比較潮濕的地方。其也可以種植在花園里(Sei-Young，Yun,PictorialBookofKoreanPlants,AcademicPress,pp.508)。然而，未見(jiàn)關(guān)于朝鮮紫菀對(duì)預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥效果，或任何效果或組分的報(bào)道。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，以及所述朝鮮紫菀的各種提取物的乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分對(duì)糖尿病并發(fā)癥的產(chǎn)生具有良好的抑制作用，從而完成本發(fā)明。以下將詳細(xì)描述本發(fā)明。依據(jù)本發(fā)明，朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物和朝鮮紫菀的花提取物是通過(guò)將朝鮮紫菀的葉和莖，根和花干燥和細(xì)切，用乙醇或乙醇水溶液提取，過(guò)濾提取液并將濾液減壓濃縮制備獲以下將進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明制備朝鮮紫菀提取物的方法和檢測(cè)提取物效果的方法。1.制備朝鮮紫菀提取物的方法1)提取步驟首先，將朝鮮紫菀的葉和莖切成細(xì)片。對(duì)切碎的葉和莖，按照5-10倍的量(w/v)添加任何一種甲醇，乙醇，以及它們的水溶液。將含有植物的溶液在室溫下連續(xù)提取2-5次。2)濃縮步驟將提取溶液過(guò)濾，接著減壓濃縮。此時(shí)，濃縮溫度維持在40-45°C，可以防止植物的分解和水解。按照上述相同的方法提取朝鮮紫菀的根和花。說(shuō)明書(shū)第8/18頁(yè)2.朝鮮紫菀提取物的分餾步驟如圖1所示，按照上述方法制備的每一種朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物和朝鮮紫菀的花提取物，都分餾入正己烷層，乙酸乙酯層，正丁醇層和水層，因此獲得各種提取物的正己烷餾分，乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分。3.對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物的抑制作用朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物以及乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分都通過(guò)體外試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，提取物和餾分可以抑制牛血清白蛋白(BSA)的糖基化作用。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)單獨(dú)一種提取物和餾分培養(yǎng)在BSA中時(shí)，晚期糖基化終末產(chǎn)物被抑制50%(IQ。)時(shí)，各種提取物和餾分的濃度是18.74—1(葉和莖提取物),38.75嗎/ml(根提取物)和35.36(ig/ml(花提取物)，表明提取物對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生具有良好的抑4.對(duì)醛糖還原酶活性的抑制作用朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物以及各種提取物的正己烷餾分，乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分都通過(guò)體外試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)其對(duì)醛糖還原酶活性的抑制效果。結(jié)果顯示，提取物和餾分都能抑制醛糖還原酶的活性。具體來(lái)說(shuō)，當(dāng)單獨(dú)一種提取物和餾分能抑制50%的醛糖酶活性時(shí)的濃度為0.40昭/ml(葉和莖提取物)，3.77嗎/ml(根提取物)和2.07昭/ml(花提取物)，表明提取物對(duì)醛糖還原酶的活性具有良好的抑制作用。同時(shí)，葉和莖提取物餾分能抑制50%的醛糖酶活性時(shí)的濃度為1.34jug/ml(乙酸乙酯餾分)，0.47|ig/ml(正丁醇餾分)和2.15|ig/ml(水僧分)。