專利名稱：：一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物。該組合物由淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿中的任意兩個、三個或四個成分組合而成，通過對骨代謝多個相關(guān)指標(biāo)的協(xié)同調(diào)節(jié)，減少骨質(zhì)丟失，增加骨密度，增強(qiáng)抗骨質(zhì)疏松作用。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致骨脆性增加，骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一種系統(tǒng)性、全身性骨骼疾病，多發(fā)生于絕經(jīng)后婦女，屬于老年病的范疇。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與老年階段內(nèi)分泌系統(tǒng)的代謝失調(diào)、機(jī)體超氧化物的過度產(chǎn)生、免疫功能失調(diào)等有關(guān)，并因此引起骨質(zhì)代謝紊亂，如成骨細(xì)胞的形成減少、活性降低，破骨細(xì)胞的形成增加，骨吸收作用增強(qiáng)等。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物如雌激素、雙磷酸鹽和鈣制劑等，只是從其中一個方面改善骨代謝，不能對機(jī)體的功能進(jìn)行全面調(diào)節(jié)。中藥及其方劑含有多種化學(xué)成分，通過多個環(huán)節(jié)和多個靶點(diǎn)對機(jī)體進(jìn)行全面調(diào)節(jié)，具有副作用較小、適合長期服用的特點(diǎn)，成為防治骨質(zhì)疏松藥物的研究熱點(diǎn)。很多中藥及其復(fù)方制劑在臨床上也表現(xiàn)出了確切、顯著的療效，但是由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜、作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚、質(zhì)量不穩(wěn)定而限制了其在臨床上的應(yīng)用。已有從中藥中提取到抗骨質(zhì)疏松活性化合物的報(bào)道，其中以淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿的作用最為顯著。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這四個化合物具有各自不同的藥理活性特點(diǎn)和作用途徑。淫羊藿苷為異黃酮類成分，具有植物雌激素樣活性，能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成、分化，抑制破骨細(xì)胞的成熟和破骨性骨吸收，可減少去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失。(Huang丄YuanL，WangX，ZhangTL，WangK.LifeSci.2007;81(10):832-840.)。知母皂苷BII為甾體皂苷類成分，專利(中藥知母中甾體總皂苷的醫(yī)藥新用途及其制備方法，01106195.2)公開了知母總皂苷具有抗炎、抗氧化和抗骨質(zhì)疏松作用，知母皂苷BII為其中活性成分之一，知母皂苷BII的抗骨質(zhì)疏松作用主要是增加成骨細(xì)胞的骨形成而不是抑制骨吸收。仙茅苷乙為酚苷類化學(xué)成分，通過調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)和免疫功能，減緩機(jī)體的衰老過程，減少骨質(zhì)的丟失。研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷乙的抗骨質(zhì)疏松作用主要是通過抑制骨吸收實(shí)現(xiàn)的(JiaoL，CaoDP，HanT，etal.Phytomedicine，2009，doi:10.1016/j.phytomed.2009.01.005)。小檗堿，又名黃連素，為異喹啉類生物堿，研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可以顯著降低去卵巢大鼠的骨丟失，抑制甲狀旁腺素、白細(xì)胞介素1等誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的破骨細(xì)胞的形成，減少破骨細(xì)胞的數(shù)目。小檗堿的這種抑制骨吸收作用與其抗炎活性相關(guān)，通過調(diào)節(jié)激活蛋白AP-1轉(zhuǎn)錄因子抑制環(huán)氧合酶(C0X-2)轉(zhuǎn)錄活性，抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠分泌物和PGE2產(chǎn)生，進(jìn)而增加骨保護(hù)素的分泌，降低骨吸收，減少骨質(zhì)丟失(LiH,MiyaharaT，TezukaY，NambaT，SuzukiT，DowakiR，WatanabeM,NemotoN，TonamiS，SetoH，KadotaS.BiolPharmBull.1999;22(4):391-396.)。盡管這些化合物通過不同的途徑減少骨丟失，但至今未見將上述活性物質(zhì)組成藥物組合物用于防治骨質(zhì)疏松的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種成分明確、質(zhì)量穩(wěn)定，能有效防治骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物。本發(fā)明的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，分別由淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿中的任意兩種、三種或四種組分組成，其特征在于該組合物由以下組分的重量份組成淫羊藿苷0—135份知母皂苷BII0—450份仙茅苷乙0—63份小檗堿0—1350份。即由淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿中的任意兩種、三種或者四種成分組成。