專利名稱：激發(fā)一種對(duì)抗鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種的免疫反應(yīng)的合成物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明普遍關(guān)于刺激免疫反應(yīng)，更特別是關(guān)于適合刺激對(duì)抗鳥分枝桿菌副結(jié)核亞 種的預(yù)防性和/或治療上的免疫反應(yīng)的合成物和方法。
背景技術(shù)：
鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)是約尼氏病(JD)的致病原，可在反芻動(dòng)物中引致慢 性肉芽腫腸炎。臨床癥狀明顯的動(dòng)物會(huì)發(fā)展出慢性腹瀉和漸進(jìn)的體重下降，最后引致死亡， 而臨床癥狀不明顯的動(dòng)物主要會(huì)降低產(chǎn)奶量。JD對(duì)環(huán)球奶類工業(yè)有驚人的經(jīng)濟(jì)重要性，估 計(jì)有20%的美國奶類動(dòng)物受減低產(chǎn)量和過早淘汰影響而引起每年2. 2億的損失(Wells， et al. 2000. J. Am. Vet. Med. Assoc. 216 1450-1457)。牛在生命中的首六個(gè)月是最易受這種 致病原的感染，但這種疾病通常直到3到5歲時(shí)才會(huì)變成明顯的。感染的發(fā)生是因?yàn)檫M(jìn)食 了受污染的糞便，初乳，或從受感染的牛的奶(Sweeney, 1996. Vet. Clin. N. Am. Food Anim. Pract. 12 :305-312)。尤其是在疾病晚期的懷孕牛只中，胎兒亦會(huì)受到感染(Sweeney， etal. 1992. Am. J. Vet. Res. 53 =477-480) 0此外，因?yàn)檫@種疾病是人類克隆氏癥的病原，所 以 MAP 的重要性亦顯著提高(Chamberlin，et al. AlimentPharmacol Ther 2001 ；15(3) 337-46 ；Naser SA, et al. . Mol Cell Probe 2002 ；16(1) 41-8).現(xiàn)時(shí)被批準(zhǔn)適合于現(xiàn)場使用的JD疫苗是一種已死的MAP品種的油性懸浮，但其有 著明顯的限制。首先，這種疫苗的效能是令人懷疑的，因?yàn)樵诓煌慕臃N試驗(yàn)中得出不同的 結(jié)果。另一種憂慮是全菌疫苗與診斷上的測試有干擾，因?yàn)橐呀臃N的動(dòng)物會(huì)對(duì)結(jié)核病和副 結(jié)核病皆有假陽性反應(yīng)。如此，對(duì)改良疫苗的需求有上升趨勢(shì)，但它們需要是有效的而同時(shí) 不會(huì)干擾結(jié)核病和JD的診斷。為達(dá)成這目標(biāo)，有幾個(gè)途徑已經(jīng)嘗試過，包括重組疫苗，DNA 疫苗和亞單位疫苗 13 ；ShinSJ, et al. Infect Immun 2005 ；73 (8) :5074_85)。然而，發(fā)展改 良MAP疫苗的需求是繼續(xù)不斷的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物內(nèi)激發(fā)對(duì)抗MAP的免疫反應(yīng)的合成物和方法。所 述合成物包括一種新的79kDa重組多肽，在此稱為"Map74F"。Map74F是由聯(lián)結(jié)一個(gè) Map3527蛋白的 17.6-kDa C-末端片段至一個(gè)Mapl519蛋白片段，接著在C末端再聯(lián)結(jié)一個(gè)Map3527蛋白的14. 6-kDa N-末端部分所產(chǎn)生的。在Map74F之外，本發(fā)明的所述合成物亦可以包括其它MAP蛋白，例如MAP蛋白 85A, 85B, 85C, 35kDa, SOD, MptC, MptD 和類 ESAT-6 蛋白，和其組合。所述方法包括對(duì)一哺乳類動(dòng)物施予一有效份量，可激發(fā)對(duì)抗MAP細(xì)菌的免疫反應(yīng) 的合成物。所述方法是預(yù)期對(duì)任何容易受MAP感染的哺乳類動(dòng)物有益的，尤其是對(duì)反芻動(dòng) 物有益。所述合成物可以與標(biāo)準(zhǔn)藥物載體一同制備，并可以經(jīng)任何一種不同的傳統(tǒng)途徑施 予。所述合成物可以在任何時(shí)候施予容易受MAP感染或已受MAP感染的動(dòng)物。然而，最優(yōu) 選是在受MAP感染之前施予所述合成物，例如經(jīng)施予所述合成物的懷孕動(dòng)物，可以經(jīng)其初 乳傳送可預(yù)防疾病的免疫成分給其嬰兒，或在出生后一至五周時(shí)施予所述合成物。


圖IA提供一個(gè)建構(gòu)Map74F的圖解。Map74F的產(chǎn)生是從其N到C末端序貫連合 ORFs編碼一個(gè)Map 3527蛋白的C末端至一個(gè)ORF編碼Map 1519蛋白的氨基酸1-460，并 以一個(gè)ORF編碼Map 3527的一個(gè)N-末端片段的ORF作終結(jié)。所述ORF編碼Map74F是由 2397個(gè)核苷酸(nt)組成和編碼一個(gè)有預(yù)計(jì)分子量大約是79kDa的799個(gè)氨基酸的多肽。圖IB提供一個(gè)從以編碼Map74F的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(BL21/pLysE)所 得的大腸桿菌溶解產(chǎn)物的考馬斯亮藍(lán)染色10% SDS-PAGE的照片表達(dá)。培育所述桿菌并以 ImM IPTG誘導(dǎo)。線道顯示IPTG誘導(dǎo)前的溶解產(chǎn)物(UI行)或IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)后的溶解產(chǎn) 物(I行)。純化的重組Map74F在P行顯示與分子量標(biāo)記(M行)并行。圖2A-2D提供從加強(qiáng)免疫接種3周后犧牲的老鼠所得的數(shù)據(jù)的圖解。將施予了 Map74F+單磷酰脂A(MPL)和只有MPL的老鼠脾細(xì)胞在10 μ g/ml的Map74F，ConA和培養(yǎng) 基中受刺激兩日。圖2A所顯示的數(shù)據(jù)是培養(yǎng)物上清液以ELISA化驗(yàn)IFN-γ水平。圖2B 所顯示的數(shù)據(jù)是以ELIspot試驗(yàn)，確定在已免疫的和在控制組的老鼠在受到和沒有受到抗 原刺激的單細(xì)胞脾懸浮液內(nèi)的IFN-Y表達(dá)細(xì)胞的相關(guān)數(shù)目。圖2C顯示，為從已接種的 (Map74F+MPL)和控制組的動(dòng)物(MPL，ConA-MPL)受重組和控制組抗原刺激后的淋巴球增生 子集特定群的脾細(xì)胞以FACS分析所得的數(shù)據(jù)。圖2D顯示對(duì)用家務(wù)基因GAPDH正常化的 Map74F做出細(xì)胞因子信使核糖核酸表達(dá)的數(shù)據(jù)。三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)是有代表性的。圖3A和3B顯示從已接種的和控制組的動(dòng)物在不同時(shí)間點(diǎn)(接種前/初步接種 (PV)，加強(qiáng)接種(B)，刺激前(BC)，刺激后4，8，12和16周)所得的血清對(duì)抗體的反應(yīng)的 數(shù)據(jù)。圖3A顯示的數(shù)據(jù)是從血清檢驗(yàn)Map74F特異抗體所得。圖3B顯示以ELISA檢驗(yàn) IgGl IgG2比例的數(shù)據(jù)。三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)是有代表性的。圖4A和4B提供接種Map74F+MPL后，在脾(圖4A)，肝(圖4B)和腸系膜淋巴結(jié) (MLN)(圖4C)所表達(dá)的保護(hù)性免疫力數(shù)據(jù)的圖標(biāo)。Map74F明顯地減低脾內(nèi)(在刺激后8_16 周)，肝(在刺激后12-16周)和MLN (在刺激后8-16周)的MAP負(fù)擔(dān)。三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù) 據(jù)是有代表性的。圖5A-5D提供已接種的和沒有接種的老鼠組織的組織病理學(xué)檢查的照片圖標(biāo)。圖 5A是代表從沒有接種的控制組老鼠的肝。為數(shù)眾多的大型肉芽腫隨意地散布在肝內(nèi)。蘇 木精和伊紅染色法。壓力是lOOum。內(nèi)圖更高放大倍數(shù)的肉芽腫，顯示很多的抗酸桿菌。齊尼氏染色。圖5B是代表已接種Map74F的老鼠的肝。顯示了只有稀疏的小型淋巴集合伴 隨著很少的巨噬細(xì)胞。圖5C是一只沒有接種的控制組老鼠的脾，在白髓中顯示偶然的肉芽 腫。圖5D是代表已接種Map74F的老鼠的脾。白髓和紅髓都沒有肉芽腫。蘇木精和伊紅染 色法。壓力是lOOnm。內(nèi)圖更高放大倍數(shù)的肉芽腫，顯示沒有抗酸桿菌。齊尼氏染色。圖6A-6C提供從對(duì)于重組抗原(85A，85B, Map74F和SOD)，Con A和PPD已免疫的 (群組I和II)和控制組(群組III)的動(dòng)物所得的周圍血液單核細(xì)胞(PBMC)的淋巴組織 增生反應(yīng)的數(shù)據(jù)的圖標(biāo)。結(jié)果表達(dá)為刺激指數(shù)(Si)，而誤差棒表示從平均數(shù)所得的標(biāo)準(zhǔn)差。圖7A-7C提供從已免疫的(群組I和II)和控制組(群組III)的動(dòng)物的PBMC抗 原特異IFN-γ反應(yīng)的數(shù)據(jù)圖標(biāo)。結(jié)果表達(dá)為OD值，而誤差棒表示從平均數(shù)所得的標(biāo)準(zhǔn)差。圖8A-8F提供在重組和控制組抗原刺激后的特定時(shí)間內(nèi)，由已免疫的群組(I和 II)和控制組群組(III)所得的PBMC內(nèi)所收集的淋巴球增生子集作流式細(xì)胞計(jì)分析的數(shù)據(jù) 的圖標(biāo)。結(jié)果表達(dá)為與沒有誘導(dǎo)樣本(以培養(yǎng)基培養(yǎng))比較的正染色細(xì)胞百分比。誤差棒 表示從平均數(shù)所得的標(biāo)準(zhǔn)差。圖9A和9B提供對(duì)在已免疫群組(I和II)和控制群組(III)內(nèi)的重組抗原作出 反應(yīng)的細(xì)胞因子基因信使核糖核酸的表達(dá)。