專(zhuān)利名稱：：補(bǔ)體相關(guān)眼疾的預(yù)防和治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明關(guān)注補(bǔ)體相關(guān)眼疾(complement-associatedeyeconditions)(諸如脈絡(luò)膜新血管形成(choroidalneovascularization,CNV)和年齡相關(guān)黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration,AMD))的預(yù)防禾口治療。
背景技術(shù)：
：補(bǔ)體系統(tǒng)是由正常情況下以無(wú)活性的酶原形式存在的一系列血清糖蛋白構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜酶級(jí)聯(lián)。兩種主要途徑(即經(jīng)典途徑和旁路途徑)能活化補(bǔ)體，它們?cè)贑3水平合并，在那里兩種相似的C3轉(zhuǎn)化酶將C3切割成C3a和C3b。巨噬細(xì)胞是已經(jīng)發(fā)展出如下先天能力的專(zhuān)門(mén)細(xì)胞，即識(shí)別細(xì)胞表面表達(dá)的鑒定標(biāo)簽(所謂的分子樣式)的結(jié)構(gòu)中的微小差異(Taylor等，EurJImm皿o133，2090-2097(2003);Taylor等，An皿RevImmunol23，901-944(2005))。雖然這些表面結(jié)構(gòu)的直接識(shí)別是先天免疫的一個(gè)基礎(chǔ)方面，但是調(diào)理容許通用巨噬細(xì)胞受體介導(dǎo)吞食，如此提高效率和使吞噬細(xì)胞的識(shí)別全集多樣化(Stuart和Ezekowitz，Immunity22，539-550(2005))。吞食過(guò)程涉及多種配體_受體相互作用，而且現(xiàn)在清楚了多種調(diào)理素(包括免疫球蛋白、膠原凝集素、和補(bǔ)體成分)經(jīng)由與巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面受體的相互作用來(lái)引導(dǎo)病原體內(nèi)化所需要的細(xì)胞活性(綜述見(jiàn)Aderem和Underhill，An皿RevImmunol17，593-623(1999);Underhill和0zinsky，AnnuRevImmunol20，825-852(2002))。雖然由種系基因編碼的天然免疫球蛋白能識(shí)別極其多種病原體，但是大多數(shù)調(diào)理性IgG是經(jīng)由適應(yīng)性免疫生成的，而且因此經(jīng)由Fc受體的高效清除不是立即的(Carroll,NatImmunol5，981-986(2004))。另一方面，補(bǔ)體快速識(shí)別病原體表面分子并使微粒準(zhǔn)備好被補(bǔ)體受體攝取(Brown，InfectAgentsDis1,63-70(1991))。補(bǔ)體由30種以上的血清蛋白質(zhì)組成，它們調(diào)理極其多種病原體，用以被補(bǔ)體受體識(shí)別。取決于級(jí)聯(lián)的初始觸發(fā)物，可區(qū)別三種途徑(綜述見(jiàn)Walport，NEnglJMed344，1058-1066(2001))。所有這三種途徑共享活化中樞成分C3的共同步驟，但是它們依據(jù)識(shí)別的本質(zhì)和導(dǎo)致C3活化的初始生化步驟而不同。經(jīng)典途徑如下活化，抗體結(jié)合至病原體表面，其繼而結(jié)合Clq補(bǔ)體成分，引起一系列蛋白酶級(jí)聯(lián)，最終將C3切割成其活性形式C3b。凝集素途徑在碳水化合物基序受到凝集素蛋白質(zhì)識(shí)別后被活化。至今，已經(jīng)鑒定了此途徑的三個(gè)成員結(jié)合甘露糖的凝集素(MBL)，SIGN-R1凝集素家族和ficolin(Pyz等，AnnMed38,242-251(2006))。MBL和ficolin都與絲氨酸蛋白酶有關(guān)，其像經(jīng)典途徑中的CI那樣起作用，即活化成分C2和C4，導(dǎo)致中樞C3步驟。旁路途徑與經(jīng)典途徑和凝集素途徑二者形成對(duì)照，即它是由于內(nèi)部C3酯與病原體表面上的識(shí)別基序的直接反應(yīng)而被活化的。經(jīng)由旁路途徑蛋白酶因子B和因子D的作用，初始C3結(jié)合活化性表面導(dǎo)致C3b沉積的快速擴(kuò)大。重要的是，經(jīng)由因子B和D的作用，通過(guò)經(jīng)典途徑或凝集素途徑任一沉積的C3b也能導(dǎo)致C3b沉積的擴(kuò)大。在補(bǔ)體活化的所有三種途徑中，調(diào)理中的關(guān)鍵步驟是成分C3轉(zhuǎn)化成C3b。補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的酶對(duì)C3的切割將硫酯暴露于親核攻擊，容許C3b經(jīng)由硫酯域共價(jià)附著到抗原表面上。這是補(bǔ)體調(diào)理中的初始步驟。對(duì)所結(jié)合的C3b的后續(xù)蛋白水解生成iC3b、C3c和C3dg，即受到不同受體識(shí)別的片段(Ross和Medof，AdvImmunol37,217-267(1985))。此切割消除了C3b進(jìn)一步擴(kuò)大C3b沉積和活化補(bǔ)體級(jí)聯(lián)晚期成分(包括能夠指導(dǎo)膜破壞的膜攻擊復(fù)合物)的能力。然而，巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞受體優(yōu)先識(shí)別C3b及其片段；由于酯鍵形成的多能性，C3介導(dǎo)的調(diào)理對(duì)于病原體識(shí)別是重要的(Holers等，I匪nolToday13,231-236(1992))，而且各種C3降解產(chǎn)物的受體因此在宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。C3自身是由13個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域組成的一種復(fù)雜的且柔性的蛋白質(zhì)。該分子的核心由8個(gè)所謂的巨球蛋白(MG)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，它們構(gòu)成了C3的壓緊的a和|3鏈。插入此結(jié)構(gòu)的是CUB(Clr/Cls、Uegf和骨形態(tài)生成蛋白-1)和TED結(jié)構(gòu)域，后者含有容許C3b與病原體表面共價(jià)結(jié)合的硫酯鍵。剩余結(jié)構(gòu)域含有C3a，或者起核心結(jié)構(gòu)域的接頭和間隔物的作用。C3b和C3c結(jié)構(gòu)與C3的比較證明了該分子在每次蛋白水解時(shí)經(jīng)歷重大構(gòu)象重排，這不僅暴露TED，而且暴露了該分子的能與細(xì)胞受體相互作用的別的新的表面(Janssen和Gros，MolImmunol44，3-10(2007))。年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)是全世界老年人失明的首要原因。AMD的特征在于中心視力的逐漸損失，其可歸于黃斑的變性性和新血管性變化，黃斑是眼視網(wǎng)膜中負(fù)責(zé)細(xì)微視敏度的高度專(zhuān)門(mén)區(qū)域。最新的估算指示1400萬(wàn)人因AMD而失明或視力嚴(yán)重受損。該病對(duì)老齡人群及其家庭的生理和心理健康具有巨大影響，而且正在成為重大公眾健康負(fù)擔(dān)。然而，新的發(fā)現(xiàn)開(kāi)始提供關(guān)于與早期AMD有關(guān)的重要細(xì)胞事件、遺傳因子、和生物化學(xué)過(guò)程的更清楚圖像。補(bǔ)體因子H基因是在多項(xiàng)獨(dú)立的研究中被鑒定為賦予發(fā)生AMD的重大遺傳風(fēng)險(xiǎn)的第一種基因。如此，三個(gè)分開(kāi)的小組報(bào)告了位于因子H氨基酸402處的酪氨酸-組氨酸多態(tài)性與AMD發(fā)生有關(guān)(Klein等，Science308,385-389(2005);Haines等，Science308,419-421(2005);及Edwards等，Science308，421-424(2005))。已經(jīng)提出，由疾病相關(guān)因子H等位基因所致的受損旁路途徑抑制或是引起或是大力促成AMD發(fā)生(Thurman和Holers,JImmunol176，1305-1310(2006))。發(fā)明概述—方面，本發(fā)明關(guān)注用于預(yù)防或治療補(bǔ)體相關(guān)眼疾的方法，包括給有需要的受試者施用有效量的因子D拮抗劑。在各種實(shí)施方案中，所述有需要的受試者是哺乳動(dòng)物，諸如人，而所述因子D拮抗劑選自下組抗因子D抗體及其片段、結(jié)合性多肽、肽、和非肽小分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述因子D拮抗劑是抗體或抗體片段。在各種實(shí)施方案中，所述抗體可結(jié)合因子D的活性位點(diǎn)，或者可結(jié)合包含因子D活性位點(diǎn)殘基的表位。本發(fā)明范圍內(nèi)的具體抗體包括但不限于抗體20D12、31A9、25A1和32H12，及其變體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體或抗體片段本質(zhì)上(essentially)與抗體20D12結(jié)合相同表位，或者包含抗體20D12的重鏈和/或輕鏈CDR序列(SEQIDNO:1和2)，或者是抗體20D12或其片段。所述抗因子D抗體包括人的、人源化的或嵌合的抗體。所述抗體片段可以是例如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、(scFv)2、dAb、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體(minibodies)、雙抗體、或自抗體片段形成的多特異性抗體。補(bǔ)體相關(guān)眼疾包括例如年齡相關(guān)黃斑變性(age-relaredmaculardegeneration)4)(CNV)、葡萄膜炎(uveitis)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變(diabeticandotherischemia—relatedretinopathies)、糖尿病性黃斑水月中(diabeticmacularedema)、病理性近視(pathologicalmyopia)、vonHippel-Lindau病、眼的組織胞漿菌病(histoplasmosisoftheeye)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CentralRetinalVeinOcclusion)(CRVO)、角膜新血管形成(cornealneovascularization)、和視網(wǎng)膜新血管形成(retinalneovascularization)。另一方面，本發(fā)明關(guān)注試劑盒，其包含因子D拮抗劑和關(guān)于施用所述拮抗劑來(lái)治療補(bǔ)體相關(guān)眼疾的指令。又一方面，本發(fā)明關(guān)注因子D拮抗劑在制備用于治療補(bǔ)體相關(guān)眼疾的藥物中的用途。再一方面，本發(fā)明關(guān)注因子D拮抗劑，其用于補(bǔ)體相關(guān)眼疾的治療。附圖簡(jiǎn)述圖1A:自正常和AMD供體眼獲得的玻璃體和布魯赫(Bruch)(膜)中的因子D水平。因子D水平是如所述的通過(guò)因子D特異性ELISA而測(cè)量的。圖IB:通過(guò)計(jì)算布魯赫膜中表達(dá)的因子D的總貢獻(xiàn)和玻璃體中找到的因子D的總量，測(cè)定眼中的因子D的總水平。圖2:來(lái)自AMD供體眼的布魯赫膜的橫切片的因子D免疫組織化學(xué)。插圖顯示了在布魯赫膜之上成層的玻璃疣中的因子D染色。在玻璃疣之外，布魯赫膜和脈絡(luò)膜也呈因子D陽(yáng)性。圖3:對(duì)補(bǔ)體旁路途徑選擇性的溶血測(cè)定法中12D20的表征。在下方指出了IC50值，而且該測(cè)定法是如方法部分中所述實(shí)施的。圖4:鼠單克隆抗體12D20的重鏈和輕鏈可變域序列(SEQIDNO:1和2)。圖5:多種抗因子D抗體的表位作圖。指出了它們?cè)谌苎獪y(cè)定法中的相對(duì)效力。圖6:天然人因子D多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。表1:AMD中補(bǔ)體成分的分析。表2:研究中使用的供體組織。發(fā)明詳述I.定義術(shù)語(yǔ)"因子D"和"補(bǔ)體因子D"可互換使用，指天然序列和變異因子D多肽。"天然序列"因子D指與自自然界衍生的因子D多肽具有相同氨基酸序列的多肽，無(wú)論其制備模式。如此，天然序列因子D可以從自然界分離，或者可以通過(guò)重組和/或合成手段生成。在成熟因子D蛋白諸如成熟人因子D蛋白(NM_001928;SEQIDNO:3)之外，術(shù)語(yǔ)"天然序列因子D"明確涵蓋因子D的天然存在前體形式(例如無(wú)活性的前蛋白，其受到蛋白水解切割而生成活性形式)、因子D的天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體，以及因子D分子的與自自然界衍生的因子D多肽具有相同氨基酸序列的結(jié)構(gòu)構(gòu)象變體。非人動(dòng)物(包括高等靈長(zhǎng)類(lèi)和非人哺乳類(lèi))的因子D多肽被明確包括在此定義內(nèi)。"因子D變體"或"補(bǔ)體因子D變體"意指與天然序列因子D多肽，諸如SEQIDNO:3的天然序列人因子D多肽具有至少約80X氨基酸序列同一性的如下文中所定義的活性因子D多肽。通常，因子D變體與SEQID冊(cè)3的成熟人氨基酸序列會(huì)具有至少約80%的氨基酸序列同一性，或至少約85%的氨基酸序列同一性，或至少約90%的氨基酸序列同一性，或至少約95%的氨基酸序列同一性，或至少約98%的氨基酸序列同一性，或至少約99%的氨基酸序列同一性。優(yōu)選的是，在因子D的活性位點(diǎn)內(nèi)存在最高程度的序列同一性。因子D的"活性位點(diǎn)"由人因子D序列中的His-57、Asp-102、和Ser-195(胰凝乳蛋白酶原編號(hào)方式)來(lái)定義。因子D在主要特異性袋的底部具有Asp-189(胰凝乳蛋白酶原編號(hào)方式)，而且切割A(yù)rg肽鍵。催化性三聯(lián)體由His-57、Asp-102和Ser-195組成。Asp-102和His-57展示與其它絲氨酸蛋白酶相比非典型的構(gòu)象(Narayana，J.Mol.Biol.235(1994)695-708)。在位于Sl袋底部的Asp-189和Arg-218之間觀察到一個(gè)獨(dú)特的鹽橋，其提起環(huán)214-218并生成深且窄的Sl袋(Jing等，J.Mol.Biol.282(1998)1061-1081)。突變分析顯示了此環(huán)和位于活性位點(diǎn)周?chē)臄?shù)個(gè)其它殘基是因子D的酯水解活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)決定子(Kim等，J.Biol.Chem.270(1995)24399-24405)?；谶@些結(jié)果提出，因子D在結(jié)合結(jié)合了C3b的因子B時(shí)可能經(jīng)歷構(gòu)象變化，導(dǎo)致蛋白水解活性的表達(dá)(Volanakis和Narayana，ProteinSci.5(1996)553-564)。"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與參照因子D序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測(cè)定百分比氨基酸序列同一性目的的對(duì)比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能決定用于測(cè)量對(duì)比的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全長(zhǎng)獲得最大對(duì)比所需的任何算法。然后計(jì)算相對(duì)于較長(zhǎng)序列的序列同一性，即即使較短序列顯示與較長(zhǎng)序列一部分的100%序列同一性，總體序列同一性也會(huì)小于100%。"