專利名稱：：抗菌組合物的制作方法抗菌組合物本發(fā)明涉及含有噬菌體(“噬菌體(phage)“)的制劑和使用高濃度的噬菌體和/或含有噬菌體K和/或P68的制劑治療細(xì)菌感染，或?qū)Ρ砻嫦镜姆椒?。特別地，本發(fā)明利用被稱為"外溶菌作用"的現(xiàn)象?；诨瘜W(xué)上的抗生素形式的抗菌劑(即，非病毒藥劑)，諸如青霉素或四環(huán)素是眾所周知的。這類抗生素的問題在于對其的耐藥性變得日益普遍。賦予抗生素耐藥性的突變或編碼抗生素耐藥性酶(諸如青霉素酶)的基因的突變在全世界的病原菌中也日益普遍。例如，甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)細(xì)菌是一種日益普遍的感染形式，其通常在醫(yī)院在由于其它原因的手術(shù)過程中獲得。使用常規(guī)的抗生素極難治療MRSA感染。一種治療細(xì)菌感染的替代方法是用被稱為噬菌體的病毒感染細(xì)菌。這種"噬菌體治療"在最初二十世紀(jì)初產(chǎn)生，但是在二十世紀(jì)四十年代自從出現(xiàn)抗生素后在西方很少使用。在東歐已經(jīng)進(jìn)行了更廣泛的工作。噬菌體(還稱作"噬菌體(phage)“)針對于細(xì)菌細(xì)胞的具體種類。它們不能感染更復(fù)雜的生物體的細(xì)胞，其原因在于在關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞表面組成的重大差異。大多數(shù)噬菌體具有諸如尾絲的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)確保噬菌體結(jié)合到它們的靶細(xì)菌表面的特定的分子之上。隨后噬菌體內(nèi)的病毒DNA或某些噬菌體內(nèi)的RNA被注入，其通常通過尾部進(jìn)入宿主細(xì)胞，然后直接產(chǎn)生子代噬菌體。發(fā)現(xiàn)感染不同細(xì)菌的不同種類的噬菌體。一般而言，它們可以從其中特定細(xì)菌生長的環(huán)境中(例如從污水或糞便中)分離。噬菌體在樣本中的百分比可通過使樣本通過濾器來測定，該濾器具有足夠小的孔徑從而防止細(xì)菌通過。所述過濾的提取物通常與生長培養(yǎng)基相混合，加入合適的宿主細(xì)菌，然后將其鋪到例如瓊脂平板上。在所得的細(xì)菌菌苔上所存在的亮點(diǎn)(被稱為噬斑)表明存在一種或多種噬菌體，該噬菌體引起細(xì)菌溶解。僅僅殺死細(xì)菌的噬菌體被稱作"專性溶解"噬菌體。專性溶解噬菌體以核酸物質(zhì)(通常為DNA)的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞的外部，其被蛋白質(zhì)外殼圍繞。所述蛋白質(zhì)外殼通常含有一個或多個連接它的分子，使得噬菌體在細(xì)菌的表面上連接至特定的分子。一旦與細(xì)菌結(jié)合，所述DNA獲得進(jìn)入細(xì)菌宿主的入口，在該細(xì)菌宿主中它被轉(zhuǎn)錄并且翻譯成用于新噬菌體復(fù)制和組裝所需的不同蛋白質(zhì)。所述DNA也被復(fù)制并且被包裝進(jìn)入新噬菌體，其在細(xì)菌細(xì)胞溶解時被釋放。除了專性溶解噬菌體之外，存在可溶性噬菌體或溫性噬菌體。這些溫性噬菌體具有兩個生命周期，在其中一個生命周期它們?nèi)芙飧腥镜募?xì)胞，并且在另一個生命周期它們進(jìn)入原噬菌體狀態(tài)。專性溶解噬菌體總是不得不從外部感染，重編宿主細(xì)胞并且通過拆開或溶解感染的細(xì)胞突然釋放噬菌體。“溫性"噬菌體可以將它們的DNA整合進(jìn)入宿主細(xì)菌DNA，從而導(dǎo)致作為原噬菌體在特定的細(xì)菌和它們的子代內(nèi)實(shí)質(zhì)上永久的關(guān)聯(lián)。某些原噬菌體在物理上并不整合進(jìn)入染色體，但是其作為自主復(fù)制子存在。原噬菌體指導(dǎo)阻遏物的合成，該阻遏物阻斷了其自身基因的表達(dá)并且也阻斷了任何緊密相關(guān)的溫性噬菌體的表達(dá)。偶爾，原噬菌體可以逃脫其阻遏物的調(diào)控。然后，原噬菌體DNA可通過位點(diǎn)專一的重組從基因組中切割、復(fù)制，并且子代在大多數(shù)情況下通過溶菌從宿主細(xì)胞中釋放。