結(jié)果表達(dá)為平均數(shù)以倍數(shù)增大超越?jīng)]有受刺激 的PBMC(作為校準(zhǔn))。誤差棒表示從平均數(shù)所得的標(biāo)準(zhǔn)差。圖10顯示在已接種群組I和II的動(dòng)物和控制組III的動(dòng)物對(duì)個(gè)別重組抗原的抗 體反應(yīng)。誤差棒表示從平均數(shù)所得的標(biāo)準(zhǔn)差。圖11提供一個(gè)在尸體解剖中收集得來的不同組織所量度到的MAP培養(yǎng)物結(jié)果 (CFU)的表格式概要。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了在一動(dòng)物中激發(fā)對(duì)抗MAP的免疫反應(yīng)的合成物和方法。所述合成物 包括一重組多肽在此稱為Map74F。編碼Map74F的開放讀碼區(qū)(ORF)的長度為2397個(gè)核苷 酸和編碼成一個(gè)799個(gè)氨基酸的多肽。Map74F蛋白序列在SEQ IDNO 1內(nèi)提供。根據(jù)其氨基 酸合成物計(jì)算Map74F的分子量為79kDa，盡管其表面上的分子量是大約74kDa如SDS-PAGE 分析所估計(jì)。在此顯示的SEQ ID NO :1所提供的序列沒有一個(gè)可選擇的提純標(biāo)簽，例如一 個(gè)組胺酸標(biāo)簽。Map74F是以連結(jié)N-末端至C-末端的方式，將一個(gè)Map3527蛋白的約17. 6_kDa 的C-末端片段，一個(gè)Map 1519蛋白的46. 8kDa片段，和一個(gè)Map3527蛋白約14. 6-kDa的 N-末端片段來建構(gòu)而成的。圖1顯示了 Map74F的圖解。Map 3527和Map 1519的完整氨基酸序列分別在SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3提 供。所述呈現(xiàn)在Map74F內(nèi)的Map 3527蛋白的17. 6-kDa C-末端片段是由SeqID 2的氨基 酸183-361所代表。所述呈現(xiàn)在Map74F內(nèi)的Map 1519的46. 8kDa片段是由Seq ID No: 3的氨基酸1-460所代表。所述呈現(xiàn)在Map74F內(nèi)的Map3527的14. 6-kDa N-末端片段是 由Seq ID :2的氨基酸33-180所代表。預(yù)計(jì)中，較長的Map 1519片段和Map 3527的N-和 C-末端可以包括在一對(duì)本發(fā)明所述的方法有用的重組蛋白。除Map 74F之外，本發(fā)明的合成物亦可包含其它可以激發(fā)對(duì)抗MAP細(xì)菌的免疫反 應(yīng)的藥劑(agent)。例如，所述合成物可以包含一個(gè)或多個(gè)其它MAP蛋白，如MAP蛋白85A，
585B，85C，35kDa，過氧化物岐化酶(SOD)，MptC, MptD和類ESAT-6蛋白，和以上組合。這些蛋 白在美國專利申請(qǐng)?zhí)?1/816，365有描述過，而所述適合于激發(fā)對(duì)抗MAP的免疫反應(yīng)的合成 物之中的蛋白，其編碼脫氧核糖核酸序列，和使用所述蛋白及其編碼脫氧核糖核酸序列在 此全部引入作參考。在一實(shí)施例中，所述合成物包括MAP74F和一個(gè)或多個(gè)MAP蛋白85A，85B或SOD。 編碼MAP 8 5A基因的脫氧核糖核酸序列和8 5A基因的氨基酸序列在GenBankac c e s s i on no. AF280067提供(于2003年10月10日登錄)。編碼MAP 85B基因的脫氧核糖核酸序 列和85A基因的氨基酸序列在GenBank accession no. AF219121提供(于2002年11月 21日登錄)。編碼MAP 85C基因的脫氧核糖核酸序列和85C基因的氨基酸序列在GenBank accession no. AF280068提供(于2002年11月21日登錄)。編碼MAP SOD基因的脫氧核 糖核酸序列和SOD基因的氨基酸序列在GenBank accession no. AF 180816提供(于2001 年11月30日登錄)。本發(fā)明所述方法包括對(duì)一哺乳類動(dòng)物施用一包含Map74F的合成物，其有效份量 可激發(fā)對(duì)抗MAP細(xì)菌的免疫反應(yīng)。激發(fā)后的免疫反應(yīng)可包含免疫系統(tǒng)的任何組成部分，包 括但不限于產(chǎn)生對(duì)MAP抗原有反應(yīng)的抗體，刺激淋巴球增生，產(chǎn)生與Thl有關(guān)的細(xì)胞因子如 IFN-γ，和前述的組合。Map74F可以載體方式施予一動(dòng)物。例如，編碼Map 74F的核酸序列可以克隆進(jìn)入 細(xì)菌的基因組(如沙門氏菌屬)或一病毒中(如?？瓢捳畈《疽恍?BHV-I))，而完成的重 組細(xì)菌或病毒可以施用于動(dòng)物。如此，本發(fā)明亦包括表達(dá)Map74F的細(xì)菌和病毒載體。本發(fā) 明范圍亦預(yù)期包含脫氧核糖核酸疫苗的方法，其中編碼Map74F的核酸分子，不論是單獨(dú)的 或與一佐藥結(jié)合的或促進(jìn)轉(zhuǎn)染的媒介，都可以直接施用于動(dòng)物。所述方法對(duì)任何易于受MAP感染的動(dòng)物有益。所述合成物和方法尤其適合于預(yù)防 或治療反芻動(dòng)物的MAP感染，包括但不限于牛，綿羊，山羊，鹿和麇鹿，羚羊，和水牛。在一實(shí) 施例中，所述方法可以用于預(yù)防或治療約尼氏病。所述合成物可以施予任何感染了或沒有感染MAP的動(dòng)物。依照本發(fā)明所述方法 將所述合成物施予受感染的動(dòng)物被認(rèn)為可刺激治療上的免疫反應(yīng)。然而，本發(fā)明亦包括在 受到MAP感染之前施用所述合成物以刺激預(yù)防疾病反應(yīng)。例如，所述合成物可以施予一懷 孕的動(dòng)物，然后可將預(yù)防疾病的免疫成份經(jīng)初乳或授乳期的奶水傳送到其沒受感染的嬰兒 中。所述合成物亦可選擇地在出生后一到五周時(shí)施予，以提供一種防止MAP感染或減低感 染后疾病嚴(yán)重性的預(yù)防疾病作用。如此，在一實(shí)施例中，本發(fā)明所述方法是預(yù)防MAP感染， 而在另一實(shí)施例中，所述方法是治療MAP感染。所述合成物可以與標(biāo)準(zhǔn)藥物載體制備，和可以經(jīng)眾多傳統(tǒng)途徑中的任何一個(gè)途徑 施予。Remington' s Pharmaceutical Sciences (18th Edition, A. R. Gennaroet al. Eds., MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1990)公開了一些可與蛋白使用的可接受藥物載體。本發(fā)明所述方法所使用的合成物亦可以包含佐藥。任何傳統(tǒng)佐藥也可使用。在一實(shí)施例中，所述佐藥可以是單磷酰脂A (MPL)，其可以與合成海藻糖二霉菌酸 脂聯(lián)合提供。在另一實(shí)施例中，所述佐藥可以是二甲溴化銨(DDA)。本發(fā)明所述合成物可以任何可接受的途徑施予。合適的施予途徑包括口服，經(jīng)粘 膜和非腸道的(如血管內(nèi)，肌肉內(nèi)，和皮下注射)。所述合成物可以在任何時(shí)候施予容易受
6MAP感染的動(dòng)物或已受MAP感染的動(dòng)物。為達(dá)至預(yù)期的效果，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，施予至一個(gè)別動(dòng)物的 MAP74F份量和任何其它在合成物內(nèi)的抗原藥劑是基于一些因數(shù)來調(diào)較的，例如給藥途徑， 和動(dòng)物的大小，動(dòng)物體格狀況，和在動(dòng)物內(nèi)MAP狀況。所述合成物可以用于一次性給藥或一 系列的給藥以加強(qiáng)所述免疫反應(yīng)。普遍來說，可施予的總劑量是在10-200yg蛋白之間。以下例子描述本發(fā)明不同的實(shí)施例。這些例子是用于說明而不是限制本發(fā)明的。例子 1本例子提供Map 74F的克隆，表達(dá)和純化的描述。產(chǎn)生一編碼Map74F的串聯(lián)連接ORF。Map74F是以序貫連接串聯(lián)Map3527約17. 6_kDa的C-末端片段的ORFs至編碼Map 1519蛋白的一段分子量為46. 8kDa的0RF，接著是在Map74F的C末端連接約14. 6-kDa的 Map3527的N-末端部分。產(chǎn)生沒有終止密碼子的Map3527c構(gòu)體。Map 3527C-末端部分(Map3527c)的5，和3，寡核苷酸的設(shè)計(jì)如下5，(TACATATG CAT CAT CAT CAT CAT CAT CTC AAC CAG AGC GTC TCG GC 3，(SEQ ID NO 4))禾口(5，TA GAATTC GGC CGG CGG CCC CTC CGC C 3，(SEQID NO :5))。所述 5，寡核苷酸包含一個(gè)在 ATG 起始密碼子之前的一個(gè)NdeI限制部位，接著是編碼六個(gè)組胺酸殘基的核苷酸序列(斜體)。 所述3’寡核苷酸包含一個(gè)EcoRI限制性內(nèi)切位點(diǎn)。這些寡核苷酸使用作擴(kuò)增Map3527c， Map 3527的羧基540-nt部份(14. 6kDa，180氨基酸殘基)和將PCR擴(kuò)增結(jié)果連接至一 PCR2. ITopo載體。備有正確插入片段的質(zhì)粒脫氧核糖核酸以NdeI和EcoRI消化，和連接入 以相同酶切割的pET17b表達(dá)載體。所述連接后的結(jié)果轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5 α細(xì)胞和以 消化限制性內(nèi)切酶和DNA測序鑒定備有正確插入片段(Map 3527c)的一個(gè)轉(zhuǎn)化株。PCR擴(kuò)增Mapl519全長編碼序列和連接進(jìn)Map3527c_pET質(zhì)粒。Mapl519 的 5，禾口 3，寡核苷酸包含以下序列5，(5，-CTA ATC GAATTC ATG TTCTAT GGG GCC TTT C-3'SEQ ID NO 6))禾口3，(5，-TA ATC GATATC CAG GAC CTT GGACTT GTC-3'SEQ ID N0:7))。所述5’寡核苷酸包含一個(gè)EcoRI限制性內(nèi)切位點(diǎn)。