此外，根提取物餾分能抑制50%的醛糖酶活性時(shí)的濃度為0.41Ug/ml(乙酸乙酯餾分)和0.86jag/ml(正丁醇餾分)。此外，花提取物餾分能抑制50%的醛糖酶活性時(shí)的濃度為1.39yg/ml(乙酸乙酯餾分)和3.63ng/ml(正丁醇提取物)。另外，本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，一種預(yù)防或延緩衰老的藥物組合物，每種組合物含有至少一種選自朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，以及各種提取物的乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分作為其活性成分。該藥物組合物在臨床上可通過(guò)口服給藥并按一般藥物制劑形式使用。具體來(lái)說(shuō)，依據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以用稀釋劑或輔料諸如填料，稀釋液，黏合劑，濕潤(rùn)劑，崩解劑，表面活性劑制成各種劑型。用于口服給藥的固體劑型有片劑，丸劑，粉劑，顆粒劑，膠囊等，其通過(guò)將一種或多種諸如淀粉，碳酸鈣，蔗糖或乳糖，明膠等的輔料與此外.除了簡(jiǎn)單的輔料外，還可以用諸如硬脂酸鎂或滑石粉的潤(rùn)滑劑?？诜o藥的方法包括混懸劑，內(nèi)液，乳劑，糖漿等，并且除簡(jiǎn)單的諸如水和液體石蠟外的稀釋劑外，還可能需要使用多種輔料，例如潤(rùn)濕劑，甜味劑，賦香劑，防腐劑等等。非消化道給藥劑型包括無(wú)菌水溶液，非水溶劑，懸浮液，乳化液，凍干制劑，或栓劑等。可以使用丙二醇，聚乙二酸，植物油諸如橄欖油，注射酯如油酸乙酯等作為非水溶劑和懸浮液?？梢允褂冒牒铣芍舅狨?，聚乙二醇，吐溫61，可可黃油，勞林黃油，甘油明膠等用作栓劑基質(zhì)。另夕卜，本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的功能性食品，一種預(yù)防或延緩衰老的功能性食品，每種組合物含有至少一種選自朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，以及各種提取物的乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分作為其活性成分。依據(jù)本發(fā)明的功能性食品可以根據(jù)最終產(chǎn)品的用途和不同消費(fèi)者的偏好添加不同的食品添加劑。有報(bào)道表明，晚期糖基化終末產(chǎn)物產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)生脂肪酸代謝異常，同時(shí)抵抗有害氧自由基的防御系統(tǒng)功能惡化，這樣就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激。此時(shí)，由于氧化應(yīng)激，在體內(nèi)以穩(wěn)定形式存在的氧氣可以通過(guò)包括酶系統(tǒng)，還原代謝，化學(xué)品，污染物及光化學(xué)反應(yīng)等環(huán)境和生化因子轉(zhuǎn)化為高活性氧，因此不可逆轉(zhuǎn)地打破了人體細(xì)胞的蛋白質(zhì)，脂肪和DNA。據(jù)認(rèn)為，抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生可以降低氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)率。下文，將通過(guò)以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步詳述本發(fā)明。但是，這些實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不作為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例朝鮮紫菀的提取和分餾2004年9月，在韓國(guó)全羅北道茂朱郡收集朝鮮紫菀的葉，莖，根和花。將收集的植物按照葉和莖部，根，花進(jìn)行分類(lèi)，并分別切成細(xì)片。切碎的每部分添加到80%的乙醇中置于提取器中在室溫條件下提取3次，每次7天。將提取物在減壓條件下濃縮，這樣就獲得了葉-莖提取物，根提取物和花提取物。在濃縮過(guò)程中，提取器的溫度維持在40-45'C，目的是防止植物組成部分的分解和水解。通過(guò)真空濃縮完全去除乙醇后，將提取物置于冷凍干燥機(jī)中去除水分干燥。