專性溶解噬菌體已經(jīng)被用于治療細(xì)菌感染。分離的專性溶解噬菌體已經(jīng)被施用于傷口或靜脈注射，從而它們殺死細(xì)菌。噬菌體的益處在于它們是自我復(fù)制的，使用像一百個左右的那么少的噬菌體能夠殺死像一億個的那么多的細(xì)菌。噬菌體通過殺死細(xì)菌一直簡單地復(fù)制自己直到它們將細(xì)菌從個體或環(huán)境中清除。例如，WO01/51066公開了用一種或多種專性溶解噬菌體治療患者的方法。類似地，US4，957，686公開了用噬菌體治療齲齒的方法。使用噬菌體的一個可能的問題是患者自己的身體通常對噬菌體具有免疫應(yīng)答并且將噬菌體從血液中清除。US5，660，812、US5，688，501和US5，766，892均顯示為了改善噬菌體在待治療患者血液中的半衰期選擇噬菌體的方法。US5，811，093討論了選擇編碼一種病毒殼體(外殼)蛋白(病毒殼體E)的修飾基因使得噬菌體在動物的循環(huán)系統(tǒng)中存活更長。在近來的患者的病例中，修飾被確定為在基因內(nèi)的點(diǎn)突變。與現(xiàn)有技術(shù)用于消毒或處理細(xì)菌污染物或疾病相關(guān)的問題在于噬菌體通常是菌株特異的。例如，在細(xì)菌內(nèi)存在的原噬菌體可阻斷來自感染的噬菌體的基因表達(dá)，從而阻止感染的噬菌體的復(fù)制并且阻止溶菌和殺死細(xì)菌。原噬菌體也可引起新來的噬菌體DNA的破壞。這在以前一直意味著噬菌體需要與細(xì)菌匹配，通常需要復(fù)雜的細(xì)菌基因分析，或者需要組合使用許多不同的噬菌體。在WO03/080823中公開了生產(chǎn)一組不同的噬菌體，諸如一組衍生自溫性噬菌體的vir突變體。自從二十世紀(jì)三十年代后期和四十年代初期以來，被稱作"外溶菌作用"的現(xiàn)象已經(jīng)為公眾所知。DelbruckM.(J.Gen.Physiol.,(1940)，第643-660頁)討論了兩個概念“內(nèi)溶菌作用"和"外溶菌作用"?！皟?nèi)溶菌作用"是其中細(xì)菌細(xì)胞被噬菌體感染，該噬菌體在細(xì)胞內(nèi)繁殖，并且所述細(xì)胞溶解，釋放新噬菌體并殺死該細(xì)菌。這是專性溶解噬菌體通常所使用的過程。在另一方面，"外溶菌作用"不涉及噬菌體在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。Delbrilck注意到噬菌體被細(xì)菌細(xì)胞吸附，但是并未釋放子代噬菌體。這導(dǎo)致進(jìn)入球形體的細(xì)菌細(xì)胞的變性并且通過溶菌殺死細(xì)菌。值得注意的是，需要高于閾值的高濃度的噬菌體以誘導(dǎo)這一現(xiàn)象。我們現(xiàn)在知道這是(至少部分是)由于細(xì)菌細(xì)胞壁被以溶解形式存在的酶或附著于噬菌體顆粒的酶消化(Stent.G.S.，MolecularBiologyofBacterialParticles,W.H.Freeman&Co.(1963)，第71-87頁)。已經(jīng)進(jìn)行了分離和表征被稱作"溶解素"的溶菌酶的大量工作。溶解素還被稱作胞壁質(zhì)水解酶。例如，RalstonD.J.，等(J.Gen.Physiol.(1957)，41(2):343_358)研究了噬菌體和病毒溶解素(virolysin)對細(xì)菌的作用。病毒溶解素已經(jīng)從噬菌體-感染的細(xì)胞的裂解物中獲得。同一研究小組繼續(xù)報道了這一現(xiàn)象。在1964年他們報道了外溶菌作用似乎需要通過噬菌體的促進(jìn)感受性，隨后通過溶解素消化細(xì)胞壁(RalstonD.，等，J.Bacteriol.(1964)，88676-681)?？茖W(xué)界將分離的溶解素的用途集中于潛在的治療應(yīng)用。還研究了其它分離的溶菌-相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)，諸如穴蛋白(holin)。穴蛋白涉及細(xì)胞膜的透化作用。例如，NelsonD.，等(PNAS,(2001),98:4107_4112)公開了純化的溶解素用于治療細(xì)菌感染的用途。使用經(jīng)口引入純化的溶解素能夠治療在上呼吸道的鏈球菌感染。