專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于將效應(yīng)分子定向遞送至腫瘤的組合物及方法用于將效應(yīng)分子定向遞送至腫瘸的組合物及方法本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2000年8月24日，申請(qǐng)?zhí)枮?0816714.1,發(fā)明名稱(chēng)為"用于將效應(yīng)分子定向遞送至腫瘰的組合物及方法"的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng).本申請(qǐng)要求1999年10月4日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/157,500、60/157,581和60/157,637的優(yōu)先權(quán)，其各自的內(nèi)容均在此全面引入，作為參考.1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及將一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子遞送至實(shí)體瘤，用于治療或抑制該腫瘤.更明確地說(shuō)，本發(fā)明涉及諸如沙門(mén)氏菌等定向于腫瘸的減毒細(xì)菌的制備和用途，將其作為栽體把一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子遞送至適當(dāng)?shù)淖饔貌课?，如?shí)體瘤部位.詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是經(jīng)過(guò)修飾可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子的兼性需氣菌或兼性厭氣菌.本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子包括TNF細(xì)胞因子家族的成員、抗血管生成因子和細(xì)胞毒性多肽或肽.本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子可用來(lái)，例如，治療癌、黑色素瘤、淋巴瘸、肉瘤或來(lái)源于這些腫瘤的轉(zhuǎn)移灶等實(shí)體瘤，本發(fā)明還涉及一項(xiàng)驚人的發(fā)現(xiàn)，即利用定向于腫瘤并且對(duì)宿主的毒性較低、引起的免疫并發(fā)癥較少的減毒細(xì)菌可將諸如TNF家族成員、抗血管生成因子和細(xì)胞毒性多肽或肽等初級(jí)效應(yīng)分子局部遞送至腫瘤.本發(fā)明還涉及一種或多種可選效應(yīng)分子(稱(chēng)為"次級(jí)效應(yīng)分子")的遞送方法，這些效應(yīng)分子可通過(guò)定向于胂瘤的減毒細(xì)菌與初級(jí)效應(yīng)分子協(xié)同遞送.次級(jí)效應(yīng)分子提供額外的抗肝瘤治療活性，促進(jìn)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌釋放初級(jí)效應(yīng)分子，以及(或者)加強(qiáng)實(shí)體瘤部位等適當(dāng)作用部位對(duì)初級(jí)效應(yīng)分子的攝取.2.
背景技術(shù)：
：贅生物，或腫瘤，是由細(xì)胞異常生長(zhǎng)而產(chǎn)生的一種贅生性團(tuán)塊，它可以是良性的，也可以是惡性的.良性腫瘤一般可維持在局部.惡性腫瘤通常有可能侵襲和破壞鄰近的身體組織，并能擴(kuò)散到遠(yuǎn)端部位和導(dǎo)致死亡(關(guān)于綜述，可參考RobinsandAngel,1976，BasicPathology,2dEd.，W.B.SaundersCo.，Philadelphia,pp，68-122),當(dāng)腫瘤從一種器官或組織擴(kuò)散到另一種器官或組織時(shí)被稱(chēng)為發(fā)生了轉(zhuǎn)移，對(duì)實(shí)體瘸進(jìn)行化療的一個(gè)主要難趙是遞送的治療刑濃度，如遞送的藥物濃度，要足以根除胂瘤細(xì)胞，同時(shí)又要盡量減少對(duì)正常細(xì)胞的損害.因此，有許多實(shí)驗(yàn)室的研究方向是設(shè)計(jì)生物遞送系統(tǒng)，例如，用于將藥物、前體藥物轉(zhuǎn)化酶和(或)基因定向遞送至腫瘤細(xì)胞的抗體、細(xì)胞因子和病毒(可參考，例如，Crystal,R.G.，1995，Science270:404-410).2.1.細(xì)胞免疫與細(xì)胞因子有一種治療癌癥的策略涉及加強(qiáng)或激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，與傳統(tǒng)的化療方法相比，成功誘導(dǎo)一種針對(duì)自體腫瘤的細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)1)免疫識(shí)別具有高度特異性，它可專(zhuān)門(mén)針對(duì)腫瘤；2)通過(guò)免疫監(jiān)視可抑制轉(zhuǎn)移部位的生長(zhǎng)；3)免疫應(yīng)答與免疫識(shí)別的多樣性可彌補(bǔ)肺瘤細(xì)胞的不同抗性機(jī)制；4)細(xì)胞毒性T細(xì)胞克隆可以比腫瘤擴(kuò)張得更快，使得抗腫瘤機(jī)制能夠最終戰(zhàn)勝腫瘤；以及5)在進(jìn)行身體檢查前，記憶應(yīng)答可以將疾病復(fù)發(fā)抑制在最早期階段.對(duì)應(yīng)答病人的臨床研究支持動(dòng)物模型的研究結(jié)果，它顯示雖然有證據(jù)說(shuō)明CD4+T細(xì)胞、巨堪細(xì)胞和NK細(xì)胞的參與，但成功的免疫療法涉及激活CD8+T細(xì)胞U類(lèi)應(yīng)答)，而對(duì)響應(yīng)患者的臨床研究也證明了該結(jié)果.可參考，例如，Chapovaletal.，1998，J.Immunol.161:6977-6984;Gollubetal.，1998，J.Clin.Invest,102:561-575;Kikuchietal.，1999,Int，J.Cancer80:425-430;Panetal.,1995，Int.J.Cancer80:425-430;Saffranetal.，1998，CancerGeneTher.5:321-330;k乂及Zim邁ermannetal.，1999，Eur.J.Immunol.29:284—290,2.2.細(xì)胞因子的腫瘤壞死因子(TNF)家族性質(zhì)了解最清除的TNP家族成員是TNF-ci.已知TNF-a可對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生多方面的影響.TNF-a是一種可直接對(duì)腫病細(xì)胞產(chǎn)生有力的細(xì)胞毒性作用的細(xì)胞因子.通常認(rèn)為T(mén)NF-a可通過(guò)其他機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用，例如刺激增殖與分化，阻止單核細(xì)胞凋亡(可參考，例如，Manganetal.,1991，J.Immunol.146:1541-1546;和Ostensenetal.，1987，J.Immunol.138:4185-4191)，提髙組織因子樣促凝血活性，以及抑制內(nèi)皮細(xì)胞表面抗凝活性，從而最終導(dǎo)致腫瘤內(nèi)形成血凝塊(見(jiàn)BeutlerandCerami，1989，Aim.Rev.Immunol.7:625-655;和Vassalli，P,，1992，Ann.Rev.Immunol.10:411-452的綜述).但這些特性的結(jié)果是，如果將TNF-a全身給藥，會(huì)造成宿主因彌散性血管內(nèi)凝血而致死的后果，抗腫瘸應(yīng)答還涉及了其他細(xì)胞因子.IL-2屬于I類(lèi)細(xì)胞因子，它被認(rèn)為在抗肺瘤應(yīng)答中起一定的作用.例如，黑色素瘤的自然消退與腫瘤內(nèi)TNF-a和IL-2水平的增加有關(guān)，可參考，例如，BeutlerandCerami，1989,Annu.Rev.Immunol.7:625—655;Lowesetal.，1997，J.Invest.Dermatol,108:914-919;Manganetal.，1991,J.Immunol.146:1541-1546;Scheruichetal.,1987，J,Immunol.138:1786-1790。TNF-a和IL-2都有助于淋巴細(xì)胞尋靶，并且已證明IL-2可誘導(dǎo)天然殺傷(NK)細(xì)胞、T細(xì)胞及淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)(可參考，例如，Etteretal,，1998，Cytokine10:395-403;Reinhardtetal.，1997，Blood89:3837-46;Chenetal.，1997,J,Neurophathol.Bxp，Neurol.56:541-50jVoraetal.，1996，Clin.Exp.Immunol.105:155—62;Luscinskasetal.