專利名稱：抑制c-MET二聚化的新型抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠特異性結(jié)合人C-Met受體和/或能夠特異性抑制所述受體的酪氨 酸激酶活性的新型抗體，特別是鼠的，嵌合的和人源化來源的單克隆抗體，以及編碼這些抗 體的氨基酸和核苷酸序列。更具體而言，本發(fā)明所述的抗體能夠抑制c-Met 二聚化。本發(fā) 明也包含這些抗體作為藥物在預(yù)防性和/或治療性處理惡性腫瘤或與所述受體過表達(dá)有 關(guān)的任何病變中的用途，以及在診斷與c-Met過表達(dá)有關(guān)的疾病的過程中和試劑盒中的用 途。本發(fā)明最后包含含有所述抗體聯(lián)合針對(duì)在腫瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移中涉及的其他生長(zhǎng)因子的其 他抗體和/或化學(xué)化合物，和/或化合物和/或抗惡性腫瘤制劑或與毒素結(jié)合的制劑的產(chǎn) 品和/或組合物，以及它們?cè)陬A(yù)防和/或治療某些惡性腫瘤中的用途。
背景技術(shù)：
已經(jīng)顯示，受體酪氨酸激酶(RTK)靶向劑如曲妥單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗、伊 馬替尼和吉非替尼抑制劑有利于以該蛋白質(zhì)類為靶標(biāo)用于治療選定的惡性腫瘤。c-Met是RTK亞家族的原型成員，該亞家族也包括RON和SEA。c_Met RTK家族與 其他RTK家族在結(jié)構(gòu)上有區(qū)別并且是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF，也稱離散因子，SF)的唯一已 知的高親和性受體[D. P. Bottaro etal, Science 1991，251 :802_804 ;L. Naldini et al, Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991，10 =2867-2878]。c-Met 和 HGF 在多種組織中廣泛表達(dá)，它們的 表達(dá)一般分別限定于上皮和間充質(zhì)來源的細(xì)胞[M. F. Di Renzo et al.，Oncogene 1991， 6 1997-2003 ；E. Sonnenberg et al.，J. Cell. Biol. 1993，123 :223_235]。兩者對(duì)于正常 的哺乳動(dòng)物的發(fā)育都是必需的，并且已經(jīng)表明它們?cè)诩?xì)胞遷移、形態(tài)分化和三維管狀結(jié)構(gòu) 的組織以及生長(zhǎng)和血管發(fā)生中特別重要[F. Baldt et al.，Nature 1995,376:768-771; C.Schmidt et al. ， Nature. 1995 373 699-702 ；Tsarfaty et al. ， Science 1994,263 98-101]。已經(jīng)表明，c-Met和HGF受控制的調(diào)節(jié)在哺乳動(dòng)物發(fā)育、組織保持和修復(fù)中是重 要的[Nagayama T, Nagayama M, Kohara S, Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, Itoh J, Shinohara Y. ,Brain Res. 2004,5 ；999(2) 155-66 ；Tahara Y,Ido A,Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H. , J Pharmacol Exp Ther. 2003,307 (1) 146-51]，它們的失調(diào)涉及到惡性腫瘤的進(jìn)展。c-Met的不適當(dāng)?shù)募せ顚?dǎo)致的異常信號(hào)傳導(dǎo)是在人的惡性腫瘤中觀察到的最常 見的改變之一，在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[Birchmeier et al. , Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003,4 915-925 ；L. Trusolino 禾口 Comoglio P. Μ. , Nat Rev. Cancer. 2002,2(4) 289-300]。不適當(dāng)?shù)腸-Met激活可通過配體依賴性和非依賴性機(jī)制(包括c-Met過表達(dá)，和 /或旁分泌或自分泌激活)發(fā)生，或通過獲得性功能突變發(fā)生[J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R.，Cancer Latters. 2005，226 1-26]。然而，在配體存在或不存在情況下 的c-Met受體的寡聚化在調(diào)節(jié)激酶對(duì)ATP和含酪氨酸的肽底物的結(jié)合親和力和結(jié)合動(dòng)力學(xué) 中是必需的[Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17,43 10570-8] 激活的
7c-Met募集信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)物到它位于胞質(zhì)區(qū)中的多停泊位點(diǎn)(multidocking site)，導(dǎo)致幾 個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，這些信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括Ras-MAPK、PI3K、Src和Stat3[Gao CF, Vandeffoude GF, Cell Res. 2005，15(1) :49_51 ；Furge ΚΑ, Zhang Yff, Vandeffoude GF, Oncogene. 2000,19(49) :5582_9]。