根據(jù)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的病理生理學(xué)原理，將具有不同活性和作用特點(diǎn)的化合物進(jìn)行組合。該組合物通過對機(jī)體的內(nèi)分泌代謝、免疫功能、氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎癥發(fā)生等環(huán)節(jié)調(diào)控，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞形成、分化和功能，協(xié)同性調(diào)控骨代謝，減少骨質(zhì)的丟失，達(dá)到預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的目的。本發(fā)明組合物的組分和重量配比(下面所提及的"份"為重量份)分別為1淫羊藿苷與知母皂苷BII組合物淫羊藿苷15135份知母皂苷BII50450份。優(yōu)選為淫羊藿苷45份知母皂苷BII150份。2淫羊藿苷與仙茅苷乙組合物淫羊藿苷15135份仙茅苷乙763份。優(yōu)選為淫羊藿苷135份仙茅苷乙63份。3淫羊藿苷與小檗堿組合物淫羊藿苷15135份小檗堿1501350份。優(yōu)選為淫羊藿苷15份小檗堿150份。4知母皂苷BII與仙茅苷乙組合物知母皂苷BII50450份仙茅苷乙763份。優(yōu)選為知母皂苷BII450份仙茅苷乙63份。5知母皂苷BII與小檗堿組合物知母皂苷BII50450份小檗堿1501350份。優(yōu)選為知母皂苷BII150份小檗堿450份。6仙茅苷乙與小檗堿組合物仙茅苷乙763份小檗堿1501350份。優(yōu)選為仙茅苷乙21份小檗堿450份。7淫羊藿苷、知母皂苷BII與仙茅苷乙組合物淫羊藿苷15135份知母皂苷BII50450份仙茅苷乙763份優(yōu)選為淫羊藿苷15份知母皂苷BII50份仙茅苷乙7份8淫羊藿苷、知母皂苷BII與小檗堿組合物淫羊藿苷15135份知母皂苷B'II50450份小檗堿1501350份優(yōu)選為淫羊藿苷135份知母皂苷BII450份小檗堿1350份9淫羊藿苷、仙茅苷乙與小檗堿組合物淫羊藿苷15135份仙茅苷乙763份小檗堿1501350份優(yōu)選為淫羊藿苷15份仙茅苷乙7份小檗堿150份10知母皂苷BII、仙茅苷乙與小檗堿組合物知母皂苷BII50450份仙茅苷乙763份小檗堿1501350份優(yōu)選為知母皂苷BII50份仙茅苷乙7份小檗堿150份11淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙與小檗堿組合物淫羊藿苷15135份知母皂苷BII50450份仙茅苷乙763份小檗堿1501350份優(yōu)選為淫羊藿苷135份知母皂苷BII450份仙茅苷乙63份小檗堿1350份經(jīng)體外細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明組合物均對骨質(zhì)疏松的防治作用明顯優(yōu)于單味用藥，說明各組分間有協(xié)同作用，因此，可用于制備防治骨質(zhì)疏松的藥物。本發(fā)明的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物可以采用中藥制劑的常規(guī)方法制備成任何常規(guī)內(nèi)服制劑用于防治骨質(zhì)疏松。具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。一、淫羊藿苷和知母皂苷BII組合物對成骨細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)1材料和方法試劑和材料淫羊藿苷和小檗堿為陜西慧科植物開發(fā)有限公司產(chǎn)品，純度均為99%，知母皂苷BII和仙茅苷乙為本課題組自制，并經(jīng)核磁共振氫譜、質(zhì)譜等波譜分析，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致，HPLC分析表明純度達(dá)到99y。以上。染料木黃酮、考馬斯亮藍(lán)G-250為美國Sigma公司產(chǎn)品，MTT、二甲亞砜、對硝基苯酚磷酸二鈉、二乙醇胺、NaOH、對硝基苯酚等均為國產(chǎn)分析純試劑。新生2-4天SD大鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。溶液配制:用無水乙醇分別配制10—4mol/L的淫羊藿苷和知母皂苷BII溶液，作為儲備液。實(shí)驗(yàn)時，用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組，淫羊藿苷和知母皂苷BII的三個劑量分別為10—Vd1/L、10—9mol/L和10—q1/L，對成骨細(xì)胞合并用藥效果研究分組見表1。表1.淫羊藿苷與知母皂苷BII合并用藥效果研究分組表藥品劑量(mol/L)陰性對照組淫羊藿苷ID-810-910-10知母皂苷BII10陽810—9io-10淫羊藿苷+知母皂苷.BI110陽8+10-810-9+1(T910-io+10-io制備成骨細(xì)胞:新生SD大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞按常規(guī)采用膠原酶消化法獲得，懸浮于含IO%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基中，置37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)傳代至第四代細(xì)胞備用。成骨細(xì)胞增殖測定按常規(guī)將培養(yǎng)的第四代大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞懸浮于含1(m胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為2Xl(^個細(xì)胞/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100ul。于37°C5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，換含終濃度為10—8、10—9、10—"mol/L的淫羊藿苷、知母皂苷BII及淫羊藿苷和知母皂苷BII的組合物，陰性對照組只加含IOy。