一種驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及驢皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]阿膠為我國(guó)藥、食兩用傳統(tǒng)中藥材，系補(bǔ)血之上品，與人參、鹿茸并稱為“滋補(bǔ)三寶”，享譽(yù)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)。而馬科動(dòng)物驢的皮是生產(chǎn)阿膠的唯一原料。驢皮中的主要蛋白質(zhì)是I型膠原蛋白，它和血清白蛋白等多肽類(lèi)物質(zhì)、多糖類(lèi)物質(zhì)及其它小分子物質(zhì)構(gòu)成了阿膠的主要成分。但近年來(lái)由于毛驢作為畜力的角色逐漸被機(jī)械取代，加上毛驢養(yǎng)殖周期長(zhǎng)、收益慢，使我國(guó)毛驢存欄量迅速下降，因而使得市場(chǎng)對(duì)驢皮需求產(chǎn)生巨大缺口，已成為制約阿膠業(yè)發(fā)展的一大瓶頸。
[0003]針對(duì)這一問(wèn)題，一方面國(guó)家制定了相應(yīng)的策略，鼓勵(lì)并擴(kuò)大了驢的養(yǎng)殖。另一方面，結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)的知識(shí)，來(lái)提高驢皮的利用率和開(kāi)發(fā)新的阿膠生產(chǎn)途徑也是科研上急需跟進(jìn)解決的問(wèn)題。這首先需要解決的問(wèn)題就是要在體外高效快速的培養(yǎng)起驢皮成纖維細(xì)胞，以便進(jìn)一步研宄驢皮成纖維細(xì)胞合成I型膠原蛋白的調(diào)控機(jī)理。
[0004]細(xì)胞培養(yǎng)方法主要有兩種:組織塊法及酶消化法。酶消化法是培養(yǎng)上皮細(xì)胞的常用方法，但消化液的用量、消化溫度及時(shí)間不好掌握，可能導(dǎo)致細(xì)胞極易老化、凋亡等結(jié)果，消化時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)胞容易受損，解決辦法是分次收集細(xì)胞，從而使實(shí)驗(yàn)比較繁瑣。組織塊法培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，有的組織塊經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)僅得到較少的細(xì)胞，有的甚至無(wú)細(xì)胞爬出，達(dá)不到所需細(xì)胞量。目前未見(jiàn)專(zhuān)門(mén)關(guān)于驢皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的報(bào)道，而同為馬屬動(dòng)物的馬皮成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法依舊采用的是傳統(tǒng)的組織貼壁法。即剪取一塊皮膚組織，75%酒精浸泡I分鐘左右，再用含雙抗的DPBS沖洗3遍，剔除皮膚間結(jié)締組織后，將皮膚組織剪成Icm3左右的小塊，然后將其均勻分布在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶倒置后加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37.5°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4-6h后，正置培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液緩慢浸沒(méi)組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)?；蚴菍⒔M織塊直接貼于培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶中，隨后用含有10 % FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37.5°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在經(jīng)歷至少4-6天，甚至是18天之后，馬的皮膚成纖維細(xì)胞才能被傳代，進(jìn)而建立起穩(wěn)定的細(xì)胞株，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法，利用胰蛋白酶和膠原蛋白酶I先后消化作用于驢皮的組織塊，使相應(yīng)的驢皮成纖維細(xì)胞被分離出來(lái)，進(jìn)而高效快速地建立起驢皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:一種驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0007]A.取一塊驢皮組織，放入75%酒精消毒漂洗后，用含100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DPBS沖洗至少3次；
[0008]B.將驢皮組織取出并用滅菌后的手術(shù)刀片將其表皮和皮下結(jié)締組織剔除干凈，再用滅菌后的手術(shù)剪刀將其剪成肉糜狀組織塊；
[0009]C.將肉糜狀組織塊放入經(jīng)滅菌的圓底玻璃瓶中，加入0.25%胰蛋白酶在37°C溫度下孵育Ih后，再加入0.5%的膠原蛋白酶I在37°C溫度下處理6h，可見(jiàn)肉糜狀組織塊大部分都已經(jīng)消失，顯微鏡下可觀察到懸浮離散的細(xì)胞以及一些毛發(fā)和少許游離組織塊，再用0.45 μ m過(guò)濾器過(guò)濾后可得較為純凈的驢皮成纖維細(xì)胞的懸浮液；
[0010]D.將懸浮液離心處理，棄去上清，加培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，再加Iml培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，將含有大部分上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液棄去，重新加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；
[0011]E.2-3天后，待細(xì)胞長(zhǎng)滿即可消化傳代，至此，穩(wěn)定的驢皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系建成。
[0012]作為對(duì)本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述步驟D中的懸浮液的離心處理采用1000r/min，離心處理4min。