這些途徑對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和血管生成和對(duì)于 逃避細(xì)胞凋亡是必需的[Furge KA, Zhang Yff, Vande Woude GF, Oncogene, 2000,19(49) 5582-9 ；Gu H, Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3) 122-30 ；Fan S, Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q, Cao Y, Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27,19(18) 2212-23] 0此外，相對(duì)于其他RTK，c_Met信號(hào)傳導(dǎo)的獨(dú)特之處在于已經(jīng)報(bào)道 的它與粘著斑復(fù)合物和非激酶結(jié)合伙伴如α6β4整合素[Trusolino L, Bertotti A， Comoglio PM, Cell. 2001,107 643-54], CD44v6[Van der Voort R, Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren Μ, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G, Gherardi Ε, Pals ST, J Biol Chem. 1999,274(10) :6499_506]，Plexin Bl 或信號(hào)素(semaphorin) [Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, Tamagnone L, Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002,4(9) 720-4 ；Conrotto P, Valdembri D, Corso S, Serini G, Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F, Giordano S, Blood. 2005,105(11) :4321_9 ；Conrotto P, CorsoS，Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S，Oncogene. 2004，23 :5131_7]之間的相互 作用，這可進(jìn)一步增加了這一受體調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的復(fù)雜性。最后，近期的數(shù)據(jù)證明，c-Met可 能涉及腫瘤對(duì)吉非替尼和埃羅替尼的抵抗，這提示聯(lián)合靶向EGFR和c-Met兩者的化合物可 能有重要意義[Engelman JA at al.，Science, 2007, 316 1039-43]。在過去幾年中，已開發(fā)出許多不同策略用來減弱惡性腫瘤細(xì)胞系中的c-Met信號(hào) 傳導(dǎo)。這些策略包括i)抗c-Met或HGF/SF的中和抗體[Cao B, Su Y, Oskarsson M, Zhao P,Kort EJ,Fisher RJ,Wang LM,Vandeffoude GF, Proc Natl Acad Sci USA. 2001，98(13) 7443-8 ；Martens Τ, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant Μ, Schwall R, WestphalM,Lamszus K,Clin Cancer Res. 2006,12(20) :6144_52]或使用 HGF/SF 的拮抗劑 NK4 來阻止配體結(jié)合 c-Met[Kuba K, Matsumoto K, Date K, Shimura H, Tanaka Μ, Nakamura Τ, Cancer Res. ,2000,60 :6737_43] ；ii) c-Met的小ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制劑來阻斷激酶活性 [Christensen JG, Schreck R, Burrows J, Kuruganti P, Chan Ε, Le P, Chen J, Wang X, RuslimL,Blake R,Lipson KE,Ramphal J,Do S,Cui JJ,Cherrington JM,MendeIDB,Cancer Res. 2003,63 7345-55] ；iii)影響通向多停泊位點(diǎn)的工程化的SH2區(qū)多肽，和降低受體或 配體表達(dá)的RNAi或核酶。這些方法中的大部分表現(xiàn)出c-Met的選擇性抑制，從而導(dǎo)致腫瘤 的抑制，并且表明c-Met在惡性腫瘤的治療性干預(yù)中可能是令人感興趣的。所產(chǎn)生的靶向c-Met的分子中，有些是抗體。最廣泛描述的是Genentech [W096/38557]生產(chǎn)的抗c_Met 5D5抗體，其在多種模 型中單獨(dú)加入時(shí)作為強(qiáng)力激動(dòng)劑起作用，當(dāng)用作Fab片段時(shí)作為拮抗劑起作用。這一抗體 的單價(jià)的工程化的形式被描述為單臂5D5(0A5D5)，在大腸桿菌中作為重組蛋白質(zhì)而產(chǎn)生， 這也是Genentech專利申請(qǐng)[W02006/015371]的主題。然而，這一分子由于它特定的支架 (scarfold)而不能被認(rèn)為是抗體，它也表現(xiàn)出能產(chǎn)生對(duì)于人具有免疫原性的突變。在活性 方面，這一未糖基化的分子不具有效應(yīng)物的功能，并且最后沒有清楚的數(shù)據(jù)證明，0A5D5抑 制c-Met的二聚化。此外，當(dāng)在G55體內(nèi)模型(表達(dá)c-Met但不表達(dá)HGF mRNA和蛋白質(zhì)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，其不依賴于配體而生長(zhǎng))中試驗(yàn)時(shí)，單臂抗c-Met對(duì)G55腫瘤生長(zhǎng)無 顯著效應(yīng)，這提示0A5D5主要通過阻斷HGF結(jié)合起作用，并且不能夠靶向不依賴于HGF而激 活的腫瘤[Martens Τ. et al, Clin. Cancer Res.，2006，12 (20) :6144_6152]。Pfizer描述的另一個(gè)靶向c-Met的抗體是通過“主要作為c-Met拮抗劑，并且在有 些情況下作為c-Met激動(dòng)劑”起作用的抗體[W02005/016382]。該申請(qǐng)沒有描述顯示Pfizer 抗體對(duì)c-Met 二聚化的任何效應(yīng)的數(shù)據(jù)。本發(fā)明的一個(gè)新的方面是產(chǎn)生沒有內(nèi)在的激動(dòng)活性并且抑制C-Met 二聚化的鼠 單克隆抗體。除了靶向配體依賴性腫瘤外，該方法也破壞由于c-Met過表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)區(qū) 突變的配體非依賴性c-Met激活，這種激活依舊依賴于寡聚化以進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。這種 抗體活性的另一方面可能是對(duì)c-Met和其伙伴之間的相互作用的產(chǎn)生空間位阻從而破壞 c-Met的功能。除了與特異性阻斷c-Met受體有關(guān)的功能之外，優(yōu)選地這些抗體是人源化的 和工程化的作為人IgGl以獲得效應(yīng)物功能如ADCC和⑶C，但不限于此。