WO01/19391和US2002/0094319還公開了純化的專性溶解酶，諸如溶解素的用途。甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)特別是在有病的、年長的或缺乏免疫力的患者中可以引起系統(tǒng)感染或膿腫和潰瘍。它日益成為在醫(yī)院中死亡的主要原因或促進(jìn)在醫(yī)院中死亡。MRSA可存在于醫(yī)生或來訪者的鼻腔，而沒有任何明顯的疾病癥狀。但是，細(xì)菌可通過人與人之間，包括患者之間傳播。因此，殺死細(xì)菌有助于預(yù)防疾病。在WO03/080823中給出的一個可能的方法是使用一組噬菌體。但是，存在著許多不同的MRSA菌株。因此，所述組通過細(xì)菌的專性溶解感染可能不殺死所有的MRSA。本發(fā)明人目前已經(jīng)意識到提供足以誘導(dǎo)外溶菌作用的高濃度噬菌體提供了一種快速殺死細(xì)菌，而無需為了引起內(nèi)溶菌作用而感染細(xì)菌的方法。這擴(kuò)大了可用噬菌體進(jìn)行治療的菌株的數(shù)量，同時仍在噬菌體的易感菌株中提供了內(nèi)溶菌作用。其它細(xì)菌，諸如艱難梭菌(C.difficile)也成為醫(yī)院中的難題，并且其通過與其它患者、健康的工作人員或來訪者接觸而傳播或從外周環(huán)境中傳播。目前，醫(yī)院利用酒精洗手以幫助防止MRSA傳染。但是，這種酒精洗滌通常不適合在鼻腔或皮膚破損區(qū)域的敏感內(nèi)層使用。因此，需要生產(chǎn)適用于殺死細(xì)菌，諸如MRSA或艱難梭菌的組合物。本發(fā)明人出人意料地確認(rèn)采用外溶菌作用提供了制備更簡單、成本有效的制劑。外溶菌作用提供了一種快速殺死細(xì)菌的方法。它允許在不需要抗生素或有害的或刺激性的化學(xué)制品的情況下殺死耐抗生素的細(xì)菌。此外，利用全部的噬菌體具有下述益處如果噬菌體經(jīng)由內(nèi)溶菌作用能夠感染細(xì)菌，那么制劑可能具有雙重的進(jìn)攻模式；通過外溶菌作用和內(nèi)溶菌作用殺死，即使制劑的濃度被體液(諸如，粘液)所稀釋。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明人所使用的優(yōu)選的噬菌體，即噬菌體K和/或噬菌體P68—起或單獨(dú)地具有對抗范圍廣泛的細(xì)菌菌株的活性和下述的其它益處。噬菌體K先前已經(jīng)被表征為抗-MRSA的噬菌體。0'FlahertyS.0.，等，(Appl.Environ.Microbiol.(2005),71(4):1836_1842)研究了噬菌體K對不同的金黃色葡萄球菌耐藥菌株的作用。例如，TakacM.和BlasiU.研究了噬菌體P68(Antimicrob.AgentsandChemo.(2005)=2934-2940)本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)噬菌體K和/或P68的感染的MRSA菌株譜互相補(bǔ)充，使得這兩個毒株的組合特別是適用于抗-MRSA組合。噬菌體K具有其它的益處。革蘭式陰性細(xì)菌的菌壁主要由肽多糖組成，同時另外革蘭式陽性細(xì)菌含有大量的磷壁酸(一種陰離子多元醇磷酸鹽聚合物)。已知自從二十世紀(jì)七十年代以來對噬菌體K抵抗的金黃色葡萄球菌突變體缺乏核糖醇壁酸(ShawD.R.D.等(1970)J.Biol.Chem.245(19)5101-5106)。噬菌體K通過磷壁酸結(jié)合至細(xì)菌細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺乏細(xì)胞壁的磷壁酸減少與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，而磷壁酸需要附著于鼻細(xì)胞(WeidenmaierC等Int.J.MedicalMicrobiol(2008)298，505-513)。因此，如果存在磷壁酸，噬菌體K將結(jié)合至細(xì)菌。如果細(xì)菌通過減少細(xì)胞壁內(nèi)的磷壁酸突變?yōu)閷κ删wK抵抗的話，那么這將降低該細(xì)菌結(jié)合鼻細(xì)胞的能力。這將有助于減少噬菌體K治療后所殘留的任何細(xì)菌的毒力。