所述3’寡核苷酸有一 個(gè)EcoRV限制性內(nèi)切位點(diǎn)，然后是包含六個(gè)C-末端氨基酸殘基而沒有一個(gè)停止密碼子 的序列。所述Mapl519編碼序列的擴(kuò)增(1380bp ；—個(gè)460_aa伸延成一個(gè)預(yù)計(jì)大小有 46. SkDa)和所得出的PCR-擴(kuò)增結(jié)果是連結(jié)至以相同酶切割的PCR2. ITopo載體。有正確插 入片段的克隆以EcoRl和EcoRV消化，并連結(jié)至以EcoRl/EcoRV預(yù)先消化的Map3527c_pET 質(zhì)粒。連結(jié)后的結(jié)果然后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5 α細(xì)胞，而一個(gè)備有正確插入片段的轉(zhuǎn)化株 (Map3527c-Mapl519)以限制性內(nèi)切酶消化來識(shí)別，并以DNA序列確認(rèn)。將Map3527 N-末端片段克隆進(jìn)入Map3527C_Mapl519構(gòu)體。Map 3527N-末端片段的5，和3，寡核苷酸的設(shè)計(jì)如下5，(5，-AT GATATC GGGCTG GCG CCG GCG TCC-3'SEQ ID NO :8))禾口3，(5，-AT CTCGAG TCA CGC GAC CTTGCC GGC-3'SEQ ID NO :9))。所述5’寡核苷酸包含一個(gè)EcoRV限制性內(nèi)切位點(diǎn)。所述3’寡核苷酸包含一個(gè) XhoI限制性內(nèi)切位點(diǎn)。它們?cè)O(shè)計(jì)成擴(kuò)增Map3527的N-末端的447_bp (149-氨基酸殘基) 部份。所得出的PCR-擴(kuò)增結(jié)果以EcoRV和XhoI消化，并連接進(jìn)以EcoRV和XhoI消化的 Map3527C-Mapl519融合pET質(zhì)粒。所述已連接的混合物用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α細(xì)胞，而所述正克隆以限制性內(nèi)切酶消化來識(shí)別并以DNA序列確認(rèn)。最后的構(gòu)體，其編碼一個(gè)74-kDa 的多蛋白(Map74F)，包含一個(gè)以線性順序排列的單一的ORF，Map3527C_Mapl519_Map3527N
ο Map74F重組蛋白的表達(dá)與純化質(zhì)粒DNA構(gòu)體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3pLysE)細(xì)胞內(nèi)。將所述已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 細(xì)胞接種在有氨芐青霉素(100yg/mL)補(bǔ)充的LB瓊膠上。再將一個(gè)單一菌落接種入IOml 備有氨芐青霉素(100yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，在37°C下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)過夜。將所述培養(yǎng)物與 包含氨芐青霉素(100yg/mL)和氯霉素(34yg/m)的LB液體培養(yǎng)基中稀釋為1 100，并 在37°C下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)。經(jīng)過三小時(shí)的ImM IPTG(Invitrogen Co.，Carlsbad, CA)誘導(dǎo)后，以 離心機(jī)(5000Xg)收集細(xì)胞并在磷酸鹽緩沖鹽水中清洗一次。在緩沖液A(50mM TrisHCl, ImM EDTA, 50mM NaCl, ρΗ8. 0)中懸浮細(xì)胞，并在一個(gè)弗氏細(xì)胞壓碎器或細(xì)胞分裂器中將細(xì) 胞裂解。在轉(zhuǎn)低包含體后，將重新懸浮的顆粒以包含體清洗緩沖液(緩沖液A+1% Triton X-100)清洗三次和以 CHAPS(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)緩沖液(1 % CHAPS 在 IOmM Tris-HCl中，pH8. 0)清洗兩次以去除脂多糖(LPS)。將包含體溶于緩沖液B (IOOmM磷酸 鈉，IOmM Tris-HCl，8M 尿素，2mMPMSF (Sigma)和 20 μ g/ml 的亮抑酶肽(Sigma), ρΗ8· 0)并 以Ni-NTA瓊脂糖柱(Invitrogen)純化。洗脫后的部份以SDS-PAGE檢查，而將包含所述 重組蛋白的部份合并并以IOmM Tris-HCl (ρΗ7. 8)在4°C下透析過夜兩次。所述蛋白通過 Detoxi-GelTM內(nèi)毒素清除凝膠(Pierce，Rockford, IL)，所述純化后的蛋白以鱟變形細(xì)胞 溶解試驗(yàn)檢查內(nèi)毒素水平。所述已純化的蛋白有微不足道的內(nèi)毒素水平(10pg/ml)。Map74F的圖表顯示出用以建構(gòu)圖1所示的多蛋白的組織和限制性內(nèi)切位點(diǎn)。所 述Map74F的ORF長度是2397nt，編碼一個(gè)有預(yù)計(jì)分子量約為79kDa的799氨基酸多肽(圖 1B)。所述ORF的設(shè)計(jì)和建構(gòu)導(dǎo)入了兩個(gè)六個(gè)核苷酸的鉸鏈序例(EcoRI和EcoRV)，在三者 連接的每個(gè)交匯點(diǎn)編碼兩個(gè)氨基酸。此外，所述ORF是設(shè)計(jì)為在N-末端備有六個(gè)組胺酸殘 基以供使用Ni-NTA基質(zhì)純化用。在大腸桿菌表達(dá)后，所述重組蛋白從包含體中純化出來， 并以SDS-PAGE(圖1B)分析，其產(chǎn)量范圍大約是每一公升的誘導(dǎo)培養(yǎng)物有大約1. 5-2. Omg 的純化蛋白。例子2本例子示范使用Map74F以激發(fā)在一老鼠模型內(nèi)對(duì)抗MAP的免疫反應(yīng)老鼠是研究MAP感染的合適模型。老鼠接受MAP挑戰(zhàn)后，細(xì)菌載量和具體器官病 理是感染情況的良好指示。老鼠的肝，脾和腸系膜淋巴結(jié)是適合于評(píng)估MAP挑戰(zhàn)后細(xì)菌負(fù) 擔(dān)的器官。在本例子中，評(píng)估這些器官內(nèi)的MAP負(fù)擔(dān)來估計(jì)Map挑戰(zhàn)后，Map74F的保護(hù)效 能。從以下結(jié)果可證實(shí)接受Map74F免疫接種的動(dòng)物能夠在為期十六周的感染過程，可殺死 或限制MAP的增殖。在脾，肝和MLN，CFU數(shù)目在挑戰(zhàn)后八周下降，暗示MAP的消滅。除了 細(xì)菌負(fù)擔(dān)外，肉芽腫數(shù)目的減少和在已接種的動(dòng)物的肝和脾中發(fā)現(xiàn)很少抗酸生物都表示所 述多蛋白的保護(hù)效能。器官內(nèi)實(shí)質(zhì)上減少的MAP載量與肝和脾的病理改善表示74F的免疫 作用快速降低或消滅MAP載量，保護(hù)老鼠對(duì)抗MAP感染。Map74F亦誘發(fā)高水平的IFN- γ。 Map74F誘導(dǎo)一個(gè)良好的Thl反應(yīng)。本例子使用以下物料和方法。動(dòng)物
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本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用6-8周大的雌性C57/BL6老鼠進(jìn)行(Harlan Sprague， Indianapolis, Indiana)。將動(dòng)物保持在一個(gè)生物安全水平II的設(shè)備中，任意喂食和喂水。 所有實(shí)驗(yàn)工作在符合動(dòng)物福利法案，人道對(duì)待及使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物在測試，研究和訓(xùn)練的公 共衛(wèi)生服務(wù)政策，NIH照顧及使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的指引，和紐約州公共衛(wèi)生部門的規(guī)定，政策 和原則下進(jìn)行。細(xì)菌品種從已感染MAP的牛只分離出MAP，將之標(biāo)簽為MAP 66115-98，用以挑戰(zhàn)老鼠和分 離染色體組DNA。MAP 66115-98在有10%油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶(Becton， Dickinson and Co, Sparks,MD)和分支桿菌生長素 J(AlliedMonitor，Inc，F(xiàn)ayette，M0)補(bǔ) 充的7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)6-8周后，用離心機(jī)以10，000X g將細(xì)胞收集，并以磷酸鹽緩 沖鹽水清洗兩次(磷酸鹽緩沖鹽水；PH 7. 2)。所述細(xì)胞在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋至所需濃 度并用于挑戰(zhàn)老鼠。老鼠的免疫接種將老鼠分成兩組，每組36只動(dòng)物。群組I動(dòng)物是已接受免疫接種兩次，兩次接種相 距三周，每次接種 50μ g/動(dòng)物以 MPL+TDM乳劑(Ribi adjuvant system, Corixa, Hamilton, MT)制備的融合蛋白，總?cè)萘繛槊縿?00μ 1，在背部經(jīng)皮下注射。群組II動(dòng)物保持為沒有 接受接種的控制組，只給予MPL+TDM乳劑。在第二次接種三周后，將12只指定作免疫原性 研究的動(dòng)物殺死并將其脾細(xì)胞以常規(guī)步驟收集。將脾細(xì)胞以包含10% FBS(Gibco)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，GrandIsland，NY)在37°C，5% C02下培養(yǎng)。用相同劑量和計(jì)劃將免疫 接種實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。以MAP挑戰(zhàn)老鼠在第二次接種三周后，將群組I和II每組24只動(dòng)物以腹膜內(nèi)注射IO9CFU單位的 鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種作挑戰(zhàn)。