發(fā)明內(nèi)容
令人驚訝地，發(fā)明人第一次設(shè)法產(chǎn)生了能夠結(jié)合C-Met也能夠抑制C-Met 二聚化 的抗體。在現(xiàn)有技術(shù)中，有時(shí)候提示能夠抑制c-Met與其伙伴二聚化的抗體可能是令人感 興趣的抗體，如果這是真的話，也從來沒有公開過，或清楚的提示有抗體能夠做到這一點(diǎn)。 此外，關(guān)于抗體的特異性，成功產(chǎn)生這種活性抗體根本是不明顯的。第一方面，本發(fā)明的主題是產(chǎn)生和選擇本發(fā)明所述的抗體的方法。更具體地，本發(fā)明涉及選擇能夠抑制配體依賴性和配體非依賴性c-Met激活的抗 c-Met抗體或其功能片段之一或衍生物的方法，所述的方法包含下述步驟i)篩選所產(chǎn)生的抗體，選擇能夠特異性結(jié)合c-Met的抗體；ii)體外評(píng)價(jià)步驟i)中選定的抗體，并且選擇能夠至少50%，優(yōu)選至少60%，70% 或80%地抑制至少一種腫瘤類型的腫瘤細(xì)胞增殖的抗體；iii)試驗(yàn)步驟ii)中選定的抗體，選擇能夠抑制c-Met 二聚化的抗體。如前面所解釋的，由于這種抗體對(duì)于更大人群的病人具有實(shí)際的意義，抑制c-Met 二聚化是本發(fā)明的首要方面。不僅配體依賴性激活的c-Met惡性腫瘤(正如直到本發(fā)明的 情況)，而且配體非依賴性激活的c-Met惡性腫瘤也能通過本發(fā)明所述的方法產(chǎn)生的抗體 進(jìn)行治療?？贵w的產(chǎn)生可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來實(shí)現(xiàn)，例如，將骨髓瘤細(xì)胞 與從免疫小鼠或任何其他與選定的骨髓瘤細(xì)胞相容的物種獲得的脾細(xì)胞融合[Kohler & Milstein, 1975，Nature, 256 =495-497]。免疫動(dòng)物可包括帶有人免疫球蛋白質(zhì)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基 因鼠，其然后能直接產(chǎn)生人抗體。其他可能的具體實(shí)施方式
可能在于使用噬菌體顯示技術(shù) 以篩選文庫(kù)。篩選步驟i)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法或過程來實(shí)現(xiàn)。作為非限制 性例子，可以提及的是ELISA、BIAcore、免疫組化、FACS分析和功能性篩選。優(yōu)選的方法在 于通過ELISA對(duì)c-Met重組蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選，并且然后通過FACS分析至少一種腫瘤細(xì)胞 系，以確定所產(chǎn)生的抗體也能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞上天然的受體。這一方法將在下述的實(shí)施例 中進(jìn)行更精確的描述。
同樣，步驟ii)也可通過已知的方法或過程來經(jīng)典地實(shí)現(xiàn)，例如使用3H-胸腺嘧啶 或任何其他DNA染色劑、MTT、ATP評(píng)價(jià)等。本發(fā)明中優(yōu)選的腫瘤細(xì)胞模型可為BxPC3模型。通過抑制c-Met 二聚化，必須理解它優(yōu)選地為c-Met同二聚化。在本發(fā)明所述的選擇方法的步驟iii)的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，所述的步驟iii) 在于通過BRET分析表達(dá)c-Met-RLuc/c-Met-YFP兩者的細(xì)胞來評(píng)價(jià)抗體，并且選擇能夠至 少30 %，優(yōu)選35 %、40 %、45 %、50 %、55 %或最優(yōu)選60 %地抑制BRET信號(hào)的抗體。BRET技術(shù)為已知技術(shù)，其是蛋白質(zhì)二聚化的代表性技術(shù)[Angerset al, PNAS, 2000,97 3684-89]。在該方法的步驟iii)中使用的BRET技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且將會(huì)在 下述實(shí)施例中進(jìn)行詳細(xì)描述。更具體地，BRET(生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)是發(fā)生在生物發(fā) 光供體(海腎熒光素酶(RenillaLuciferashRluc))和熒光受體，GFP (綠色熒光蛋白質(zhì)) 或YFP(黃色熒光蛋白質(zhì))的突變體之間的非放射性能量轉(zhuǎn)移。在本案中使用了 EYFP(增 強(qiáng)型黃色熒光蛋白質(zhì))。轉(zhuǎn)移的效率依賴于供體和受體之間的方向和距離。因此，只有當(dāng)兩 個(gè)分子臨近(I-IOnm)時(shí)才可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。這一屬性用來進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作 用分析。實(shí)際上，為研究?jī)蓚€(gè)伙伴間的相互作用，第一個(gè)通過基因工程使其融合到海腎熒光 素酶中，并且第二個(gè)融合到GFP的黃色突變體中。融合蛋白質(zhì)一般但不是一定在哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中表達(dá)。在其膜具有通透性的底物(腔腸素(coelenterazine))存在條件下，Rluc發(fā) 射藍(lán)光。如果GFP突變體與Rluc接近大于lOnm，可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，并且可檢測(cè)到另外的黃 色信號(hào)。測(cè)量的BRET信號(hào)為受體發(fā)射的光和供體發(fā)射的光的比率。