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，例如，高濃度的噬菌體K及其宿主范圍變化的衍生物仍然能殺死金黃色葡萄球菌，即使它們突變?yōu)閷Ｐ匀芙飧腥镜挚沟摹１景l(fā)明的第一個方面提供用于對表面消毒的含有載體和至少一種類型的噬菌體的消毒劑組合物，其特征在于當(dāng)細(xì)菌存在于待消毒的表面時，在組合物中以足夠高的濃度提供噬菌體從而在細(xì)菌中誘導(dǎo)外溶菌作用，其中該噬菌體是該細(xì)菌的病原體。引起外溶菌作用所需的噬菌體的濃度可在實(shí)驗(yàn)上測定，例如，通過在正常生長溫度將細(xì)菌細(xì)胞與不同濃度的所述噬菌體溫孵并且在所述噬菌體的濃度觀察如培養(yǎng)物松散濁度(cultureloosingturbidity)所示的細(xì)菌細(xì)胞溶解。在組合物中的噬菌體通常來自預(yù)先確定的特定的細(xì)菌種類。在本文所使用的術(shù)語"病原體"意旨能夠特定結(jié)合至一種細(xì)菌的表面上的噬菌體，并且當(dāng)在高濃度時能夠誘導(dǎo)外溶菌作用。噬菌體不必具有誘導(dǎo)內(nèi)溶菌作用的能力。如上所述，在相同細(xì)菌種類的不同的菌株中存在不同的原噬菌體是指特定的噬菌體經(jīng)由內(nèi)溶菌作用機(jī)制可以或不可以誘導(dǎo)細(xì)菌的溶菌。但是，該噬菌體仍然可以結(jié)合至該細(xì)菌的表面并且仍然經(jīng)由外溶菌作用機(jī)制誘導(dǎo)溶菌。優(yōu)選地，噬菌體的濃度是噬菌體的噬菌斑形成單位(pfu)細(xì)菌的集落形成單位(Cfu)為至少41、51、61、71、81、9UlO1、至少201、401、501，至少1001。所述噬菌體的噬菌斑形成單位在細(xì)菌上測定，該細(xì)菌能夠經(jīng)由內(nèi)溶菌作用被噬菌體溶解?？梢岳斫獾氖?，不同類型的噬菌體能夠在不同的細(xì)菌上誘導(dǎo)外溶菌作用的效力將隨著噬菌體的不同而變化。誘導(dǎo)這種現(xiàn)象所需的濃度可以由常規(guī)實(shí)驗(yàn)測定。有可能地，可以對任何表面進(jìn)行處理，其中在所述表面上施用消毒劑組合物以產(chǎn)生足夠高濃度的噬菌體從而產(chǎn)生所需的外溶菌作用。因此，所述表面可以是例如，醫(yī)院內(nèi)的醫(yī)療設(shè)備、被褥、家具、墻壁或地板。但是，最優(yōu)選地，待處理的表面是哺乳動物的外部皮膚，例如哺乳動物的鼻腔或創(chuàng)傷表面或表面內(nèi)的切口。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人類。消毒劑組合物可以噴霧劑或洗液的形式用于表面。所述組合物可以是洗手液。優(yōu)選地，所述組合物是用于局部施用的制劑，它可以采用洗劑、霜劑、軟膏劑、糊劑、凝膠劑、泡沫劑的形式或眾所周知的作為用于局部給藥的載體的其它物理形式。這種增稠的局部制劑是特別有益的，其原因是該制劑粘附于材料所放置的皮膚區(qū)域，從而允許將集中的高濃度的噬菌體引入待消毒的特定區(qū)域。例如，基于石蠟-和羊毛脂的霜劑特別適用于施用于鼻腔的產(chǎn)品是本領(lǐng)域眾所周知的。但是，也可以使用其它增稠劑，諸如聚合物增稠劑。所述制劑還包括下述的一種或多種水、防腐劑、表面活性劑(activesurfactants)、乳劑、抗氧化劑或溶劑?？梢允褂脙煞N或多種不同的噬菌體。例如，相同細(xì)菌種類的不同的菌株的表面外殼有時會變化。因此，為了增加特定制劑可以在特定的表面上的特定種類的細(xì)菌種群中誘導(dǎo)外溶菌作用的可能性，優(yōu)選使用能夠感染相同細(xì)菌種類的不同菌株的兩種或多種不同的噬菌體。這還增加了內(nèi)溶菌作用還可用作在特定的表面上殺死細(xì)菌的輔助方法的可能性?？蛇x擇地或另外地，可使用兩種或多種不同類型的噬菌體，噬菌體各自可以特定用于不同細(xì)菌種類。這允許在特定的表面上可能存在許多不同細(xì)菌的情境下將要使用的特定制劑作為對照。