如圖l所示，朝鮮紫菀的葉和莖提取物，根提取物和花提取物根據(jù)上述方法獲得，并分餾入正己垸層，乙酸乙酯層，正丁醇層和水層，接著收集各分餾層。實(shí)驗(yàn)例1:發(fā)明材料對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物的抑制作用分析選擇牛血清白蛋白(下文稱(chēng)作為BSA;Sigma,USA)作為體外試驗(yàn)檢測(cè)朝鮮紫菀的葉和莖提取物，根提取物和花提取物以及各種提取物餾分對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制作用的蛋白來(lái)源。用50mM的磷酸緩沖液(pH7.4)溶解BSA到終濃度10mg/ml。用0.2M的果糖和0.2M的葡萄糖作為糖來(lái)源。將果糖/葡萄糖混合物添加到制備好的BSA溶液中。將朝鮮紫菀的葉和莖提取物，根提取物和花提取物以及提取物正己烷餾分，乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分溶于蒸餾水中作為試驗(yàn)組。接著，將各種溶液添加到BSA/糖混合液中，37'C培養(yǎng)14天。此時(shí)，添加0.02%的疊氮鈉作為一種抗菌劑。對(duì)照組是BSA/糖混合培養(yǎng)物，以及各試驗(yàn)組的空白，且對(duì)照組制備好后不進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)，將作為決定發(fā)明材料優(yōu)勢(shì)指標(biāo)的氨基胍作為陽(yáng)性對(duì)照。各種培養(yǎng)物制備4個(gè)樣本，目的是減少誤差。14天后，測(cè)定各組培養(yǎng)物中晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的含量，并記錄結(jié)果。AGEs顯示熒光棕色并具有能夠交聯(lián)的物理和化學(xué)特性。此外，它們還具有被細(xì)胞膜受體識(shí)別的配體。利用分光光度計(jì)(激發(fā)光350nm,發(fā)射光450nm)來(lái)測(cè)定具有如此特性的晚期糖基化終末產(chǎn)物的總量來(lái)分析晚期糖基化終末產(chǎn)物的抑制情況。將按照上述實(shí)施例制備的朝鮮紫菀葉和莖提取物，分別制成濃度為5Mg/ml，10ng/ml和25Mg/ml的溶液。接著，按照試驗(yàn)實(shí)施例1將實(shí)施例中制備得到的朝鮮紫菀根和花提取物，分別制成濃度為10jig/ml，25jug/ml和50jug/ml的溶液。接著，按照試驗(yàn)實(shí)施例1的方法將制備好的各種溶液置于37。C，培養(yǎng)14天。14天后，利用分光光度計(jì)(激發(fā)光350nm，發(fā)射光450nm)來(lái)測(cè)定每種培養(yǎng)物中晚期糖基化終末產(chǎn)物的總量。測(cè)量結(jié)果如表1和圖2所示。按照下面的公式來(lái)計(jì)算晚期糖基化終末產(chǎn)物的抑制產(chǎn)物的抑制(％)=100-(樣本組的熒光強(qiáng)度-空白樣本組的熒光強(qiáng)度)/(對(duì)照組的熒光強(qiáng)度-空白對(duì)照組的熒光強(qiáng)度)x100比較例1:氨基胍對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物的抑制作用作為陽(yáng)性對(duì)照的氨基胍，是用于預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)癥的最有前途的合成藥，將其溶解在蒸餾水中到終濃度為18.5Mg/ml,55.5jag/ml和74.0jug/ml，接著按照試驗(yàn)實(shí)施例1的方法置于37。C，培養(yǎng)14天。14天后，利用分光光度計(jì)(激發(fā)光350nm，發(fā)射光450nm)來(lái)測(cè)定各組培養(yǎng)物中晚期糖基化終末產(chǎn)物的含量。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表1和圖2至5所示，朝鮮紫菀葉和莖提取物的ICs。值為18.74Hg/ml，它的抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍(Q。值是72.12ng/ml)3.8倍。