因此，當(dāng)使兩個(gè)融合蛋 白接近或如果構(gòu)象變化使Rluc和GFP突變體更近時(shí)，BRET信號(hào)將會(huì)增加。如果BRET分析是一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的話，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方 法可用來測(cè)量c-Met 二聚化。非限制性地，下述技術(shù)可被提及FRET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)， HTRF(均相時(shí)間分辨熒光)，F(xiàn)LIM(熒光壽命成像顯微鏡)或SW-FCCS((單波長(zhǎng)熒光相關(guān)光 譜法(single wavelength fluorescence cross-correlation spectroscopy)) 0也可使用其他經(jīng)典的技術(shù)，如免疫共沉淀，α篩選，化學(xué)交聯(lián)，雙雜交，親和層析， ELISA 或遠(yuǎn)端 western 印跡(Far western blot)。第二方面，本發(fā)明的主題為通過所述的方法獲得的分離的抗體或其功能片段之一 或衍生物。所述的抗體或其所述的功能片段之一或衍生物能夠特異性結(jié)合到人c-Met，并 且，如果必要，優(yōu)選地還能夠抑制其配體HGF的天然結(jié)合和/或能夠特異性抑制所述c-Met 的酪氨酸激酶活性，所述的抗體也能夠抑制c-Met的二聚化。更具體地，所述的抗體能夠抑 制c-Met的配體依賴性和配體非依賴性激活?！肮δ苄云魏脱苌铩钡谋硎龃撕髸?huì)在本說明書中進(jìn)行詳細(xì)的限定。在此必須理解，本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，也就是說，這些抗體不是在其天然 的環(huán)境中，而是它們能夠從天然來源中通過純化被分離或獲得，或還可通過基因重組獲得， 或通過化學(xué)合成獲得，因此，它們含有非天然氨基酸，這一點(diǎn)會(huì)進(jìn)一步描述。更具體地，根據(jù)本發(fā)明所述的另一方面，其要求保護(hù)抗體或其功能片段之一或衍 生物，所述的抗體的特征在于其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R，所述⑶R選自包含氨基酸序 列 SEQ ID No. 1 至 17 和 56 至 61 的 CDR。含有至少一個(gè)⑶R，該⑶R的序列在與序列SEQ ID No. 1至17和56至61進(jìn)行優(yōu)化比對(duì)后，至少具有80 %的同一性，優(yōu)選地85 %、90 %、95 %或98 %的同一性的任何抗體或 片段或衍生物，都應(yīng)理解為本發(fā)明的等同物，因此，也是本發(fā)明的一部分。CDR區(qū)或CDR的意思是指IMGT限定的免疫球蛋白質(zhì)的重鏈和輕鏈的高變區(qū)。IMGT特有編號(hào)(IMGT unique numbering)被限定用來比較可變區(qū)，而不論抗原受 體、鏈的類型或物種[Lefranc M. -P. , ImmunologyToday 18, 509 (1997)/Lefranc M.-P.， The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc, Μ. -P. , Pommie, C, Ruiz, Μ. , Giudicelli, V. , Foulquier, Ε. , Truong, L. , Thouvenin-Contet, V.禾口 Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。在IMGT特有編號(hào)中，保守氨基酸總是具有相同的位置，例如半胱氨酸23 (第 1-CYS)，色氨酸41 (保守-TRP (CONSERVED-TRP))，疏水氨基酸89，半胱氨酸104 (第2-CYS)， 苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT特有編號(hào)提供了對(duì)框架區(qū)(FR1-IMGT 位 置 1 至 26，F(xiàn)R2-IMGT 39 至 55、FR3-IMGT 66 至 104 和 FR4-IMGT :118 至 128)和其互補(bǔ)決 定區(qū)CDR1-IMGT 27 至 38、CDR2_IMGT 56 至 65 和 CDR3-IMGT 105 至 117 的標(biāo)準(zhǔn)限定。由 于缺口代表未占據(jù)的位置，⑶R-IMGT的長(zhǎng)度(在括號(hào)中顯示用并點(diǎn)分開，例如[8.8. 13]) 是重要的信息。IMGT特有編號(hào)用2D圖表示，稱為IMGT Colliers de Perles[Ruiz, Μ. and Lefranc, Μ.-P. , Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas, Q.and Lefranc, M. -P., CurrentBioinformatics，2，21-30 (2007)]，并且在 IMGT/3D 結(jié)構(gòu) _DB[Kaas，Q. ,Ruiz,Μ. and Lefranc, Μ. -P. , T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res. ,32, D208-D210(2004)]中用 3D 結(jié)構(gòu)表示。存在3個(gè)重鏈⑶R和3個(gè)輕鏈⑶R。根據(jù)情況的不同，此處使用的術(shù)語⑶R或多個(gè) CDR用于表示這些區(qū)(含有大部分負(fù)責(zé)抗體對(duì)抗原或其識(shí)別的表位的親和性結(jié)合的氨基酸 殘基的區(qū))中的一個(gè)或幾個(gè)，或甚至全部。本發(fā)明意義上的兩條核酸或氨基酸序列之間的“同一性百分?jǐn)?shù)”是指將要比較的 兩個(gè)序列之間的核苷酸或同樣的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，該百分?jǐn)?shù)在進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)(優(yōu)化比 對(duì))后獲得，這一百分?jǐn)?shù)是純粹統(tǒng)計(jì)上的，并且兩個(gè)序列間的差異隨機(jī)分布并在全長(zhǎng)上分 布。傳統(tǒng)上，對(duì)兩個(gè)核酸或氨基酸序列的比較是通過將他們以優(yōu)化的方式比對(duì)后進(jìn)行比較， 所述的比較可通過區(qū)段或“比較窗口”進(jìn)行。