百分比(％)核酸序列同一性"定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)引入缺口以獲取最大百分比序列同一性后，候選序列中與參照因子D編碼序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。為測(cè)定百分比核酸序列同一性目的的對(duì)比可以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式進(jìn)行，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能決定用于測(cè)量對(duì)比的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全長(zhǎng)獲得最大對(duì)比所需的任何算法。然后計(jì)算相對(duì)于較長(zhǎng)序列的序列同一性，即即使較短序列顯示與較長(zhǎng)序列一部分的100%序列同一性，總體序列同一性也會(huì)小于100%。"分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與核酸的天然來(lái)源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開(kāi)的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)所編碼多肽的細(xì)胞中包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時(shí)。"分離的"因子D多肽編碼核酸分子指已經(jīng)鑒定且與因子D編碼核酸的天然來(lái)源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開(kāi)的核酸分子。分離的因子D多肽編碼核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。分離的因子D多肽編碼核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的編碼核酸分子有區(qū)別。然而，分離的因子D編碼核酸分子包括通常表達(dá)因子D的細(xì)胞中包含的因子D編碼核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時(shí)。術(shù)語(yǔ)"拮抗劑"以最廣義使用，包括能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或干擾因子D生物學(xué)活性的任何分子。因子D拮抗劑包括但不限于抗因子D抗體及其抗原結(jié)合片段，結(jié)合因子D且能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或干擾因子D活性(諸如因子D參與補(bǔ)體相關(guān)眼疾的病理學(xué)的能力)的其它結(jié)合性多肽、肽、和非肽小分子。"小分子"在本文中定義為具有低于約600，優(yōu)選低于約1000道爾頓的分子量。"有活性的"或"活性"或"生物學(xué)活性"在本發(fā)明因子D拮抗劑的語(yǔ)境中指拮抗(部分或完全抑制)因子D生物學(xué)活性的能力。因子D拮抗劑的一種優(yōu)選生物學(xué)活性是在因子D相關(guān)疾病或疾患(諸如例如補(bǔ)體相關(guān)眼疾)的狀態(tài)(例如病理學(xué))中實(shí)現(xiàn)可測(cè)量的改善的能力。所述活性可在體外或在體內(nèi)測(cè)試中測(cè)定，包括結(jié)合測(cè)定法，使用有關(guān)動(dòng)物模型，或人體臨床試驗(yàn)。術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)體相關(guān)眼疾"以最廣義使用，包括病理學(xué)涉及補(bǔ)體(包括經(jīng)典途徑和旁路途徑，特別是補(bǔ)體旁路途徑)的所有眼疾。補(bǔ)體相關(guān)眼疾包括但不限于黃斑變性性疾病，諸如所有階段的年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)(包括干性和濕性(非滲出性和滲出性))形式，脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)，葡萄膜炎，糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變，和其它眼內(nèi)新血管疾病，諸如糖尿病性黃斑水腫，病理性近視，vonHippel-Lindau病，眼的組織胞漿菌病，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)，角膜新血管形成，和視網(wǎng)膜新血管形成。一組優(yōu)選的補(bǔ)體相關(guān)眼疾包括年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)(包括非滲出性(濕性)和滲出性(干性或萎縮性)AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)、和眼內(nèi)炎。"治療"或"處理"指旨在預(yù)防病癥發(fā)展或改變病癥病理而實(shí)施的干預(yù)。因而，"治療"或"處理"指治療性處理及預(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者。在免疫相關(guān)疾病的治療中，治療劑可直接改變免疫應(yīng)答的一種成分的應(yīng)答程度，或者使得疾病對(duì)其它治療劑(例如抗生素、抗真菌劑、抗炎劑、化療劑等)的治療更敏感。疾病(諸如補(bǔ)體相關(guān)眼疾)的"病理"或"病理學(xué)"包括所有危及患者康樂(lè)的現(xiàn)象。這包括但不限于異常的或不可控的細(xì)胞生長(zhǎng)(嗜中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)、抗體生成、自身抗體生成、補(bǔ)體生成、對(duì)鄰近細(xì)胞正常機(jī)能的干擾、細(xì)胞因子或其它分泌產(chǎn)物的異常水平釋放、任何炎性或免疫學(xué)應(yīng)答的抑制或惡化、炎癥細(xì)胞(嗜中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)浸潤(rùn)入細(xì)胞間隙(cellularspaces)等。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"指歸為哺乳類(lèi)的任何動(dòng)物，包括但不限于人，高等靈長(zhǎng)類(lèi)，家畜和牲畜，及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如馬、豬、牛、犬、貓和雪貂等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物指人。與一種或多種其它治療劑"聯(lián)合/組合"施用包括同時(shí)(共同)施用和任何次序的序貫施用。"治療有效量"指在目標(biāo)疾病或疾患(諸如例如補(bǔ)體相關(guān)眼疾)的狀態(tài)(例如病理學(xué))中實(shí)現(xiàn)可測(cè)量的改善所需要的"因子D拮抗劑"量。術(shù)語(yǔ)"控制序列"指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)、和增強(qiáng)子。7若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連接的"。例如，若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretoryleader)的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(pr印rotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的"意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必相鄰。連接可以通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)處的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。若沒(méi)有此類(lèi)位點(diǎn)，則依照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性"可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易的確定，而且通常根據(jù)探針長(zhǎng)度、洗滌溫度、和鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。一般而言，較長(zhǎng)的探針要求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時(shí)變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用的相對(duì)溫度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對(duì)溫度會(huì)趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋?zhuān)瑓⒁?jiàn)Ausube1等，《CurrentProtoco1sinMolecularBiology》，WileyIntersciencePublishers,1995。"嚴(yán)格條件"或"高嚴(yán)格性條件"，如本文中所定義的，可如下鑒定(l)采用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行清洗，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，于5(TC;(2)在雜交過(guò)程中采用變性劑，諸如甲酰胺，例如50%(v/v)甲酰胺及O.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1X聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，于42t:;或(3)采用50%甲酰胺，5xSSC(0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1X焦磷酸鈉，5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚(yú)精DNA(50iig/m1)，0.1%SDS，和10%硫酸右旋糖苷，于42°C，及于42。C在0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50X甲酰胺中清洗，于55t:，接著于55t:在含EDTA的0.lxSSC中進(jìn)行高嚴(yán)格性清洗。"中等嚴(yán)格條件"可以如Sambrook等，《MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al》，NewYork，ColdSpringHarborPress,1989中所述鑒定，包括使用比上文所述較不嚴(yán)格的清洗溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)例子是于37。C在含20%甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM擰檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性的經(jīng)剪切的鮭魚(yú)精DNA的溶液中溫育過(guò)夜，接著于約37-5(TC在lxSSC中清洗濾膜。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到如何在必要時(shí)調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。術(shù)語(yǔ)"表位標(biāo)記的"或"帶表位標(biāo)簽的"在用于本文時(shí)指包含本發(fā)明多肽且其與"標(biāo)簽多肽"融合的嵌合多肽。標(biāo)簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對(duì)其的抗體，但又足夠短使得其不干擾與其融合的多肽的活性。標(biāo)簽多肽還優(yōu)選是相當(dāng)獨(dú)特的，使得其抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽通常具有至少6個(gè)氨基酸殘基，通常在約8個(gè)和約50個(gè)氨基酸殘基之間(優(yōu)選在約10個(gè)和約20個(gè)氨基酸殘基之間)。術(shù)語(yǔ)"抗體"以最廣義使用，明確覆蓋但不限于單一抗因子D單克隆抗體(包括激動(dòng)性、拮抗性、和中和性抗體)和具有多表位特異性的抗因子D抗體組合物。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一抗原性位點(diǎn)。此外，與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。修飾語(yǔ)"單克隆"指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定方法來(lái)生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)首次由Kohler等(1975)Nature256:495記載的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可以通過(guò)重組DNA方法來(lái)制備(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4，816，567)。"單克隆抗體"也可以使用例如Clackson等(1991)Nature352:624-628及Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)分離。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)別或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類(lèi)抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專(zhuān)利No.4，816，567;及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類(lèi)的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體任選還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)Jones等(1986)Nature321:522-525;Riechmann等(1988)Nature332:323-329;及Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。"物種依賴性抗體"指對(duì)來(lái)自第一哺乳動(dòng)物物種的抗原具有強(qiáng)于對(duì)該抗原來(lái)自第二哺乳動(dòng)物物種的同系物的結(jié)合親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體"特異性結(jié)合"人類(lèi)抗原(即具有不超過(guò)約1x10—7M、優(yōu)選不超過(guò)約1x10—8M、和最優(yōu)選不超過(guò)約1x10—9M的結(jié)合親和力(Kd))，但是對(duì)該抗原來(lái)自第二非人哺乳動(dòng)物物種的同系物具有比其對(duì)人類(lèi)抗原的結(jié)合親和力弱至少約50倍、或至少約500倍、或至少約1000倍的結(jié)合親和力。物種依賴性抗體可以是上文定義的各種類(lèi)型抗體，但是優(yōu)選人源化抗體或人抗體。在用于本文時(shí)，"抗體突變體"或"抗體變體"指物種依賴性抗體的氨基酸序列變體，其中物種依賴性抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了修飾。