在挑戰(zhàn)后4，8，12和16周后，將兩組每組六只動(dòng)物殺死， 收集脾，肝和腸系膜淋巴結(jié)(MLN)并將之分成兩部分。將一部分的組織在磷酸鹽緩沖鹽水 (100mg/ml)打勻，而100 μ 1的個(gè)別組織勻漿接種在包含分支桿菌生長素J的Herald’ s egg yoke (HEY) MM (Becton, Dickinson and Co, Sparks, MD) ±,以{gi古胃ifi。 _ 種8-12周后，以菌落數(shù)目檢查所述斜面上的細(xì)菌生長。另一部分的組織用于組織病理學(xué)檢 查。組織病理學(xué)檢查將用作組織病理學(xué)檢查的脾，肝和MLN部分浸入10 %中性緩沖甲醛溶液中固定， 包埋在石蠟中，切片成4μπι，用蘇木素，曙紅和齊尼氏抗酸性染色劑以常規(guī)組織學(xué)方法染 色，然后以光學(xué)顯微鏡檢查?？贵w反應(yīng)的ELISA以常規(guī)ELISA方法量度抗原特異的IgG反應(yīng)。將ELISA板塊(Nunc-immunomodule， Nunc, Roskilde, Denmark)以200ng/反應(yīng)孔的重組蛋白覆蓋，并在4°C下培養(yǎng)過夜。用 PBST (在磷酸鹽緩沖鹽水中0.05% Tween 20)清洗一次后，加入300 μ 1的封閉緩沖液 (PBST加入BSA)并在25°C下培養(yǎng)1小時(shí)。將所述板塊以PBST清洗三次，然后在反應(yīng) 孔上加入100 μ 1已稀釋的血清樣本并在37°C下培養(yǎng)一小時(shí)。為測量總IgG反應(yīng)，在清洗 后在反應(yīng)孔中加入50ng與堿性磷酸酶綴合的羊抗小鼠IgG(KPL，Gaithersburg, MD)，并在25°C下培養(yǎng)30分鐘。清洗后，加入50μ 1的BluePhos底物(KPL)，并培養(yǎng)10分鐘。加入 50 μ 1 的停止溶液(KPL)后，將板塊放在一個(gè) ELx 808Ultra microplatereader (Bio-Tek Instruments, Inc，Winooski, VT)中，在630nm下解讀。為測量同位素反應(yīng)，清洗后在反應(yīng) 孔中加入25ng與生物素綴合的羊抗小鼠IgGl或IgG2a(Southern Biotech, Birmingham, AL)，并在25°C下培養(yǎng)30分鐘。清洗后，加入0.2yg/ml以山葵過氧化物酶(KPL)標(biāo)簽的抗 生蛋白鏈菌素，并在25°C下培養(yǎng)30分鐘。清洗后，在反應(yīng)孔中加入50 μ 1的3，3’，5，5’-四 甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB)并培養(yǎng)15分鐘。加入50 μ 1 IN的H2SO4為停止溶液后，將板塊放 ^hELx 808Ultra microplate reader (Bio-Tek Instruments) ^^ 450nm T 解讀。IFN-Y 試驗(yàn)在5X IO5細(xì)胞/反應(yīng)孔中將以常規(guī)步驟所得的脾細(xì)胞接種一式兩份，并在有所述 重組抗原和沒有所述重組抗原下培養(yǎng)48小時(shí)。收集培養(yǎng)物的上清液并使用固相夾心ELISA 工具套件(Biosource，Camari llo, CA)，依照廠家提供的計(jì)劃方法分析IFN- γ。簡單地說， 將50μ 1的培養(yǎng)物上清液加入已經(jīng)用小鼠IFN-Y特異的單克隆抗體覆蓋的反應(yīng)孔中。與 生物素化的多克隆抗體在室溫下共同培養(yǎng)兩小時(shí)后，將所述反應(yīng)孔清洗并加入抗生蛋白鏈 菌素-過氧化物酶。培養(yǎng)30分鐘和清洗后，將四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB)溶液加入反應(yīng)孔 中，而結(jié)果以 ELx 808Ultra microplate reader (Bio-Tek Instruments)在 450nm 下角軍讀。ELIspot 分析依照廠家的指弓丨，使用ELIspot工具套件(KPL)測定在脾單細(xì)胞懸液內(nèi)表達(dá) IFN-Y細(xì)胞的相關(guān)數(shù)目。簡單地說，將10μ g/ml的IFN-γ捕獲抗體(BDBioscience，San Jose, CA)在 4°C下覆蓋進(jìn) MultiScreen 96-反應(yīng)孔過濾板塊(Milipore，Bedford, ΜΑ)過 夜。用Ix清洗溶液清洗后，用Ix BSA溶液在25°C下封閉板塊一小時(shí)并再次清洗。在5X105 細(xì)胞/反應(yīng)孔中接種一式兩份的脾細(xì)胞，并在37°C下將細(xì)胞與所述重組抗原和沒有所述重 組抗原的情況下培養(yǎng)48小時(shí)。所述板塊以Ix清洗溶液清洗，并在25°C下和5 μ g/ml與生 物素綴合的小鼠抗小鼠IFN-Y 二次抗體(BD Bioscience)培養(yǎng)一小時(shí)。清洗所述板塊，并 與0. 2 μ g/ml的HRP-抗生蛋白鏈菌素在25°C下培養(yǎng)30分鐘。以TureBlue底物將過濾器 顯影15分鐘，在黑暗處干燥并計(jì)算班點(diǎn)數(shù)目。細(xì)胞表面標(biāo)記的FACS分析將一式兩份IxlO6細(xì)胞/反應(yīng)孔的脾細(xì)胞接種于96-反應(yīng)孔的組織培養(yǎng)碟，并培 養(yǎng)24小時(shí)。將用74F激發(fā)的脾細(xì)胞和有伴刀豆球蛋白A的合適沒有激發(fā)的控制組細(xì)胞進(jìn) 行FACS分析。將所述細(xì)胞用FACS緩沖液(在磷酸鹽緩沖鹽水中有1 % BSA和0. 05%疊氮 化鈉)清洗兩次，并在50 μ 1的FACS緩沖液中懸浮，和0. 5 μ g與FITC或PE綴合的⑶3， ⑶4和⑶8抗體(eBioscience，SanDiego, CA)混合并在冰上培養(yǎng)30分鐘。再以FACS緩沖 液清洗細(xì)胞兩次，并在100 μ 1含有3%甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水中懸浮和轉(zhuǎn)移到載有500 μ 1 磷酸鹽緩沖鹽水的FACS試管中。使用一個(gè)FACS水平的流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson， San Jose,CA)和Cellquest軟件分析10，000個(gè)結(jié)果后收集數(shù)據(jù)。所述結(jié)果表達(dá)為正染色 的細(xì)胞與以相同抗體染色的未經(jīng)誘導(dǎo)的樣本相比下所增加平均百分比。細(xì)胞因子信使核糖核酸表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR使用RNeasy mini kit (Qiagen，Valencia，CA)從已接受免疫接種的老鼠身上所獲得的脾臟組織中分離出總核糖核酸。使用Superscript II (Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄信使核 糖核酸，并用作模板cDNA。所使用的引物和探針序列的詳細(xì)資料在表1顯示。以下是表1 所用的注解FW，正向引物；RV，反向引物；TP，以5’ FAM和3’ TAMRA雙標(biāo)記的TaqMan探針； a擴(kuò)增子的對(duì)鹼基長度。bcDNA及其對(duì)應(yīng)基因的Genbank保藏編號(hào)。c反義探針.所述探針以熒光報(bào)導(dǎo)染料，6-羧基螢光素(FAM)在5’端染色，和以抑制熒光染料， N’，N’，N’，N’，N’ -6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)在3’端染色。所述反應(yīng)是一式兩份的在 25μ 1容量內(nèi)進(jìn)行，所述容量包含2μ 1 IOpM的正向和反向引物，2 μ 1 2ρΜ的探針，12. 5μ 1 的TaqMan PCR master Mix和9. 5 μ 1已稀釋的cDNA，所述反應(yīng)使用以下條件在一個(gè)自動(dòng) 的熒光計(jì)中(7700SequenceDetector, Applied Biosystems, Foster City)在 94°C下運(yùn)行 10分鐘，然后是總共40個(gè)雙溫度循環(huán)(95°C 15秒和60°C 1分鐘)。使用比較性循環(huán)閥值 (Ct)方法來作測數(shù)量，并且報(bào)告成相對(duì)轉(zhuǎn)錄或相對(duì)校準(zhǔn)cDNA的η-倍差別。表 1
11 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以Excel軟件作統(tǒng)計(jì)分析。群組和個(gè)別抗原的差異以單因子變異數(shù)分析然后 再以Tukey-Kramer多重比較法或?qū)W生t檢定分析。明顯的差異是當(dāng)?shù)玫揭粋€(gè)少于0. 05的 或然率。以下是通過本例子所述的物料和方法所得的結(jié)果在已接受Map74F蛋白免疫接種的老鼠的免疫反應(yīng)加強(qiáng)接種后三周，殺死從每組而來的四只老鼠，然后評(píng)估抗Map74F抗體反應(yīng)和T 細(xì)胞反應(yīng)。已接受Map74F免疫接種的老鼠有明顯(P < 0. 01)強(qiáng)烈對(duì)抗Map 74F的IgGl 反應(yīng)但不是IgG2a反應(yīng)。相比之下，在控制組內(nèi)并沒有檢測到Map74F-特異抗體。所述培養(yǎng)物上清液的IFN- γ反應(yīng)是以IFN- y ELISA和IFN- y ELISPOT試驗(yàn)方法 來評(píng)估。相比只接受MPL的控制組動(dòng)物(圖2A)，已接受Map74F免疫接種的老鼠的抗原特異 IFN- γ反應(yīng)是明顯地比較高(P < 0. 05)。IFN- y ELISPOT的結(jié)果亦可比得上IFN- y ELlSA 的結(jié)果(圖2Β)，所述結(jié)果進(jìn)一步肯定在已接受免疫接種的動(dòng)物有已增加的IFN-Y反應(yīng)。 所述已接種的群組的平均單細(xì)胞形成菌落數(shù)值為20，對(duì)比控制組的數(shù)值為7。