，1996，J.Immunol.157:326-35;Kjaergaardetal.，1998，Scand.J.Immunol.47，532-540;Johanssonetal.，1996，Nat.Iminun.15:87-97;和Watanabeetal.，1997，Am.J.Pathol.150:1869-80).當(dāng)TNF-a與IL-2都存在時(shí)，NK和LAK細(xì)胞的溶細(xì)胞活性均提高，甚至對(duì)TNF-不敏感細(xì)胞系的溶細(xì)胞活性也有所提高(參考，例如，Ostensenetal.，1987，J.Immunol.138:4185-4191).但治療水平的IL-2也表現(xiàn)出對(duì)宿主的毒性，將細(xì)胞因子全身給藥會(huì)產(chǎn)生受刑量限制的毒性作用，這無(wú)疑為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子在癌癥治療中的作用設(shè)置了一道明顯的陣礙.此外，將細(xì)胞因子全身給藥會(huì)降低同系T細(xì)胞的尋靶作用，并由此對(duì)抗定向免疫治療，另外還可導(dǎo)致有害的臨床副作用.參考Addisonetal.，1998，GeneTher.5:1400-1409jAlbertinietal.，1997,Clin.CancerRes.3:1277-1288;Beckeretal.，1996，Proc，Natl.Acad，Sci.USA93:7826-7831;Booketal,，1998，J.Neuroim畫(huà)ol.92:50-59;Caoetal.，1998，J.CancerRes.ClinOncol.124:88-92;D，Angelicaetal.，1999，CancerImmunol.I咖unother.47:265-271;Deszoetal.，1996，Clin.CancerRes.2:1543-1552jKjaergaardetal.,1998，Scand.J.Immunol.47:532-540;Ostensenetal.，1987，J.Immunol.138:4185-4191;和Schirrmacheretal.，1998，Clin.CancerRes.4:2635—2645,2.3.細(xì)胞因子的遞送近期的試驗(yàn)動(dòng)物研究和臨床研究試?yán)в杉?xì)胞因子的亞全身給藥或其它方法來(lái)避免細(xì)胞因子的全身毒性和更高刑量給藥，目前在鼠模型中已通過(guò)基因融合脂質(zhì)體包哀的TNP-a基因給藥方法和能夠局限于肺瘤血管系統(tǒng)的聚乙二醇包哀的TNF-a全身給藥方法來(lái)治療肉瘸-180腫瘤(見(jiàn)Tsutsumietal.，1996，Jpn.J.CancerRes.87:1078-1085),另外還報(bào)道了內(nèi)皮-單核細(xì)胞-激活肽II可促進(jìn)腫瘤對(duì)TNF-a的敏慼性(見(jiàn)Marvinetal.，1999,J.Surg.Res.63:248-255;Wuetal.，1996，CancerRes.59:205-212).臨床研究發(fā)現(xiàn)，用隔離性肢體灌注方法將高刑量的TNF-a與a干擾素或美法侖組合給藥于患者可完全根除腫瘤.但是，若在治療后沒(méi)能完全去除細(xì)胞因子，該技術(shù)就會(huì)為患者帶來(lái)很?chē)?yán)重的危險(xiǎn).此外，這些處理方法肢體隔離，這本身就會(huì)為患者帶來(lái)危險(xiǎn).可參考Egger謹(jǐn)tetal.,1997，Semin.Oncol.24:547-555;Frakeretal，，1995，CancerJ.Sci.Am.1:122-130;Lejeuneetal.,1998，Curr.Opin.Immunol.10:573-580;Marvinetal.，1996，J.Surg.Res.63:248-255;Mizuguchietal.，1998,CancerRes.58:5725-5730;Tsutsumietal.，1996，Jpn.J.CancerRes.87:1078-1085;和Wuetal.,1996，CancerRes.59:205-212,根據(jù)此前Carrieretal.，1992，J.Immunol.148:1176-81;Saltzmanetal.，1997，CancerBiother.Radiopharm.12:37-45;Saltzmanetal.,1997，J.Pediat.Surgery32:301-306發(fā)表的研究結(jié)果，可利用沙門(mén)氏菌減毒菌株直接將IL-ip(Carrier)和IL-2(Saltzman)遞送到沙門(mén)氏菌的天然感染部位，肝臟和脾臟，從而充當(dāng)疫苗菌林或影響肝臟的轉(zhuǎn)移性病灶.Saltzman的研究采用沙門(mén)氏菌口服給藥的方法，該方法是用GALT(腸相關(guān)淋巴組織)吸收細(xì)菌并將其運(yùn)送到肝臟和脾臟.但這些感染只局限于天然感染部位.2.4.血管發(fā)生與腫瘤發(fā)生另一種癌癥治療策略涉及對(duì)血管發(fā)生進(jìn)行抑制.血管發(fā)生是指原有血管長(zhǎng)出新毛細(xì)血管的過(guò)程，新毛細(xì)血管的形成過(guò)程是，原有血管的內(nèi)皮細(xì)胞利用基質(zhì)金屬蛋白睞等蛋白水解酶降解其周?chē)幕啄?，增殖，遷移到周?chē)幕|(zhì)組織內(nèi)并形成微管道.血管發(fā)生過(guò)程受負(fù)因子與正因子之間的相互作用的嚴(yán)密調(diào)控，該過(guò)程在成人中一般只限于女性生殖周期和傷口修復(fù)(Malonneetal.，1999，Clin.Exp.Metastasis17:1-14).有多種人類(lèi)疾病與血管發(fā)生的錯(cuò)誤或異常調(diào)控有關(guān)，其中包括糖尿病性視網(wǎng)膜病、銀屑病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病和腫瘤發(fā)生(Folkman,1995，Nat.Med.1:27-31).血管發(fā)生過(guò)程對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要.腫瘸形成可劃分為兩個(gè)階段，即血管前期和血管期.研究表明，血管前期肺瘤細(xì)胞可以象血管期腫瘤細(xì)胞那樣快速增殖.但血管前期腫瘤很少生長(zhǎng)到2-3咖3以上，因?yàn)榧?xì)胞增殖與血管前期腫瘤的低氣特性導(dǎo)致的細(xì)胞死亡之間存在一種平衡(Folkman，1995，Nat.Med.1:27-31).血管前期轉(zhuǎn)變?yōu)檠芷谛枰馨l(fā)生調(diào)控因子的平衡轉(zhuǎn)變，從負(fù)因子占優(yōu)勢(shì)的凈平衡轉(zhuǎn)變?yōu)檎蜃?，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)占優(yōu)勢(shì)的凈平衡(Cao，1998,Prog.Mol.Subcell.Biol,20:161-176).調(diào)控因子之間的這種平衡的轉(zhuǎn)變是上調(diào)血管生成因子，同時(shí)下調(diào)抗血管生成因子的結(jié)果(Folkman,1995,N.Eng.J.Med.333:1757-1763).2.5.抗血管生成因子推測(cè)抗血管生成因子存在的依據(jù)是，從一些相關(guān)現(xiàn)象來(lái)判斷，原發(fā)性腫瘤通常能抑制其轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)(Cao，1998，Prog.Mol.Subcell.Biol.20:161-176).在這些因子中，首先分離出來(lái)的是小鼠制管張素，它是原發(fā)性L(fǎng)ewis肺癌腫瘤釋放到循環(huán)系統(tǒng)中的纖溶酶原的一種38kDa蛋白水解片段，該片段可阻礙繼發(fā)轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)(O，Reillyetal.，1994，Cell79:315-328).在人類(lèi)中，通過(guò)金屬?gòu)椥缘鞍酌笇?duì)纖溶醉原的有限水解而產(chǎn)生的40、42和45kDa的肽具有與小鼠制管張素類(lèi)似的抗血管生成活性(O，Reillyetal.,1994,Cell79:315-328),纖溶酶原本身不具有這種活性.另外還認(rèn)為，腫瘸相關(guān)巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生制管張素，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞本身不含有可檢測(cè)的制管張素mRNA.腫瘤細(xì)胞分泌的粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)金屬?gòu)椥缘鞍酌?Dongetal.，1997，Cell88:801-810).在某些腫瘤中是由腫瘤細(xì)胞直接產(chǎn)生的絲氨酸蛋白醉來(lái)催化制管張素的產(chǎn)生，而不是金屬?gòu)椥缘鞍酌?Gatelyetal.,1997，CancerRes.56:4887-4890).