重組人成纖維細胞生長因子-18的生產(chǎn)方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及重組人成纖維細胞生長因子-18的生產(chǎn)方法 及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] FGF18是FGF家族的一個新成員，是一種可分泌蛋白。1998年，日本科學(xué)家 化bayashi首次從老鼠胚胎中分離得到了FGF18。人FGF18基因編碼一個207氨基酸組成 的蛋白序列，分子質(zhì)量約為23kDa。序列分析結(jié)果表明，F(xiàn)GF18基因是由207個氨基酸組成 的高度保守的序列，小鼠FGF18與人及大鼠的氨基酸序列具有99. 5%和99%的同源性。在 結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)GF18和FGF8、FGF17相似，為同一亞家族成員，具有70%~80%的氨基酸序列同 源性。FGF18在骨骼生長發(fā)育過程中扮演著重要的角色，也參與皮質(zhì)神經(jīng)元活動，腺垂體的 生存、分化和增殖及調(diào)節(jié)頭發(fā)的生長和皮膚修復(fù)。體外和體內(nèi)的多項研究表明，F(xiàn)GF18在形 態(tài)發(fā)生、血管形成、腫瘤生長和其他細胞發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要的作用。
[0003] 由于FGF18的發(fā)現(xiàn)對于骨骼性疾病W及脫發(fā)癥的治療有著重要意義，對于FGF18 的研究W及臨床應(yīng)用的前景日益受到人們的關(guān)注。因此，F(xiàn)GF18蛋白具有廣闊的市場前 景。然而，目前FGF18蛋白表達水平低，同時很難制備具有高活性的蛋白。運些已經(jīng)構(gòu)成了 FGF18基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的瓶頸問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明在前期研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建了W桿狀病毒為載體的FGF18昆蟲細胞表達 系統(tǒng)，同時計劃對于在系統(tǒng)中影響目的蛋白表達量的主要影響因素，如病毒的濃度滴度 (M0I)，收獲時間（T0I)W及細胞的狀態(tài)等相關(guān)因素進行優(yōu)化。 陽0化]因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn) 方法，本發(fā)明通過利用昆蟲細胞表達系統(tǒng)，對于影響蛋白表達量的主要影響因素，如病毒的 濃度滴度（M0I)，收獲時間燈01) W及細胞的狀態(tài)等相關(guān)因素進行優(yōu)化，解決了FGF18不能 穩(wěn)定高效表達且不影響其蛋白生物活性的問題，同時通過CM-Se地arose FF陽離子交換和 肝素親和層析柱的兩步法分離純化技術(shù)，解決了FGF18蛋白純度低的問題。。
[0006] 本發(fā)明的還有一個目的是提供重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白用于治療骨 骼性疾病和脫發(fā)癥的用途。 陽007]為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0008] 一種重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法，包括W下步驟：
[0009] 步驟一、利用昆蟲桿狀病毒載體表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中表達成纖維細胞生長因 子-18蛋白，具體包括：
[0010] 1)獲得重組桿狀病毒Bacmid-FGF18,其中FGF18基因為成纖維細胞生長因子-18 基因，其堿基序列如SEQIDNO: 1所示，
[0011] 2)用步驟1)得到的M0I為1~32的Bacmid-FGF18重組桿狀病毒侵染昆蟲細胞， 侵染后于溫度25~29°C下培養(yǎng)1化~9化后收獲細胞液；W及，
[0012] 步驟二、從步驟一收獲的細胞液中純化得到人成纖維細胞生長因子-18蛋白。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟 2)中，所述Bacmid-FGF18重組桿狀病毒的M0I為3. 5。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟 2)中，用Bacmid-FGF18重組桿狀病毒侵染昆蟲細胞后于溫度27°C下培養(yǎng)9化后收獲細胞。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟 2)中所述重組桿狀病毒Bacmid-FGF18為第四代重組桿狀病毒。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟 1)中，獲得重組桿狀病毒Bacmid-FGF18的具體方法包括：
[0017] 步驟1.1)W人工合成含有FGF18基因的載體為模板，利用如SEQIDN0:2和SEQ IDN0:3所示的引物序列通過PCR擴增得到如SEQIDN0:1所示的核巧酸序列的基因片段， 并將其構(gòu)建到pFas巧ac質(zhì)粒上W得到pFas巧ac-FGF18重組載體；
[0018] 步驟1. 2)利用步驟1. 1)中得到的pFas巧ac-FGF18重組載體轉(zhuǎn)座含有Bacmid質(zhì) 粒的E.Coli畑lOBac感受態(tài)細胞中，從而使其發(fā)生同源重組W得到Bacmid-FGF18重組載 體；