以FACS評(píng)估 脾細(xì)胞內(nèi)的抗原特異⑶3+，⑶4+，和⑶8+Τ細(xì)胞。⑶3+和⑶4+Τ細(xì)胞在已接受Map 74F免疫 接種后的老鼠(圖2C)中是明顯地高于(P < 0. 01)控制組動(dòng)物。相比之下，已接種的動(dòng)物 和控制組動(dòng)物之間的CD8+T細(xì)胞數(shù)量并沒有顯著差異。細(xì)胞因子基因表達(dá)水平以實(shí)時(shí)PCR 評(píng)估。在已接種的動(dòng)物和控制組動(dòng)物(圖2D)之間的細(xì)胞因子基因IL-2，IL-12，TNF-a和 IFN- γ的表達(dá)水平并沒有顯著差異(P > 0. 05)。Map74F保護(hù)C57/BL6老鼠對(duì)抗MAP感染基于從已接種的老鼠中所得的免疫反應(yīng)，我們計(jì)劃評(píng)估Map74F蛋白在老鼠中對(duì) 抗MAP感染的保護(hù)效能。從不同時(shí)間點(diǎn)所收集的血清用ELISA測試IgG反應(yīng)(圖3A)和 IgGl/IgG2a比例(圖3B)。在接受加強(qiáng)接種后的3和7周(挑戰(zhàn)后4周)，相對(duì)于控制組 的動(dòng)物，已接受74F免疫接種的老鼠顯示出一個(gè)明顯(P <0.01)增強(qiáng)的74F特異抗體反 應(yīng)。雖然抗體水平在接受挑戰(zhàn)后的控制組動(dòng)物有所上升，但在已接種的動(dòng)物接受挑戰(zhàn)后8， 12和16周的反應(yīng)更高。在接受加強(qiáng)接種后三周，已接種的動(dòng)物和控制組動(dòng)物的IgGl/IgG2a比例有明顯差異。在已接種的動(dòng)物中，所述IgGl/IgG2a比例在加強(qiáng)接種后有所上升直至挑 戰(zhàn)后四周。其后，在已接種的動(dòng)物中的IgGl/IgG2a比例會(huì)下跌直至挑戰(zhàn)后16周的觀察期 結(jié)束為止。為評(píng)估74F的保護(hù)效能，在MAP挑戰(zhàn)后，脾，肝和MLN會(huì)在不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)MAP。已 接種的動(dòng)物在接受挑戰(zhàn)后8，12和16周的脾內(nèi)MAP負(fù)載與控制組動(dòng)物相比是明顯地較低的 (P < 0. 01)(圖4A)。已接種的動(dòng)物在接受挑戰(zhàn)后12周的肝內(nèi)MAP負(fù)載與控制組動(dòng)物相比 是明顯地較低的(P < 0. 01)(圖4B)。已接種的動(dòng)物在接受挑戰(zhàn)后8周的MLN內(nèi)MAP負(fù)載 與控制組動(dòng)物相比是明顯地較低的(P < 0. 01)(圖4C)。肝(圖5A和B)和脾(圖5C和 D)的組織病理學(xué)檢查顯示，在控制組動(dòng)物的腹膜內(nèi)接受MAP挑戰(zhàn)8，12和16周后會(huì)引致更 多的肉芽腫。在沒有接受接種的控制組動(dòng)物內(nèi)，肝臟有數(shù)目眾多和隨意地分散的大型肉芽 腫(圖5A)而已接種的動(dòng)物的肝只有數(shù)目稀少的小型淋巴結(jié)集(圖5B)。同樣地，沒有接受 接種的控制組動(dòng)物的脾臟(圖5C)比已接種的動(dòng)物(圖5D)有更多的肉芽腫。當(dāng)控制組動(dòng) 物的肝和脾組織以齊尼氏抗酸性染色法染色后，可以見到有大量的抗酸桿菌。相比之下，在 已接受74F免疫接種的動(dòng)物，其肉芽腫和抗酸桿菌的數(shù)目比較少。如此，在本例子中，我們使用從已接受免疫接種和控制組動(dòng)物所得的脾細(xì)胞來確 定被融合蛋白誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)的種類。在分支桿菌感染中，Thl細(xì)胞是在感染初期的保 護(hù)有關(guān)鍵性的作用。最有效對(duì)抗胞內(nèi)病原體的免疫接種策略，應(yīng)該是可刺激CD4+和CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)兩者以產(chǎn)生與Thl有關(guān)的細(xì)胞因子。普遍來說，IFN-γ被認(rèn)為是啟動(dòng)巨噬細(xì)胞的 主要成分，而其由Thl⑶4+T細(xì)胞的生產(chǎn)對(duì)遏制MAP感染是被認(rèn)為很重要的。我們的結(jié)果顯 示，接種融合蛋白可誘發(fā)重要的IFN-Y反應(yīng)。同樣地，我們亦發(fā)現(xiàn)，Map74F的免疫作用在 已接受免疫接種的動(dòng)物中，誘發(fā)一可與⑶8+T細(xì)胞反應(yīng)對(duì)比的強(qiáng)烈⑶3+和⑶4+T細(xì)胞反應(yīng)， 這表示IFN-Y水平的增加可以是因?yàn)镃D4+T細(xì)胞數(shù)目的增加。所述結(jié)果支持CD4+T細(xì)胞是 占主導(dǎo)地激活I(lǐng)FN- γ這個(gè)結(jié)論的。在我們的研究中，MAP挑戰(zhàn)后⑶4+T細(xì)胞反應(yīng)和保護(hù)水 平的增加顯示Map74F的保護(hù)效能。我們?cè)谶@個(gè)例子所呈現(xiàn)的免疫原性研究亦顯示，備有MPL的74F在已接受免疫接 中的動(dòng)物中引發(fā)一個(gè)良好的抗體反應(yīng)。直至MAP挑戰(zhàn)后4周，IgGl/IgG2a比例的上升表示 著有一個(gè)Th2特異的反應(yīng)。然而，IgGl/IgG2a比例在第8周的開始逐步下降，表示著有可能 是轉(zhuǎn)為Thl反應(yīng)。在這個(gè)例子所呈現(xiàn)的結(jié)果顯示74F誘導(dǎo)ThI和Th2兩者反應(yīng)的證據(jù)，而 從一個(gè)明顯的IFN-Y反應(yīng)可以顯示前者反應(yīng)更顯著。例子3本例子示范使用Map74F和其它選定的MPA蛋白激發(fā)一個(gè)在反芻動(dòng)物內(nèi)對(duì)抗MAP 的免疫反應(yīng)。本例子使用下列物料和方法獲得所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)。動(dòng)物。本研究使用從沒有受到MAP感染的羊群中取得的總共25只介乎5和10日 大的小山羊。在這個(gè)免疫接種實(shí)驗(yàn)之前，從所述的羊中取得的糞便樣本經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)和IS900 基因PCR測試顯示MAP陰性的結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)工作在符合動(dòng)物福利法案，人道對(duì)待及使用 實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物在測試，研究和訓(xùn)練的公共衛(wèi)生服務(wù)政策，NIH照顧及使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的指引， 和紐約州公共衛(wèi)生部門的規(guī)定，政策和原則下進(jìn)行。細(xì)菌。使用臨床分離的MAP 66115-98挑戰(zhàn)所述經(jīng)過免疫接種之后的羊。這個(gè)品種是IS900陽性和依賴分支桿菌生長素的。MAP 66115-98是在有10%油酸-白蛋白-右 旋糖-過氧化氫酶(Becton Dickinson Co, Sparks, MD)和分支桿菌生長素J(Allied Monitor, Inc，F(xiàn)ayette, MO)補(bǔ)充的7H9培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在培養(yǎng)后8周，細(xì)胞是由離心機(jī)在 4000x g和10分鐘的情況下收集，并且以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS ;pH 7. 2)清洗兩次。所述 生物在磷酸鹽緩沖鹽水內(nèi)稀釋至所需的濃度并用于挑戰(zhàn)小牛。抗原和佐藥。如美國專利號(hào)11/816，365所載，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆，表達(dá)和純化三 個(gè)重組MAP抗原，85A，85B, SOD和融合多肽Map74F，所述克隆，表達(dá)和純化的描述在此全部 引用作參考。使用Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen，Valencia，CA)純化所述已表達(dá)的蛋白。內(nèi)毒 素污染用Affinity Pak Detoxi Gel (Pierce, Rockford, IL)移除，而所述抗原經(jīng)過鱟變形 細(xì)胞溶解試驗(yàn)測定有微不足道的內(nèi)毒素水平(10pg/ml)。將DDA(Sigma，USA)混進(jìn)無菌蒸 餾水至濃度是2. 5mg/ml，持續(xù)攪伴加熱至80°C 20分鐘，并冷卻至室溫。DDA與所述重組抗 原徹底混合至最終濃度為250 μ g/劑量。動(dòng)物的免疫接種。所述羊分為三組，群組I和II有八只動(dòng)物物，而群組III有九 只動(dòng)物(因?yàn)槲覀冇卸喑鲆恢坏男∩窖?。所有小山羊依靠母羊直至三個(gè)月大。群組I的 動(dòng)物是已接受在DDA中的四種抗原(85A，85B，S0D，和Map74F)以每種100 μ g的皮下注射 免疫接種。群組Π的動(dòng)物是已接受沒有DDA，每種100μ g抗原的免疫接種。群組III維持 作控制組動(dòng)物，并只施予DDA。首次免疫接種后三周，所述羊以相同制度的抗原和佐藥作加 強(qiáng)接種。以MAP挑戰(zhàn)動(dòng)物。加強(qiáng)接種后三周，全部24只羊連續(xù)7日以口服方法接受在IOml 奶內(nèi)有5X IO8MAP細(xì)胞/動(dòng)物的挑戰(zhàn)。在接受挑戰(zhàn)的2，4，6，8和10日后，每只動(dòng)物皆需要