以100mg/kg/天的濃度將制管張素給藥于患有原發(fā)性腫瘤的試驗(yàn)小鼠，則可以在不產(chǎn)生毒性副作用的條件下對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制.肺瘤可在制管張素療法停止后的2周內(nèi)重新生長(zhǎng)，表明該療法可導(dǎo)致肺瘤退化至休眠狀態(tài)，而不是完全死亡(O，Reillyetal.，1996，Nat.Med.2:689-692),在發(fā)現(xiàn)制管張素后，又發(fā)現(xiàn)并分離了其他一些血管生成抑制刑，其中包括幾種血管生成抑制性肽.kringle5是一種比制管張素更有效的血管生成抑制刑，它是含有纖溶酶原笫5kiingle結(jié)構(gòu)域的一種肽(制管張素含有笫1-4kringle結(jié)構(gòu)域)，其重組形式同樣具有活性(Caoetal.，1997，J.Biol.Chem.272:22924-22928),內(nèi)抑素(endostatin)的分離方式與制管張素類(lèi)似(O，Reillyetal,,1997，Cell88:1-20)，其來(lái)源為鼠血管內(nèi)皮瘤，而不是Lewis肺癌.這種肽的表觀分子量為20kDa，其序列相當(dāng)于膠原蛋白XVIII的一段稱(chēng)為NCI的C-端區(qū)城(O，Reillyetal.，1997，Cell88:1-20)，該區(qū)域在不同的膠原蛋白分子中變化很大(Ohetal.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:4229-4233;和Rehnetal.,1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:4234-4239),在小鼠中，以0.3mg/kg/天的濃度將重組內(nèi)抑素給藥可抑制Lewis肺癌轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)，以20mg/kg/天的濃度給藥則可以使原發(fā)性腫瘤退化至休眠狀態(tài)，功能性重組內(nèi)抑素可通過(guò)體外變性和重折疊由包涵體產(chǎn)生，也可通過(guò)皮下給藥的內(nèi)抑素包涵體制劑的持續(xù)體內(nèi)釋放來(lái)產(chǎn)生(O'Reillyetal.,1997，Cell88:1-20).作為遞送內(nèi)抑素的替代方法，還可以將內(nèi)抑素的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行肌內(nèi)給藥，該方法在小鼠模型系統(tǒng)中只能部分抑制腫瘤生長(zhǎng)(Blezingeretal.,1999，Nat.Biotech.17:343-348),與此類(lèi)似，將脂質(zhì)體復(fù)合的內(nèi)抑素或血管緊張素編碼質(zhì)粒進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥的遞送方法可部分抑制乳腺癌棵鼠模型中的腫瘸生長(zhǎng)(Chenetal.，1999,CancerRes.59:3308-3312),最近發(fā)現(xiàn)，Serpin(絲氨酸蛋白酶抑制刑)抗凝血酶的一種C端截短肽具有新的抗血管生成活性(O，Reillyetal.，1999，Science285:1926-1928).全長(zhǎng)的抗凝血酶并非先天具有抗血管生成活性，但其C端活性環(huán)區(qū)一旦被凝血酶剪切，抗凝血酶即可獲得很強(qiáng)的血管生成活性，下文將把這種蛋白水解片段稱(chēng)為抗血管生成性抗凝血醉.本領(lǐng)域已知的其他血管生成抑制性肽包括，纖連蛋白的一種29kDa的N端蛋白水解片段和一種40kDa的C端蛋白水解片段(Homandbergetal.，1985，J.Am.Pathol.120:327-332);催乳素的一種16kDa的蛋白水解片段(Clappetal.,1993,Endocrinology133:1292-1299);血小板因子-4的一種7.8kDa的蛋白水解片段(Guptaetal.,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7799-7803),除了那些已證明具有抗血管生成作用的天然產(chǎn)生的蛋白水解片段之外，對(duì)一些相當(dāng)于已知細(xì)胞外基質(zhì)蛋白特定區(qū)城的合成肽也已進(jìn)行了血管生成抑制活性的評(píng)定.已證明可作為功能性?xún)?nèi)皮細(xì)胞抑制刑的合成肽，即作為血管生成抑制刑的合成肽，包括，相當(dāng)于血小板因子-4的片段的一種13個(gè)氨基酸的肽(Maioneeta1.，1990，CancerRes.51:2077-2083);相當(dāng)于膠原蛋白I的片段的一種14個(gè)氨基酸的肽(Tolsmaetal.，1993，J.CellBiol.122:497-511);相當(dāng)于血小板反應(yīng)蛋白I的片段的一種19個(gè)氨基酸的肽(Tolsmaetal.，1993，J.CellBiol.122:497-511);以及相當(dāng)于SPARC的片段的一種20個(gè)氨基酸的肽(Sageetal.，1995，J.Cell.Biochem.57:1329-1334)，這是一種分泌的富含半胱氨酸的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，這種糖蛋白在人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)可導(dǎo)致體外細(xì)胞侵襲的減少，而在棵鼠模型體內(nèi)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生能力降低(Leddaetal.，1996，NatureMed.3:171-176).另外還描述了其他一些可抑制血管生成的少于IO個(gè)氨基酸殘基的肽，這些肽分別相當(dāng)于層粘連蛋白、纖連蛋白、前膠原和EGF的片段(見(jiàn)Cao，1998，Prog.Mol.Subcell.Biol.20:161-176的綜述).可抑制血管生成的纖連蛋白小分子肽一般都含有RGD基序.RGD是一種肽基序(Arg-Gly-Asp氨基酸)，蛋白可通過(guò)該基序識(shí)別并結(jié)合整聯(lián)蛋白分子.生血管性血管均伴有整聯(lián)蛋白o(hù)u(33的表達(dá)，用單克隆抗體抑制該蛋白的活性可阻斷血管形成(Brooksetal.，1994,Science264:569-571).這一點(diǎn)已被研究所證實(shí)，該研究表明，給予含有RGD基序的環(huán)五肽可抑制玻連蛋白受體型整聯(lián)蛋白的活性，并可阻斷視網(wǎng)膜的新血管形成(Hammesetal.,1996，NatureMedicine2:529-533),整聯(lián)蛋白阻斷刑，如環(huán)五肽和單克隆抗體，具有抗血管生成作用，該作用可誘導(dǎo)生血管性血管的凋亡，以此來(lái)促進(jìn)腫瘤退化(Brooksetal.:1994，Cell79:1157-1164),含有RGD基序和另一種整聯(lián)蛋白結(jié)合基序NGR(Asn-Gln-Arg氨基酸)的肽可表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的抗肺瘤活性.通過(guò)抑制另一類(lèi)細(xì)'胞表面受體的活性，即抑制尿激酶纖溶醉原激活劑(uPA)受體的活性，也可產(chǎn)生對(duì)血管生成的抑制作用.uPA受體一旦與配體結(jié)合，即可引發(fā)一種蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)是血管生成過(guò)程中基底膜侵襲步驟所必需的.用受體拮抗刑抑制uPA受體可阻礙血管發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)(Minetal,，1996，CancerRes.56:2428-2433)和轉(zhuǎn)移(Crowleyetal.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5021-5025).利用隨機(jī)肽的噬菌體肽展示技術(shù)已鑒定出一些這樣的拮抗刑(Goodsonetal.，Proc.Natl,Acad.Sci,USA91:7129-7133).另外還鑒定出了顯性失活形式的受體配體uPA(Minetal.，1996，CancerRes.56:2428-2433),制管張素、內(nèi)抑素及其他抗血管生成肽的發(fā)現(xiàn)為癌癥治療提供了一種令人興奮的新方法，但是，用一種或多種這些肽進(jìn)行治療的方法并不實(shí)用，因?yàn)檫@需要產(chǎn)生大量的肽(以65kg或143lbs的一般人為例，每天需產(chǎn)生約1.3或6.5g蛋白，從其成本和(或)投入的勞力來(lái)考慮很不切實(shí)際)，從治療的持續(xù)時(shí)間來(lái)看也是如此(若要保持腫瘤的退化狀態(tài)，必須持續(xù)用藥).