除了手工方式之外，進(jìn)行比較的序列的優(yōu)化比 對(duì)可通過 Smith 和 Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 482]的局部同源性算法，Neddleman 和 Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 443]的局部同源性算法，Pearson 和 Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444)的相似性檢索法，通過使用這些算法的計(jì)算機(jī)軟件 (威斯康辛遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(Genetics Computer Group), 575 Science Dr.，Madison，WI，或通過 BLAST N 或 BLAST P 比較軟件的 別的方式)的方式進(jìn)行。兩條核酸或氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)通過以優(yōu)化方式比較這兩個(gè)序列來 確定，并且其中進(jìn)行比較的核酸或氨基酸序列可包含相對(duì)于參考序列的加入序列或刪除序 列，該參考序列用于在這兩條序列之間進(jìn)行優(yōu)化比對(duì)。同一性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算是通過確定兩 個(gè)序列間相同核苷酸或氨基酸殘基的同樣位置的數(shù)目，將這一同樣位置的數(shù)目除以所比較 窗口的總位置數(shù)目，將所獲得的結(jié)果乘以100，從而獲得這兩條個(gè)序列間的同一性百分?jǐn)?shù)。例如，可能使用BLAST程序?qū)?個(gè)序列進(jìn)行BLAST(Tatusova etal，“ Blast 2 sequences—a new tool for comparing protein 禾口 nucleotidesequences " , FEMSMicrobiol Lett. 174 247-250)，^tMit http //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/ bl2.html上獲得，使用那些缺省給定的參數(shù)(特別是參數(shù)“開放空缺罰分(open gap penalty) ” 5，和“擴(kuò)展空缺罰分(extension gap penalty) ” 2 ；選擇作為矩陣，例如該程 序建議的“BL0SUM 62”矩陣)，將要比較的兩條序列的同一性百分?jǐn)?shù)直接通過該程序計(jì)算得出。相對(duì)于參考氨基酸序列具有至少80 %，優(yōu)選85 %、90 %、95 %或98 %的同一性的 氨基酸序列，那些相對(duì)于參考序列具有某些修飾，特別是刪除、加入或替換了至少一個(gè)氨基 酸，截短或延長(zhǎng)是優(yōu)選的。在替換一個(gè)或多個(gè)連續(xù)或不連續(xù)氨基酸的情況下，該替換優(yōu)選為 所替換的氨基酸被“等同”氨基酸所替換。“等同氨基酸”(equivalent amino acids)的表 述在此處的目的是表示任何能夠多個(gè)氨基酸之一所替換的任何氨基酸，替換上去的氨基酸 具有相應(yīng)抗體的基本結(jié)構(gòu)卻不會(huì)對(duì)其生物活性進(jìn)行實(shí)質(zhì)上修飾，并且這些氨基酸將在以后 限定，特別是在實(shí)施例中限定。這些等同氨基酸的確定可基于它們與被它們替換的氨基酸 的結(jié)構(gòu)同源性，或基于能夠進(jìn)行的不同抗體間生物活性的比較性試驗(yàn)。通過舉例的方式提及能夠進(jìn)行的可能的替換，該替換不導(dǎo)致相應(yīng)的修飾抗體的生 物活性的較大修飾。作為非限制性的例子，下述表1給出了考慮到保持修飾抗體的生物活性的可能的 替換。在同樣條件下，相反的替換當(dāng)然也是可能的。表 權(quán)利要求
一種能夠抑制c Met的配體依賴性和配體非依賴性激活的抗c Met抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”的選擇方法，其特征在于該方法包含下述步驟i)篩選所產(chǎn)生的抗體，選擇能夠特異性結(jié)合c Met的抗體；ii)體外評(píng)價(jià)步驟i)中選定的抗體，選擇能夠抑制至少50％的至少一種腫瘤類型的腫瘤細(xì)胞增殖的抗體；iii)試驗(yàn)步驟ii)中選定的抗體，選擇能夠抑制c Met二聚化的抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟iii)在于通過BRET分析表達(dá)c-Met-RLuc/ c-Met-YFP兩者的細(xì)胞來評(píng)價(jià)抗體，選擇能夠抑制至少30% BRET信號(hào)的抗體。
3.—種能夠通過如權(quán)利要求1或2所述的方法獲得的分離抗體或其功能性“二價(jià)片段” 之一或“衍生物”。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R，所述的⑶R選自包含氨基酸序列SEQ ID No. 1至17和56 至61的CDR。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于其 包含重鏈，所述的重鏈包含至少一個(gè)⑶R，所述的⑶R選自包含氨基酸序列SEQ ID No. 1至 9和56至58的CDR。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈，所述的重鏈包含至少一個(gè)⑶R，所述的⑶R選自⑶R-Hl、⑶R-H2或⑶R-H3，其 中-CDR-Hl包含氨基酸序列SEQ ID No. 1、4、7或56，-CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No. 2、5、8或57，-CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No. 3、6、9或58。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈，所述的重鏈包含⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中⑶R-Hl包含氨基酸序列SEQ ID No. 1，CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No. 2，CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No. 3。