優(yōu)選地，所述噬菌體是選自下述細(xì)菌的病原體葡萄球菌屬、螺桿菌屬、克雷伯氏菌屬、利斯特氏菌屬、分枝桿菌屬、埃希氏菌屬、腦膜炎雙球菌、彎曲桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、梭菌屬、軍團(tuán)菌屬、不動桿菌屬(Acetinobacter)或沙門氏菌屬。優(yōu)選地，所述噬菌體是金黃色葡萄球菌、特別是MRSA或艱難梭菌的病原體。實(shí)際上，可以以在高濃度和更低濃度下使用噬菌體K和/或噬菌體P68或其突變體的組合，在高濃度下誘導(dǎo)不允許噬菌體繁殖的細(xì)菌菌株外溶菌作用，在較低濃度下基本上僅僅發(fā)生內(nèi)溶菌作用。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在消毒劑制劑中單獨(dú)使用噬菌體K或與噬菌體P68組合使用使得感染或殺死范圍廣泛的MRSA菌株。噬菌體K和噬菌體P68的宿主范圍互相補(bǔ)充。因此，本發(fā)明的另一方面提供用于對表面消毒的消毒劑組合物，其含有載體、噬菌體K和/或噬菌體P68或其突變體。噬菌體K或噬菌體P68可單獨(dú)使用或優(yōu)選地互相組合使用或與其它噬菌體組合使用?？稍跓o噬菌體P68或在有其它噬菌體的情況下單獨(dú)使用噬菌體K。除了噬菌體K和/或噬菌體P68之外，所述組合物可包括其它類型的噬菌體。噬菌體K或P68的突變體可為點(diǎn)突變、缺失突變或添加突變。相對于最初的噬菌體K或P68序列，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個堿基可發(fā)生變化。這種突變體優(yōu)選具有變化的宿主范圍。在0‘Flaherty等的文章中詳細(xì)討論了噬菌體K(J.Bacteriol.(2004)2862-2871)，其全文被并入本文。它是含有127，395bp的DNA基因組的多價噬菌體。典型地噬菌體K基本上缺乏GATC和GGNCC位點(diǎn)。它典型地包含具有與利斯特氏菌屬噬菌體A511同源性的大片區(qū)域。該基因組在基本噬菌體功能中還典型地包含多個內(nèi)含子，其中兩個在聚合酶中以及一個在溶解素基因中。在VybiralD.等的文章中表示了P68的核苷酸序列(FEMSMicrobiol·Lett(2003)，219，275-283)，其全文被并入本文。P68包含18277bp(GenbankNoAF513033)。優(yōu)選地，噬菌體K或噬菌體P68的突變至少90%，最優(yōu)選地至少92%、94%、96%、98%或99%與噬菌體的天然序列相同。如上所述，噬菌體可以以足夠高濃度存在以誘導(dǎo)外溶菌作用。但是，兩種噬菌體之一或兩者還可以以低于誘導(dǎo)外溶菌作用所需的濃度存在。例如，噬菌體K和噬菌體P68各自以Pfu噬菌體cfu細(xì)菌低于51的比例存在，其中細(xì)菌的濃度是表面上的其中噬菌體K或噬菌體P68是所述細(xì)菌的病原體的所述細(xì)菌的濃度。所述組合物可局部施用于，例如哺乳動物，諸如人類的皮膚上。例如，皮膚可以是鼻腔或手上。其它表面可如上定義。組合物的形式、組合物的組分和用途可如上定義。特定用于不同細(xì)菌種類，并且實(shí)際上用于細(xì)菌的不同菌株的噬菌體是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，所述組合物可包含一種或多種眾所周知的噬菌體，該噬菌體能夠感染MRSA，包括噬菌體K和/或噬菌體P68。本發(fā)明還提供在表面上殺死細(xì)菌的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明第一方面的消毒劑組合物施用至所述表面。這可作為消毒劑來使用，例如為了防止特定細(xì)菌傳播。它還可作為抑制表面上例如皮膚表面上細(xì)菌感染的方法來使用。優(yōu)選地，表面是哺乳動物，諸如人類的皮膚。特別地，所述表面可以是哺乳動物的鼻腔或人類手上的皮膚。還提供了治療細(xì)菌感染的方法，該方法包括將本發(fā)明組合物施用至感染的表面。本發(fā)明還另一方面提供用于治療細(xì)菌感染的根據(jù)本發(fā)明第一方面的組合物。所述消毒劑組合物可施用至繃帶或創(chuàng)傷敷料。