這些肽必須如此大刑量給藥的原因主要有兩點(diǎn)，第一，大部分肽在血流中被降解，笫二，在未被降解的分子中，只有很有限的一部分可以到達(dá)腫瘤.因此，若能以更節(jié)約成本和更友好的方式將抗血管生成蛋白或肽更有效地遞送至腫瘤，將會(huì)為腫瘤治療領(lǐng)域帶來(lái)非常大的利益，2.6.細(xì)菌素家族大腸桿菌素E3(此后稱(chēng)為ColE3)是一種細(xì)菌素，即具有選擇性活性的細(xì)菌性蛋白毒素，因?yàn)槠渌拗鲗?duì)該毒素免疫.細(xì)菌素可由宿主基因組或質(zhì)粒編碼，其宿主范圍可寬可窄，細(xì)菌素可以是只含有一個(gè)或兩個(gè)亞基的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)，也可以是多亞基結(jié)構(gòu)(Konisky，1982,Ann.Rev.Microbiol.36:125-144).此外，細(xì)菌素的宿主具有抵抗該細(xì)菌素的免疫力.這種免疫力可出現(xiàn)在特定宿主群體的所有細(xì)胞中，甚至出現(xiàn)在不表達(dá)這種細(xì)菌素的細(xì)胞.ColE3的細(xì)胞毒性來(lái)源于其對(duì)蛋白合成的抑制(Nomura,1963，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.28:315-324),ColE3活性的作用對(duì)象是細(xì)菌核糖體的16S組分，30S及70S核糖體都含有該組分(Bo鵬netal.，1971，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.68:964-968)，這種活性可導(dǎo)致核糖體降解(Meyhack，1970，Proc.Natl.Acad.Sci.USA),在RNA酶中，ColE3的活性是很獨(dú)特的，因?yàn)樗粫?huì)導(dǎo)致RNA全部降解，而是只剪切mRNA分子的末端49個(gè)核苷酸，以使rRNA與mRNA分離，并由此抑制翻譯.分子中的ColE3殘基本身即具有核糖核酸醉活性，不需要另一種蛋白來(lái)介導(dǎo)(Saunders,1978，Nature274:113-114).ColE3還能夠穿過(guò)靶細(xì)胞的內(nèi)膜和外膜.天然形式的ColE3是一種60kDa的蛋白復(fù)合物，由比率為1:1的一種50kDa蛋白和一種10kDa蛋白組成，較大的亞基具有核酸睞活性，較小的亞基具有抑制50kDa亞基的功能.因此，50kDa的蛋白可作為一種細(xì)胞毒性蛋白(或毒素)，而10kDa的蛋白可作為一種抗毒素，50kDa的亞基至少含有兩種功能結(jié)構(gòu)域，即穿越靶細(xì)胞膜所必需的N-端區(qū)域和具有催化(RNA醉)活性的C-端區(qū)域.在宿主生物內(nèi)，大亞基的活性被小亞基所抑制.一旦該毒素進(jìn)入靶細(xì)胞，則可通過(guò)與靶細(xì)胞外膜的相互作用使亞基解離(見(jiàn)Konisky，1982，Ann.Rev.Microbiol.36:125-144的綜述).ColE3大亞基的毒性已被用來(lái)阻礙克隆基因在徵生物中的側(cè)向擴(kuò)散，Diaz等人(1994，Mol.Microbiol.13:855-861)分離了ColE3的這兩種組分，使小(抗毒性)亞基以染色體整合編碼序列的形式表達(dá)，大亞基則由質(zhì)粒表達(dá).帶有染色體整合小亞基的細(xì)菌對(duì)表達(dá)ColE3大亞基的質(zhì)粒免疫，但是若該質(zhì)粒側(cè)向轉(zhuǎn)移到另一個(gè)不含小亞基的接受細(xì)胞，該細(xì)胞就會(huì)被殺死.大腸桿菌素E3(ColB3)還可表現(xiàn)出對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的深度細(xì)胞毒性作用(見(jiàn)Smardaetal.，1978，F(xiàn)oliaMicrobiol.23:272-277)，其中包括對(duì)一種白血病細(xì)胞模型系統(tǒng)的深度細(xì)胞毒性作用(見(jiàn)Fiskaetal.,1979，Experimentia35:406-407),ColE3活性的作用對(duì)象是哺乳動(dòng)物80S核糖體的40S亞基(Turnowskyeta1.，1973,Biochem.Biophys.Res.Comm.52:327-334)2.7.細(xì)菌性感染與癌癥在早期的臨床觀測(cè)中報(bào)道過(guò)一些病例，即細(xì)菌性感染患者體內(nèi)的一些癌出現(xiàn)了退化，見(jiàn)Nautsetal.，1953，ActaMedica.Scandinavica145:1-102，(Suppl.276);和Shear,1950，J.A.M，A,142:383-390.此后，Leeetal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1847-1851(Lee等人)和Jonesetal,,1992，Infect.I咖un.60:2475-2480(Jones等人)分離出一些鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變體，這些突變體與野生型菌林相比，可以有明顯更多的菌體侵入離體的服P-2(人表皮樣癌)細(xì)胞.這些"高侵襲性"突變體是在適合需氧菌生長(zhǎng)的條件下分離獲得，而這種條件通常會(huì)抑制野生型菌林對(duì)HEp-2動(dòng)物細(xì)胞的侵襲能力.但是Lee等人及Jones等人描述的高侵襲性鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有導(dǎo)致泛侵襲性感染的危除，并且可在癌癥患者體內(nèi)引起廣泛的細(xì)菌性感染.Carswelletal.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72:3666-3669證實(shí)，在注射卡介苗(BCG)的小鼠中，血清的TNF含量增加，并且TNF陽(yáng)性血清可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)的MethA肉瘤和其他移植腫瘤出現(xiàn)壞死，正是由于這些觀測(cè)結(jié)果，目前仍在某些癌癥治療方案中通過(guò)BCG注射來(lái)對(duì)癌癥患者進(jìn)行免疫，有關(guān)BCG療法的綜迷見(jiàn)Sos雨ski，1994,Compr.Ther.20:695-701;BarthandMorton,1995:Cancer75(Suppl.2):726-734;Friberg,1993,Med.Oncol.Tumor.Pharmacother.10:31—36,但是，使用細(xì)菌會(huì)引起人們的擔(dān)心，TNF-a介導(dǎo)的膿毒性休克就是主要的擔(dān)心之一，它可以對(duì)宿主產(chǎn)生毒性，或是帶來(lái)致死性后果(Bone，1992，JAMA268:3452-3455;Dinarelloetal.，1993，JAMA269:1829-1835).此外，TNF-a會(huì)產(chǎn)生受刑量限制的全身毒性，這也成為其有效臨床應(yīng)用的主要陣礙.進(jìn)行修飾以降低這種免疫應(yīng)答是有用的，因?yàn)樵谶@種情況下的TNF-a水平不會(huì)產(chǎn)生毒性，所以可采用更有效的治療栽體濃度和(或)療程.2.8.定向于腫瘤的細(xì)菌已證明基因工程沙門(mén)氏菌可定向于腫瘤，并且具有抗腫瘤活性，能夠有效地用于向?qū)嶓w瘤遞送單純皰滲病毒胸腺嘧啶激酶(KSVTK)等效應(yīng)劑的基因(Paweleketal.，WO96/40238).2.9.修飾的細(xì)菌脂質(zhì)A導(dǎo)致對(duì)TNF-a的誘導(dǎo)降低Pawelek等人建議對(duì)定向于腫瘤的細(xì)菌的脂類(lèi)成分進(jìn)行修飾，以通過(guò)對(duì)產(chǎn)生TNFa的誘導(dǎo)的降低來(lái)改變免疫應(yīng)答(Paweleketal.，WO96/40238),Pawelek等人提供了一些方法，用于從紅桿菌中分離那些負(fù)責(zé)產(chǎn)生單辨酰脂A(MLA)的基因.MLA可作為膿毒性休克的一種拮抗劑.Pawelek等人還建議對(duì)脂質(zhì)A的生物合成途徑進(jìn)行遣傳修飾，其中包括firA基因的突變，該基因可編碼脂質(zhì)A生物合成途徑中的笫三種酶，即UDP-3-0(R-30幾基肉豆寇酰)-葡糖胺-?；D(zhuǎn)移醉(Kelleyetal.，1993,J.Biol.Chera.268:19866—19874).Pawelek等人指出，firA基因的突變資導(dǎo)較低的TNFa水平.在大腸桿菌中已鑒定出一種負(fù)責(zé)脂質(zhì)A末端肉豆寇跣化的msbB(mlt)基因(Engel，etal.，1992，J.Bacteriol.174:6394-6403;"rowandGeorgopoulos1992,J.Bacteriol,174:702-710;Somervilleetal.，1996，J.Clin.Invest.97:359—365),對(duì)該基因進(jìn)行遺傳破壞可產(chǎn)生一種穩(wěn)定的無(wú)條件性突變，該突變可降低對(duì)TNFa的譯導(dǎo)作用(Somervilleetal.