進(jìn)行糞便細(xì)菌培養(yǎng)，然后是每月一次。周圍血液的單核細(xì)胞(PBMC)的分離和細(xì)菌培養(yǎng)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，從所述實(shí)驗(yàn)用羊 群中分離出PBMC。簡單來說，使用EDTA真空采血管(Becton Dickinson andCo. ,Franklin Lakes, NJ)從頸靜脈抽取 10_15ml 的周圍血液。使用 Histopaquel. 077 (Sigma-Aldrich, St. Louise, MO)以差分離心將淋巴細(xì)胞分離。所述單核細(xì)胞以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH 7.2)清洗三次。將清洗過的細(xì)胞顆粒懸浮在PBS內(nèi)，并以0.4%的錐藍(lán)將之染色后計(jì)算細(xì) 胞存活。將淋巴細(xì)胞重新懸浮在包含10%胎牛血清(Gibco，Grand Island, NY), 2mM L-谷 氨酸，IOOmM HEPES, 100IU/ml 盤尼西林，100 μ g/ml 鏈霉素和 50 μ g/ml 慶大霉素(Gibco) 至最終濃度是2x IO6存活細(xì)胞/ml的RPMI-1640介質(zhì)。所述細(xì)胞然后播種在有96-反應(yīng) 孔的圓或平底板(200yl/Wel 1)，視乎實(shí)驗(yàn)種類而定。淋巴細(xì)胞增殖化驗(yàn)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖化驗(yàn)。簡單來說，將放有PBMC 的96-反應(yīng)孔平底板放在潮濕大氣環(huán)境，5% C02，37°C下培養(yǎng)，并以四個(gè)所述已純化的重組 抗原(10 μ g/ml)，伴刀豆球蛋白 A(ConA ； 10 μ g/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)和已純 化的蛋白 行生物(PPD ; 10 μ g/ml,DBL,National Veterinary Services Laboratory,Ames, IA)刺激72小時(shí)。根據(jù)廠家的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，用細(xì)胞增殖ELISA編入的溴脫氧尿苷(BrdU)，再以 BrdUcolorimetric kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)量度在刺激后和沒有刺激 過的控制細(xì)胞內(nèi)的DNA合成。簡單來說，所述細(xì)胞以10μ 1的BrdU標(biāo)記溶液標(biāo)記兩小時(shí)。 將與過氧化物酶共軛的抗BrdU抗體加入并培養(yǎng)90分鐘。接著是加入酶底物溶液并在室溫 下培養(yǎng)15分鐘。加入IM硫酸停止酶反應(yīng)，并以ELx 808Ultra microplate reader (Bio-TekInstruments, Inc，Winooski，VT)在450nm下讀取光學(xué)密度(OD)。將所述實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn) 行，并將結(jié)果表達(dá)為平均刺激指數(shù)(Si)，計(jì)算與抗原一起培養(yǎng)的細(xì)胞的平均OD值和沒有與 抗原一起培養(yǎng)的細(xì)胞的平均OD值之間的比例。IFN-Y化驗(yàn)。根據(jù)廠家的指弓|，使用單克隆抗體基礎(chǔ)三明治酵素免疫分析法 (B0VIGAM ；Biocor Animal Health, Omaha, NE)來量度 PBMC 的培養(yǎng)上清液內(nèi)的 IFN-γ 水 平° 使用 ELx 808Ultra microplate reader (Bio-Tek Instruments, Inc)在 450nm 下角軍讀 培養(yǎng)板。結(jié)果基于負(fù)與正控制光學(xué)密度(OD)的比較來詮釋。相對(duì)于廠家建議的截?cái)嘀?，結(jié) 果詮釋為正(如果OD是大過正控制)或負(fù)(如果OD是少于正控制)。淋巴細(xì)胞標(biāo)記的流式細(xì)胞儀分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，使用羊特異單克隆抗 體(CD2-MUC2A ；CD4-17D-IgGl ；CD4_GClAl_IgG2a ；CD8-CACT80C_IgG，；CD8_7C2B_IgG2a； CD25-CACT116A-IgGl ;CD45R0-ILA116A-IgG3 ； γ δ TCR alpha 鏈特異 IgG2b_GB21Al ； ACTl-C ACT7A-IgM ；ACT16-GB IlOA-IgM) (VMRD, Inc, Pullman, WA)對(duì)淋巴細(xì)胞表面分化抗 原作單色流式細(xì)胞儀分析。簡單來說，所述細(xì)胞用熒光活化細(xì)胞分揀器(FACS)緩沖劑清洗 三次，并與先前以滴定達(dá)致最佳反應(yīng)的一抗在4°C下培養(yǎng)30分鐘。然后，將所述樣本清洗三 次，用異硫氰酸熒光素酯標(biāo)記的馬抗小鼠免疫球蛋白(Vector Laboratories,Burlingame, CA)在4°C下培養(yǎng)30分鐘。所述細(xì)胞用FACS緩沖劑清洗兩次，并懸浮在100 μ 1有3%中性 緩沖甲醛溶液的PBS。最后，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一 FACS試管，并在使用FACS水平流式細(xì)胞儀 (Becton Dickinson, San Jose, CA)量度之前將容量以 PBS 加至 500 μ 1。在 5，000-10，000 結(jié)果時(shí)收集數(shù)據(jù)和以Cellquest軟件分析。實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)細(xì)胞因子基因。依照常規(guī)方法進(jìn)行總RNA分離，cDNA合成和實(shí) 時(shí)定量 RT-PCR。簡單來說，使用 RNeasy mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)從裂解的 PBMC 中分離出RNA。所述已分離的RNA樣本以IOU/ μ 1的RNase-freeDNase I (Qiagen)在37°C 下處理10分鐘，接著在95°C熱滅活5分鐘然后冰上冷凍。RNA樣本的逆轉(zhuǎn)錄在20 μ 1的反 應(yīng)容量中(1. 6 μ 1的總RNA，從Invitrogen所得200U的Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶，50mM Tris-HCl，75mM氯化鉀，3mM氯化鎂，0. OlM 二硫蘇糖醇和0. 5mMdNTPs)在42°C下進(jìn)行50分 鐘，接著是在700C下滅火15分鐘。實(shí)時(shí)定量RT-PCR所用的探針和引物是以Primer Express software (Appl ied Biosystems, Foster city, CA)用牛 beta 肌動(dòng)蛋白禾口源自 GenBank 的 細(xì)胞因子基因序列所設(shè)計(jì)的。表2顯示在這研究中使用的探針和引物的詳細(xì)內(nèi)容。表2細(xì)胞因子IFN-Y

IL-10
16
序列(5’ -3’ )長度保藏編號(hào)
FP-CAAATTCCGGTGGATGATCTG(SEQ ID 358-378 AY603405 NO 25)
433-412
RP-GCGACAGGTCATTCATCACCTT(SEQ ID NO 26)382-409
^ff" -atccagcgcaaagccataaatgaactca (SEQ ID NO 27)
FP-CCAGGATGGTGACTCGACTAGAC(SEQ ID338-360 DQ837159
NO 28)
413-394RP-TGGCTCTGCTCTCCCAGAAC(SEQ ID NO 29)364-391探針-ccgacataaacctctgaaatccgaccca(SEQ ID NO:30)β-肌動(dòng)蛋 FP-GCCCCTCTGAACCCCAAA(SEQ ID NO :31) 67-84 AF481159白R(shí)P-GCAGGAGTGTTGAAAGTCTCGAA(SEQ ID137-115NO: 32)86-112^ff" -ccaaccgtgagaagatgacccagatca (SEQID NO:33)所述探針以熒光報(bào)導(dǎo)染料6-羧基熒光素(FAM)在5’端標(biāo)記，和以抑制熒光染料，
N’，N’，N’，N’，N’ -6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)在3’端標(biāo)記。在一 25 μ 1備有10 μ 1 已稀釋的 cDNA，400nM 濃度的引物，80ηΜ 的 Ta#an 探針(Integrated DNA Technologies, Inc. , Coralville, 10),禾口 universal PCRmaster mix (Applied Biosystems)內(nèi)含每個(gè)反 應(yīng)有IOmM Tris-HCKpH 8. 3)，50mM氯化鉀，5mM氯化鎂，2. 5mM濃度的脫氧核苷三磷酸， 0. 625U的Ampl iTaq金DNA聚合酶和0. 25U的AmpErase尿嘧啶-N-糖苷酶的反應(yīng)容量內(nèi) 進(jìn)行PCR。重復(fù)的樣本保持在96-反應(yīng)孔板并在一個(gè)自動(dòng)熒光計(jì)(7700Sequence Detector, Applied Biosystems)內(nèi)擴(kuò)增。PCR的條件是在50°C下2分鐘和在95°C下10分鐘，接著是 在95°C下運(yùn)行40個(gè)循環(huán)15秒和在60°C下1分鐘。使用比較性循環(huán)閥值(Ct)方法來作測 數(shù)量，并且報(bào)告成相對(duì)轉(zhuǎn)錄或相對(duì)校準(zhǔn)cDNA的η-倍差別?？贵w對(duì)重組抗原的反應(yīng)。依照常規(guī)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃以ELISA評(píng)估抗體對(duì)四個(gè)重組抗 原，con A和PPD的反應(yīng)。用覆蓋有每一個(gè)抗原每個(gè)有100 μ 1的96-反應(yīng)孔平底板進(jìn)行 間接ELISA，保持在4°C下過夜，并以包含0. 05% Tween20的PBS(PBST)清洗兩次。沒有結(jié) 合的部位以放有5%脫脂奶的PBST在37°C下封閉一小時(shí)，并以PBST清洗兩次。