[0013]作為對(duì)本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述步驟D中的培養(yǎng)液包括DMEM及10% FBS。
[0014]作為對(duì)本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述步驟C中的圓底玻璃瓶采用上小下大的結(jié)構(gòu)。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果是:克服了驢皮成纖維細(xì)胞因驢皮中含有大量膠原蛋白而不便被體外培養(yǎng)的難題，且僅需三天左右便可建立穩(wěn)定的驢皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，時(shí)間短，效率高。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0017]一種驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0018]A.用剃毛刀將驢身上一小片區(qū)域的毛發(fā)剔除干凈，利用消毒后的取皮器取下約Icm3的驢皮組織，迅速放入事先加入含有100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DPBS中，帶回實(shí)驗(yàn)室；用滅菌的鑷子將驢皮組織取出，放入75%酒精中漂洗lmin，隨后再放入含有100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DPBS中沖洗三次以上；
[0019]B.將驢皮組織取出并用滅菌后的手術(shù)刀片將其表皮和皮下結(jié)締組織剔除干凈，再用滅菌后的手術(shù)剪刀將其剪成肉糜狀組織塊；
[0020]C.將肉糜狀組織塊放入經(jīng)滅菌的圓底玻璃瓶中，其中圓底玻璃瓶的選擇原則為采用上小下大的結(jié)構(gòu)，加入2ml,0.25%胰蛋白酶在37°C水浴鍋或者培養(yǎng)箱中孵育Ih后，再加入21111、0.5%的膠原蛋白酶1在37°0溫度下處理611，可見(jiàn)肉糜狀組織塊大部分都已經(jīng)消失，顯微鏡下可觀察到懸浮離散的細(xì)胞以及一些毛發(fā)和少許游離組織塊，再用0.45 μ m過(guò)濾器過(guò)濾后可得較為純凈的驢皮成纖維細(xì)胞的懸浮液；
[0021]D.將懸浮液利用1000r/min離心處理4min，棄去上清，加含DMEM及10% FBS的培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，再加Iml培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，將含有大部分上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液棄去，重新加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；
[0022]E.2-3天后，待細(xì)胞長(zhǎng)滿即可消化傳代，至此，穩(wěn)定的驢皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系建成。
[0023]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括以下步驟: A.取一塊驢皮組織，放入75%酒精消毒漂洗后，用含100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DPBS沖洗至少3次； B.將驢皮組織取出并用滅菌后的手術(shù)刀片將其表皮和皮下結(jié)締組織剔除干凈，再用滅菌后的手術(shù)剪刀將其剪成肉糜狀組織塊； C.將肉糜狀組織塊放入經(jīng)滅菌的圓底玻璃瓶中，加入0.25 %胰蛋白酶在370C溫度下孵育Ih后，再加入0.5%的膠原蛋白酶I在37°C溫度下處理6h，可見(jiàn)肉糜狀組織塊大部分都已經(jīng)消失，顯微鏡下可觀察到懸浮離散的細(xì)胞以及一些毛發(fā)和少許游離組織塊，再用0.45 μ m過(guò)濾器過(guò)濾后可得較為純凈的驢皮成纖維細(xì)胞的懸浮液； D.將懸浮液離心處理，棄去上清，加培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，再加Iml培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后，將含有大部分上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液棄去，重新加入培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)； E.2-3天后，待細(xì)胞長(zhǎng)滿即可消化傳代，至此，穩(wěn)定的驢皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系建成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述步驟D中的懸浮液的離心處理采用1000r/min，離心處理4min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述步驟D中的培養(yǎng)液包括DMEM及10 % FBSo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述步驟C中的圓底玻璃瓶采用上小下大的結(jié)構(gòu)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及驢皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種驢皮成纖維細(xì)胞體外快速培養(yǎng)的方法。該方法利用胰蛋白酶和膠原蛋白酶I先后消化作用于驢皮的組織塊，使相應(yīng)的驢皮成纖維細(xì)胞被分離出來(lái)，進(jìn)而高效快速地建立起驢皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。本發(fā)明克服了驢皮成纖維細(xì)胞由于驢皮中含有大量膠原蛋白而不便被體外培養(yǎng)的難題，且僅需三天左右便可建立穩(wěn)定的驢皮成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，時(shí)間短，效率高。
【IPC分類(lèi)】C12N5-071
【公開(kāi)號(hào)】CN104830750
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510234370
【發(fā)明人】曾維斌, 王艷萍, 高帥, 王惠娥, 馬國(guó)海, 王莉
【申請(qǐng)人】塔里木大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月5日