[0019] 步驟1. 3)利用Bacmid-FGF18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞W得到第一代重組桿狀病 毒；W及，
[0020] 步驟1. 4)將步驟1. 3)中得到的第一代重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞W表達得到第 二代重組桿狀病毒，之后再利用同樣的方法侵染昆蟲細胞直到得到第四代重組桿狀病毒。
[0021] 優(yōu)選的是，所述的重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟 二中，從步驟一中收獲的細胞液中純化得到人成纖維細胞生長因子-18蛋白的具體過程包 括：
[0022] 2. 1)將步驟一中收獲的細胞液于14000g離屯、15min，取上清經(jīng)0. 22ym濾膜過濾 得濾液；
[0023] 2. 2)將步驟2. 1)中得到的濾液使用陽離子交換柱進行層析并收集得到FGF18蛋 白粗樣品；W及，
[0024] 2. 3)將步驟2. 2)中得到的FGF18樣品再使用肝素親和層析柱進行層析，并收集得 到FGF18蛋白樣品。
[00巧]優(yōu)選的是，所述的重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟 2.2) 中，將步驟2.1)中得到的濾液使用陽離子交換柱進行層析的具體過程包括：
[00%] 首先將步驟2. 1)中得到的濾液上樣至CM-瓊脂糖凝膠FF陽離子交換柱，然后使 用10柱體積的溶液A清洗層析柱，再用20柱體積的溶液A和溶液B的混合溶液于時間 90min內(nèi)使溶液B的比例從0%升至100%進行梯度清洗，并收集FGF18蛋白粗樣品。
[0027] 優(yōu)選的是，所述的重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法中，所述步驟 2.3) 中將步驟2. 2)中得到的FGF-18樣品再使用肝素親和層析柱進行層析的具體步驟包 括：
[0028] 首先將步驟2. 2)中得到的FGF18蛋白粗樣品上樣至肝素親和層析柱，然后使用10 柱體積的溶液A清洗層析柱，再用20柱體積的溶液A和溶液C的混合溶液于時間90min內(nèi) 使溶液B的比例從0%升至100%進行梯度清洗，并收集FGF18蛋白樣品。
[0029] 優(yōu)選的是，所述的重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白的生產(chǎn)方法中，所述昆蟲 細胞為S巧細胞。
[0030] 重組人成纖維細胞生長因子-18蛋白用于治療骨骼性疾病和脫發(fā)癥的用途。
[0031] 本發(fā)明的有益效果為：
[0032] 本發(fā)明構(gòu)建了W桿狀病毒為載體的FGF18昆蟲細胞表達系統(tǒng)，同時對于在系統(tǒng) 中影響目的蛋白表達量的主要影響因素，如病毒的濃度滴度（M0I)，收獲時間（T0I)W 及細胞的狀態(tài)等相關(guān)因素進行了優(yōu)化，實現(xiàn)了在昆蟲細胞中FGF18的表達，同時利用 CM-Se地aroseFF陽離子交換和肝素親和層析柱分離純化目的蛋白，經(jīng)兩步法最終獲得蛋 白純度超過95 %的FGF18重組蛋白，不但顯著提高FGF18重組蛋白的表達量，而且簡化了純 化工藝，提高了收率，為FGF18蛋白藥物提供了一條高效、穩(wěn)定的生產(chǎn)新途徑。為今后開展 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0033] 圖la為本發(fā)明其中一個實施例中Bacmid-FGF18載體的PCR鑒定的部分凝膠電泳 結(jié)果圖。
[0034] 圖化為本發(fā)明其中一個實施例中pFas巧ac-FGF18載體的PCR鑒定的部分凝膠電 泳結(jié)果圖。
[0035] 圖2a為本發(fā)明其中一個實施例中顯微鏡下觀察到的正常的昆蟲細胞的照片。
[0036] 圖化為本發(fā)明其中一個實施例中顯微鏡下觀察到的病毒侵染的昆蟲細胞的照 片。
[0037] 圖3為本發(fā)明其中一個實施例中FGF18蛋白表達情況的Westernblot鑒定示意 圖。
[003引 圖4為本發(fā)明其中一個實施例中FGF18蛋白分子量的Westernblot鑒定示意圖。
[0039] 圖5a為本發(fā)明其中一個實施例中顯微鏡下觀察到的正常的昆蟲細胞的照片。
[0040] 圖化為本發(fā)明其中一個實施例中顯微鏡下觀察到的病毒侵染的昆蟲細胞的照 片。
[0041] 圖6為本發(fā)明其中一個實施例中不同病毒轉(zhuǎn)染時間對FGF18蛋白表達影響的曲線 不意圖。
[0042] 圖7為本發(fā)明其中一個實施例中經(jīng)兩步法純化后的FGF18蛋白的Western blot 鑒定不意圖。
【具體實施方式】
[0043] 根據(jù)本發(fā)明，可采用本領(lǐng)域技能中的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細胞學(xué)和DNA重 組技術(shù)。如果出現(xiàn)于本文下來術(shù)語的定義如下。
[0044] "DNA分子"指脫氧核糖核巧酸（胸腺喀晚、胞喀晚、腺嚷嶺或鳥嚷嶺）的聚合形式， 是染色體主要組成成分，同時也是組成基因的材料。運一術(shù)語只指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)， 不限制其任何具體的S級形式。本術(shù)語包括特別是在線性DNA分子、病毒、染色體、質(zhì)粒中 國發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。運里討論的結(jié)構(gòu)，按照習(xí)慣上給出的只是DNA正義鏈的5'到3'方向的 序列。
[0045]"載體"是指能夠轉(zhuǎn)運與其連接的另一個核酸的核酸分子，一種類型的載體是"質(zhì) 粒"，質(zhì)粒是其他的