將100 μ 1 與山葵過氧化酶(Sigma)共軛的1 25，000稀釋的抗羊IgG加入所述反應(yīng)孔并在37°C下 培養(yǎng)一小時(shí)。所述培養(yǎng)板用PBST清洗三次，并在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入2，2’ -聯(lián)氮雙噻唑 啉-6-磺酸(Sigma)。將培養(yǎng)板在37°C黑暗中培養(yǎng)30分鐘，接著加入停止溶液(1M鹽酸)， 然后使用微型板塊閱讀器(BioTEK Instruments，Inc，Winooski，VT)在405nm下解讀三次， 每次的間隔是2分鐘。合適的正和負(fù)血清和抗原和抗體控制都包括在每一塊板中。糞便和器官的MAP培養(yǎng)。緊隨著挑戰(zhàn)后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃使用Herald’ segg yolk(HEY)培養(yǎng)基(Becton, Dickinson and Co.，Sparks, MD)來嘗試從糞便中分離出 MAP 生物。用作分離MAP的糞便樣本是從所有動(dòng)物在接受挑戰(zhàn)后2，4，6，8和10日，及其后的每 一個(gè)月所收集得來的。同樣地，從24只動(dòng)物在死體解剖時(shí)收集的23個(gè)組織樣本亦以細(xì)菌 培養(yǎng)檢測MAP。細(xì)菌培養(yǎng)由康奈爾動(dòng)物健康診斷中心的細(xì)菌學(xué)部進(jìn)行，而他們對(duì)治療組是遮 盲的。大體病理學(xué)和組織病理學(xué)檢查。所有羊在首輪防疫注射后38周進(jìn)行安樂死和進(jìn) 行死體解剖。從每一只動(dòng)物中收集總共23個(gè)組織樣本，其包括脾，扁桃腺，腸系膜淋巴結(jié)(3)，顎淋巴結(jié)，回盲淋巴結(jié)，肝淋巴結(jié)，十二指腸(升和降)，空腸(從近端到遠(yuǎn)程大概等同 間隔的三個(gè)部位)，回腸(近端兩個(gè)部位，中回腸兩個(gè)部位和遠(yuǎn)程兩個(gè)部位)，回盲瓣口，盲 結(jié)腸瓣口，盲腸，和結(jié)腸螺旋，全部在死體解剖時(shí)收集。將收集到的組織浸入10%中性緩沖 甲醛溶液固定，包埋在石蠟中，切片成4 μ m并以傳統(tǒng)組織學(xué)的蘇木素和曙紅染色法染色。 切片是由合資格的獸醫(yī)病理學(xué)家(SM)檢驗(yàn)，他也對(duì)治療組是遮盲的。統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以Excel軟件作統(tǒng)計(jì)分析。群組和個(gè)別抗原的差異以單因子變異 數(shù)分析然后再以Tukey-Kramer多重比較法或?qū)W生t檢定分析。明顯的差異是當(dāng)?shù)玫揭粋€(gè) 少于0. 05的或然率。以下是通過本例子所述的物料和方法所得的結(jié)果。淋巴組織增生對(duì)抗原的反應(yīng)雖然抗原特異的淋巴組織增生反應(yīng)是在首輪防疫注 射后(APV)六周檢測到的，但所述反應(yīng)在已接受免疫接種的群組(I和II)與沒有接受免疫 接種的控制組(III)在APV 10周(圖6)比較下是明顯地高的(P < 0. 05)。然而，在測試 過的不同抗原之間的反應(yīng)沒有檢測到明顯地差別?？乖禺怚FN- γ反應(yīng)在APV 6和10周檢測到在已接受免疫接種的和控制組動(dòng) 物(圖7)之間的所述IFN-Y反應(yīng)的明顯差別(P < 0. 01)。在已接受免疫接種的動(dòng)物中所 檢測到的最佳反應(yīng)是Map74F。在APV 10周，群組I的動(dòng)物對(duì)抗原85A和Map74F的IFN- γ 反應(yīng)是明顯地高過(P < 0. 05)群組II的動(dòng)物。然而，在其它重組抗原測試中并沒有檢測 到明顯的差異。雖然重組抗原特異的IFN-Y水平從APV 18周到38周有下降，但是在已接 受免疫接種的動(dòng)物中它們是明顯地高于(P < 0. 05)控制組的。對(duì)應(yīng)重組抗原的淋巴細(xì)胞子集分布反應(yīng)使用流式細(xì)胞檢查抗原激發(fā)的淋巴細(xì)胞 子集的百分比差別。在已接受免疫接種的群組中，⑶4+IgGl，⑶4+IgG2a，⑶8+IgGl，⑶8+IgG2a 細(xì)胞子類型比起控制組有明顯的增長(圖8A-D)。所述增長在APV六周開始，并在整個(gè)實(shí) 驗(yàn)的過程中持續(xù)至APV 38周。重組抗原特異⑶4+和⑶8+T細(xì)胞數(shù)目在已接受免疫接種的 動(dòng)物中較高，但⑶4+細(xì)胞部份比⑶8+細(xì)胞部分更高。然而，在APV 26和38周時(shí)，⑶8+T細(xì) 胞數(shù)目有增長，雖然并不顯著。當(dāng)所有重組抗原在我們的研究中被試驗(yàn)后，Y STCR+細(xì)胞 的數(shù)目在已接受免疫接種的群組中相比于控制組動(dòng)物有所增長，而85A和Map74F抗原的增 長是明顯地較高的(P <0.05)。再者，如在⑶4+和⑶8+T細(xì)胞數(shù)目的情況中，我們留意到 Y S TCR+細(xì)胞數(shù)目持續(xù)增加直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束階段(圖8E)。在已接受免疫接種的動(dòng)物，抗原 特異的CD25+T細(xì)胞部份在四種實(shí)驗(yàn)過的重組抗原中是較高的。雖然在不同實(shí)驗(yàn)過的抗原 之間，CD25+T細(xì)胞反應(yīng)有少量差別，但它們并不顯著。細(xì)胞因子基因特異的mRNA表達(dá)與控制組動(dòng)物在APV六周開始時(shí)(圖9A)，在已接 受免疫接種的動(dòng)物中可檢測到重組抗原特異IFN-Y表達(dá)有明顯增加(P < 0. 01)。雖然所 述表達(dá)水平在APV 10周到達(dá)頂峰，但直至APV 38周時(shí)，在已接受免疫接種的動(dòng)物中的水平 相比起控制組動(dòng)物的仍然是明顯地較高。對(duì)照起來，除了所有三個(gè)群組在APV 26-38周時(shí)， 整體的IL-10表達(dá)都有所增加之外(圖9B)，任何時(shí)候在我們的研究中，在已接受免疫接種 和控制組動(dòng)物之間，所檢測到的IL-10表達(dá)都是沒有明顯差別的。抗體的重組抗原特異反應(yīng)在這個(gè)研究中，所有測試過的四個(gè)重組抗原在已接受 免疫接種群組中可誘發(fā)強(qiáng)健的抗體反應(yīng)。從APV六周到整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中(圖10)，所述反應(yīng) 在已接受免疫接種群組中比起控制組是明顯更高的(P < 0. 01)。在多種使用過的重組抗原之間，所檢測到的抗體反應(yīng)并沒有明顯差別。在死體解剖時(shí)所收集的組織病理學(xué)組織在死體解剖中對(duì)從每一只動(dòng)物收集得來 的組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，75%沒有接受免疫接種的控制組動(dòng)物(群組III) 在最少一個(gè)組織中有肉芽腫，然而群組I和群組Π分別只有25和50%的動(dòng)物有肉芽腫。 在群組1中一只動(dòng)物的腸系膜淋巴結(jié)和空腸中發(fā)現(xiàn)肉芽腫，而在同組另一只動(dòng)物的回盲淋 巴結(jié)中肉芽腫。相比之下，在群組II和III中的肉芽腫主要是在回腸，回盲交合處，或盲腸， 雖然這兩組內(nèi)有五只動(dòng)物的回盲淋巴結(jié)也有受影響。在任何動(dòng)物中的十二指腸并沒有發(fā)現(xiàn) 肉芽腫，而只有2只動(dòng)物，一只從群組I而另一只在群組III，的空腸有肉芽腫。在群組III 中的兩只沒有接受免疫接種的動(dòng)物，其受影響的組織包括盲結(jié)腸交合處和肝淋巴結(jié)。緊接挑戰(zhàn)后，MAP在組織的負(fù)載以細(xì)菌培養(yǎng)評(píng)估從每一只動(dòng)物的死體解剖中所 獲得的23個(gè)組織的MAP負(fù)載(圖11)。在已接受免疫接種的動(dòng)物之間，只有群組I的一只 動(dòng)物呈現(xiàn)有非常低CFU的陽性培養(yǎng)。在群組II中，雖然5/8的動(dòng)物是MAP陽性，但在五只 動(dòng)物的其中四只可分離出MAP的動(dòng)物(<5)中，其細(xì)菌載量是非常低的。在沒有接受免 疫接種的群組III中，全部九只動(dòng)物都是MAP陽性的，而大部分動(dòng)物都有最少5個(gè)組織有> 300CFU的MAP陽性(太多，不能盡數(shù))。如前面證明，在這例子中，我們?cè)谏窖蚰Ｐ椭性u(píng)估重組85A，85B，SOD和Map74F的 保護(hù)效能。因?yàn)镸AP是一種細(xì)胞內(nèi)的生物，所以激活后的T細(xì)胞所介導(dǎo)的Thl反應(yīng)，尤其是 可分泌IFN-γ的激活后的T細(xì)胞，被認(rèn)為在保護(hù)中扮演重要的角色。在多種使用過的工具 中，最被廣泛利用作確定細(xì)胞免疫反應(yīng)的是量度淋巴細(xì)胞在特異抗原測試中的增殖反應(yīng)。 在加強(qiáng)免疫接種后三個(gè)星期，我們示范了檢測重組抗原特異淋巴細(xì)胞增殖，在已接受免疫 接種群組中的結(jié)果與控制組接受挑戰(zhàn)后比較是明顯較高的，這表示抗原特異細(xì)胞免疫的誘 導(dǎo)。IFN-Y是主要細(xì)胞因子基因的其中一種，在牛只中會(huì)因受到MAP感染而激活。此 外，人們都相信主要組織兼容性復(fù)合體第一型可限制生產(chǎn)細(xì)胞因子如IFN- γ的CD8+T細(xì)胞 在對(duì)抗其它分支桿菌感染如結(jié)核桿菌中是必須的。在這例子中，在接受加強(qiáng)免疫接種和挑 戰(zhàn)后可檢測到Map74F介導(dǎo)的IFN-Y反應(yīng)。在沒有意圖被任何個(gè)別理論約束下，可考慮以 IFN-Y介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞訊號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的IFN-Y水平的增強(qiáng)在山羊接受活MAP挑戰(zhàn)后的保護(hù)性 免疫中扮演重要的角色。