血清的a-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，在培養(yǎng)結(jié)束前4小時，每孔加入20ul用PBS緩沖液配制的5mg/ml的MTT溶液，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去上清，每孔加入150ul二甲亞砜，放置，使形成的甲臜顆粒完全溶解，于550nm處檢測吸光度值。堿性磷酸酶的活性測定按常規(guī)將培養(yǎng)的第四代大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為2Xl(T個細(xì)胞/ml，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100"1。于37°C5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，換含終濃度為10—8、10—9、10—"mol/L的淫羊藿苷、知母皂苷BII及淫羊藿苷和知母皂苷BII的組合物，陰性對照組只加含10%血清的ct-MEM培養(yǎng)基，以后每3天換藥一次。培養(yǎng)至6天時測定ALP的活性棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，力Q100u150mmol/L的二乙醇胺，50ul2.5mmol/L的對硝基苯酚磷酸二鈉，37。C反應(yīng)30分鐘，最后用0.3mol/L的Na0H終止反應(yīng)，于波長405nm處測得吸光度值，以不同濃度的對硝基苯酚溶液在405nm處的OD值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。Bradford法測定總蛋白含量，以每ng蛋白產(chǎn)生的對硝基苯酚的Pmol數(shù)表示ALP的活性。骨結(jié)節(jié)數(shù)測定將第四代成骨細(xì)胞傳代后按每孔5X104個細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，用含l.O%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，換含0.1%牛血清白蛋白的新鮮a-MEM培養(yǎng)基，使細(xì)胞適應(yīng)，12小時后換含有10—8、10—9、10—"mol/L的淫羊藿苷，知母皂苷BII，淫羊藿苷+知母皂苷BI1的骨結(jié)節(jié)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(0.1%BSA，10nM地塞米松，10mMP-甘油磷酸鈉和50ug/ml抗壞血酸以及10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基)。每3天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)觀察14天后，進(jìn)行vonKossa染色。倒置相差顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)每孔內(nèi)20個隨機(jī)不同視野內(nèi)骨結(jié)節(jié)的數(shù)量，以棕黑色結(jié)節(jié)和邊界清晰為準(zhǔn)，結(jié)果以骨結(jié)節(jié)數(shù)/孔表示。藥物相互作用分析以各組藥物與對照組相比的變化率為指標(biāo)，按照金氏兩藥作用為單純相加兩藥作用為協(xié)同增強(qiáng)兩藥作用為顯著協(xié)同增強(qiáng)兩藥作用為拮抗兩藥作用為明顯拮抗11W式q=EA+B/(EA+EB-EaXEb)，判斷各藥物間的相互作用關(guān)系。q:0.851.151.1520〉200.850.05〈0.552實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表2可見，在10—810—、c)l/L的濃度范圍內(nèi)，淫羊藿苷、知母皂苷BII及其組合物均可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性和骨結(jié)節(jié)的形成。根據(jù)金氏概率相加法計(jì)算淫羊藿苷和知母皂苷BII的相互作用關(guān)系(見表3)，在10—9mol/L濃度的淫羊藿苷與知母皂苷BII配伍后，成骨細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性和骨結(jié)節(jié)形成指標(biāo)的Q值分別為1.33、1.18、1.30，均大于l.15，表明淫羊藿苷和知母皂苷BII可以協(xié)同增強(qiáng)成骨細(xì)胞的增殖和骨形成作用。表2淫羊藿苷、知母皂苷BII及其組合對成骨細(xì)胞的影響(n=10，jc±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3淫羊藿苷與知母皂苷BII合并用藥對成骨細(xì)胞的作用效果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>二、淫羊藿苷、小檗堿、仙茅苷乙組合物對破骨細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)1材料和方法試劑和材料淫羊藿苷和小檗堿為陜西慧科植物開發(fā)有限公司產(chǎn)品，純度為99%以上，知母皂苷BI工和仙茅苷乙為本課題組自制，并經(jīng)核磁共振氫譜、質(zhì)譜等波譜分析，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致，HPLC分析表明純度達(dá)到99呢以上。胰蛋白酶、II型膠原酶、特級胎牛血清、a-MEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；1，25_雙羥基維生素D3(1,25-(OH)2VitaminD3)、地塞米松、萘酚AS-BI磷酸鈉、六偶氮副品紅購自美國Sigma公司；甲苯胺藍(lán)為生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)品；乙二醇單甲醚、酒石酸鉀鈉等均為國產(chǎn)分析純試劑。新生2-4天SD大鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。溶液配制用無水乙醇分別配制10—4mol/L的淫羊藿苷、仙茅苷乙和小檗堿溶液，作為儲備液。