，1996，J.Clin.Invest.97:359-365;Somervi1leWO97/25061).但這些參考文獻(xiàn)并未提出，破壞定向于肺瘤的沙門(mén)氏菌栽體中的msbB基因會(huì)使細(xì)菌的毒性降低，并且使細(xì)菌對(duì)鰲合劑更敏感.用細(xì)菌作為基因遞送栽體牽涉到一些問(wèn)題，主要是細(xì)菌通常能直接殺死正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且能夠通過(guò)可以對(duì)宿主產(chǎn)生毒性的TNFa而過(guò)度刺激免疫系統(tǒng)(Bone,1992，JAMA268:3452-3455;和Dinarelloetal.，1993，JAMA269:1829-1835).除了這些因素之外，對(duì)抗生素的抗性會(huì)使處理人體內(nèi)細(xì)菌的存在變得非常復(fù)雜(Tschape，1996，DTWDtschTierarztlWochenschr1996103:273-7;Ramosetal.，1996，EnfermInfec.Microbiol.Clin.14:345-51),HoneandPowell,W097/18837("Hone與Powell")公開(kāi)了一些方法，用于產(chǎn)生含有非熱源性脂質(zhì)A或LPS的革蘭氏陰性菌.Maskell，W098/33923描述了一種在msbB基因中含有一個(gè)突變的沙門(mén)氏菌突變菌林，該菌林與野生型菌株相比可誘導(dǎo)較低水平的TNFa.Bermudesetal.,WO99/13053講述了一些組合物和方法，用于遺傳破壞沙門(mén)氏菌中的msbB基因，由此產(chǎn)生的沙門(mén)氏菌與野生型相比具有較低的TNFa誘導(dǎo)能力和較低的毒性.在某些實(shí)施方案中，一些突變沙門(mén)氏菌與野生型沙門(mén)氏菌相比，對(duì)螯合刑的敏感性提高.也可參考Lowetal.，1999，NatureBiotech,17:37-47,在本申請(qǐng)書(shū)的第2節(jié)或任何章節(jié)中引用或標(biāo)明的所有參考文獻(xiàn)都不能解釋為承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的先有技術(shù).3.發(fā)明概述本發(fā)明提供一些方法，用于將一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子遞送至實(shí)體瘤.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，達(dá)些方法可用來(lái)遞送高水平的一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子.詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明提供一些方法，用于通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，例如對(duì)宿主的毒性降低的沙門(mén)氏菌，將全身給藥于宿主時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性或誘導(dǎo)不良作用(如不良的免疫學(xué)作用)的初級(jí)效應(yīng)分子局部遞送至腫瘤.本發(fā)明包括諸如沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的制備和用途，將其作為栽體把一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子遞送至適當(dāng)?shù)淖饔貌课?，如?shí)體瘤部位.明確地說(shuō)，本發(fā)明的定向于肺瘸的減毒細(xì)菌是經(jīng)過(guò)加工可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的兼性需氣菌或兼性厭氣菌.本發(fā)明提供定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可在實(shí)體瘤部位表達(dá)初級(jí)效應(yīng)分子的編碼核酸分子.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，這種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種初級(jí)效應(yīng)分子的一種編碼核酸分子.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，這種定向于腫痛的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子的一種或多種編碼核酸分子.根據(jù)該實(shí)施方案，可將單一的細(xì)菌菌林加工成能夠在實(shí)體瘤部位表達(dá)一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子的一種或多種編碼核酸分子.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，可將一種以上的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林加工成能夠表達(dá)一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子的一種或多種編碼核酸分子.在該實(shí)施方案中，一種方式是采用同種的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林.另一種方式是采用不同種的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林(如李斯特菌與沙門(mén)氏菌).本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子可用于治療實(shí)體瘤，如癌、黑色素瘤、淋巴瘤或肉瘤，文中使用的"實(shí)體瘤的治療"或"治療實(shí)體瘤"包括，抑制腫瘤或腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、縮小腫瘤的體積、殺死肺瘤細(xì)胞，或防止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移)，在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子可在腫瘤部位誘導(dǎo)一種局部的免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答可抑制腫瘤或腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、殺死腫瘤細(xì)胞，或防止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到身體的其他部位.因此，這些初級(jí)效應(yīng)分子可提供對(duì)肺瘤的治療作用.這些初級(jí)效應(yīng)分子可來(lái)源于任何已知的生物，其中包括，但不局限于，動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌，以及原生生物或病毒，在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，優(yōu)選采用來(lái)源于一種哺乳動(dòng)物的初級(jí)效應(yīng)分子.在該實(shí)施方案中，更優(yōu)選采用來(lái)源于人的初級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子包括TNF家族成員、抗血管生成因子、細(xì)胞毒性多肽或肽、腫瘤抑制性酶，及其功能性片段.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為T(mén)NF家族成員或其功能性片段.TNP家族成員的實(shí)例包括，但不局限于，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子-卩(TNF-p)、TNF-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNP-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNF-a相關(guān)凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)、CD40配體(CD40L)、LT-a(淋巴毒素a)、LT-p(淋巴毒素P)、0X40L(0X40配體)、FasL、CD27L(CD27配體)、CD30L(CD30配體)、4-lBBL、APRIL(—種增殖誘導(dǎo)配體)、LIGHT(由激活的T細(xì)胞產(chǎn)生的一種29kDa的II型跨膜蛋白)、TL1(一種腫瘸壞死因子樣細(xì)胞因子)、TNFSF16、TNFSF17和AITR-L(激活誘導(dǎo)型TNFR家族成員的配體).