此類(lèi)突變體與物種依賴性抗體必然具有小于100%的序列同一性或相似性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體突變體所具有的氨基酸序列與物種依賴性抗體的重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在比對(duì)序列并在必要時(shí)引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中與物種依賴性抗體殘基相同(即相同殘基)或相似(即根據(jù)共同側(cè)鏈特性來(lái)自同一組的氨基酸殘基，見(jiàn)下文)的氨基酸殘基的百分比。N-末端、0末端、或內(nèi)部的延伸、刪除、或插入可變域以外的抗體序列都不應(yīng)視為影響序列同一性或相似性。"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開(kāi)和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95%，最優(yōu)選重量超過(guò)99%，(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常會(huì)通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。在用于本文時(shí)，"抗體可變域"指抗體分子的輕鏈和重鏈中包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架區(qū)(FR)氨基酸序列的那部分。VH指重鏈可變域。、指輕鏈可變域。依照本發(fā)明所使用的方法，歸為CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.，1987和1991))來(lái)限定。抗體或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號(hào)方式也依照Kabat。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)決定區(qū)(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗體可變域中其存在是抗原結(jié)合所必需的氨基酸殘基。每個(gè)可變域通常具有三個(gè)CDR，鑒定為CDRl、CDR2和CDR3。每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)可以包含來(lái)自如Kabat定義的"互補(bǔ)決定區(qū)"的氨基酸殘基(即大約是輕鏈可變域的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變域的殘基31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5片反PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))和/或來(lái)自"高變環(huán)"的殘基(即大約是輕鏈可變域的殘基26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變域的殘基26-32(HI)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。在有些情況中，互補(bǔ)決定區(qū)可以包含來(lái)自依照Kabat定義的CDR和來(lái)自高變環(huán)二者的氨基酸。例如，抗體4D5重鏈的CDRH1包含氨基酸26-35。"框架區(qū)"(以下的FR)指可變域中CDR殘基以外的殘基。每個(gè)可變域通常具有四個(gè)FR，鑒定為FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定義的，那么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4)，而重鏈FR殘基位于大約重鏈殘基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含來(lái)自高變環(huán)的氨基酸殘基，那么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4)，而重鏈FR殘基位于大約重鏈殘基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、和102-113(HCFR4)。在有些情況中，在CDR包含來(lái)自依照Kabat定義的CDR和來(lái)自高變環(huán)二者的氨基酸時(shí)，F(xiàn)R殘基會(huì)做相應(yīng)的調(diào)整。例如，當(dāng)CDRH1包含氨基酸H26-H35時(shí)，重鏈FR1殘基位于第1_25位，而FR2殘基位于第36-49位。在用于本文時(shí)，"密碼子集"指用于編碼期望變異氨基酸的一套不同核苷酸三聯(lián)體序列?？梢酝ㄟ^(guò)例如固相合成來(lái)合成一套寡核苷酸，其包括呈現(xiàn)由密碼子集提供的核苷酸三聯(lián)體的所有可能組合并編碼期望氨基酸組的序列。一種標(biāo)準(zhǔn)形式的密碼子命名是IUB代碼，其是本領(lǐng)域已知的且在本文中有記載。密碼子集通常以3個(gè)斜體大寫(xiě)字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，"非隨機(jī)密碼子集"在用于本文時(shí)指編碼部分、優(yōu)選完全滿足本文所述氨基酸選擇標(biāo)準(zhǔn)的選定氨基酸的密碼子集。在某些位置具有選定核苷酸"簡(jiǎn)并性"的寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域眾所周知的，例如TRIM法(Kna卯ek等(1999)J.Mol.Biol.296:57-86;Garrard和Henner(1993)Gene128:103)。此類(lèi)具有某些密碼子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成儀來(lái)合成(可購(gòu)自例如AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)，或者可以通過(guò)商業(yè)途徑獲得(例如購(gòu)自LifeTechnologies,Rockville，MD)。因此，一套具有特定密碼子集的合成寡核苷酸通常會(huì)包括具有不同序列(在整個(gè)序列中由密碼子集建立的差異)的多種寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本發(fā)明使用時(shí)，具有容許與可變域核酸模板雜交的序列，而且還可以但非必須包含可用于例如克隆目的的限制酶位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)"抗體片段"在本文中以最廣義使用，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、(scFv)2、dAb、和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體、和自抗體片段形成的多特異性抗體。"Fv"片段是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。該區(qū)域由緊密結(jié)合(該結(jié)合的本質(zhì)可以是共價(jià)的，例如在scFv中)的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，每個(gè)可變域的三個(gè)CDR相互作用而在Vf、二聚體表面上限定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR或其子集一起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或是只包含對(duì)抗原特異性的三個(gè)CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是通常親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。"Fab"片段包含輕鏈的可變域和恒定域及重鏈的可變域和第一恒定域(CHI)。F(ab')2抗體片段包含一對(duì)Fab片段，它們一般在它們羧基末端附近通過(guò)它們之間的鉸鏈半胱氨酸共價(jià)連接。本領(lǐng)域還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和、結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單一多肽鏈中。一般而言，F(xiàn)v多肽在VH與、結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)一步包含多肽接頭，其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見(jiàn)Pluckthun，于《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，第113巻，Rosenburg禾口Moore編，Springer-Verlag,NewYork,第269-315頁(yè)，1994。術(shù)語(yǔ)"雙抗體"指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(Vh及VJ中包含相連接的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VJ。通過(guò)使用過(guò)短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載于例如EP404，097;W093/11161;及Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444—6448。表述"線性抗體"指Zapata等(1995)ProteinEng，8(10):1057-1062中所描述的抗體。簡(jiǎn)言之，這些抗體包含一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(VfQl-VfCHl)，該區(qū)段與互補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性的。在用于本文時(shí)，"文庫(kù)"或"庫(kù)"指眾多抗體或抗體片段序列(例如本發(fā)明的多肽)，或者編碼這些序列的核酸，即根據(jù)本發(fā)明方法導(dǎo)入這些序列中的、變異氨基酸組合方面不同的序列。"噬菌體展示"是一種將變異多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術(shù)。噬菌體展示的效用在于能對(duì)隨機(jī)化蛋白質(zhì)變體的大型文庫(kù)快速且高效分選那些以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列的實(shí)情。肽和蛋白質(zhì)文庫(kù)在噬菌體上的展示已經(jīng)用于對(duì)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的多肽篩選那些具有特異性結(jié)合特性的多肽。多價(jià)噬菌體展示法已經(jīng)用于展示小隨機(jī)肽和小蛋白質(zhì)，其通過(guò)與絲狀噬菌體的基因III或基因VIII融合來(lái)實(shí)現(xiàn)。Wells和Lowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3:355-362，及其中引用的參考文獻(xiàn)。在單價(jià)噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫(kù)與基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白時(shí)以低水平表達(dá)，使得噬菌體顆粒展示一個(gè)拷貝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(yīng)(avidityeffect)相對(duì)于多價(jià)噬菌體得到了降低，使得分選基于內(nèi)在的配體親和力，而且使用噬菌粒載體，這簡(jiǎn)化了DNA操作。Lowman和Wells(1991)Methods:AcompaniontoMethodsinEnzymology3:205-0216。"噬菌粒"是具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(例如ColEl)和一個(gè)拷貝的噬菌體基因區(qū)間的質(zhì)粒載體。噬菌?？衫萌魏我阎删w，包括絲狀噬菌體和A類(lèi)噬菌體。質(zhì)粒一般也會(huì)包含抗生素抗性的選擇標(biāo)志?？寺∪脒@些載體的DNA區(qū)段可以像質(zhì)粒一起而擴(kuò)增。在給攜帶這些載體的細(xì)胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時(shí)，質(zhì)粒的復(fù)制模式變成滾環(huán)復(fù)制，以生成質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝，并包裝噬菌體顆粒。噬菌?？尚纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w顆粒。此術(shù)語(yǔ)包括如下的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。術(shù)語(yǔ)"噬菌體載體"指包含異源基因且能夠復(fù)制的雙鏈復(fù)制型噬菌體。噬菌體載體具有容許噬菌體復(fù)制和噬菌體顆粒形成的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)。噬菌體優(yōu)選是絲狀噬菌體，諸如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物，或者是A類(lèi)噬菌體，諸如A、21、Cp80、(p81、82、424、434等或其衍生物。在用于本文時(shí)，"溶劑可及位置"指源抗體或抗原結(jié)合片段重鏈和輕鏈可變區(qū)中根據(jù)抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)系綜(ensemble)和/或建模結(jié)構(gòu)確定為潛在地可被溶劑觸及和/或與分子(諸如抗體特異性抗原)接觸的氨基酸殘基位置。這些位置通常發(fā)現(xiàn)于CDR中和蛋白質(zhì)外部上。如本文所定義的抗體或抗原結(jié)合片段的溶劑可及位置可使用本領(lǐng)域已知的多種算法之任一種來(lái)確定。優(yōu)選的是，溶劑可及位置是使用來(lái)自抗體三維模型的坐標(biāo)而確定的，優(yōu)選使用計(jì)算法程序，諸如InsightII程序(Accelrys，SanDiego，CA)。溶劑可及位置還可以使用本領(lǐng)域已知的算法來(lái)確定(例如Lee和Richards(1971)J.Mol.Biol.55,379及Connolly(1983)J.Appl.Cryst.16,548)。溶劑可及位置的確定可使用適于蛋白質(zhì)建模的軟件和自抗體得到的三維結(jié)構(gòu)信息來(lái)進(jìn)行。可用于這些目的的軟件包括SYBYLBiopolymerModule軟件(TriposAssociates)。一般和優(yōu)選的是，若算法(程序)要求用戶輸入大小參數(shù)，計(jì)算中所使用的探針的"大小"設(shè)為半徑大約1.4?；蚋?。另外，Pacios(1994)Comput.Chem.18(4):377-386記載了使用供個(gè)人計(jì)算機(jī)用的軟件確定溶劑可及區(qū)域和面積的方法。II.詳述補(bǔ)體在身體的防御中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而且與免疫系統(tǒng)的其它成分一起保護(hù)個(gè)體免于病原體侵入身體。然而，如果沒(méi)有受到正確的活化或控制，那么補(bǔ)體也能引起對(duì)宿主組織的損傷。補(bǔ)體的不當(dāng)活化涉及多種疾病(稱作補(bǔ)體相關(guān)疾病或病癥，諸如免疫復(fù)合物和自身免疫性疾病)和多種炎癥狀況(包括補(bǔ)體介導(dǎo)的炎性組織損傷)的發(fā)病機(jī)理。各種補(bǔ)體相關(guān)疾病的病理有所不同，而且可涉及時(shí)間或長(zhǎng)或短的補(bǔ)體活化，整個(gè)級(jí)聯(lián)、只有級(jí)聯(lián)之一(例如經(jīng)典途徑或旁路途徑)、只有級(jí)聯(lián)的一些成分、等的活化。