實(shí)驗(yàn)時，用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對照組，淫羊藿苷、仙茅苷乙和小檗堿的三個劑量分別為10-5mol/L、10—6mol/L和10—7mol/L，對破骨細(xì)胞合并用藥效果研究分組見表4。表4.淫羊藿苷、仙茅苷乙和小檗堿對破骨細(xì)胞合并用藥效果研究分組表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>制備破骨細(xì)胞將第四代成骨細(xì)胞和新鮮收集的骨髓細(xì)胞共同懸浮于含10—8mol/L的1，25-(0H)2-VD3、10—7mol/L地塞米松和10%胎牛1&清的a-MEM培養(yǎng)基中，使成骨細(xì)胞的濃度為1X1()5細(xì)胞/ml，骨髓單核細(xì)胞為1X106細(xì)胞/ml，以誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞分化形成多核破骨細(xì)胞，備用。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性測定將成骨細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞懸浮接種于96孔板內(nèi)，每孔100W，于37。C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后換新鮮的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以后每3天換液一次，培養(yǎng)8天后破骨細(xì)胞分化成熟，換含10—5、10—in10—7mol/L的淫羊藿苷、仙茅苷乙和小檗堿及其組合物的培養(yǎng)基，陰性對照組加不含藥物的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時后測定TRAP的活性棄上清，PBS沖洗2次，200.1%TritonX-100室溫破碎細(xì)胞15分鐘，加入100W反應(yīng)液(0.4g對硝基苯基磷酸二鈉，去離子水溶解后加入2.0g酒石酸鉀鈉，加水溶解至150ml，HCl調(diào)節(jié)pH至3.5，再加水定容至200ml)，于37。C反應(yīng)30分鐘，迅速加入100W1mol/L的Na0H終止反應(yīng)，于波長405nm處測定其0D值。同時計(jì)數(shù)TRAP陽性細(xì)胞。以對硝基苯酚溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，TRAP活性用每孔破骨細(xì)胞生成的對硝基苯酚的nmol數(shù)表示。TRAP陽性成熟破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)將第4代成骨細(xì)胞和新鮮收集的骨髓細(xì)胞共同懸浮于含10—8mol/L的1，25-(OH)廠VDi、10—7mol/L地塞米松和10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基中，使成骨細(xì)胞的濃度為1X105個細(xì)胞/ml，骨髓單核細(xì)胞為1Xl()6個細(xì)胞/ml，接種于放有無菌玻片的96孔板內(nèi)，每孔100W，于37°C，5%0)2培養(yǎng)||中培養(yǎng)，24小時后，換含10—5、10—3和10—7mol/L的淫羊藿苷、仙茅苷乙和小檗堿及其組合物的培養(yǎng)基，陰性對照組加不含藥物的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每3天換液一次，培養(yǎng)10天后進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，光鏡下觀察，并以細(xì)胞核》3個作為破骨細(xì)胞標(biāo)志，對陽性多核破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。骨吸收陷窩數(shù)的測定如前所述，將成骨細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞懸液接種到放有骨片的96孔培養(yǎng)板上，24小時后，換含10—5、10—6和10—7mol/L的淫羊藿苷、仙茅苷乙和小檗堿及其組合物的培養(yǎng)基，陰性對照組加不含藥物的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每3天換液一次，培養(yǎng)12天后對骨片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，光鏡100倍下觀察并計(jì)數(shù)每張骨片上20個隨機(jī)視野內(nèi)骨吸收陷窩的數(shù)目，結(jié)果以陷窩數(shù)/骨片表示。藥物相互作用分析以各組藥物與對照組相比的變化率為指標(biāo)，按照金氏公式q=EA+B/(EA+EB-EAXEB)，判斷各藥物間的相互作用關(guān)系。q:0.851.15兩藥作用為單純相加1.1520兩藥作用為協(xié)同增強(qiáng)〉20兩藥作用為顯著協(xié)同增強(qiáng)0.850.05兩藥作用為拮抗〈0.55兩藥作用為明顯拮抗2實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表5可見，在10—510—7mol/L的濃度范圍內(nèi)，淫羊藿苷、小檗堿和仙茅苷乙及其組合物顯著抑制破骨細(xì)胞的形成分化、抗酒石酸酸性磷酸酶的活性，減少破骨細(xì)胞在骨片上形成的吸收陷窩的數(shù)目。淫羊藿苷、小檗堿和仙茅苷乙對破骨細(xì)胞的相互作用關(guān)系見表6。由表6可見，淫羊藿苷與小檗堿合用，在10—610—7mol/L濃度下，對破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性、破骨細(xì)胞的形成分化和破骨細(xì)胞在骨片上形成的吸收陷窩的數(shù)目的q值均大于1.15，表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用。由表6可見，淫羊藿苷與仙茅苷乙合用，在10—610—^01/L濃度下，對破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性的q值分別為1.25和1.21，表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用；對破骨細(xì)胞的形成分化和骨吸收陷窩的形成表現(xiàn)為相加抑制作用。