在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為肺瘤壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子-p(TNP-p)、TNF-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNF-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNF-a相關(guān)凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)和CD40配體(CD40L),或其功能性片段.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為抗血管生成因子或其功能性片段.抗血管生成因子的實(shí)例包括，但不局限于，內(nèi)抑素、制管張素、apo邁igren、抗血管生成性抗凝血酶III、纖連蛋白的29IcDaN-端蛋白水解片段和40kDaC-端蛋白水解片段、uPA受體拮抗刑、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24個(gè)氨基酸的抗血管生成性片段、被稱(chēng)為13.40的抗血管生成因子、血小板反應(yīng)蛋白I的含有22個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、層粘連蛋白的抗血管生成性小分子肽、纖連蛋白的抗血管生成性小分子肽、前膠原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整聯(lián)蛋白o(hù)uP3的肽拮抗刑和VEGF受體的肽拮抗刑.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為內(nèi)抑素、apomigren的或血小板反應(yīng)蛋白I的功能性片段.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為細(xì)胞毒性多肽或肽，或其功能性片段.細(xì)胞毒性多肽或肽的實(shí)例包括，但不局限于，細(xì)菌素家族成員、Vero細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒性壞死因子1(CNFl)、細(xì)胞毒性壞死因子2(CNF2)、多殺巴斯德菌毒素(PMT)、假單孢菌內(nèi)毒素、溶血素、法尼基轉(zhuǎn)移酶的強(qiáng)竟?fàn)幮砸种苿〤AAX四肽、細(xì)胞周期蛋白抑制刑、Raf激酶抑制刑、CDC激睞抑制劑、caspases、p53、p16和p21。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為細(xì)菌素家族成員，條件是該細(xì)菌素家族成員不是一種細(xì)菌素釋放蛋白(BRP).細(xì)菌素家族成員的實(shí)例包括，但不局限于，ColEl、ColEla、ColElb、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大脈桿菌素A、大腸桿菌素K、大腸桿菌素L、大腸桿菌素M、陰溝腸道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、膿菌素Rl或AP41、巨桿菌素A-216，以及弧菌素.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為大腸桿菌素E3.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為腫瘤抑制性醉或其功能性片段，胂瘸抑制性醉的實(shí)例包括，但不局限于，甲硫氨酸醉、天冬酞胺醉、脂醉、辨脂醉、蛋白醃、核糖核酸醉(不包括colE3)、DNA醉和糖苷酶.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為甲硫氨酸醉.本發(fā)明還提供一些方法，用于通過(guò)沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌將一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子和一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子以組合方式局部遞送至實(shí)體瘤部位.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，定向于腫瘸的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種初級(jí)效應(yīng)分子與一種次級(jí)效應(yīng)分子的一種編碼核酸分子.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子與一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的一種或多種編碼核酸分子.根據(jù)該實(shí)施方案，可將單一的細(xì)菌菌抹加工成能夠在實(shí)體瘤部位表達(dá)一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子與一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的一種或多種編碼核酸分子.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，可將一種以上的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林加工成能夠在實(shí)體瘤部位表達(dá)一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子與一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的一種或多種編碼核酸分子.在該實(shí)施方案中，一種方式是采用同種的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林.另一種方式是采用不同種的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林(如李斯特菌與沙門(mén)氏菌).本發(fā)明的次級(jí)效應(yīng)分子提供類(lèi)外的抗腫瘤治療活性、促進(jìn)定向于胂瘤的減毒細(xì)菌釋放初級(jí)效應(yīng)分子，以及(或者)加強(qiáng)實(shí)體瘤部位等作用部位的內(nèi)化作用.本發(fā)明的次級(jí)效應(yīng)分子可含有一種分子(例如一種抗腫瘤蛋白，其中包括，但不局限于，細(xì)胞毒素、酶和細(xì)菌素；前體藥物轉(zhuǎn)化酶；反義分子；核酶；抗原；等等)，該分子可通過(guò)本發(fā)明的方法與初級(jí)效應(yīng)分子協(xié)同遞送，以治療癌、黑色素痏、淋巴瘤或肉瘤等實(shí)體瘤.這些次級(jí)效應(yīng)分子可來(lái)源于任何已知的生物，其中包括，但不局限于，動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌，以及原生生物或病毒.在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中采用來(lái)源于一種細(xì)菌或病毒的次級(jí)效應(yīng)分子.在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中采用來(lái)源于一種細(xì)菌的次級(jí)效應(yīng)分子(如BRP).在本發(fā)明的其他一些優(yōu)選實(shí)施方案中采用來(lái)源于一種病毒的次級(jí)效應(yīng)分子(如TAT).在本發(fā)明的另一些優(yōu)選實(shí)施方案中采用來(lái)源于一種哺乳動(dòng)物的次級(jí)效應(yīng)分子.在某些優(yōu)選實(shí)施方案中采用來(lái)源于人的次級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明提供一些含有效應(yīng)分子的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌，這些效應(yīng)分子由質(zhì)粒或可轉(zhuǎn)染核酸編碼.在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的定向于胂瘤的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.當(dāng)沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可表達(dá)一種以上的效應(yīng)分子時(shí)(如初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子)，這些效應(yīng)分子可由相同的質(zhì)?；蚝怂醽?lái)編碼，也可以由一種以上的質(zhì)粒或核酸來(lái)編碼.