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈，所述的重鏈的序列包含氨基酸序列SEQID No. 18。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈，所述的重鏈包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-Hl包含氨基酸序列SEQ ID No. 4，CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No. 5，CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No. 6。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈，所述的重鏈的序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 19。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈，所述的重鏈包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-Hl包含氨基酸序列SEQ ID No. 7，CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No. 8，CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No. 9。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含重鏈，所述的重鏈的序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 20。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈，所述的重鏈包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其中CDR-Hl包含氨基酸序列SEQID No. 56，CDR-H2包含氨基酸序列SEQ ID No. 57，CDR-H3包含氨基酸序列SEQ ID No. 58。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含重鏈，所述的重鏈的序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 62。
15.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含輕鏈，所述的輕鏈包含至少一個(gè)⑶R，所述的⑶R選自包含氨基酸序列SEQ ID No. 10 至17和59至61的CDR0
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含輕鏈，所述的輕鏈包含至少一個(gè)⑶R，所述的⑶R選自⑶R-Ll、⑶R-L2或⑶R-L3， 其中-CDR-Ll 包含氨基酸序列 SEQ ID No. 10、13、15 或 59，-CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No. 11、16或60，-CDR-L3 包含氨基酸序列 SEQ ID No. 12、14、17 或 61。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含輕鏈，所述的輕鏈包含⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中⑶R-Ll包含氨基酸序列SEQ ID No. 10，CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No. 11，CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No. 12。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含輕鏈，所述的輕鏈的序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含輕鏈，所述的輕鏈包含⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中⑶R-Ll包含氨基酸序列SEQ ID No. 13，CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No. 11，CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No. 14。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含輕鏈，所述的輕鏈的序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 22。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含輕鏈，所述的輕鏈包含⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中⑶R-Ll包含氨基酸序列SEQ ID No. 15，CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No. 16，CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No. 17。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含輕鏈，所述的輕鏈的序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 23。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含輕鏈，所述的輕鏈包含⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中⑶R-Ll包含氨基酸序列SEQ ID No. 59，CDR-L2包含氨基酸序列SEQ ID No. 60，CDR-L3包含氨基酸序列SEQ ID No. 61。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含輕鏈，所述的輕鏈的序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 63。