在有些疾病中，補(bǔ)體片段的補(bǔ)體生物學(xué)活性導(dǎo)致組織損傷和疾病。因而，補(bǔ)體的抑制劑具有高度的治療潛力。旁路途徑的選擇性抑制劑會(huì)是特別有用的，因?yàn)榻?jīng)由經(jīng)典路徑自血液中清除病原體和其它生物體會(huì)保持完整。本發(fā)明的因子D拮抗劑對(duì)于補(bǔ)體相關(guān)眼疾(病理牽涉補(bǔ)體(包括經(jīng)典途徑和旁路途徑，特別是補(bǔ)體旁路途徑)的所有眼疾和眼病)的預(yù)防和治療是有用的，諸如例如黃斑變性性疾病，諸如所有階段的年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)(包括干性和濕性(非滲出性和滲出性)形式)，脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)，葡萄膜炎，糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變，眼內(nèi)炎，和其它眼內(nèi)新血管疾病，諸如糖尿病性黃斑水腫，病理性近視，vonHippel-Lindau病，眼的組織胞漿菌病，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)，角膜新血管形成，和視網(wǎng)膜新血管形成。一組優(yōu)選的補(bǔ)體相關(guān)眼疾包括年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)(包括非滲出性(濕性)和滲出性(干性或萎縮性)AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)、和眼內(nèi)炎。AMD，即年齡相關(guān)黃斑變性，是60歲以上個(gè)體中不可逆的視功能障礙的首要原因。有兩類(lèi)AMD，即非滲出性(干性)和滲出性(濕性)AMD。干性或滲出性形式涉及中央視網(wǎng)膜(黃斑)下面的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的萎縮性和肥大性變化，以及RPE上的沉積物(玻璃疣)。非滲出性AMD患者可發(fā)展成濕性或滲出性AMD，其中稱作脈絡(luò)膜新血管膜(CNVM)的異常血管在視網(wǎng)膜下面形成，滲漏液體和血液，并最終在視網(wǎng)膜中和在視網(wǎng)膜下引起失明性盤(pán)狀瘢痕。非滲出性AMD(通常是滲出性AMD的前身)更加常見(jiàn)。非滲出性AMD的表現(xiàn)有所不同；可存在硬玻璃疣、軟玻璃疣、RPE地理性萎縮、和色素聚團(tuán)。補(bǔ)體成分在AMD早期在RPE上沉積，而且是玻璃疣的主要組分。本發(fā)明具體關(guān)注高危(highrisk)AMD的治療，包括第3類(lèi)和第4類(lèi)AMD。第3類(lèi)AMD的特征在于雙眼都不存在晚期AMD，至少一只眼具有20/32或更好的視力及至少一粒大的玻璃疣(例如125um)、廣泛的(通過(guò)玻璃疣面積來(lái)測(cè)量)中間體玻璃疣、或不牽涉黃斑中心的地理性萎縮(GA)、或這些的任意組合。第3類(lèi)AMD(仍視為"干性"AMD)有高風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)化成脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)。第4類(lèi)高危AMD(分類(lèi)為"濕性"AMD)的特征在于視力為20/32或更好及指標(biāo)眼中沒(méi)有晚期AMD(牽涉黃斑中心的GA或脈絡(luò)膜新血管形成的特征)。對(duì)側(cè)眼的特征在于晚期AMD，或視力低于20/32，這可歸于AMD黃斑病變。典型的是，如果不治療的話，高危AMD迅速進(jìn)展成脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)，其速率比第1類(lèi)或第2類(lèi)(非高危)AMD的進(jìn)展速率高大約10-30倍。因子D拮抗劑特別可用于預(yù)防AMD(特別是第3類(lèi)或第4類(lèi)AMD)進(jìn)展成CNV，和/或在未受影響的或受影響較小的對(duì)側(cè)眼中預(yù)防AMD或CNV的發(fā)生/進(jìn)展。在此語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"以最廣義使用，包括完全或部分阻斷和減緩疾病的進(jìn)展，以及延遲疾病更嚴(yán)重形式的發(fā)作。處于發(fā)生或進(jìn)展成高危(第4類(lèi))AMD或CMV高風(fēng)險(xiǎn)的患者尤其受益于本發(fā)明的這個(gè)方面。已知補(bǔ)體因子H(CFH)多態(tài)性與個(gè)體發(fā)生AMD和/或CNV的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。CFH中的突變能活化補(bǔ)體，繼而可導(dǎo)致AMD/CNV。最近有報(bào)告，補(bǔ)體因子H(CFH)多態(tài)性占到AMD可歸因風(fēng)險(xiǎn)的50%(Kleinetal.'Science308:385-9(2005))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CFH中的一種常見(jiàn)單體型(HF1/CFH)使個(gè)體易患年齡相關(guān)黃斑變性(Hageman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102(2):7227-7232(2005))。已經(jīng)將AMD分離成常染色體顯性性狀，疾病基因座定位至染色體lq25-q31，在標(biāo)志物D1S466與D1S413之間，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分為約3.20(Kleinetal.，ArchOpthalmol.116(8):1082-9(1998);Majewskietal.，Am.J.Hum.Genet.73(3):540-50(2003);Seddonetal.，Am.J.Hum.Genet.73(4):780-90(2003);Weeksetal.，Am.J.Ophthalmol.132(5):682-92(2001);Iyengaretal.，Am.J.Hum.Genet.74(1):20-39(2004));染色體2q3/2q32，在標(biāo)志物D12S1391與D2S1384之間，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分為2.32/2.03(Seddonetal.，supra);3pl3，在標(biāo)志物D12S1300與D12S1763之間，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分為2.19(Majewskietal.，supra;Schicketal.，Am.J.Hum.Genet.72(6):1412-24(2003));6ql4，在標(biāo)志物D6S1056與DS249之間，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分為3.59/3.17(Kniazevaetal.，Am.J.Ophthlmol.130(2):197-202(2000));9q33，在標(biāo)志物D9S934處，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分為2.06(Mejwskietal.，supra);10q26，在標(biāo)志物D10S1230處，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分為3.06(Majewskietal.，supra;Iyengaretal.，supra;Ke固lyetal.，Mol.Vis.10:57-61(2004));17q25，在標(biāo)志物D17S928處，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分為3.16(Weeksetal.，supra);和22ql2，在標(biāo)志物D22S1045處，最大優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)計(jì)分為2.0(Seddonetal.，supra)。因而，遺傳篩選是鑒定對(duì)于預(yù)防性處理(包括預(yù)防疾病進(jìn)展成更嚴(yán)重的形式，諸如從AMD進(jìn)展成CNV)而言是特別好的候選者的患者的一個(gè)重要部分。1.抗因子D抗體本發(fā)明包括抗因子D抗體的生產(chǎn)和應(yīng)用。產(chǎn)生抗體的示例性方法在以下章節(jié)中有更詳細(xì)的描述。用衍生自哺乳動(dòng)物物種的因子D抗原選出抗因子D抗體?？乖瓋?yōu)選是人因子D。然而，來(lái)自其它物種的因子D，諸如鼠因子D，也可用作靶抗原。來(lái)自各種哺乳動(dòng)物物種的因子D抗原可分離自天然來(lái)源。在其它實(shí)施方案中，抗原是重組生產(chǎn)的或者是利用本領(lǐng)域已知的其它合成方法而制備的。所選的抗體通常會(huì)具有足夠強(qiáng)的針對(duì)因子D抗原的結(jié)合親和力。例如，抗體結(jié)合人因子D的Kd值可不超過(guò)約5nM，優(yōu)選不超過(guò)約2nM，而更優(yōu)選不超過(guò)約500pM。例如，抗體親和力可由基于表面等離振子共振的測(cè)定法(如實(shí)施例所述的BIAcore測(cè)定法)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA);和競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法(如RIA的)來(lái)測(cè)定。而且，抗體可進(jìn)行其它生物學(xué)活性測(cè)定法，如，用以評(píng)估其作為治療劑的有效性。此類(lèi)測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的，而且依賴于靶抗原和抗體的預(yù)定用途。實(shí)例包括HUVEC抑制測(cè)定法(如下文實(shí)施例所述的)；腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定法(如例如W089/06692所述的)；抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(CDC)測(cè)定法(美國(guó)專(zhuān)利5，500，362);及下文關(guān)于鑒定因子D拮抗劑描述的體外和體內(nèi)測(cè)定法。為了篩選結(jié)合感興趣抗原上的特定表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷測(cè)定法，諸如如Antibodis，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，EdHarlow和DavidLane(1988)所述的。另外，可進(jìn)行表位作圖，例如如Champe等(1995)J.Biol.Chem.270:1388-1394所述的，來(lái)確定抗體是否結(jié)合感興趣表位。14在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用獨(dú)特的噬菌體展示法來(lái)選擇抗因子D抗體。該方法包括產(chǎn)生基于單個(gè)框架模板的合成抗體噬菌體文庫(kù)，設(shè)計(jì)可變域內(nèi)的足夠的多樣性，展示具有多樣化可變域的多肽，選擇對(duì)靶因子D抗原具有高親和力的候選抗體，和分離所選的抗體。噬菌體展示方法的詳情可在例如2003年12月11日公布的W003/102157中找到。在一個(gè)方面，抗體文庫(kù)可通過(guò)在抗體可變域的至少一個(gè)CDR中突變?nèi)軇┛杉暗暮?或高度多變的位置來(lái)產(chǎn)生。一些或所有CDR可用本文提供的方法來(lái)突變。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選突變CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成單個(gè)文庫(kù)或突變CDRL3和CDRH3中的位置以形成單個(gè)文庫(kù)或突變CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成單個(gè)文庫(kù)，由此產(chǎn)生多樣的抗體文庫(kù)。例如，可產(chǎn)生這樣的抗體可變域文庫(kù)，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3中溶劑可及的和/或高度多變的位置上有突變。可產(chǎn)生這樣的另一種文庫(kù)，其在CDRL1、CDRL2和CDRL3中有突變。這些文庫(kù)也可互相結(jié)合使用以產(chǎn)生具有期望親和力的結(jié)合物。例如，在對(duì)重鏈文庫(kù)進(jìn)行一輪或多輪對(duì)靶抗原結(jié)合的選擇后，可將輕鏈文庫(kù)替換入重鏈結(jié)合物群中，用以在其它輪次的選擇中提高結(jié)合物的親和力。文庫(kù)優(yōu)選通過(guò)用重鏈序列可變區(qū)CDRH3區(qū)中的變異氨基酸替代原始氨基酸來(lái)產(chǎn)生。所得文庫(kù)可包含多種抗體序列，其中序列多樣性主要位于重鏈序列的CDRH3區(qū)中。在一個(gè)方面，文庫(kù)在人源化抗體4D5序列、或人源化抗體4D5序列的框架氨基酸序列的背景中產(chǎn)生。文庫(kù)優(yōu)選通過(guò)用DVK密碼子集編碼的氨基酸至少替代重鏈殘基95-100a來(lái)產(chǎn)生，其中DVK密碼子集用于編碼這些位置中每一個(gè)位置的變異氨基酸集?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的一個(gè)例子包含序列(DVK)7。在一些實(shí)施方案中，文庫(kù)通過(guò)用DVK和NNK兩種密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-100a來(lái)產(chǎn)生。可用于產(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的一個(gè)例子包含序列(DVK)6(NNK)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，文庫(kù)通過(guò)用DVK和NNK兩種密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-100a來(lái)產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的一個(gè)例子包含序列(DVK)5(NNK)?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的另一個(gè)例子包含序列(NNK)e。根據(jù)本文所述標(biāo)準(zhǔn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定合適寡核苷酸序列的其它例子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，利用不同的CDRH3設(shè)計(jì)來(lái)分離高親和力結(jié)合物和分離針對(duì)各種表位的結(jié)合物。該文庫(kù)中產(chǎn)生的CDRH3的長(zhǎng)度范圍是11至13個(gè)氨基酸，盡管也可產(chǎn)生不同于此的長(zhǎng)度。通過(guò)使用NNK、DVK和NVK密碼子集能拓展H3多樣性，以及在N和/或c-末端處的更有限的多樣性。CDRH1和CDRH2中也可產(chǎn)生多樣性。CDR-H1和H2多樣性的設(shè)計(jì)遵循目標(biāo)為模擬所述帶有如下修飾的天然抗體全集的策略，所述修飾使多樣性較前述設(shè)計(jì)更緊密地與天然多樣性相匹配。對(duì)于CDRH3中的樣性，可分開(kāi)構(gòu)建多個(gè)文庫(kù)，它們具有不同長(zhǎng)度的H3，然后組合起來(lái)以選擇針對(duì)靶抗原的結(jié)合物。合并多個(gè)文庫(kù)并用前述和本文下述的固體支持物選擇和溶液分選法來(lái)選擇。可采用多種分選策略。