本發(fā)明的還另一方面提供含有至少一種類型的噬菌體的繃帶或創(chuàng)傷敷料，其特征在于當(dāng)與細(xì)菌接觸時在繃帶或創(chuàng)傷敷料上以足夠高的濃度提供所述噬菌體從而誘導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)的外溶菌作用，其中所述噬菌體是所述細(xì)菌的病原體。本發(fā)明的還另一方面提供含有噬菌體K和/或噬菌體P68或其突變體的繃帶或創(chuàng)傷敷料。噬菌體K或P68可單獨(dú)或組合使用。所述創(chuàng)傷敷料可以是襯墊或粘性石膏類型敷料。所述噬菌體和/或使用的濃度優(yōu)選地如在本發(fā)明的前一個方面中所定義的。在施用至創(chuàng)傷敷料或繃帶之前，所述噬菌體可作為消毒劑制劑或局部霜劑應(yīng)用至創(chuàng)傷敷料或繃帶。可選擇地，所述創(chuàng)傷敷料或繃帶可浸泡在含有噬菌體的載體中并且干燥以留下在敷料或繃帶中浸透的噬菌體。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，還可將噬菌體吸附于繃帶或創(chuàng)傷敷料的表面上。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于所述繃帶或創(chuàng)傷敷料允許引入噬菌體從而使其與含有細(xì)菌的傷口接觸。通過將繃帶或創(chuàng)傷敷料施用至患者，還提供了抑制或治療細(xì)菌的方法。在本發(fā)明的組合物中優(yōu)選使用噬菌體K和/或噬菌體P68以及衍生自它們的噬菌體。這些在范圍廣泛的MRSA菌株中誘導(dǎo)外溶菌作用。所述兩種噬菌體是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，噬菌體K可從ATCC(ATCC19685-B1)獲得和/或P68可從Laval大學(xué)的細(xì)菌病毒Felixd'HerelleReferenceCenter(HER49)獲得。還可使用其它噬菌體。對本文討論的噬菌體的專性溶解感染不敏感的金黃色葡萄球菌細(xì)菌在生長培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基中生長至濃度為約2xl08個集落形成單位(cfu)/ml。向在培養(yǎng)基中的懸浮細(xì)菌的不同等分部分中加入不同濃度的噬菌體并在37°C溫孵過夜。測定培養(yǎng)物的濁度。濁度的降低表明細(xì)胞的外溶菌作用。將噬菌體的濃度計算為細(xì)菌細(xì)胞上的噬菌斑形成單位(pfu)，其中已知在該細(xì)菌細(xì)胞上噬菌體感染和誘導(dǎo)內(nèi)溶菌作用以形成噬斑。噬菌體和細(xì)菌細(xì)胞的Pfu的計算是標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？蛇x擇地，提供固體生長培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿。將對本文討論的噬菌體的專性溶解感染不敏感的細(xì)菌與液體低密度瓊脂混合，然后鋪到固體生長培養(yǎng)基上。然后，將噬菌體制備物的不同的稀釋物的等分部分(20μ1)點(diǎn)種到培養(yǎng)皿的表面上。溫孵所述培養(yǎng)皿以使得細(xì)菌生長。對應(yīng)于任何噬菌體稀釋物點(diǎn)種位置的無細(xì)菌生長的區(qū)域表明外溶菌作用。噬菌體誘導(dǎo)內(nèi)溶菌作用的能力可通過多種技術(shù)測定。典型地，提供固體生長培養(yǎng)基(Luria-Bertani培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿。將細(xì)菌與噬菌體和液體低密度瓊脂混合，然后鋪到固體生長培養(yǎng)基上。溫孵所述培養(yǎng)皿以使得細(xì)菌生長。在內(nèi)溶菌作用出現(xiàn)的地方，觀察到細(xì)菌生長中的噬斑。MM表1顯示噬菌體K和噬菌體P68在甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌株(MRSA)的一系列不同菌株內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)溶菌作用(噬斑)的能力。SAI653已經(jīng)被作為標(biāo)準(zhǔn)使用。