25.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含氨基酸序列SEQ ID No. 18、19、20或62，并且所述的輕 鏈包含氨基酸序列21、22、23或63。
26.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含⑶R-Hl、⑶R-H2和⑶R-H3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID No. 1、2和3 ；所述的輕鏈包含⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID No. 10、11和 12。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含氨基酸序列SEQ ID No. 18，所述的輕鏈包含氨基酸 序列 SEQ ID No. 21。
28.一種能夠分泌如權(quán)利要求27所述的抗體的鼠雜交瘤。
29.—種如權(quán)利要求28所述的鼠雜交瘤，其于2007年3月14日保藏在巴黎巴斯德研 究所CNCM，保藏號(hào)為1-3731。
30.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID No. 4、5和6 ；所述的輕鏈包含⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID No. 13、11 和 14。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含氨基酸序列SEQ ID No. 19，所述的輕鏈包含氨基酸 序列 SEQ ID No. 22。
32.—種能夠分泌如權(quán)利要求31所述的抗體的鼠雜交瘤。
33.如權(quán)利要求32所述的鼠雜交瘤，其于2007年3月14日保藏在巴黎巴斯德研究所 CNCM，保藏號(hào)為1-3732。
34.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID No. 7、8和9 ；所述的輕鏈包含⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID No. 15、16 和 17。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含氨基酸序列SEQ ID No. 20，所述的輕鏈包含氨基酸 序列 SEQ ID No. 23。
36.一種能夠分泌如權(quán)利要求35所述的抗體的鼠雜交瘤。
37.如權(quán)利要求36所述的鼠雜交瘤，其于2007年7月6日保藏在巴黎巴斯德研究所 CNCM，保藏號(hào)為1-3786。
38.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在于 其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，它們分別包含氨基酸序列 SEQ ID No. 56,57和58 ；所述的輕鏈包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，它們分別包含氨基酸 序列 SEQ ID No. 59、60 和 61。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其特征在 于其包含重鏈和輕鏈，所述的重鏈包含氨基酸序列SEQ ID No. 62，所述的輕鏈包含氨基酸 序列 SEQ ID No. 63。
40.一種能夠分泌如權(quán)利要求39所述的抗體的鼠雜交瘤。
41.如權(quán)利要求40所述的鼠雜交瘤，其于2007年3月14日保藏在巴黎巴斯德研究所 CNCM，保藏號(hào)為1-3724。
42.根據(jù)權(quán)利要求3-27、30、31、34、35、38或39所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之 一或“衍生物”，其特征在于其是單克隆抗體。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一，其特征在于所述的抗體為嵌合抗體，并且還包含來自于與小鼠異源的物種的抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的嵌合抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一，其特征在于所述的 異源物種為人。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的人源化抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”，其 特征在于所述的來自于人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)分別為輕鏈κ區(qū)和重鏈Y-l、Υ-2或 Y-4 區(qū)。
46.一種分離的核酸，其特征在于其選自下述核酸a)編碼如權(quán)利要求3-27、30、31、34、35、38、39和42-45之一所述的抗體或其功能性“二 價(jià)片段”之一或“衍生物”的核酸、DNA或RNA ；b)包含選自下述序列的DNA序列的核酸-包含序列 SEQ ID No. 24,SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26 和序列 SEQ ID No. 33、SEQ ID No. 34 和 SEQ ID No. 35 的核序列；-包含序列 SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29 和序列 SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 34 和 SEQ ID No. 37 的核序列；-包含序列 SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 32 和序列 SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 39 和 SEQ ID No. 40 的核序列，-包含序列 SEQ ID No. 64,SEQ ID No. 65、SEQ ID No. 66 和序列 SEQ ID No. 67、SEQ ID No. 68 和 SEQ ID No. 69 的核序列；c)包含選自下述序列的DNA序列的核酸-包含序列SEQ ID No. 41和SEQ ID No. 44的核序列；-包含序列SEQ ID No. 42和SEQ ID No. 45的核序列；-包含序列SEQ ID No. 43和SEQ ID No. 46的核序列；-包含序列SEQ ID No. 70和SEQ ID No. 71的核序列；d)b)或c)中限定的核酸相對(duì)應(yīng)的RNA核酸；e)a)，b)和c)中限定的核酸的互補(bǔ)核酸；f)能夠在高度嚴(yán)緊條件下與序列為SEQID No. 24至40和64至69的⑶R中的至少一 個(gè)雜交的至少18個(gè)核苷酸的核酸。