例如，一種變化涉及在結(jié)合至固相的靶物上分選，接著分選可能在融合多肽上存在的標(biāo)簽(例如抗gD標(biāo)簽)，接著再一次在結(jié)合至固相的靶物上分選?；蛘?，文庫(kù)可首先在結(jié)合至固相表面的靶物上選擇，然后用靶抗原濃度逐漸減低的溶液相結(jié)合來(lái)分選所洗脫的結(jié)合物。利用不同分選方法的組合能實(shí)現(xiàn)最低限度地只選擇高度表達(dá)的序列并能實(shí)現(xiàn)選擇許多不同的高親和力克隆。針對(duì)靶因子D抗原的高親和力結(jié)合物可自文庫(kù)分離。限制H1/H2區(qū)中的多樣性將簡(jiǎn)并性降低約104至105倍，而且允許更多H3多樣性能得到更多高親和力結(jié)合物。禾U用在CDRH3中具有不同類(lèi)型多樣性(例如利用DVK或NVT)的文庫(kù)能實(shí)現(xiàn)分離可與靶抗原的不同表位結(jié)合的結(jié)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生在CDRH1、CDRH2和CDRH3區(qū)中具有多樣性的一個(gè)或多個(gè)文庫(kù)。在該實(shí)施方案中，用各種長(zhǎng)度的H3區(qū)并主要用密碼子集XYZ和NNK或NNS來(lái)產(chǎn)生CDRH3中的多樣性。用各寡核苷酸形成文庫(kù)并合并，或者合并寡核苷酸來(lái)形成文庫(kù)子集。該實(shí)施方案的文庫(kù)可針對(duì)結(jié)合至固相的靶物進(jìn)行分選。分離自多次分選的克隆可利用ELISA測(cè)定法來(lái)篩選特異性和親和力。對(duì)于特異性，克隆可以針對(duì)期望靶抗原以及其它非靶抗原進(jìn)行篩選。然后，在溶液結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定法或點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中對(duì)那些針對(duì)靶因子D抗原的結(jié)合物篩選親和力?？梢杂萌缟纤鲋苽涞腦YZ密碼子集自文庫(kù)分離高親和力結(jié)合物?？扇菀椎卦诩?xì)胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率將這些結(jié)合物制備成抗體或抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，可能希望產(chǎn)生在CDRH3區(qū)長(zhǎng)度方面具有更大多樣性的文庫(kù)。例如，可能希望產(chǎn)生CDRH3區(qū)的范圍為約7至19個(gè)氨基酸的文庫(kù)。自這些實(shí)施方案的文庫(kù)分離的高親和力結(jié)合物可容易地在細(xì)菌和真核細(xì)胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率產(chǎn)生?？稍O(shè)計(jì)載體以容易地去除如下序列諸如gD標(biāo)簽、病毒外殼蛋白成分序列，和/或添加恒定區(qū)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率地產(chǎn)生全長(zhǎng)抗體或抗原結(jié)合片段?？梢詫DRH3中有突變的文庫(kù)與包含變異型式的其它CDR(例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2)的文庫(kù)組合。如此，例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將CDRH3文庫(kù)與CDRL3文庫(kù)組合，所述CDRL3文庫(kù)用預(yù)先確定的密碼子集在第28、29、30、31、和/或32位有變異氨基酸的人源化4D5抗體序列的背景中產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將CDRH3有突變的文庫(kù)與包含變異CDRH1和/或CDRH2重鏈可變域的文庫(kù)組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，CDRH1文庫(kù)用第28、30、31、32和33位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生。CDRH2文庫(kù)可用預(yù)先確定的密碼子集用第50、52、53、54、56和58位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生?？蛇M(jìn)一步修飾自噬菌體文庫(kù)產(chǎn)生的抗因子D抗體以產(chǎn)生抗體突變體，所述突變體具有比親本抗體改善了的物理、化學(xué)和/或生物學(xué)特性。若所使用的測(cè)定法是生物學(xué)活性測(cè)定法，則優(yōu)選抗體突變體在所選測(cè)定法中的生物學(xué)活性比親本抗體在該測(cè)定法中的生物學(xué)活性好至少約10倍，優(yōu)選好至少約20倍，更優(yōu)選好至少約50倍，有時(shí)好至少約100倍或200倍。例如，優(yōu)選抗因子D抗體突變體針對(duì)因子D的結(jié)合親和力比親本抗因子D抗體(諸如圖5中所顯示的任何抗體，特別是抗體20D12)的結(jié)合親和力強(qiáng)至少約IO倍，優(yōu)選強(qiáng)至少約20倍，更優(yōu)選強(qiáng)至少約50倍，有時(shí)強(qiáng)至少約100倍或200倍。為了產(chǎn)生抗體突變體，將一處或多處氨基酸改變(例如替代)引入親本抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)?；蛘?另外，可將框架區(qū)殘基的一處或多處改變(例如替代)引入親本抗體，這些改變導(dǎo)致抗體突變體針對(duì)來(lái)自第二哺乳動(dòng)物物種的抗原的結(jié)合親和力有所改善。要修飾的框架區(qū)殘基的實(shí)例包括那些直接非共價(jià)結(jié)合抗原的(Amit等(1986)Science233:747-753);與CDR相互作用的/影響CDR構(gòu)象的(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917);和/或參與VfVH界面的(EP239400B1)。在某些實(shí)施方案中，對(duì)一個(gè)或多個(gè)此16類(lèi)框架區(qū)殘基的修飾導(dǎo)致抗體針對(duì)來(lái)自第二哺乳動(dòng)物物種的抗原的結(jié)合親和力有所增強(qiáng)。例如，在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，可改變約l個(gè)至約5個(gè)框架殘基。有時(shí)，這可足以產(chǎn)生適合在臨床前試驗(yàn)中使用的抗體突變體，甚至其中沒(méi)有高變區(qū)殘基被改變。然而，通常，抗體突變體會(huì)包含別的高變區(qū)改變。所改變的高變區(qū)殘基可以是隨機(jī)改變的，尤其是在親本抗體的起始結(jié)合親和力使得此類(lèi)隨機(jī)產(chǎn)生的抗體突變體能被容易地篩選出來(lái)的情況中。用于生成此類(lèi)抗體突變體的一種有用方法稱作"丙氨酸掃描誘變"(Cu皿inghamandWells(1989)Science244:1081-1085)。這里，一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基用丙氨酸或多丙氨酸殘基替代，以影響氨基酸與來(lái)自第二哺乳動(dòng)物物種的抗原的相互作用。然后通過(guò)在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它突變，推敲那些對(duì)替代展現(xiàn)出功能敏感性的高變區(qū)殘基。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。如本文所述對(duì)如此生成的丙氨酸突變體篩選它們的生物學(xué)活性。通常，從保守替代諸如下文顯示在標(biāo)題"優(yōu)選替代"下的那些開(kāi)始。如果此類(lèi)替代導(dǎo)致生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)的改變，那么可以引入下表中稱為"例示替代"的更實(shí)質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類(lèi)的進(jìn)一步描述，并篩選產(chǎn)物。下表中列出了優(yōu)選的替代。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>對(duì)抗體生物學(xué)特性的甚至更實(shí)質(zhì)性修飾通過(guò)選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的替代來(lái)實(shí)現(xiàn)(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積?；诠餐膫?cè)鏈特性，將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性、親水性的cys、ser、thr、asn、gln;(3)酸性的asp、glu;(4)堿性的his、lys、arg;(5)影響鏈取向的殘基gly、pro;及(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守替代會(huì)需要用這些類(lèi)別之一的一個(gè)成員替換另一個(gè)類(lèi)別的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，利用噬菌體展示(見(jiàn)上)，對(duì)為修飾而選擇的位點(diǎn)進(jìn)行親和力成熟。編碼氨基酸序列突變體的核酸分子通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于對(duì)早先制備的突變或非突變型式的親本抗體的寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變、和盒式誘變。制備突變體的優(yōu)選方法是定點(diǎn)誘變(參見(jiàn)例如K皿ke1(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488)。在某些實(shí)施方案中，抗體突變體僅有單個(gè)高變區(qū)殘基被替代。在其它實(shí)施方案中，有親本抗體的兩個(gè)或更多個(gè)高變區(qū)殘基被替代，例如約2個(gè)至約10個(gè)高變區(qū)替代。通常，生物學(xué)特性得到改善的抗體突變體所具有的氨基酸序列與親本抗體重鏈或輕鏈任一可變域的氨基酸序列有至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，和最優(yōu)選至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在比對(duì)序列并在必要時(shí)引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中與親本抗體殘基相同(即相同殘基)或相似(即根據(jù)共同側(cè)鏈特性來(lái)自同一組的氨基酸殘基，見(jiàn)上文)的氨基酸殘基的百分比。N-末端、C-末端、或內(nèi)部的延伸、刪除、或插入可變域以外的抗體序列都不應(yīng)視為影響序列同一性或相似性。產(chǎn)生抗體突變體后，測(cè)定該分子相對(duì)于親本抗體的生物學(xué)活性。如上所示，這可包括測(cè)定抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)活性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，制備一組抗體突變體并篩選針對(duì)抗原(諸如因子D或其片段)的結(jié)合親和力。任選將該初始篩選中選出的一個(gè)或多個(gè)抗體突變體進(jìn)行一種或多種其它生物學(xué)活性測(cè)定法以確證結(jié)合親和力增強(qiáng)的抗體突變體是真正有用的，例如可用于臨床前研究。這樣選出的抗體突變體可進(jìn)一步修飾，這常常取決于抗體的預(yù)期用途。此類(lèi)修飾可包括進(jìn)一步改變氨基酸序列，融合異源多肽和/或共價(jià)修飾，諸如下文所詳述的那些。對(duì)于氨基酸序列改變，示例性的修飾上文有詳述。例如，也可替代任何不涉及保持抗體突變體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基，一般替代為絲氨酸，用以改善分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反地，可向抗體中添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是在抗體是抗體片段，諸如Fv片段時(shí))。另一類(lèi)氨基酸突變體具有改變的糖基化樣式。這可通過(guò)刪除抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊和/或增加不存在于抗體中的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)?？贵w糖基化通常是N-連接的或0-連接的。N-連接的指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。如此，多肽中存在這些三肽序列之任一產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指糖類(lèi)N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附著于羥基氨基酸(最常見(jiàn)的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸)。在抗體上增加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列使之包含一個(gè)或多個(gè)上述的三肽序列來(lái)方便地實(shí)現(xiàn)(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。也可在原始抗體序列中通過(guò)添加、或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)產(chǎn)生改變(用于0-連接的糖基化位點(diǎn))。本發(fā)明的抗因子D抗體可使用易于得到的技術(shù)和材料而重組生產(chǎn)。為了重組生產(chǎn)抗因子D抗體，分離編碼它的核酸，并插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)。編碼抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離或合成(例如通過(guò)使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？梢垣@得許多載體。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一項(xiàng)或多項(xiàng)信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。(1)信號(hào)序列構(gòu)件本發(fā)明的抗體不僅可以直接重組生產(chǎn)，而且可以作為與異源多肽的融合多肽而重組生產(chǎn)，所述異源多肽優(yōu)選是成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端處的信號(hào)序列或具有特異性切割位點(diǎn)的其它多肽。所選擇的異源信號(hào)序列優(yōu)選是受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即受到信號(hào)肽酶切割)的。對(duì)于不識(shí)別和加工天然抗體信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，所述信號(hào)序列用例如選自堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的原核信號(hào)序列取代。為了酵母分泌，天然信號(hào)序列可以用例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a因子前導(dǎo)序列)、酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列、或W090/13646中記載的信號(hào)取代。