專利名稱：人成纖維細胞生長因子-21(hFGF-21)的N-末端化學(xué)修飾及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用聚乙二醇(PEG)N末端化學(xué)修飾人成纖維細胞生長因 子-21 (hFGF-21)的偶聯(lián)物，還涉及該偶聯(lián)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
成纖維細胞生長因子(FGF)是一種多功能非特異性的活性物質(zhì)?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)該成纖維 細胞生長因子家族(FGFs)共有23個成員，即FGF-I到FGF-23 (Olsen SH et al.，J Biol Chem278 :34226_34236，2003)。它們功能各異，主要由成纖維細胞，內(nèi)皮細胞，骨細胞，多形 細胞等分泌，相對分子量一般在17_34kD，其中心區(qū)域的氨基酸含有30% -70%的同源性。FGF-21是FGF家族的一個新成員，屬于FGF-19亞家族；最先從老鼠胚胎中分離得 到，是一種分泌蛋白；主要在肝臟中表達，少量表達于胸腺。人FGF-21 (hFGF-21) cDNA編碼 209個氨基酸，N端前28個氨基酸為信號肽序列，其后181個氨基酸為人FGF-21成熟氨基 酸序列。hFGF-21與hFGF-19、hFGF-23以及鼠的FGF-21的氨基酸序列相比分別有35%、 24%和 75%的同源性(Nishimura et al.，Biochim Biophys Acta 1492:203-206,2000)。臨床前研究顯示，hFGF-21的主要生物學(xué)功能表現(xiàn)在糖脂代謝調(diào)控方面。hFGF-21 的代謝調(diào)節(jié)功能所表現(xiàn)出的作用與胰島素類似，它可以增強胰島素的敏感性，改善β 細胞功能及其存活率，降低血糖，改善胰島素抵抗，卻不出現(xiàn)低血糖的不良反應(yīng)；同時 它能有效降低血脂，對脂代謝和動脈粥樣硬化也有重要的作用(A Kharitonenkov et al., J Clin Invest 115 1627-1635,2005 ；Wente et al. , Diabetes 55:2470—2478， 2006 ；A Kharitonenkov et al. Endocrinology 148 774-781,2007 ；A Kharitonenkov et al. , Biodrugs. 22(1) 37-44,2008 ；AKharitonenkoν et al. , Current Opinion in Investigational Drugs 10:359_364，2009)。因此hFGF-21的研究以及在臨床上的應(yīng)用前 景日益受到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)hFGF-21在體內(nèi)半衰期短，這限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。在其他治 療用蛋白質(zhì)藥物的研究中，發(fā)現(xiàn)了解決蛋白類藥物在機體內(nèi)半衰期短和免疫原性等問題的 方法。其中方法之一，是將蛋白質(zhì)與水溶性聚合物共價結(jié)合成偶聯(lián)物。其中所使用的水溶 性聚合物包括聚乳糖、聚乙二醇、聚合氨基酸等，而聚乙二醇的使用較為普遍。聚乙二醇-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物具有良好的熱穩(wěn)定性、抗酶解、增加水溶性、延長半衰 期、降低免疫原性和毒性等優(yōu)勢(Inada, et al.，J. Bioact. And Compatible Polymers, 5 343(1990) ；Delgalo, etal. ,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems, 9:249(1992) ；katre,Advanced DrugDelivery Systems，10 :91 (1993))。自 1991 年第一禾中 用PEG修飾的藥物PEG-ADA被FDA批準上市后，制藥公司們積極推進PEG修飾藥物蛋白質(zhì) 的技術(shù)。近幾年上市的的產(chǎn)品有PEG-干擾素、PEG-粒細胞集落刺激因子、PEG-天冬酰胺 酶、PEG-生長抑素以及PEG化單鏈抗體等；而且，還有數(shù)幾十種PEG修飾的蛋白藥物處于研 究或臨床實驗階段。