同時(shí)，朝鮮紫菀根提取物(Cw值是38.75Mg/ml)和花提取物(Cso值是35.36jug/ml)的抑制效果都優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照約2倍。實(shí)驗(yàn)例2:發(fā)明提取物和餾分對(duì)醛糖還原酶活性的抑制作用分析將朝鮮紫菀的葉和莖提取物，根提取物和花提取物以及各種提取物正己烷餾分，乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分和水餾分溶用于體外試驗(yàn)分析其對(duì)醛糖還原酶活性的抑制作用。檢測(cè)方法按照Dufrane(1984)的方法，為了從SD大鼠(Sprague-Dawley大鼠，250-280g)的眼球獲得天然的醛糖還原酶，將從大鼠釆集的晶狀體在135mM的鈉,鉀磷酸緩沖液(pH7.0)和10mM的2-巰基乙醇緩沖液中用勻漿儀和超聲波破碎儀破粹。將獲得的溶液在14000rpm下離心30分鐘，將上清液用0.2-um過(guò)濾器過(guò)濾后用于試驗(yàn)。以上所有過(guò)程都在4'C下進(jìn)行。BSA用作一種酶蛋白質(zhì)來(lái)源，蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定釆用Lawiy，的方法。將135mM的鈉，鉀磷酸緩沖液(pH7.0)，lOOmM硫酸鋰，0.03mMNADPH，0.04mMDL-甘油醛，以及100ng/ml的酶的混合物溶于0.1%的DMSO中，然后添加至50jul的每種樣品，使其最終體積為lml。接著將獲得的溶液置于37°C，反應(yīng)10分鐘。將不添加0.04mMDL-甘油醛的混合液作為對(duì)照，將含有135mM的鈉,鉀磷酸緩沖液(pH7.0)和添加有50julNADP(0.2-5jum)的100mM硫酸鋰混合液作為標(biāo)準(zhǔn)。添加0.3ml的0.5NHC1終止反應(yīng)后，添加lml含有10mM咪唑的6MNaOH在6(TC反應(yīng)IO分鐘。測(cè)定NADP轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)物的情況。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次。利用分光光度計(jì)(Bio-TEK，SynergyHT,USA)在激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為460nm條件下，測(cè)定各樣品的效果，表述為IC50。1.朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物和朝鮮紫菀的花提取物對(duì)醛糖還原酶活性抑制效果的分析將按照實(shí)施例中制備的朝鮮紫菀葉和莖提取物，分別制成濃度為0.1jag/ml，0.25|ig/ml和0.5jag/ml的溶液。接著，按照實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。將實(shí)施例中制備的朝鮮紫菀根提取物，分別制成濃度為0.5yg/ml，5ug/ml和10ng/ml的溶液。接著，按實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。將實(shí)施例中制備的朝鮮紫菀花提取物，分別制成濃度為1.0M<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>將按照上述實(shí)施例制備的朝鮮紫菀根提取物乙酸乙酯餾分，分別制成濃度為0.25|ag/ml，0.5jag/ml和1.0jag/ml的溶液。接著，按照實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。將按照上述實(shí)施例制備的朝鮮紫菀根提取物正丁醇餾分，分別制成濃度為0.25|ug/ml，0.5jig/ml和1.0jug/ml的溶液。接著，按照實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。將按照上述實(shí)施例制備的朝鮮紫菀根提取物水餾分，分別制成濃度為20.0yg/ml，30.0Mg/ml和40.0jig/ml的溶液。接著，按照實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。將按照上述實(shí)施例制備的朝鮮紫菀花提取物正己垸餾分，分別制成濃度為10.0|ug/ml，20.0ug/ml和30.0ng/ml的溶液。