本發(fā)明還提供一些含有效應(yīng)分子的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌，這些效應(yīng)分子由整合到細(xì)菌基因組中的一種核酸編碼.整合的效應(yīng)分子可以是沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的內(nèi)源分子，也可以被引入定向于腫瘤的減毒細(xì)菌中(例如引入一種可編碼效應(yīng)分子的核酸，如質(zhì)粒、可轉(zhuǎn)染核酸、轉(zhuǎn)座子，等等)，使得編碼效應(yīng)分子的該核酸能夠整合到定向于肺瘤的減毒細(xì)菌的基因組中.本發(fā)明提供一種與適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的編碼效應(yīng)分子的核酸分子.與編碼效應(yīng)分子的核酸可搮作性連接的啟動(dòng)子可以是同源的(即本身的)，也可以是異源的(即編碼效應(yīng)分子的核酸本身不具有的).適當(dāng)啟動(dòng)子的實(shí)例包括，但不局限于，Tet啟動(dòng)子、trc、pepT、lac、sulA、polII(dinA)、ruv、recA、uvrA、uvrB、uvrD、umuDC、lexA、cea、caa、recN和pagC,本發(fā)明還提供一些方法，用于通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌將一種或多種含有信號(hào)序列及效應(yīng)分子的融合蛋白進(jìn)行局部遞送.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，定向于腫痛的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種融合蛋白的一種或多種編碼核酸分子，這些融合蛋白含有一種0mp樣蛋白或其部分(如信號(hào)序列、前導(dǎo)序列、周質(zhì)區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、多跨膜結(jié)構(gòu)域，或其組合，見(jiàn)下文笫3，1節(jié)對(duì)"0邁p樣蛋白"的定義)，并含有一種效應(yīng)分子.盡管不受原理的限制，但本發(fā)明人認(rèn)為0叩樣蛋白可以將效應(yīng)分子錨定或粘連于外膜，或可用來(lái)使效應(yīng)分子定位于細(xì)菌外膜.在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的效應(yīng)分子可加強(qiáng)向細(xì)菌外膜的遞送.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，效應(yīng)分子與0mp樣蛋白的融合被用來(lái)促進(jìn)效應(yīng)分子定位于周質(zhì).在其他一些實(shí)施方案中，效應(yīng)分子與0mp樣蛋白的融合被用來(lái)促進(jìn)效應(yīng)分子的釋放.Omp樣蛋白的實(shí)例包括，但不局限于，k乂下各實(shí)多!l的至少、一部分0mpA、OmpB、OmpC、OmpD、0邁pE、0邁pF、OmpT、孔蛋白樣蛋白、PhoA、PhoE、lamB、p-內(nèi)酰胺醃、腸毒素、蛋白A、內(nèi)切葡聚糖酶、肽聚糖相關(guān)脂蛋白(PAL)、FepA、PhuA、NmpA、NmpB、NmpC，和一種主要的外膜脂蛋白(如LPP).在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白含有一種蛋白水解性剪切位點(diǎn).該蛋白水解性剪切位點(diǎn)可以是效應(yīng)分子的內(nèi)源位點(diǎn)，也可以是Oinp樣蛋白的內(nèi)源位點(diǎn)，也可以是構(gòu)建到融合蛋白中的蛋白水解性剪切位點(diǎn).本發(fā)明還提供一些方法，用于通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌將一種或多種含有運(yùn)送肽及效應(yīng)分子的融合蛋白局部遞送至實(shí)體瘤，研究表明，在融合蛋白中使用運(yùn)送肽可利于將目的多肽或肽遞送至處在其產(chǎn)生或引入的擴(kuò)散范圍內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞(可參考，例如，Bayley，1999，NatureBiotechnology17:1066-1067;Fernandezetal.，1998，NatureBiotechnology16:418-420;和Derossietal.，1998，TrendsCellBiol.8:84-87).因此，將定向于腫瘤的減毒細(xì)菌加工成可表達(dá)含有運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白的方法能夠提高效應(yīng)分子被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的能力.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種核酸分子，該核酸分子可編碼一種含有運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，定向于腫瘸的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼一種或多種含有運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.這些實(shí)施方案中的效應(yīng)分子可以是初級(jí)效應(yīng)分子，也可以是次級(jí)效應(yīng)分子.運(yùn)送肽的實(shí)例包括，但不局限于，來(lái)源于HIVTAT蛋白、觸角足同源域(穿透蛋白(penetratin))、卡波西成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)膜移位序列(MTS),以及單純皰奢病毒VP22的肽.本發(fā)明還提供一些方法，用于通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌將一種或多種含有信號(hào)肽、運(yùn)送肽及效應(yīng)分子的融合蛋白局部遞送至實(shí)體瘤.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，定向于肺瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼一種或多種含有信號(hào)肽、運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.該實(shí)施方案中的效應(yīng)分子可以是初級(jí)效應(yīng)分子，也可以是次級(jí)效應(yīng)分子，本發(fā)明還提供一些方法，用于通過(guò)定向于肺瘤的減毒細(xì)菌將一種或多種含有信號(hào)肽、蛋白水解性剪切位點(diǎn)、運(yùn)送肽及效應(yīng)分子的融合蛋白局部遞送至實(shí)體瘤.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼一種或多種含有信號(hào)序列、蛋白水解性剪切位點(diǎn)、運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.該實(shí)施方案中的效應(yīng)分子可以是初級(jí)效應(yīng)分子，也可以是次級(jí)效應(yīng)分子.在某些實(shí)施方案中，可將單一的細(xì)菌菌林加工成能夠在實(shí)體瘤部位表達(dá)本發(fā)明所迷融合蛋白的一種或多種編碼核酸分子.在其他一些實(shí)施方案中，可將一種以上的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌抹加工成能夠在實(shí)體瘤部位表達(dá)一種或多種本發(fā)明所述融合蛋白的一種或多種編碼核酸分子，這些實(shí)施方案的方式是采用同種的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌菌林.另一種方式是采用不同種的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林(如李斯特菌與沙門(mén)氏菌).本發(fā)明還提供一些方法，用于通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌將本發(fā)明的一種或多種融合蛋白及本發(fā)明的一種或多種效應(yīng)分子局部遞送至實(shí)體瘤部位.優(yōu)選的是，與單獨(dú)表達(dá)融合蛋白或單獨(dú)表達(dá)效應(yīng)分子相比，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌在實(shí)體瘤部位同時(shí)表達(dá)融合蛋白和效應(yīng)分子可以提高對(duì)腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制水平，本發(fā)明還提供在沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌中表達(dá)一種初級(jí)效應(yīng)分子和任選的一種次級(jí)效應(yīng)分子的方法，其中的細(xì)菌具有一種增強(qiáng)釋放系統(tǒng).