專利PCT2005/113606 報道用 IgG4_Fc 或 BSA 同 FGF-21 融合，形成一種 hFGF-21 融合蛋白。該蛋白能有效改善hFGF-21在體內(nèi)的藥代動力學(xué)，可用于治療2型糖尿病、肥胖 癥或代謝綜合癥。專利PCT2005/091944報道用聚乙二醇修飾hFGF-21的Lys的ε -氨基 和其Cys的巰基，該修飾后的hFGF-21也能有效改善TOF-21在體內(nèi)的藥代動力學(xué)。本發(fā)明 采用N末端修飾方法修飾人成纖維細胞生長因子-21及其突變體或變異體，形成單一位點 PEG修飾的均一產(chǎn)物。通過實施能有效改善hFGF-21在體內(nèi)的藥代動力學(xué)，可適用于治療2 型糖尿病、肥胖癥或代謝綜合癥的一種藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種使用聚乙二醇(PEG)N末端化學(xué)修飾人成纖維細胞生 長因子-21 (hFGF-21)的偶聯(lián)物；同時，該偶聯(lián)物可用于制備治療2型糖尿病、肥胖癥或代謝 綜合癥的藥物。對于聚乙二醇分子來說，可通過多種方法將其加到蛋白質(zhì)上?？偟膩碚f，聚乙二醇 分子是通過一個分子上的反應(yīng)基團而聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上的。PEG偶聯(lián)的主要基團是氨基、 巰基和羧基(Veroneee FM, Biomaterials, 2001, 22 :405)，絕大部分修飾劑主要與Lys的
ε -氨基和N-末端的氨基進行共價偶聯(lián)的。目前的方法顯示，任何活化的PEG (包括SPA、 OTS、NH2, NPC、SS、SC等)與Lys的ε -氨基反應(yīng)時，易造成產(chǎn)物的不均一性。如果這些治 療蛋白質(zhì)在組合物中各批量間有區(qū)別，人們將無法對其生物活性進行預(yù)測。不同位點的的 聚乙二醇分子穩(wěn)定性不同。如果這些分子是隨機附著而因此隨機解離，那么治療用PEG化 蛋白質(zhì)的藥物動力學(xué)就不可能準確預(yù)測。本發(fā)明采用一種醛基化的PEG對人成纖維細胞生長因子-21進行修飾，選擇性激 活hFGF-21的N-末端殘基的氨基基團，使PEG專一性共價結(jié)合hFGF-21的N-末端，從而形 成穩(wěn)定和單一的PEG修飾偶聯(lián)物。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種修飾的人成纖維細胞生長因子-21， 其中每一分子人成纖維細胞生長因子-21的N-末端與一分子的聚乙二醇類聚合物通過化 學(xué)鍵相偶聯(lián)(PEG-rhFGF-21)。所述聚乙二醇為醛基活化的mPEG，包括甲醛基、乙醛基、丙 醛基、丁醛基、戊醛基等，優(yōu)選丙醛基和丁醛基活化的mPEG。優(yōu)選的丙醛基和丁醛基活化的 mPEG分子量為10KD-40KD，進一步優(yōu)選丁醛基活化的mPEG的分子量為20KD。修飾后的人成 纖維細胞生長因子-21經(jīng)常規(guī)的柱層析色譜分離純化后，純度大于95%。所述的人成纖維細胞生長因子-21為天然的人成纖維細胞生長因子-21或天然人 成纖維細胞生長因子-21的突變體或天然人成纖維細胞生長因子-21的變異體。天然人 FGF-21 (hFGF-21) cDNA編碼209個氨基酸，其N端含有28個信號肽序列，其后181個氨基酸 為人成熟氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。所述的天然人成纖維細胞生長因子-21的突變體或天然人成纖維細胞生長因 子-21的變異體指的是天然人成纖維細胞生長因子-21的至少一個氨基酸被另一個氨基酸 取代或天然人成纖維細胞生長因子-21的氨基酸序列被延長或被截斷，或天然人成纖維細 胞生長因子-21的至少一個氨基酸被另一個氨基酸取代的同時人成纖維細胞生長因子-21 的氨基酸序列被延長或被截斷。人成纖維細胞生長因子-21的結(jié)構(gòu)和功能在近年得到廣泛的研究(Reuss et al.，Cell TissueRes. 313 :139_157(2003) ；Olsen SH et al.，J Biol Chem 278 :34226_34236， 2003 ；AKharitonenkovet al., J Clin Invest 115 1627-1635,2005 ；Wente et al., Diabetes 55 2470-2478,2006 ；AKharitonenkov et al. Endocrinology 148:774—781， 2007 ；A Kharitonenkov et al. ， Biodrugs. 22(1) 37-44,2008 ；AKharitonenkov et al.， Current Opinion in Investigational Drugs 10:359-364,2009) ；Ryden Μ. Cell Mol Life Sci. 2009Mar 11 ；Micanovic R et al. ,J Cell Physiol. 2009May ；219 (2) :227_34·； Yie J et al. ,FEBS Lett. 2009Jan 5 ；583(1) :19_24.)，為了提高其穩(wěn)定性和臨床應(yīng)用，對 其結(jié)構(gòu)進行了一定的突變和變異。