接著，按照實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。將按照上述實(shí)施例制備的朝鮮紫菀花提取物乙酸乙酯餾分，分別制成濃度為0.5jug/ml，1.0jag/ml和2.5jag/ml的溶液。接著，按照實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。將按照上述實(shí)施例制備的朝鮮紫菀花提取物正丁醇餾分，分別制成濃度為2.5jug/ml，5.0Mg/ml和10.0jag/ml的溶液。接著，按照實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。將按照上述實(shí)施例制備的朝鮮紫菀花提取物水餾分，分別制成濃度為10.0jug/ml，20.0)Jg/ml和30.0Mg/ml的溶液。接著，按照實(shí)驗(yàn)例2的方法檢測(cè)各種溶液的作用效果。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如表3和圖10至16所示，朝鮮紫菀葉和莖提取物正丁醇餾分，乙酸乙酯餾分和水餾分的IC5o值分別為0.47嗎/ml，1.34嗎/ml，2.15嗎/ml，表明餾分的抑制效果優(yōu)于3,3-四甲烯戊二酸(Cso值是4.50嗎/ml，參見(jiàn)表2)9.6倍，3.4倍和2.1倍。朝鮮紫菀根提取物乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分的IC5Q值分別為0.41(ig/ml和0.86ng/ml，表明餾分的抑制效果優(yōu)于3,3_四甲烯戊二酸U倍和5.2倍。朝鮮紫菀花提取物乙酸乙酯餾分，正丁醇餾分的ICso值分別為1.39|tig/ml和3.63jLig/ml,表明餾分的抑制效果優(yōu)于3,3-四甲烯戊二酸3.2倍和1.2倍。實(shí)驗(yàn)例3:利用ELISA試驗(yàn)來(lái)測(cè)定發(fā)明提取物和餾分對(duì)AGEs-BSA產(chǎn)生的抑制作用利用晚期糖基化終末產(chǎn)物特異抗體按照免疫學(xué)方法(ELISA)分析本發(fā)明的提取物和餾分中對(duì)晚期糖基化終末產(chǎn)物產(chǎn)生具有相對(duì)良好抑制作用的材料的效果。檢測(cè)方法依據(jù)Engvall的方法按照下面的方式進(jìn)行AGEs-ELISA試驗(yàn)。取100ixl樣品和50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)(l:2v/v)的混合液體添加到96孔板的每個(gè)小孔中，接著置于37。C下2小時(shí)。將平板用0.05%的PBST洗3次，接著用1%BSA/PBS封閉。在平板放置1小時(shí)后，用0.05%的PBST洗3次。將每種AGE抗體(6D12,TransGenicInc.,Kobe,Japan)和CML抗體(NF-IG,TransGenicInc.,Kobe,Japan)稀釋1000倍，然后每孔添加lOO(il的抗體稀釋液，室溫放置1小時(shí)。在用0.05。/。的PBST洗板3次后，每孔加入100iil的HRP標(biāo)記的二抗(SantaCruz,USA)IOOO倍稀釋液，放置1小時(shí)。用0.05%的PBST洗平板3次，每孔添加100|il的底物3,3',5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。平板放置5分鐘后，每孔添加lOO(il的反應(yīng)終止液(1MH2S02)。接著，用酶標(biāo)儀測(cè)定平板小孔里內(nèi)含物的吸光度。在根提取物和莖/葉提取物中，培養(yǎng)14天后，它們?cè)跐舛葹?5jng/ml和50Mg/ml時(shí)對(duì)AGEs的產(chǎn)生表現(xiàn)出顯著的抑制作用(參見(jiàn)圖17和18)。在花提取物中，其在濃度為50jug/ml時(shí)對(duì)AGEs的產(chǎn)生表現(xiàn)出顯著的抑制作用(參見(jiàn)圖19)。20當(dāng)AGEs濃度為25和50yg/ml時(shí)，莖/葉提取物具有最佳的效果。在圖中，#，##和絲#分別表示與不含紫菀的培養(yǎng)物的統(tǒng)計(jì)比較結(jié)果p〈0.05，0.01和0.001。