47.一種包含如權(quán)利要求46所述的核酸的載體。
48.一種包含如權(quán)利要求47所述的載體的宿主細(xì)胞。
49.一種除了人之外的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其包含至少一種通過如權(quán)利要求47所述的載體轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞。
50.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求3-27、30、31、34、35、38、39和42-45之一所述的抗體或其功能 性“二價(jià)片段”之一的方法，其特征在于其包含下述階段a)在培養(yǎng)基中和在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求48所述的細(xì)胞；以及b)收獲從培養(yǎng)基或所述的培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生的所述抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一。
51.一種能夠通過如權(quán)利要求50所述的方法獲得的抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一。
52.用作藥物的如權(quán)利要求3-27、30、31、34、35、38、39、42-45或51所述的抗體。
53.一種通過有效要素的方式包含化合物的組合物，所述的化合物由如權(quán)利要求 3-27、30、31、34、35、38、39、42-45 和 51 之一所述的，或通過如權(quán)利要求 28、29、32、33、36、[37、40或41所述的雜交瘤產(chǎn)生的，抗體或其功能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”組成。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的組合物，其特征在于其另外包含作為組合產(chǎn)品以同時(shí)、分 別或相繼使用的抗腫瘤抗體。
55.根據(jù)權(quán)利要求53或54所述的組合物，其特征在于其另外包含作為組合產(chǎn)物以同 時(shí)、分別或相繼使用的細(xì)胞毒性劑/細(xì)胞抑制劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求53至55之一所述的組合物，其特征在于至少一種所述的抗體或其功 能性“二價(jià)片段”之一或“衍生物”與細(xì)胞毒素和/或放射性元素結(jié)合。
57.根據(jù)權(quán)利要求55所述的組合物，其特征在于所述的細(xì)胞毒性劑/細(xì)胞抑制劑或所 述的毒素和/或放射性元素化學(xué)偶聯(lián)至所述的組合物的至少一種成分上以同時(shí)使用。
58.用作藥物的如權(quán)利要求53-57之一所述的組合物。
59.如權(quán)利要求3-27、30、31、34、35、38、39、42-45或51所述的抗體或其功能性“二價(jià) 片段”之一或“衍生物”，或通過如權(quán)利要求28、29、32、33、36、37、40或41所述的雜交瘤產(chǎn) 生的抗體，和/或如權(quán)利要求53-58所述的組合物，在制備用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或 增殖的藥物中的用途。
60.如權(quán)利要求3-27、30、31、34、35、38、39、42-45或51所述的抗體或其功能性“二價(jià) 片段”之一或“衍生物”，或通過如權(quán)利要求28、29、32、33、36、37、40或41所述的雜交瘤產(chǎn) 生的抗體，和/或如權(quán)利要求53-58所述的組合物，或如權(quán)利要求59所述的用途，在制備用 于預(yù)防或治療惡性腫瘤的藥物中的用途。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的用途，其特征在于所述的惡性腫瘤選自前列腺癌、骨肉瘤、 肺癌、乳癌、子宮內(nèi)膜癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或結(jié)腸癌。
62.根據(jù)權(quán)利要求60或61所述的用途，其特征在于所述惡性腫瘤是HGF依賴性和非依 賴性Met激活相關(guān)的惡性腫瘤。
63.一種從懷疑c-Met受體異常存在的生物樣品開始的體外診斷由c-Met受體過表達(dá) 或表達(dá)不足誘導(dǎo)的疾病的方法，其特征在于所述的方法包含使所述的生物樣品與如權(quán)利要 求 3-27、30、31、34、35、38、39、42-45 或 51 所述的抗體，或與如權(quán)利要求 28、29、32、33、36、 37,40或41所述的雜交瘤產(chǎn)生的抗體接觸的步驟，如果必要，可能將所述的抗體進(jìn)行標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及選擇能夠抑制c-Met的配體依賴性和配體非依賴性激活的抗c-Met抗體的方法。更具體地，所述的方法基于對(duì)c-Met二聚化的抑制。另一方面，本發(fā)明涉及用于制備治療惡性腫瘤的藥物的這種抗體和包含這種抗體的組合物。診斷方法和試劑盒也是本發(fā)明的一部分。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101981054SQ200880024368
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2008年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
發(fā)明者L·格奇 申請(qǐng)人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司