如專利CN101010338A，通過氨基酸的取代，改變FGF-21 的糖基化數(shù)量和類型；專利PCT 2006/065582，用帶電的和/或極性但不帶電荷的氨基酸 取代 hFGF-21 Kglutamine 54，arginine 77，leucine 139，alanine 145，leucine 146， isoleucine 152，glutamine 156，glycine 161，serine 163 氨基酸等。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，人成纖維細胞生長因子-21是通過基因重組技術(shù)，經(jīng)宿 主表達和純化而得的重組人成纖維細胞生長因子-21 (rhFGF-21)。所述宿主體系主要指大 腸桿菌或酵母。本發(fā)明還提供了通過N末端PEG修飾后的人成纖維細胞生長因子-21或其突變體 和變異體能有效改善hFGF-21在體內(nèi)的藥代動力學(xué)，作為用于制備治療2型糖尿病、肥胖癥 或代謝綜合癥的藥物。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用CD-I鼠研究N末端PEG修飾后的重組人成纖維細胞生 長因子-21(PEG-rhFGF-21)在體內(nèi)的藥代動力學(xué)；采用3T3-LI脂肪細胞和Ob/ob小鼠模型 研究PEG-rhFGF-21的體內(nèi)外生物活性。該藥物的有效劑量指的是能夠有效實現(xiàn)治療2型糖尿病、肥胖癥或代謝綜合癥的 所需醫(yī)學(xué)效果的量。本文涉及的所有專利和出版物引為參考。


圖1為pET-3c-FGF_21的構(gòu)建示意圖。圖2為rh-CNTF在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE圖譜，其中1為誘導(dǎo)前；2為誘導(dǎo) 3hr ；3為誘導(dǎo)4hr ；M為蛋白質(zhì)marker。圖 3 為 mPEG-ButylALD-20KD 修飾 rhFGF-21 的 SDS-PAGE 圖，其中 M 為蛋白質(zhì) marker ；1 為 rhFGF-21 ；2 為 mPEG-ButylALD_20KD 對 rhFGF-21 的修飾。圖 4 為 mPEG-PropionALD-40KD 修飾 rhFGF-21 的 SDS-PAGE 圖，其中 M 為蛋白質(zhì) marker ；1 為 rhFGF-21 ；2 為 mPEG-PropionALD_40KD 對 rhFGF-21 的修飾。
具體實施例方式以下實施實例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實例1、rhFGF-21的上游構(gòu)建與表達根據(jù)Gene Bank獲得人FGF_21cDNA序列后進行大腸桿菌偏愛密碼子改變，設(shè)計 FGF-21的表達cDNA序列(SEQ ID NO :2)，序列5，端和3，分別設(shè)計限制性內(nèi)切酶Nde I 和BamHI位點。委托寶生物工程(大連)有限公司全基因人工合成，并嵌入pMD_19_T載體且命名為pMD-FGF-21。質(zhì)粒pMD-FGF_21/DH5 α和表達載體質(zhì)粒pET_3c用限制性內(nèi)切酶 Nde I和BamH I雙酶切，根據(jù)1 %瓊脂糖電泳結(jié)果，回收pET_3c酶切后約4638bp的片段，回 收pMD-FGF-21酶切后的FGF_21cDNA約550bp的片段，將兩個片段用T4連接酶進行連接。 用LA (胰蛋白胨2g，酵母提取物lg, NaCl 2g，瓊脂3g，加水定溶至200mL，121°C，高壓滅菌 30min,當(dāng)溫度降到50°C左右時加入Amp至終濃度為100ug/mL，取適量倒培養(yǎng)皿，凝固后即 成LA瓊脂平板)平板篩選重組子，Nde I和BamH I雙酶切鑒定陽性克隆。正確質(zhì)粒命名 為 pET-3c-FGF-21(圖 1)。再將質(zhì)粒 pET-3c-FGF_21 轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3) plysS 宿主菌中，篩選 目的蛋白表達的工程菌命名pET-3c-FGF-21/BL21(DE3) plysS。用于表達的載體和宿主菌菌 購于Novagen公司，Nde I和BamH I酶購于寶生物工程(大連)有限公司。