權(quán)利要求1、一種用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，其含有選自下組中的任一種作為有效成分朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，朝鮮紫菀的葉和莖提取物的乙酸乙酯餾分、正丁醇餾分或水餾分，朝鮮紫菀的根提取物的乙酸乙酯餾分或正丁醇餾分，以及朝鮮紫菀的花提取物的乙酸乙酯餾分或正丁醇餾分，所述每種提取物是通過(guò)將朝鮮紫菀的葉和莖部分，根和花細(xì)切用乙醇或乙醇水溶液提取，過(guò)濾提取液并將濾液減壓濃縮制備獲得，所述每種提取物的餾分是通過(guò)將各種提取物依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水分餾得到。2、一種用于預(yù)防或延緩衰老的藥物組合物，其含有選自下組中的任一種作為有效成分朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，朝鮮紫菀的葉和莖提取物的乙酸乙酯餾丁醇餾分，以及朝鮮紫菀的花提取物的乙酸乙酯餾分或正丁醇餾分，所述每種提取物是通過(guò)將朝鮮紫菀的葉和莖部分，根和花細(xì)切用乙醇或乙醇水溶液提取，過(guò)濾提取液并將濾液減壓濃縮制備獲得，所述每種提取物的餾分是通過(guò)將各種提取物依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水分餾得到。3、一種用于預(yù)防和減緩糖尿病并發(fā)癥的保健功能食品，其含有選自下組中的任一種作為有效成分朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，朝鮮紫菀的葉和莖提取物的乙酸乙酯餾分、正丁醇僧分或水餾分，朝鮮紫菀的根提取物的乙酸乙酯餾分或正丁醇餾分，以及朝鮮紫菀的花提取物的乙酸乙酯餾分或正丁醇餾分，所述每種提取物是通過(guò)將朝鮮紫菀的葉和莖部分，根和花細(xì)切用乙醇或乙醇水溶液提取，過(guò)濾提取液并將濾液減壓濃縮制備獲乙酯、正丁醇和水分餾得到。4、一種用于預(yù)防和延緩衰老的保健功能食品，其含有選自下組中的任一種作為有效成分朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物，朝鮮紫菀的花提取物，朝鮮紫菀的葉和莖提取物的乙酸乙酯餾分、正丁醇餾分或水餾分，朝鮮紫菀的根提取物的乙酸乙酯餾分或正丁醇餾分，以及朝鮮紫菀的花提取物的乙酸乙酯餾分或正丁醇餾分，所述每種提取物是通過(guò)將朝鮮紫菀的葉和莖部分，根和花細(xì)切用乙醇或乙醇水溶液提取，過(guò)濾提取液并將濾液減壓濃縮制備獲得，所述每種提取物的餾分是通過(guò)將各種提取物依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇和水分餾得到。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種朝鮮紫菀的葉和莖提取物，一種朝鮮紫菀的根提取物，一種朝鮮紫菀的花提取物，以及一種用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，一種用于改善糖尿病并發(fā)癥的保健功能食品，以及一種預(yù)防或延緩衰老的藥物組合物和保健功能食品，所述組合物和食品含有至少一種所述朝鮮紫菀提取物作為活性成分。所述每種提取物是通過(guò)干燥并細(xì)切朝鮮紫菀的每個(gè)葉和莖部分，根和花，用乙醇或乙醇水溶液提取切碎植物，將提取溶液過(guò)濾并將濾液減壓濃縮得到。本發(fā)明還公開(kāi)一種用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物，一種預(yù)防或治療糖尿病的功能食品，以及一種預(yù)防或延緩衰老的藥物組合物和功能食品，其含有至少一種通過(guò)每種所述朝鮮紫菀提取物依次用正己烷，乙酸乙酯，正丁醇和水分餾得到的餾分。朝鮮紫菀的葉和莖提取物，朝鮮紫菀的根提取物以及朝鮮紫菀的花提取物具有抑制導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)的作用，并且有效抑制醛糖還原酶(AR)活性。因此，所公開(kāi)的提取物在預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥和預(yù)防衰老中具有重要作用。文檔編號(hào)A61K36/28GK101678061SQ200880015216公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日發(fā)明者劉姃林,孫銀珍,張大植,李允美,鄭東昊,金周煥,金正玹,金溫順,金真淑,金種敏,金英淑,金贊植申請(qǐng)人:韓國(guó)韓醫(yī)學(xué)研究院