在這例子中呈現(xiàn)的結(jié)果亦顯示出在已接受免疫接種的動(dòng)物有較高的⑶4+和⑶8+T 細(xì)胞反應(yīng)。我們的結(jié)果亦支持CD4+T細(xì)胞對(duì)周圍IFN-Y水平和緊隨著重組抗原免疫接種后 的增殖性反應(yīng)有貢獻(xiàn)。CD25是由已激活的T-細(xì)胞所表達(dá)的。我們的結(jié)果清楚表示，已激活 的T-細(xì)胞在已接受免疫接種的動(dòng)物內(nèi)會(huì)擴(kuò)充。雖然γ δ TCR+細(xì)胞數(shù)目維持在較小于CD4+ 和CD8+T細(xì)胞地?cái)?shù)目，但它們?cè)谝呀邮苊庖呓臃N的動(dòng)物中是明顯地高于(Ρ<0. 05)控制組 動(dòng)物的。⑶4+Τ細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)理是與IFN-γ的分泌有關(guān)，其可在巨噬細(xì)胞，淋巴毒素，穿孔 素和粒溶素中激活細(xì)菌活動(dòng)力。CD8+和γ δ+T細(xì)胞亦分泌粒溶素。這和我們的挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)的 結(jié)果一致，并且支持我們的重組抗原的保護(hù)效能。所述已增加的IFN-γ mRNA表達(dá)水平，在 已接受免疫接種的動(dòng)物中清楚表示這里有一個(gè)明確的抗原特異Thl反應(yīng)，而不明顯的Th2 特異IL-10表達(dá)支持這論點(diǎn)。隨著淋巴組織增生反應(yīng)，IFN- γ反應(yīng)，⑶4+T和⑶8+T細(xì)胞反應(yīng)為在已接受免疫接種群組的顯著Thl反應(yīng)提供證據(jù)。我們分析挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以評(píng)估所述重組抗原在山羊 內(nèi)的保護(hù)效能。在沒有典型的臨床征象下，死體解剖時(shí)所收集的組織的組織病理學(xué)和細(xì)菌 負(fù)載被認(rèn)為是最佳評(píng)估MAP防疫注射的保護(hù)效能的標(biāo)準(zhǔn)。我們從25只動(dòng)物中每只收集23 個(gè)組織，分析其組織病理損害和以細(xì)菌培養(yǎng)分析MAP負(fù)載。我們觀察到曾接受重組抗原和 DDA的動(dòng)物和組織的損害數(shù)目有顯著下降，這表示有保護(hù)效能。與抗酸菌染色法或顯微鏡觀察法比較下，從細(xì)菌培養(yǎng)中分離出MAP這種方法對(duì)檢 測組織內(nèi)MAP的敏感度較高，尤其是在感染非常初期的時(shí)候。然而，肉芽腫損害的分布普遍 可以反映MAP細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果。本例子所呈示的MAP細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果清楚證明所使用的四個(gè)重 組抗原的保護(hù)效能。當(dāng)所述抗原與DDA—起施予時(shí)有近乎完整的保護(hù)。在群組I中，八只動(dòng) 物只有一只可以獲得MAP，而這只動(dòng)物只有一個(gè)陽性組織有明顯較低的MAP載量，那就是遠(yuǎn) 程回腸。抗原在沒有佐藥的情況下施用亦顯示有保護(hù)能力，雖然在沒有佐藥的情況下的保 護(hù)效能較低。這種情況可以在給予抗原但沒有佐藥的群組II動(dòng)物的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果中觀察 得到。雖然5/8的動(dòng)物是MAP陽性，其細(xì)菌載量是明顯地較群組III的控制組動(dòng)物的低，這 表示所述抗原即使在沒有佐藥的情況下依然具有保護(hù)性。在所有沒有接受免疫接種的控制 組動(dòng)物中，所獲得的MAP數(shù)目是明顯地較高，這再次顯示所述抗原的保護(hù)效能。山羊的重組 抗原免疫注射在一段時(shí)間中產(chǎn)生持續(xù)的抗體反應(yīng)。因此，本例子所呈示的結(jié)果表示所述重 組抗原激發(fā)了細(xì)胞介導(dǎo)免疫和體液免疫系統(tǒng)。已接受免疫注射的群組在加強(qiáng)免疫注射后， 與所述沒有接受過免疫注射的群組比較下其檢測到的所有重組抗原的抗體反應(yīng)有所增加。 接受抗原和佐藥的群組I動(dòng)物中，所述反應(yīng)雖然不顯著但傾向較高。緊隨著血清轉(zhuǎn)化后的 早發(fā)性細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)是反芻動(dòng)物受分支桿菌感染后的恒常特征。然而，相對(duì)于接受假 免疫注射的山羊，我們?cè)谶@例子中所使用到的多成份亞單位在降低目標(biāo)器官中的桿菌負(fù)載 而言是可給予明顯的保護(hù)。本發(fā)明內(nèi)所述的具體實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。事實(shí)上，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可從前面所描述的實(shí)施方式中輕易地對(duì)本發(fā)明作出不同的修改。這些修改包含在本發(fā)明 附屬權(quán)利要求范圍之內(nèi)。這里引用的所有文獻(xiàn)都在此整體引入作參考，而所有目的在相同程度上就如每一 個(gè)別文獻(xiàn)，專利或?qū)＠暾?qǐng)都是特別地和個(gè)別地在此整體引入作參考。任何文獻(xiàn)的引證都是為了證明其公開是在申請(qǐng)日期之前，但不應(yīng)該被認(rèn)為是本發(fā) 明因?yàn)樵谙鹊陌l(fā)明，而承認(rèn)本發(fā)明沒有權(quán)利去宣告其發(fā)明是比這些文獻(xiàn)居先的。
權(quán)利要求
一種包含一重組蛋白的合成物(composition)，所述合成物包括由N-末端到C-末端(i)一包含SEQ ID NO2的氨基酸183-361的Map 3527蛋白的C-末端片段；(ii)一包含SEQ ID NO3的氨基酸1-460的Map 1519蛋白序列；和(iii)一包含SEQ ID NO2的氨基酸33-180的Map 3527蛋白的N-末端片段。
2.如權(quán)利要求1的合成物，其中所述Map1519蛋白序列包括SEQ ID NO :3的蛋白序列。
3.如權(quán)利要求1的合成物，其中所述Map3527蛋白的C-末端片段有17. 6kDa的分子量。
4.如權(quán)利要求1的合成物，其中所述Map3527蛋白的N-末端片段有14. 6kDa的分子量。
5.如權(quán)利要求1的合成物，其中所述多肽包含SEQID NO 1的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1的合成物，其中所述合成物進(jìn)一步包括一佐藥(adjuvant)。
7.如權(quán)利要求6的合成物，其中所述佐藥選自以下群組包括單磷酰酯A(MPL)，雙十八 烷基二甲基溴化銨(DDA)，及其組合。
8.如權(quán)利要求1的合成物進(jìn)一步包括一鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)蛋白，其中所述 蛋白是選自以下群組包括MAP蛋白85A，MAP蛋白85B，MAP蛋白SOD，及其組合。
9.一種在一哺乳類動(dòng)物內(nèi)激發(fā)對(duì)抗鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)的免疫反應(yīng)的方法， 所述方法包括對(duì)所述哺乳類動(dòng)物施予如權(quán)利要求1的合成物。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中所述合成物進(jìn)一步包括一佐藥。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中所述佐藥是選自以下群組包括單磷酰酯A(MPL)和雙 十八烷基二甲基溴化銨(DDA)。
12.如權(quán)利要求9的方法，其中所述合成物是施予一反芻動(dòng)物。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中所述反芻動(dòng)物是牛，綿羊，山羊，鹿或麇鹿。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中所述反芻動(dòng)物是牛。
15.如權(quán)利要求12的方法，其中所述反芻動(dòng)物并沒有受MAP感染。
16.如權(quán)利要求12的方法，其中所述反芻動(dòng)物受了MAP感染。
17.如權(quán)利要求14的方法，其中所述?；加屑s尼氏病。
18.如權(quán)利要求9的方法，其中所述動(dòng)物是懷孕的。
19.如權(quán)利要求9的方法，其中所述合成物進(jìn)一步包括一鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP) 蛋白，其中所述蛋白是選自以下群組包括=MAP蛋白85A，MAP蛋白85B，MAP蛋白S0D，及其組合。
20.如權(quán)利要求9的方法，其中所述合成物的多肽包括SEQID NO :1的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在哺乳動(dòng)物內(nèi)激發(fā)對(duì)抗鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(MAP)的免疫反應(yīng)的合成物和方法。所述合成物包括一重組多肽，而所述重組多肽是由聯(lián)結(jié)一個(gè)MAP蛋白Map3527的C-末端片段至一Map1519蛋白氨基酸序列，接著再聯(lián)結(jié)一個(gè)Map3527的N-末端部分。所述方法包括對(duì)一動(dòng)物施予一有效份量，可激發(fā)對(duì)抗MAP細(xì)菌的免疫反應(yīng)的合成物。所述方法是預(yù)期對(duì)任何容易受MAP感染的哺乳類動(dòng)物有益的，尤其是對(duì)反芻動(dòng)物有益。
文檔編號(hào)A61K39/04GK101883582SQ200880119048
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月13日
發(fā)明者張永富 申請(qǐng)人:康奈爾大學(xué)