將上述表達最佳工程菌株劃線接種于LA瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)的 LA平板上挑取菌苔接種于含LB液體培養(yǎng)基試管中，37°C培養(yǎng)12小時。然后按的比例 轉(zhuǎn)接到含200mL LB培養(yǎng)液的IOOOmL三角瓶中，37°C培養(yǎng)過夜即成為上罐種子液。將上罐 種子液按5%的比例接種于含20L M9YT培養(yǎng)液的30L發(fā)酵罐中，37°C培養(yǎng)。整過發(fā)酵過程 中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通空氣量、通純氧量來保持溶氧在30%以上，用28%的氨水調(diào)節(jié)pH并保 持在7. O。至菌液0D600 = 10 14時，加入終濃度為0. 5mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4小時獲得高 效hFGF-21 (圖2)，SOOOrpm離心10分鐘，收集菌液，棄上清，收集菌體放入_20°C冰箱保存 實例 2、rhFGF-21 的純化從_20°C冰箱中取出菌體，按加入細菌裂解液(50mM Tris-HCl ρΗΙΟ. O, IOmM EDTA，0. 2mg/mL溶菌酶)中，37°C下攪拌1小時。冷卻后超聲(400W，工作時間5s，間歇 5s，超聲40個循環(huán))，12000rpm離心10分鐘棄上清，沉淀用溶液A (20mM Tris-HCl pH 10， 1 OmMEDTA, 2M urea, 1% TritonX-100)洗滌，37°C攪拌 30min，12000rpm 離心 10 分鐘，棄上 清。沉淀再用溶液 B(20mM Tris-HCl pH 10,4M urea, 1. OM NaCl)洗滌，37°C攪拌 30min，再 12000rpm離心10分鐘，收集包涵體(沉淀)。包涵體用溶解液(8M尿素，IOmM乙醇胺，PH11. 5，1/1000 β β _ME，2mM EDTA)溶解， 除去不溶物后，溶解液用Q-S印harose FF柱分離。用Q-S印harose FF平衡液(8M尿素， IOmM 乙醇胺，PH11. 5，1/1000 β -ME, 2mM/L EDTA)平衡 Q_s印harose FF 柱，上樣溶解液樣 品，再平衡。用0-500mM/L的NaCl線性洗脫，收集目的洗脫峰。包涵體的復(fù)性經(jīng)Q-s印harose純化的目的蛋白置于4°C復(fù)性液(20mMTris_HCl pH9. 0)中進行透析復(fù)性H或稀釋復(fù)性12小時。復(fù)性液經(jīng)RP-HPLC(Waters公司C18柱純化流動相A液(0. 1 %三氟乙酸、5%乙 腈)，流動相B液(0. 三氟乙酸、95%乙腈)，0-100% B線性洗脫，進一步純化復(fù)性后的 rhFGF-21 蛋白。經(jīng) RP-HPLC 純化的目的蛋白再經(jīng) Superdex-75 (Amersham Biosciences) (緩沖為IOmm的磷酸鹽緩沖，pH7. 4)凝膠柱層析獲得rhFGF-21的純度可達95%以上。實例3、mPEG-ButylALD-20KD 對 rhFGF-21 的修飾rhFGF-21溶液由實例2制備，mPEG-ButylALD_20KD (相對分子質(zhì)量為20 X IO3)，氰 基硼氫化鈉(CH3BNNa)溶液作為α-NH2的活化劑。rhFGF-21溶液經(jīng)對IOOmM PB pH5. 0透析后，加入CH3BNNa終濃度為20mM。取 rhFGF-21 與 mPEG-ButylALD-20KD 質(zhì)量比 1 2，4°C條件下，100r/min 攪拌，反應(yīng) 24hr，取樣進行SDS-PAGE電泳(圖3)，確定PEG-20-FGF-21的修飾比例，其修飾率達到75%。
實例4、mPEG-Prop ionALD-40KD 對 rhFGF-21 的修飾rhFGF-21溶液經(jīng)對100mM/L PB pH5. O透析后，加入CH3BNNa終濃度為20mM。取 rhFGF-21 與 mPEG-ButylALD_40KD 質(zhì)量比 1 3，4°C條件下，100r/min 攪拌，反應(yīng) 24hr，取 樣進行SDS-PAGE電泳(圖4)，確定PEG-40-FGF-21的修飾比例，其修飾率達到70%。
實例5、PEG-FGF-21 的純化修飾后樣品PEG-FGF-21 (包括20KD和40KD PEG修飾)，用DDW稀釋5_10倍后，調(diào) PH至8. O。采用Source 15-Q進一步分離純化。用平衡液(50mM Tris-HCl pH8. 0)平衡后， 上樣再平衡。用0-500mM的NaCl線性洗脫，收集不含未修飾的rhFGF-21的PEG-20-FGF-21 或 PEG-40-FGF-21 洗脫峰。
實例6、PEG-20-FGF-21 和 PEG-40-FGF-21 體外生物活性測定3T3-L1前體脂肪細胞培養(yǎng)于含10% FBS的高糖DMEM中培養(yǎng)中，在37°C、5% C02， 飽和濕度條件下培養(yǎng)，以2. 5 X IO4密度將細胞接種于12孔板中。待細胞生長至接觸抑制 時，用脂肪分化液 1(含 10% FBS,0. 25ymol/L dexamethasone、0· 5mmol/L IBMX、5mg/L 重 組人胰島素)的DMEM培養(yǎng)基分化48h后。再用脂肪分化液II (含10% FBS、5mg/L重組人 胰島素的DMEM培養(yǎng)基)繼續(xù)分化48h，此后用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2d 換1次液直到90%以上(IOd左右)的細胞表現(xiàn)出脂肪細胞特征。