它是從ATCC(ATCC號碼19685)可以公眾獲得的，并且是金黃色葡萄球菌金黃亞種(StaphylococcusaureussubspaureusRosenbach。剩余的菌株是分離自英國禾口海夕卜醫(yī)院的患者的MRSA菌株。所述表還顯示在更高濃度所述噬菌體可用于在菌株中誘導(dǎo)外溶菌作用，所述菌株包括經(jīng)內(nèi)溶菌作用所述噬菌體不形成噬斑的菌株。通過增加不同細(xì)菌菌株的數(shù)目大大增加含有噬菌體的制劑的效力，因此含有噬菌體的制劑可用于感染。關(guān)于噬菌體K，觀察到在不能誘導(dǎo)噬斑形成的噬菌體上誘導(dǎo)外溶菌作用所需的噬菌體K的最小濃度是噬斑pfu對細(xì)胞為51。鍾謝本趣抵拋■細(xì)賄辨?zhèn)认Σ贰?cè)金黃色葡萄球菌噬菌體K、K*和K*710(來源于最初母體K的自發(fā)宿主范圍突變體)和噬菌體P68可以引起大部分受試的金黃色葡萄球菌菌株的外溶菌作用。為了研究對專性溶解感染(內(nèi)溶菌作用)抵抗的金黃色葡萄球菌突變體是否仍然對外溶菌作用敏感而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分離對噬菌體Κ*710抵抗的金黃色葡萄球菌菌株SAI669(EMRSA-15分離物)的五種獨(dú)立的突變體，同樣分離對噬菌體Ρ68抵抗的另外的五種突變體。對通過噬菌體Κ*710的專性溶解感染抵抗的所分離的全部突變體還表現(xiàn)出對通過噬菌體K和K*的專性溶解感染的抵抗性。對通過Κ/Κ*/Κ*710的專性溶解感染抵抗的突變體對通過噬菌體Ρ68的專性溶解感染敏感，并且反之亦然對通過噬菌體Ρ68的專性溶解感染抵抗的突變體仍然對通過Κ/Κ*/Κ*710的專性溶解感染敏感。測試了每個個體噬菌體-抵抗的突變體對外溶菌作用的敏感性。如下述方法進(jìn)行所述測試通過在Luria培養(yǎng)基瓊脂(1.5%w/v)的平板上的3mlLuria培養(yǎng)基頂層瓊脂(0.7%w/v)中的金黃色葡萄球菌菌株的菌苔上接種，然后在頂層瓊脂上點(diǎn)種20μ1的每個噬菌體的10-倍系列稀釋液(最初濃度5xIO9噬斑形成單位/ml)，隨后在37°C溫孵20小時。在高噬菌體濃度細(xì)菌菌苔中的區(qū)域透明，但是在低噬菌體濃度沒有單個噬斑，用來表明外溶菌作用。全部十個突變體對通過噬菌體K，K*和K*710的外溶菌作用敏感。但是，對Ρ68抵抗的突變體對通過Ρ68的外溶菌作用不敏感。分離了最初十個突變體的每一個的自發(fā)雙重突變株，其目前對Κ*710和Ρ68均是抵抗的。篩選這些雙重突變株對外溶菌作用的敏感性。所有的所述雙重突變株均對通過噬菌體K，K*和Κ*710的外溶菌作用敏感，但是對通過噬菌體Ρ68的外溶菌作用不敏感。從這些結(jié)果可得出下述結(jié)論對通過噬菌體K和衍生自噬菌體K的自發(fā)宿主范圍突變體的專性溶解感染抵抗的金黃色葡萄球菌的突變體仍然對外溶菌作用敏感。因此，在噬菌體治療的上下文中，即使噬菌體K和它的宿主范圍突變體衍生物突變?yōu)閷Ｐ匀芙飧腥揪哂械挚剐裕褂米銐蚋邼舛鹊氖删wK和它的宿主范圍突變體衍生物仍將殺死金黃色葡萄球菌菌株。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求用于對表面消毒的消毒劑組合物，含有載體和至少一種類型的噬菌體，其特征在于當(dāng)細(xì)菌存在于待消毒的表面上時，在所述組合物中以足夠高的濃度提供噬菌體，從而在細(xì)菌中誘導(dǎo)外溶菌作用，其中所述噬菌體是該細(xì)菌的病原體。2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，所述組合物包含噬菌體K和/或P68或其突變體。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述噬菌體的濃度是pfu噬菌體cfu細(xì)菌為至少51。4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的組合物，所述組合物是用于施用于哺乳動物的皮膚的局部施用。5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中所述皮膚是在鼻腔內(nèi)部，或人手上的皮膚。