由表6可見，小檗堿與仙茅苷乙合用，對破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為相加的抑制作用，對破骨細(xì)胞的形成分化和在骨片上形成的吸收陷窩數(shù)目的q值均大于1.15，表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用。由表6可見，淫羊藿苷、小檗堿和仙茅苷乙合用，對破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶活性和骨吸收陷窩的Q值均大于1.15，表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用。與單獨(dú)使用小檗堿和淫羊藿苷與仙茅苷乙組合物相比較，對破骨細(xì)胞的形成分化的q值分別為1.21，1.25和1.51，表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用，其它配對分析的q值均小于1.15，表現(xiàn)為相加抑制作用。表5淫羊藿苷、小檗堿、仙茅苷乙及其組合物對破骨細(xì)胞的作用(11=10，x士力組別濃度(mol/L)TRAP活性(nmol/孔)TRAP陽性細(xì)胞數(shù)量(個/孔)骨吸收陷窩數(shù)(陷窩數(shù)/骨片)陰性對照組18.1±1.56370±614930±8610-514.2±1.7"4830±372**572±49"*淫羊藿苷A210616.2±2.0*5225±356**693±42"*A310717,9±2,45885±414*806±58*Bj1。-513.6±1.5**4660±317"*551±44"*小檗堿B210615,7±1.6"5110±304**678±37"*B3icr716.7±2.0*5735±595*797±82**d1。-514.8±2.r4990±376**590±37"*仙茅苷乙c210-615.4±1.5"5420±341**704±37***c310-716.8±1.4'5730±412'812±45*淫羊藿苷+小檗堿A晶A2B2A3B3'9.8±2.1***12.8土1.8'"15.8±2.3*'3050±214"*3645±226*"4825±358**254±16"*436±17***607±32*"A，d淫羊藿苷A2C2+仙茅苷乙A3C311.1±2.4***12.7±2.1"*16.3±1.8*4050±201"*4575±267"*5425±326"306±21***483±30"*674±51**B，d小檗堿B2C2+仙茅苷乙B3C312.2±1.6***13.8±2.(T15.8±1.6**3135±185*"3725±245"*4610±315***279±14"*402±19*"652±34"*淫羊藿苷氣B^6.5±1.8***2235±127**'63±8*"+小檗堿A2B2C29.6±1.5"*3005±203***157±12+仙茅苷乙A3B3C312.8±2.0*"4120±276***409±28*"與對照組相比較，*P<0.05,**i<0.01，***i><0.001表6淫羊藿苷、小檗堿、仙茅苷乙合用對破骨細(xì)胞作用效果分析組別TRAP活性破骨細(xì)胞數(shù)量骨吸收陷窩數(shù)淫羊藿苷+小檗堿A2B2A3B31.121.311.451.171.251,441.141.161.35淫羊藿苷1,080.901,10+仙茅苷A2C21.250.931.10乙A3C31.210.881.13小檗堿+仙茅苷乙B，dB2C2B3C30.850.910.881.191.311.451.121.271.19A晶G1.361.041.141.191.211.16d+A晶1.151.041.13淫羊藿苷-、B2C2A2+B2C21,481.021.23+小檗堿+B2+A2C21.201.251.34仙茅苷乙C2+A2B21.181,031.29A3B3C;3A3+B3C32,141.071.43B3+A3C31.731.511.48C3+A3B31,541.111.30三、淫羊藿苷、知母皂苷BII、小檗堿和仙茅苷乙組合物對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的作用實(shí)驗(yàn)1材料和方法材料和試劑淫羊藿苷和小檗堿為陜西慧科植物丌發(fā)有限公司產(chǎn)品，純度為99%以上，知母皂苷BII和仙茅苷乙為本課題組自制，并經(jīng)核磁共振氫譜、質(zhì)譜等波譜分析，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致，HPLC分析表明純度達(dá)到99%以上。陽性對照藥尼爾雌醇片，購自上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司新華聯(lián)制藥廠，批號080801)。血清堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶測定試劑盒，購自南京建成生物工程公司。血清骨保護(hù)素ELISA試劑盒購自美國RapidBioTM。外周骨定量計(jì)算機(jī)斷層掃描儀(pQCT，peripheralQuantitativeComputedTomography,XCTReasearchSA)，德國Stratec公司產(chǎn)品；全自動定量繪圖酶標(biāo)儀，美國BIOTECK產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，上海天美公司產(chǎn)品動物3月齡雌性昆明種小鼠，體重2530g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。實(shí)驗(yàn)分組將3月齡雌性昆明種小鼠隨機(jī)分組，每組10只，包括假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(0VX)，尼爾雌醇陽性對照組(nilestriol)及不同劑量的各藥物及其配伍組。假手術(shù)、模型組小鼠灌胃0.1ml/10g生理鹽水；陽性對照組每周灌胃一次，0.2mg/ml的尼爾雌醇，2mg/kg;淫羊藿苷的劑量分別為15mg/kg、45mg/kg、135mg/kg;知母皂苷BII組的劑量分別為50mg/kg、150mg/kg、450mg/kg;小檗堿的劑量分別為小檗堿150mg/kg、450mg/kg、1350mg/kg;仙茅苷乙的劑量為7mg/kg、21mg/kg、63mg/kg;各給藥組每周灌胃6次，所有藥液均用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制。