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可以利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)，例如單純皰疹gD信號(hào)。將此類(lèi)前體區(qū)(precursorregion)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼抗體的DNA連接。(2)復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件表達(dá)和克隆載體都包含使載體能夠在一種或多種所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是使載體能夠不依賴于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。眾所周知多種細(xì)菌、酵母和病毒的此類(lèi)序列。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2ii質(zhì)粒起點(diǎn)適合于酵母，而各種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。一般而言，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件(SV40起點(diǎn)的使用通?？赡苤皇且?yàn)樗缙趩?dòng)子)。(3)選擇基因構(gòu)件表達(dá)和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供不能自復(fù)合培養(yǎng)基獲得的必需營(yíng)養(yǎng)物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個(gè)例子利用藥物來(lái)阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，如此幸免于選擇方案。此類(lèi)顯性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的另一個(gè)例子是那些能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II(優(yōu)選靈長(zhǎng)類(lèi)金屬硫蛋白基因)、腺苷脫氨酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等。例如，首先通過(guò)將所有轉(zhuǎn)化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一種競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在采用野生型DHFR時(shí)，適宜的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系?；蛘?，可以通過(guò)細(xì)胞在含有針對(duì)選擇標(biāo)志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)來(lái)選擇經(jīng)編碼抗體、野生型DHFR蛋白質(zhì)、和另一種選擇標(biāo)志諸如氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參閱美國(guó)專(zhuān)利No.4，965，199。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Stinchcombetal.(1979)Nature282:39)。trpl基因?yàn)槿狈υ谏彼嶂猩L(zhǎng)能力的酵母突變株，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了選擇標(biāo)志。Jones(1977)Genetics85:12。酵母宿主細(xì)胞基因組中存在trpl損傷隨之提供了用于通過(guò)在缺少色氨酸時(shí)的生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類(lèi)似的，用攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20，622或38，626)。此外，衍生自1.6ym環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維氏酵母屬酵母?；蛘?，報(bào)導(dǎo)了用于在乳酸克魯維氏酵母中大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。VandenBerg(1990)Bio/Technology8:135。還披露了用于由克魯維氏酵母屬的工業(yè)用菌株分泌成熟重組人血清清蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達(dá)載體。Fleeretal.(1991)Bio/Technology9:(4)啟動(dòng)子構(gòu)件表達(dá)和克隆載體通常包含受到宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，而且它與抗體核酸可操作連接。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括phoA啟動(dòng)子、13-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、和雜合啟動(dòng)子諸如tac啟動(dòng)子。然而，其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是合適的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子還會(huì)包含與編碼抗體的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列。事實(shí)上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上游大約25至30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信號(hào)。將所有這些序列合適的插入真核表達(dá)載體。適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖_6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。作為具有通過(guò)生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的其它酵母啟動(dòng)子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步記載于EP73,657。酵母增強(qiáng)子也可以有利的與酵母啟動(dòng)子一起使用。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄抗體受到例如從病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類(lèi)肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選的猿病毒40(SV40)基因組，從異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子，及從熱休克啟動(dòng)子獲得的啟動(dòng)子的控制，倘若此類(lèi)啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。美國(guó)專(zhuān)利No.4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國(guó)專(zhuān)利No.4，601，978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在來(lái)自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下表達(dá)人P-干擾素cDNA還可參見(jiàn)Reyesetal.(1982)Nature297:598-601?；蛘?，可以使用勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。(5)增強(qiáng)子元件構(gòu)件常常通過(guò)將增強(qiáng)子序列插入載體來(lái)提高高等真核細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明抗體的DNA的轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)在知道來(lái)自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常會(huì)使用來(lái)自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。例子包括SV40復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件還可參見(jiàn)Yaniv(1982)Nature297:17-18?？梢詫⒃鰪?qiáng)子剪接到載體中，位于抗體編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)。(6)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物、人或來(lái)自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還會(huì)包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類(lèi)序列通常可以從真核或病毒DNA或cDNA的5'端和偶爾的3'端非翻譯區(qū)獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參見(jiàn)WO94/11026及其中披露的表達(dá)載體。(7)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核生物細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽(yáng)性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大腸埃希氏菌/大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31，446)，盡管其它菌株諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是編碼抗體的載體的合適克隆或表達(dá)宿主。啤酒糖酵母/釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌株且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe);克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12，424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16，045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC56，500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophila進(jìn))(ATCC36，906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K.marxia皿s);亞羅酵母屬(Yarrowia)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)(EP183，070);假絲酵母屬(Candida);瑞氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234);粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa);許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis);禾口絲狀真菌，諸如例如脈抱菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)禾口黑曲霉(A.niger)。適于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的允許昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞，它們來(lái)自諸如草地夜蛾Spodopterafrugiperda(毛蟲(chóng))、埃及伊蚊Aedesaegypti(蛟子)、白紋伊岐Aedesalbopictus(岐子)、黑月復(fù)果蟲(chóng)雖Drosophilamelanogaster(果蟲(chóng)雖)禾口家香Bombyxmori等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉(zhuǎn)染，例如苜蓿尺蠖Autogr即hacalifornicaNPV的L-l變體和家蠶BombyxmoriNPV的Bm_5株，而且此類(lèi)病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。然而，脊椎動(dòng)物細(xì)胞得到最多關(guān)注，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動(dòng)物細(xì)胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(C0S-7，ATCCCRL1651);人胚腎系(293或?yàn)榱嗽趹腋∨囵B(yǎng)中生長(zhǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，Grahametal.(1977)J.GenVirol.36:59);幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCL10);中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/_0冊(cè)1((:110，Urlaubetal.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216);小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather(1980)Biol.R印rod.23:243-251);猴腎細(xì)胞(CV1，ATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(H印G2，HB8065);小鼠乳瘤(匪T060562，ATCCCCL51);TRI細(xì)胞(Matheretal.(1982)AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68;MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝瘤系(H印G2)。用上文所述用于生產(chǎn)抗體的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)更改的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(8)培養(yǎng)宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、禾口Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Hametal.(1979)Meth.Enz.58:44;Barnesetal.(1980)Anal.Biochem.102:255;美國(guó)專(zhuān)利No.4，767，704;4，657，866;4，927，762;4，560，655;或5，122，469;WO90/03430;W087/00195;或美國(guó)專(zhuān)利Re.30，985。