6.根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的組合物，其中所述組合物是霜劑、洗劑、軟膏劑、糊劑、凝膠劑或泡沫劑的形式。7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項的組合物，其中所述載體包括羊毛脂或石蠟。8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的組合物，所述組合物包括兩種或更多種不同的噬菌體。9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的組合物，其中所述噬菌體是選自下述細(xì)菌的病原體葡萄球菌屬、螺桿菌屬、克雷伯氏菌屬、利斯特氏菌屬、分枝桿菌屬、埃希氏菌屬、腦膜炎雙球菌、彎曲桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、梭菌屬、軍團(tuán)菌屬、不動桿菌屬(Acetinobacter)或沙門氏菌屬。10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述噬菌體是金黃色葡萄球菌的病原體。11.用于對表面消毒的消毒劑組合物，含有載體、噬菌體K和/或噬菌體P68或其突變體。12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中當(dāng)細(xì)菌存在于待消毒的表面上時在組合物中以足夠高的濃度提供所述噬菌體從而在細(xì)菌中誘導(dǎo)外溶菌作用，其中所述噬菌體是所述細(xì)菌的病原體。13.根據(jù)權(quán)利要求11的消毒劑制劑，其中所述噬菌體的濃度低于51的pfu噬菌體cfu細(xì)菌。14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項的組合物，所述組合物用于局部施用于哺乳動物的皮膚。15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中所述皮膚是在鼻腔內(nèi)部，或人類手上的皮膚。16.根據(jù)權(quán)利要求14-15中任一項的組合物，其中所述組合物是霜劑、洗劑、軟膏劑、糊劑、凝膠劑或泡沫劑的形式。17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任一項的組合物，其中所述載體包括羊毛脂或石蠟。18.在表面上殺死細(xì)菌的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的消毒劑組合物施用至所述表面。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述表面是哺乳動物的皮膚。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述表面是哺乳動物的鼻腔。21.治療細(xì)菌感染的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的組合物施用至所述感染的表面。22.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的組合物，用于治療細(xì)菌感染。23.含有至少一種類型的噬菌體的繃帶或創(chuàng)傷敷料，其特征在于，當(dāng)與細(xì)菌接觸時在繃帶或創(chuàng)傷敷料上以足夠高的濃度提供所述噬菌體從而在細(xì)菌中誘導(dǎo)外溶菌作用，其中所述噬菌體是所述細(xì)菌的病原體。24.根據(jù)權(quán)利要求23的繃帶或創(chuàng)傷敷料，所述繃帶或創(chuàng)傷敷料包含噬菌體K和/或噬菌體P68。全文摘要本發(fā)明涉及抗菌組合物，其含有足夠高的濃度的噬菌體，以在細(xì)菌中誘導(dǎo)外溶菌作用。公開了所述組合物的用途。特別優(yōu)選噬菌體K和/或P68。文檔編號A61K35/76GK101835384SQ200880110119公開日2010年9月15日申請日期2008年10月3日優(yōu)先權(quán)日2007年10月4日發(fā)明者賈瑩申請人:諾沃萊蒂克斯有限公司