合并用藥效果研究分組見表7。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，各組小鼠在2%戊巴比妥鈉麻醉下，無菌操作，腹部肋下切開皮膚、肌肉，暴露腹腔，找出雙側(cè)卵巢，Sham組保留之，其余各組切除之。所有動物在2428"C，通風(fēng)良好動物房內(nèi)飼養(yǎng)，每周稱量體重一次，以調(diào)整給藥劑量。12周后，眼眶取血，分離血清，測定血清生化指標(biāo)；處死小鼠，取出子宮，稱量子宮重量；分離右側(cè)脛骨，用75%酒精固定，以備閃CT測定骨密度。表7.淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿合并用藥效果研究分組表<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>淫羊藿苷+知母皂苷BII+仙茅苷乙+小檗堿15+50+7+15045+150+21+450135+450+63+1350血清生化指標(biāo)的測定血清堿性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶酶活性的測定采用南京建成公司生產(chǎn)的試劑盒，按照說明書進(jìn)行。血清骨保護(hù)素的含量采用ELISA試劑盒，按照說明書進(jìn)行測定。骨密度的測定脛骨以外周骨定量計(jì)算機(jī)斷層掃描儀(PQCT)于近骨骺線3mm處測定其骨密度(BMD)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)均采用SPSS13.0軟件，進(jìn)行均值和方差處理，參數(shù)值用均值士標(biāo)準(zhǔn)差U士》表示，組間比較采用Dunnett，sMultipleComparisontest檢驗(yàn)，代O.05為有顯著性差異。藥物相互作用分析以各組藥物與對照組相比的變化率為指標(biāo)，按照金氏公式q=EA+B/(EA+EB-EAXEB)，判斷各藥物間的相互作用關(guān)系。q:0.851.15兩藥作用為單純相加1.1520兩藥作用為協(xié)同增強(qiáng)兩藥作用為顯著協(xié)同增強(qiáng)兩藥作用為拮抗兩藥作用為明顯拮抗2實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表8可見，小鼠去卵巢后，子宮發(fā)育受到抑制，去卵巢組與正常組比較，小鼠子宮重量減輕77%。陽性對照藥物尼爾雌醇顯著增加去卵巢小鼠的子宮重量。但淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿及其組合物對去卵巢小鼠的體重和子宮重量均無顯著的影響，說明本發(fā)明的抗骨質(zhì)疏松藥物組合物對小鼠子宮沒有刺激作用。表8淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿及其組合物對去卵巢小鼠體重和子宮重量的影響(n=10，x±s)〉200.850.05<0.55<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>與模型對照組相比較，*i><0.05，**/<0.01，***/<0.001由表9可見，淫羊藿苷在15135mg/kg的濃度范圍內(nèi)，顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨鈣素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性。由表9可見，知母皂苷BII在50450mg/kg的濃度范圍內(nèi)，顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨鈣素水平，但對血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性沒有顯著的影響。由表9可見，仙茅苷乙在763mg/kg的濃度范圍內(nèi)，顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性，但對血清堿性磷酸酶活性和骨鈣素水平?jīng)]有顯著的影響。由表9可見，小檗堿在1501350mg/kg的濃度范圍內(nèi)，顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性，但對血清堿性磷酸酶活性和骨鈣素水平?jīng)]有顯著的影響。由表9可見，淫羊藿苷與知母皂苷BII合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性。由表io可見，與單獨(dú)使用淫羊藿苷或知母皂苷相比，二者組合物對去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和抗酒石酸酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為相加作用，對血清骨鈣素水平不同劑量組合物q值分別為1.20、1.19和1.15，表現(xiàn)為協(xié)同作用。由表9可見，淫羊藿苷與仙茅苷乙合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶水平。由表10可見，與單獨(dú)使用淫羊藿苷或仙茅苷乙相比，二者組合物對小鼠骨密度的q值分別為1.02，1.01和1.17，對血清堿性磷酸酶活性的q值分別為1.42，1.03和1.25，對骨保護(hù)素水平的q值分別為1.25，0.96和1.07表現(xiàn)為協(xié)同增加作用，對血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為相加抑制作用。由表9可見，淫羊藿苷與小檗堿合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶水平。由表10可見，與單獨(dú)使用淫羊藿苷或小檗堿相比，對小鼠骨密度和血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為相加作用；對血清堿性磷酸酶的q值分別為1.03，1.12，1.23，對血清骨保護(hù)素的q值分別為1.22，0.99，1.06，表現(xiàn)為協(xié)同促進(jìn)作用。