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件，諸如溫度、PH等，就是先前為表達(dá)而選擇用于宿主細(xì)胞的，這對(duì)于普通技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。(9)抗體的純化在使用重組技術(shù)時(shí)，可以在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么作為第一步，通過(guò)例如離心或超濾除去宿主細(xì)胞或裂解片段的微粒碎片。Carteretal.(1992)Bio/Technology10:163-167記載了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的規(guī)程。簡(jiǎn)單的說(shuō)，在存在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)時(shí)使細(xì)胞糊融化約30分鐘。可通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么一般首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元濃縮來(lái)自此類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來(lái)抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來(lái)防止外來(lái)污染物的生長(zhǎng)?？梢允褂美缌u磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來(lái)純化自細(xì)胞制備的抗體組合物，優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc域的種類(lèi)和同種型。蛋白A可用于純化基于人Yl、Y2或Y4重鏈的抗體(Lindmarketal.(1983)，J.Immunol.Meth.62:1-13)。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人Y3(Gussetal.(1986)EMB0J.5:1567-1575)。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時(shí)間。若抗體包含Q3結(jié)構(gòu)域，則可使用BakerbondABX樹(shù)脂(J.T.Baker，Phi11ipsburg，NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，諸如離子交換柱上的分級(jí)、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀。在任何預(yù)備性純化步驟后，包含感興趣抗體和污染物的混合物可進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，使用pH大約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度進(jìn)行(例如大約0-0.25M鹽)。2.用于鑒定閔子D桔杭劑的篩詵測(cè)l定法和動(dòng)物樽型可以在多種基于細(xì)胞的測(cè)定法和補(bǔ)體相關(guān)疾病或病癥的動(dòng)物模型中評(píng)估因子D拮抗劑。如此，例如，重組(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物模型可使用用于生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)將感興趣基因的編碼部分導(dǎo)入感興趣動(dòng)物的基因組來(lái)改造。可充當(dāng)轉(zhuǎn)基因操作對(duì)象的動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、綿羊、山羊、豬和非人靈長(zhǎng)類(lèi)，例如狒狒、黑猩猩和其它猴。本領(lǐng)域已知的用于將轉(zhuǎn)基因?qū)氪祟?lèi)動(dòng)物中的技術(shù)包括原核顯微注射(pro皿cleicmicroinjection)(Hoppe和Wanger，美國(guó)專(zhuān)利No.4，873，191);逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入種系中(例如VanderPutten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:6148—615(1985));胚胎干細(xì)胞中的基因?qū)ぐ?Thompson等，Cell,56:313-321(1989));胚胎電穿孔(Lo，Mol.Cel.Biol.，3:1803-1814(1983));精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，Cell,57:717-73(1989))。綜述參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4，736，866。為了本發(fā)明的目的，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括那些只在其部分細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物("鑲嵌動(dòng)物")。轉(zhuǎn)基因可作為單一轉(zhuǎn)基因或者串聯(lián)物例如頭-頭或頭-尾串聯(lián)物整合。通過(guò)遵循例如Lasko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:6232-636(1992)的技術(shù)，還可能將轉(zhuǎn)基因選擇性導(dǎo)入特定細(xì)胞類(lèi)型中。轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)。例如，Southern印跡分析或PCR擴(kuò)增可用于驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因的整合。然后可使用諸如原位雜交、Northern印跡分析、PCR、或免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)分析mRNA表達(dá)水平。動(dòng)物可進(jìn)一步檢驗(yàn)免疫病病理學(xué)的征候，例如通過(guò)組織學(xué)檢驗(yàn)以測(cè)定免疫細(xì)胞進(jìn)入特定組織中的浸潤(rùn)。還可實(shí)施阻斷實(shí)驗(yàn)，其中用本發(fā)明的候選因子D拮抗劑處理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以測(cè)定對(duì)補(bǔ)體和補(bǔ)體活化(包括經(jīng)典途徑和旁路途徑)、或T細(xì)胞增殖影響的程度。在這些實(shí)驗(yàn)中，將結(jié)合本發(fā)明多肽的阻斷性抗體施用于動(dòng)物并監(jiān)測(cè)感興趣生物學(xué)效應(yīng)。或者，可構(gòu)建"敲除"動(dòng)物，它由于編碼因子D多肽的內(nèi)源基因和導(dǎo)入動(dòng)物胚胎細(xì)胞中的改變的編碼該多肽的基因組DNA之間的同源重組而具有缺陷的或改變的編碼因子D的基因。例如，可依照已建立的技術(shù)用編碼因子D的cDNA克隆編碼因子D的基因組DNA?？梢詫⒕幋a因子D的基因組DNA的一部分刪除或用另一基因替換，諸如可用于監(jiān)測(cè)整合的、編碼選擇標(biāo)志的基因。通常，載體中包含數(shù)千堿基未改變的側(cè)翼DNA(5'和3'末端都有)(關(guān)于同源重組載體的描述參見(jiàn)例如Thomas和Capecchi，Cell,51:503(1987))。將載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系中(例如通過(guò)電穿孔)，并選擇其中所導(dǎo)入DNA與內(nèi)源DNA發(fā)生了同源重組的細(xì)胞(參見(jiàn)例如Li等，Cell,69:915(1992))。然后將所選擇的細(xì)胞注射入動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合體(參見(jiàn)例如Bradley，在《TeratocarcinomasandEmbryonicStemCells:APracticalApproach》中，E.J.Robertson編，IRL，Oxford,1987，第113-152頁(yè))。然后可將嵌合胚植入合適的假孕雌性代孕動(dòng)物中，并使胚胎足月產(chǎn)生"敲除"動(dòng)物。在其生殖細(xì)胞中包含同源重組DNA的后代可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定，并用于繁殖其中動(dòng)物的所有細(xì)胞都包含同源重組DNA的動(dòng)物。敲除動(dòng)物可以在例如由于缺乏因子D多肽而形成病理疾患和具有抵御某些病理疾患的能力方面進(jìn)行表征。如此，可以在鼠因子D敲除小鼠中進(jìn)一步研究潛在因子D拮抗劑的生物學(xué)活性。年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)的動(dòng)物模型由在Ccl-2或Ccr_2基因中具有無(wú)效突變的小鼠組成。這些小鼠形成AMD的主要特征，包括視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)中脂褐素的積累和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)下玻璃疣、光感受器萎縮和脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)。這些特征在6月齡后形成?？梢詫?duì)候選因子D拮抗劑測(cè)試玻璃疣形成、光感受器萎縮和脈絡(luò)膜新血管形成。3.藥物組合物可以以藥物組合物的形式施用本發(fā)明的因子D拮抗劑，包括抗因子D抗體和通過(guò)上文所公開(kāi)的篩選測(cè)定法鑒定得到的其它分子來(lái)治療補(bǔ)體相關(guān)眼疾。通過(guò)將具有期望純度的活性分子與任選的藥學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.編，1980)混合來(lái)制備本發(fā)明因子D拮抗劑的治療用配制劑，供貯存，以凍干劑型或水溶液的形式?？山邮艿妮d體、賦形劑、或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，而且包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、芐索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對(duì)羥基苯甲酸烴基酯，諸如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3_戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類(lèi)，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN、PLUR0NICS或聚乙二醇(PEG)。脂轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體也可用于將多肽、抗體、或抗體片段投遞入細(xì)胞中。在使用抗體片段的情況中，優(yōu)選特異性結(jié)合靶蛋白質(zhì)的結(jié)合域的最小片段。例如，基于抗體的可變區(qū)序列，可設(shè)計(jì)保留結(jié)合靶蛋白質(zhì)序列的能力的肽分子。此類(lèi)肽可化學(xué)合成和/或通過(guò)重組DNA技術(shù)生成(參見(jiàn)例如Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7889-7893(1993))?；钚苑肿舆€可包載入例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠囊(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、膠狀藥物投遞系統(tǒng)(例微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或粗滴乳狀液。此類(lèi)技術(shù)披露于《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16片反，Osol，A.編，1980。要用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無(wú)菌的。這可容易的通過(guò)使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專(zhuān)利No.3，773，919)、L_谷氨酸和L-谷氨酸y-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸_乙醇酸共聚物諸如LUPR0NDEP0T(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)、及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)膠囊化抗體在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持時(shí)，它們可能由于暴露于37t:的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？筛鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來(lái)設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫醇_二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，那么可通過(guò)修飾巰基、自酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。用于預(yù)防或治療眼病或眼疾的本發(fā)明化合物通常通過(guò)眼部、眼內(nèi)、和/或玻璃體內(nèi)注射來(lái)施用。也可使用其它施用方法，包括但不限于表面、胃腸外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、和病變內(nèi)施用。胃腸外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下施用。用于眼部、眼內(nèi)或玻璃體內(nèi)施用的配制劑可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法和使用本領(lǐng)域已知成分來(lái)制備。有效治療的一項(xiàng)主要要求是適當(dāng)滲透穿過(guò)眼。與眼前部的疾病(在這種情況中藥物可以表面投遞)不同，視網(wǎng)膜疾病要求更加位點(diǎn)特異性的辦法。滴眼劑和軟膏劑很少滲透眼后部，而且血眼屏障妨礙系統(tǒng)性施用的藥物滲透到眼組織中。因而，為了治療視網(wǎng)膜疾病，諸如AMD和CNV而選擇的藥物投遞方法通常是直接玻璃體內(nèi)注射。玻璃體內(nèi)注射通常要重復(fù)進(jìn)行，時(shí)間間隔取決于患者的狀況及所投遞藥物的特性和半衰期。為了眼內(nèi)(例如玻璃體內(nèi))滲透，通常優(yōu)選較小的分子。補(bǔ)體相關(guān)眼疾，諸如AMD或CNV的治療功效可以通過(guò)評(píng)估眼內(nèi)疾病時(shí)常用的多種終點(diǎn)來(lái)測(cè)量。例如，可評(píng)估視覺(jué)損失。