已分化的成熟3T32L1脂肪細胞饑餓12h，分別將rhFGF-21、PEG-20_FGF_21和 PEG-40-FGF-21用細胞培養(yǎng)液(含0. 2% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基)稀釋成以下不同的濃度 (100nm、20nm、4nm、0. 8nm、0. 16nm、0. 032nm)，分別處理細胞 24h_48h 后，分別取上清培養(yǎng)基 測定葡萄糖的含量，采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(G0D-P0D)測定，運用統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果。結(jié)果顯示(圖5)，不同濃度的 rhFGF-21、PEG-20-FGF-21 和 PEG-40-FGF-21 處理小鼠3T32L1脂肪細胞后，對葡萄糖的攝取利用顯著增加，呈劑量依賴關(guān)系。其中 PEG-20-FGF-21和PEG-40-FGF-21提高葡萄糖攝取利用率潛能比FGF-21有所降低。在相同 濃度條件下，PEG-20-FGF-21保留65%左右，PEG-40-FGF-21保留50%左右。實例7、PEG-FGF-21在⑶-1小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué) 取 CD-I 小鼠 48 只，隨機分成三組(PEG-20-FGF-21 組，PEG-40-FGF-21 組， rhFGF-21組)。每組按0. 4mg/kg皮下注射，于注射后0到144hr間，間隔多次取血。采用 FGF-21ELISAKit(康肽生物公司)測定血中FGF-21的血藥濃度，計算半衰期。
權(quán)利要求
一種化學(xué)修飾的人成纖維細胞生長因子 21(hFGF 21)偶聯(lián)物，其特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)通式式中mPEG (CH2)n C 為醛基聚乙二醇鏈，其中n為1至7的整數(shù)；NH 為N末端氨基；FGF 21為人成纖維細胞生長因子 21。F2009101046529C0000011.tif,F2009101046529C0000012.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人成纖維細胞生長因子-21偶聯(lián)物，其特征在于，所述人成纖 維細胞生長因子-21為天然人成纖維細胞生長因子-21或天然人成纖維細胞生長因子-21 的突變體或天然人成纖維細胞生長因子-21的變異體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FGF-21偶聯(lián)物，其特征在于，所述偶聯(lián)部分是直鏈或分支鏈聚乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)修飾，其特征在于，聚乙二醇以N末端化學(xué)修飾人成纖維 細胞生長因子-21。
5.根據(jù)權(quán)利要求3、4任一項所述的聚乙二醇，其特征在于，所述聚乙二醇為醛基活化 的mPEG，其分子量為10KD-40KD。
6. 一種人成纖維細胞生長因子_21(hFGF-21)的化學(xué)修飾偶聯(lián)物的應(yīng)用，其特征在于， 該偶聯(lián)物可用于制備治療2型糖尿病、肥胖癥或代謝綜合癥的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于，所述藥物為治療有效劑量的權(quán)利要求1、 2、4任一項所述的用聚乙二醇N末端化學(xué)修飾天然人成纖維細胞生長因子-21及其突變體 和變異體的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人成纖維細胞生長因子-21(hFGF-21)的化學(xué)修飾及其應(yīng)用。其特征為它是以分子量為10KD-40KD的聚乙二醇N末端化學(xué)修飾人成纖維細胞生長因子-21而形成的hFGF-21偶聯(lián)物。本發(fā)明的hFGF-21偶聯(lián)物修飾率高，產(chǎn)物均一；該偶聯(lián)物保持了hFGF-21在體內(nèi)的活性，改善了hFGF-21在體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)；同時，該偶聯(lián)物可用于制備治療2型糖尿病、肥胖癥或代謝綜合癥的藥物。
文檔編號A61P3/04GK101993494SQ20091010465
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者曹宇, 梅翔, 范開, 譚克海, 陳勇 申請人:重慶富進生物醫(yī)藥有限公司