由表9可見，知母皂苷BII與仙茅苷乙合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶水平。由表10可見，與單獨(dú)使用知母皂苷BII或仙茅苷乙相比，對小鼠骨密度的q值分別為1.05，1.02，1.16，對血清堿性磷酸酶的q值分別為1.16，1.12，1.33，對血清骨保護(hù)素的Q值分別為1.18，1.08,1.10，均表現(xiàn)為協(xié)同增加作用；對血清抗酒石酸酸性磷酸酶的活性表現(xiàn)為相加抑制作用。由表9可見，知母皂苷BII與小檗堿合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶水平。由表10可見，與單獨(dú)使用知母皂苷BII或小檗堿相比，對小鼠骨密度、血清骨保護(hù)素水平和抗酒石酸酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為相加作用；對血清堿性磷酸酶活性的q值分別為1.16，1.20，1.13，表現(xiàn)為協(xié)同增強(qiáng)作用。由表9可見，仙茅苷乙與小檗堿合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性，但對血清堿性磷酸酶活性和骨鈣素水平?jīng)]有顯著影響。由表10可見，與單獨(dú)使用仙茅苷乙或小檗堿相比，對小鼠骨密度和抗酒石酸酸性磷酸酶的q值均為1.17，表現(xiàn)為協(xié)同作用；對小鼠血清堿性磷酸酶的活性和骨保護(hù)素的水平的Q值分別為1.33和1.17，表現(xiàn)為協(xié)同作用。由表9可見，淫羊藿苷、知母皂苷BII與仙茅苷乙合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性。由表10可見，與單獨(dú)使用淫羊藿苷、或知母皂苷BII或仙茅苷乙及其組合物相比，對小鼠骨密度和抗酒石酸酸性磷酸酶表現(xiàn)為相加作用，對血清堿性磷酸酶和骨保護(hù)素水平表現(xiàn)為協(xié)同增加作用。由表9可見，淫羊藿苷、知母皂苷BII與小檗堿合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性。由表10可見，與單獨(dú)使用淫羊藿苷、或知母皂苷BII或小檗堿及其組合物相比，對血清骨保護(hù)素水平表現(xiàn)為協(xié)同增加作用，對骨密度、血清堿性磷酸酶水平和血清抗酒石酸酸性磷酸酶水平表現(xiàn)為相加作用。由表9可見，淫羊藿苷、仙茅苷乙與小檗堿合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性。由表10可見，與單獨(dú)使用淫羊藿苷、或仙茅苷乙或小檗堿及其組合物相比，對去卵巢小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平表現(xiàn)為協(xié)同增強(qiáng)作用，對血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性表現(xiàn)為相加抑制作用。由表9可見，知母皂苷BII、仙茅苷乙與小檗堿合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性。由表10可見，與單獨(dú)使用知母皂苷BII、或仙茅苷乙或小檗堿及其組合物相比，對去卵巢小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶、骨保護(hù)素水平和抗酒石酸酸性磷酸酶水平均表現(xiàn)為協(xié)同作用。由表9可見，淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙與小檗堿合用顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶活性和骨保護(hù)素水平，降低血清抗酒石酸酸性磷酸酶活性。由表10可見，與單獨(dú)使用淫羊藿苷、知母皂苷BII、或仙茅苷乙或小檗堿及其組合物相比，對去卵巢小鼠的骨密度、血清堿性磷酸酶、骨保護(hù)素水平和抗酒石酸酸性磷酸酶水平均表現(xiàn)為協(xié)同作用。表9淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿組合物對去卵巢小鼠骨密度和血清生化指標(biāo)的影響(n=10，x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>B3450428±27*6.3±0.5*317±22*12.5±1.4仙茅苷乙d411±32*5.5±0.3272±3711.7±1.5*c221421±2r5,6±0.6275±2711.4±0.9*c363427±17*5.4±0.7275±2110.9±1.6**小檗堿D，50408±24*5.6±0.7270±4111.9土1.rD2450417±35*5.5±0.3272±2911.5±1.8*D31350428±29*5.7±0.6269±3211.0±0.8**淫羊藿苷+知母皂苷BllA晶437±13**6.4±0.5*312±25*12.2±1.4A2B2466±31**7,3±0.5**366±32**11.7±1.5*A3B3475±26***7.2±0.7**374±21**11.3±1.34淫羊藿苷+仙茅苷乙A，d439±36**6.1±0.5*300±3411.2±0.8*A2C2457±28**6,5±0.4*320土7711濕±0.4**A3C3484±33***6.4±0.6*331±37*9.6±1.0***淫羊藿苷+小檗堿A晶442±48*6.0±0.7297±4211.4±1.3*A2D2454±32"6.5±0.8*319±36*10.4±1.2**A3D3473±36**6.7±0.5**325±27*9.9±1.3***知母皂苷Bll+仙茅苷乙B，d435±50*6.2±0.8*290±4011.5土1.3'B2C2455±67"6.7±0,7**319±32*11.2土1.3'B3C3479±54**6.6±0.6**325±52*10.5±1.3**知母皂苷Bll+小檗堿434±45*6.3±0.7285±2911.7±1.3*B2D2460±52**6.7±0.4**317±43*11.2±1.3*B3D3470±51**6.7±1.0*324±39*10.7±1.3**仙茅苷乙+小檗堿435±14'5