視覺(jué)損失可通過(guò)但不限于例如下述各項(xiàng)來(lái)測(cè)量測(cè)量最好矯正視力/視敏度(BCVA)自基線到預(yù)期時(shí)間點(diǎn)的均值變化(例如其中BCVA基于早期治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變研究(ETDRS)視力表和測(cè)試距離4米的評(píng)估)；測(cè)量在預(yù)期時(shí)間點(diǎn)與基線相比視力損失小于15個(gè)字母的受試者比例；測(cè)量在預(yù)期時(shí)間點(diǎn)與基線相比視力獲得超過(guò)或等于15個(gè)字母的受試者比例；測(cè)量在預(yù)期時(shí)間點(diǎn)Snellen視力相當(dāng)于20/2000或更差的受試者比例；測(cè)量NEI視覺(jué)功能問(wèn)巻(VisualFunctioningQuestionnaire);測(cè)量預(yù)期時(shí)間點(diǎn)CNV的大小和CNV滲漏的量，例如通過(guò)熒光素血管造影術(shù)評(píng)估；等。眼部評(píng)估可通過(guò)下述各項(xiàng)來(lái)進(jìn)行，例如包括但不限于例如實(shí)施眼部檢查，測(cè)量眼內(nèi)壓，評(píng)估視力，測(cè)量裂隙燈壓，評(píng)估眼內(nèi)炎癥，等。提供下文實(shí)施例僅僅為了例示目的，而非意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在此通過(guò)述及明確地完整收錄本說(shuō)明書(shū)中所引用的所有專(zhuān)利和參考文獻(xiàn)。實(shí)施例除非另有說(shuō)明，實(shí)施例中提及的商品化試劑依照制造商的說(shuō)明書(shū)使用。下文實(shí)26施例和整篇說(shuō)明書(shū)中以ATCC編號(hào)鑒別的那些細(xì)胞的來(lái)源是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBoulevard，Manassas,VA20110-2209)。實(shí)施例1:抗因子D抗體的制備和測(cè)試方法:肝舶齢禾斤白勺鵬碰禾口絲編白勺燃融化人AMD和非AMD尸眼，并沿著玻璃體、視網(wǎng)膜和RPE取出前段。在微量管中收集玻璃體，在干冰上冷凍，并保存于_701:直至進(jìn)一步加工。自后半球剝離布魯赫膜_脈絡(luò)膜層(Crabb，J.W.等，ProcNatlAcadSciUSA.,99:14682-7(2002)),并自黃斑和周?chē)醒雲(yún)^(qū)分離4mm或6mm環(huán)鉆樣品，供后續(xù)分析用。見(jiàn)所附關(guān)于布魯赫膜制備物、年齡、性別、AMD階段、解剖記錄和蛋白質(zhì)組分析所使用的量的匯總表(表2)。使用一份環(huán)鉆樣品(4mm直徑)來(lái)分析補(bǔ)體因子D蛋白質(zhì)水平。將樣品在測(cè)定稀釋劑(PBS/0.5%BSA/0.5%Tween-20)中超聲處理10分鐘，并通過(guò)以5000rpm離心10分鐘將可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分分開(kāi)。將可溶性級(jí)分用于ELISA分析。tH(寸A附D白勺絲歸翻頓如下生成針對(duì)人因子D的單克隆抗體，即在Balb/c小鼠的足墊中注射單磷酰脂質(zhì)A/二棒分枝菌酸海藻糖佐劑(Corixa，Hamilton,MT)中的2ug因子D(Comptech，Taylor,TX)11次。將來(lái)自小鼠的胭淋巴結(jié)與P3X63Ag.U.l骨髓瘤細(xì)胞融合。篩選雜交瘤細(xì)胞針對(duì)鼠因子D的結(jié)合親和力。通過(guò)有限稀釋來(lái)克隆生成抗體的細(xì)胞系。溶血測(cè)l定法為了測(cè)定旁路途徑活性，將家兔紅細(xì)胞(Er，ColoradoSerum)在GVB中清洗3次，并重懸至2xl07ml。將抑制劑(50ul)和20ulEr懸浮液與GVB/0.1MEGTA/0.1MMgCl21:1混和。通過(guò)添加經(jīng)Clq消減的人血清(Quidel;30ul，在GVB中1:3稀釋)來(lái)啟動(dòng)補(bǔ)體活化。于室溫溫育30分鐘后，添加200ulGVB/10mMEDTA以終止反應(yīng)，并將樣品以500g離心5分鐘。通過(guò)測(cè)量412nm處的吸光度，在200ul上清液中測(cè)定溶血情況。數(shù)據(jù)表述成相對(duì)于在缺乏抑制劑時(shí)誘導(dǎo)的溶血的百分比。為了測(cè)定因子D抗體對(duì)補(bǔ)體經(jīng)典路徑的影響，遵循類(lèi)似的規(guī)程，只是用經(jīng)IgM包被的綿羊紅細(xì)胞(E-IgM，CompTech)替換Er且在GVB++中在因子B缺陷的人血清中實(shí)施測(cè)定法。人因子DELISA將抗人補(bǔ)體因子D山羊多克隆抗體(pAb)(R&DSystems,Minneapolis,MN)在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋至lug/mL，并在4t:過(guò)夜溫育期間包被到ELISA板(384孔，高結(jié)合板，GreinerBioOnethroughVWRInternational,Bridgeport,NewJersey)上。用清洗緩沖液(PBS/0.05%Tween-20)清洗3次后，將板用PBS/0.5%牛血清清蛋白(BSA)封閉1-2小時(shí)。此溫育和所有其它溫育均于室溫在定軌搖床上實(shí)施。用測(cè)定稀釋劑(PBS/0.5%BSA/0.5%Tween-20)稀釋人玻璃體液和布魯赫膜溶胞物樣品。使用相同緩沖液，配制因子D(ComplementTechnology,Inc.，Tyler，Texas)標(biāo)準(zhǔn)曲線的連續(xù)稀釋度(15.6pg/mL-l，OOOpg/mL)。融化為了在標(biāo)準(zhǔn)曲線的高、中、和低區(qū)定量而預(yù)稀釋的冷凍對(duì)照樣品。封閉步驟后，清洗板，并添加樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、和對(duì)照，溫育2小時(shí)。清洗板，并將生物素化的抗人因子D單克隆抗體9G7.1.16稀釋至62.5ng/mL，添加至板，溫育1_2小時(shí)。將鏈霉親合素-辣根過(guò)氧化物酶(SA_HRP)(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ)在測(cè)定稀釋劑中1/10，000稀釋?zhuān)⑻砑又燎逑春蟮陌濉?0分鐘溫育和最后一次清洗步驟后，添加四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg，MD)，并顯色5-7分鐘。最后，通過(guò)添加1M磷酸來(lái)終止反應(yīng)。使用微量板讀數(shù)儀(450nm，650nm參照)獲得光密度，并自4參數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。人玻璃體液和布魯赫膜溶胞物樣品中因子D的最小限度可計(jì)量濃度分別為780pg/mL(l/50最低限度稀釋)和156pg/mL(1/10最低限度稀釋)。免翩會(huì)只仆,，在OCT化合物中冷凍布魯赫膜樣品，并在低溫切片機(jī)上切出7um切片。免疫染色。切片后將切片在丙酮中固定5分鐘，并保存于-S(TC直至準(zhǔn)備好染色。將冷凍的切片在PBS中漂洗2次，接著在含有0.1%Tween的Tris緩沖鹽水(TBST)中漂洗2次。用Vector親合素生物素封閉試劑盒(SP-2001)遵循制造商的指導(dǎo)于室溫封閉內(nèi)源親合素和生物素。將切片在TBST中漂洗，更換2次，每次5分鐘，并用3%BSA/PBS中的10%馬血清于室溫封閉內(nèi)源免疫球蛋白30分鐘。將切片與在10%馬血清中稀釋至10ug/ml的抗人因子D(9G7.1.16)抗體一起于室溫溫育60分鐘。使用10ug/ml的天然小鼠IgG2a(Pharmingen)作為陰性對(duì)照。在TBST中漂洗后(更換2次，每次5分鐘)，將切片與在馬血清中稀釋至2.5ug/ml(l:200)的生物素化的馬抗小鼠抗體(Vector)—起溫育30分鐘。將切片在TBST中漂洗，更換2次，每次5分鐘，并與VectastainABC-APElite試劑于室溫一起溫育30分鐘，在TBST中漂洗(更換2次，每次5分鐘)，并在新鮮制備的VectorRed溶液中溫育。VectorRed是如下制備的對(duì)于200mMTrisHCl，在dH20中l(wèi):5稀釋1MTrisHCl(l份TrisHC1和4份dH20)。在每5ml新鮮制備的200mMTrisHC1溶液中混和1滴Levamisole。在每5ml200mMTrisHCl-Levamisole溶液中分別混和2滴來(lái)自VectorRed試劑盒的試劑1、2和3。在添加來(lái)自VectorRed試劑盒的試劑3后5_10分鐘內(nèi)使用。將切片在H20中漂洗，并如下用Mayer的蘇木精復(fù)染，即在蘇木精中浸泡10-15次(20_30秒鐘)，用水和藍(lán)(blue)漂洗，并在流水中充分漂洗5分鐘以洗去發(fā)藍(lán)試劑。將切片在Crystal封固液中封固，并讓其干燥過(guò)夜。在二甲苯中浸泡干燥的Crystal封固覆蓋的載玻片，并使用永久封固封固劑蓋上蓋玻片o20D12的重鏈和輕鏈的克隆使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen，Germany)自生成小鼠抗人因子D單克隆20D12的雜交瘤細(xì)胞提取總RNA。使用RT-PCR用如下簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增輕鏈可變域(VL)和重鏈可變域(VH):輕鏈(LC)正向:5'GATCGATATCGTRATGACHCARTCTCA3'(SEQIDNO:4)輕鏈反向5'TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC3'(SEQIDNO:5)重鏈(HC)正向:5'GATCCGTACGCTCAGGTYCARYTGCARCARTCTGG3'(SEQIDNO:6)重鏈反向5'ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT3'(SEQIDNO:7)正向引物是對(duì)VL和VH區(qū)的N端氨基酸序列特異性的。相應(yīng)地，LC和HC反向引物設(shè)計(jì)成與在物種中高度保守的輕鏈恒定域(CL)和重鏈第l恒定域(CHI)中的一個(gè)區(qū)域退火。將擴(kuò)增得到的VL克隆入含有人k恒定域的pRK哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體(Shields等，JBiolChem2000;276:6591-604)。將擴(kuò)增得到的VH插入編碼全長(zhǎng)人dgGl恒定域的pRK哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。如此，將20D12重定格式成小鼠_人IgGl嵌合物。認(rèn)為前述書(shū)面說(shuō)明足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明。本發(fā)明并不限于所保藏構(gòu)建體的范圍，因?yàn)樗２貙?shí)施方案意圖作為本發(fā)明某些方面的單一例示，而且功能上相當(dāng)?shù)娜魏螛?gòu)建物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中的材料保藏并非承認(rèn)本文中所包含的書(shū)面說(shuō)明不足以能夠?qū)嵺`本發(fā)明的任何方面，包括其最佳模式，也不能解釋為將權(quán)利要求的范圍限制于它所描述的具體例示。實(shí)際上，根據(jù)上面的描述，除了本文所顯示和描述的，本發(fā)明的多種修飾對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，而且在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。29權(quán)利要求一種用于預(yù)防或治療補(bǔ)體相關(guān)眼疾的方法，包括給有需要的受試者施用有效量的因子D拮抗劑。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述受試者是人。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述因子D拮抗劑選自下組抗因子D抗體及其片段、結(jié)合性多肽、肽、和非肽小分子。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述因子D拮抗劑是抗體或抗體片段。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體結(jié)合因子D的活性位點(diǎn)。7.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體結(jié)合包含因子D活性位點(diǎn)殘基的表位。8.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體選自下組抗體20D12、31A9、25A1和32H12，及其變體。9.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體本質(zhì)上與抗體20D12結(jié)合相同表位。10.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體包含抗體20D12的重鏈和/或輕鏈CDR序列(SEQIDNO:1禾P2)。11.權(quán)利要求5的方法，其是人的、人源化的或嵌合的抗體。12.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體片段選自下組Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、(scFv)2、dAb、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體、和自抗體片段形成的多特異性抗體。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體片段是Fab、Fab'、F(ab'h、scFv、或(scFv)2片段。14.權(quán)利要求3的方法，其中所述補(bǔ)體相關(guān)眼疾選自下組年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、vonHippel-Lindau病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網(wǎng)膜新血管形成。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述AMD是干性AMD。16.權(quán)利要求14的方法，其中所述AMD是濕性AMD。17.—種試劑盒，其包含因子D拮抗劑和關(guān)于施用所述拮抗劑來(lái)治療補(bǔ)體相關(guān)眼疾的指令。18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述補(bǔ)體相關(guān)眼疾選自下組年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、vonHippel-Lindau病、眼的組織胞漿菌病、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(CRV0)、角膜新血管形成、和視網(wǎng)膜新血管形成。19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述補(bǔ)體相關(guān)眼疾是AMD或CNV。20.因子D拮抗劑在制備用于治療補(bǔ)體相關(guān)眼疾的藥物中的用途。21.因子D拮抗劑，其用于補(bǔ)體相關(guān)眼疾的治療。全文摘要本發(fā)明關(guān)注通過(guò)施用因子D拮抗劑來(lái)預(yù)防和治療補(bǔ)體相關(guān)眼疾，諸如脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)和年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)。文檔編號(hào)A61K39/395GK101754980SQ200880100137公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年5月22日優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日發(fā)明者克里斯琴·威斯曼,小肯尼思·卡奇克,殷建平,菲利普·哈斯,邁卡·斯蒂費(fèi)克,門(mén)諾·范盧克倫坎佩吉申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司