.7±0.5273±2410.8±1.4**C2D2462±16"5.7±0.7279±329.7±1.8*"C3D3468±23**5.8±0.5276±349.4±1.6***淫羊藿苷+知母皂苷BII+仙茅苷乙470±57"6.6±0.5*316±49*11.0±1.2*A2B2C2495±60*"7.6±0.7***369±42**10.1±1.2**A3B3C3526±38***7.5±0.8***377±29**9.3±1.2*"淫羊藿苷+知母皂苷BII+小檗堿468±40"6.7±0.9**310±35*11.2±1.2*A2B2D2491±34***7.5±0.7***365±35**10.3±1.2**26<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>與模型對照組相比較，*尸<0.05,**戶<0.01，***i><0.001表10淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿合用對去卵巢小鼠的相互作用效果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>注二個成分或四個成分相互作用的q值為與各種不同組合相比較時的取值范圍。該組合物能夠協(xié)同促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，通過對骨代謝多個相關(guān)指標(biāo)的協(xié)同調(diào)節(jié)，增強(qiáng)抗骨質(zhì)疏松作用，達(dá)到預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的目的，可以用于制備防治骨質(zhì)疏松的藥物。權(quán)利要求1.一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，分別由淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿中的任意兩種、三種或四種組分組成，其特征在于該組合物由以下組分的重量份組成淫羊藿苷0～135份知母皂苷BII0～450份仙茅苷乙0～63份小檗堿0～1350份。2.按照權(quán)利要求1所述的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其特征在于該組合物分別由以下任意兩種組分的重量份組成(1)淫羊藿苷15135份知母皂苷BII50450份；(2)淫羊藿苷15135份仙茅苷乙763份；(3)淫羊藿苷15135份小檗堿1501350份；(4)知母皂苷BI150450份仙茅苷乙763份；(5)知母皂苷BI150450份小檗堿1501350份；(6)仙茅苷乙763份小檗堿1501350份。3.按照權(quán)利要求1或2所述的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其特征在于該組合物分別由以下任意兩種組分的重量份組成(1)淫羊藿苷45份知母皂苷BII150份；(2)淫羊藿苷135份仙茅苷乙63份；(3)淫羊藿苷15份小檗堿150份；(4)知母皂苷BI1450份仙茅苷乙63份；(5)知母皂苷BII150份小檗堿450份；(6)仙茅苷乙21份小檗堿450份。4.按照權(quán)利要求1所述的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其特征在于該組合物分別由以下任意三種組分的重量份組成(1)淫羊藿苷15135份知母皂苷BII50450份仙茅苷乙763份;(2)淫羊藿苷15135份知母皂苷BII50450份小檗堿1501350份；(3)淫羊藿苷15135份仙茅苷乙763份小檗堿1501350份；(4)知母皂苷BI150450份仙茅苷乙763份小檗堿1501350份。5.按照權(quán)利要求1或4所述的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其特征在于該組合物分別由以下任意三種組分的重量份組成(1)淫羊藿苷15份知母皂苷BII50份仙茅苷乙7份；(2)淫羊藿苷135份知母皂苷BII450份小檗堿1350份；(3)淫羊藿苷15份仙茅苷乙7份小檗堿150份；(4)知母皂苷BI150份仙茅苷乙7份小檗堿150份。6.按照權(quán)利要求1所述的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其特征在于該組合物由四種組分的重量份組成淫羊藿苷15135份知母皂苷BII50450份仙茅苷乙763份小檗堿1501350份。7.按照權(quán)利要求1或6所述的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其特征在于該組合物由四種組分的重量份組成:淫羊藿苷135份知母皂苷BII450份仙茅苷乙63份小檗堿1350份。8.權(quán)利要求1所述的一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物在制備防治骨質(zhì)疏松的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
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，是一種抗骨質(zhì)疏松的藥物組合物，該組合物分別由淫羊藿苷、知母皂苷BII、仙茅苷乙和小檗堿中的任意兩種、三種或四種組分組成，其特征在于該組合物由以下組分的重量份組成淫羊藿苷0～135份、知母皂苷BII0～450份、仙茅苷乙0～63份、小檗堿0～1350份。該組合物能夠協(xié)同促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，通過對骨代謝多個相關(guān)指標(biāo)的協(xié)同調(diào)節(jié)，增強(qiáng)抗骨質(zhì)疏松作用，達(dá)到預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的目的，可以用于制備防治骨質(zhì)疏松的藥物。文檔編號A61K31/7034GK101543504SQ20091005057公開日2009年9月30日申請日期2009年5月5日優(yōu)先權(quán)日2009年5月5日發(fā)明者張巧艷,磊焦,菲燕,秦路平,婷韓申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)