在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，增強(qiáng)釋放與定向于腫瘤的減毒細(xì)菌表達(dá)一種釋放因子有關(guān)，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，該釋放允許效應(yīng)分子從細(xì)胞質(zhì)空間或周質(zhì)空間釋放.釋放因子可以是定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的內(nèi)源因子，也可以是外源因子(也就是由定向于腫瘤的減毒細(xì)菌本身不具有的一種編碼分子來(lái)編碼).釋放因子可以由質(zhì)粒等核酸來(lái)編碼，也可以由整合到定向于腫瘤的減毒細(xì)菌基因組中的核酸來(lái)編碼.釋放因子可以由編碼初級(jí)效應(yīng)分子的同一核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼，也可以由不同的核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼.釋放因子可以由編碼次級(jí)效應(yīng)分子的同一核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼，也可以由不同的核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，釋放因子為細(xì)菌素釋放蛋白(BRP).在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，BRP為陰溝腸道菌素DF13質(zhì)粒的BRP、大腸桿菌素E1-E9質(zhì)粒的一種BRP,或大腸桿菌素A、N或D質(zhì)粒的一種BRP.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的BRP為陰溝腸道菌素DF13的BRP(pCloDF13BRP).在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，該增強(qiáng)釋放系統(tǒng)包括一種孔蛋白的過(guò)度表達(dá).本發(fā)明還提供在沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌中表達(dá)本發(fā)明的一種融合蛋白的方法，其中的細(xì)菌具有一種增強(qiáng)釋放系統(tǒng).在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，釋放因子的表達(dá)是在一種細(xì)胞中進(jìn)行，該細(xì)胞還能表達(dá)一種含有初級(jí)效應(yīng)分子和0mp樣蛋白的融合蛋白.在該實(shí)施方案中，釋放罔子的共表達(dá)能夠促進(jìn)該融合蛋白從周質(zhì)空間釋放.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一些方法，用于通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的經(jīng)過(guò)修飾的菌林來(lái)遞送高水平的效應(yīng)分子或融合蛋白，這些經(jīng)過(guò)修飾的菌林能夠在表達(dá)效應(yīng)分子或融合蛋白的同時(shí)選擇性地積聚在腫瘤內(nèi).在一種特定的方法中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的修飾菌林可選擇性地增加腫瘤內(nèi)的效應(yīng)分子.盡管以下章節(jié)為簡(jiǎn)單起見(jiàn)是以沙門(mén)氏菌為參考來(lái)進(jìn)行講述，但本發(fā)明的組合物和方法絕不局限于沙門(mén)氏菌，而是還包括其他任何適用的細(xì)菌.明確地說(shuō)，本發(fā)明提供一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌可以是兼性需氣菌，也可以是兼性厭氣菌.定向于肺瘤的減毒細(xì)菌的實(shí)例包括，但不局限于，大腸桿菌，其中包括腸侵襲性大腸桿菌，沙門(mén)氏菌、志賀菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、人型支原體，和鏈球菌.本發(fā)明還提供一些藥用組合物，這些組合物含有一種可藥用栽體物和一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于胂瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些藥用組合物，這些組合物含有一種可藥用栽體和一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些藥用組合物，這些組合物含有一種可藥用栽體和一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于肺瘸的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼本發(fā)明的一種或多種融合蛋白.此外，本發(fā)明還提供一些藥用組合物，這些組合物含有一種可藥用栽體和一種經(jīng)過(guò)修飾而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼本發(fā)明的一種或多種融合蛋白以及一種或多種效應(yīng)分子(即初級(jí)效應(yīng)分子或(和)次級(jí)效應(yīng)分子).在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.本發(fā)明的藥用組合物可用來(lái)治療實(shí)體瘤.實(shí)體瘸包括，但不局限于，肉瘸、癌、淋巴瘸和其他實(shí)體瘤癌癥，其中包括，但不局限于，生殖細(xì)胞系胂痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、印巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星形細(xì)胞瘸、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌和間皮瘤.本發(fā)明還提供一些遞送初級(jí)效應(yīng)分子的方法，用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步稞包括，將一種藥用組合物給藥于需要這種治療的一種動(dòng)物，優(yōu)選的是一種哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的是人，該組合物含有一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些遞送初級(jí)效應(yīng)分子的方法，用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將一種藥用組合物給藥于需要這種治療的一種動(dòng)物，優(yōu)選的是一種哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的是人，該組合物舍有一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些遞送初級(jí)效應(yīng)分子的方法，用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將一種藥用組合物給藥于需要這種治療的一種動(dòng)物，優(yōu)選的是一種哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的是人，該組合物含有一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼本發(fā)明的一種或多種融合蛋白，此外，本發(fā)明還提供一些遞送初級(jí)效應(yīng)分子的方法，用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將一種藥用組合物給藥于需要這種治療的一種動(dòng)物，優(yōu)選的是一種哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的是人，該組合物含有一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼本發(fā)明的一種或多種融合蛋白以及一種或多種效應(yīng)分子(即初級(jí)效應(yīng)分子或(和)次級(jí)效應(yīng)分子).在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，定向于胂瘤的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.在一種特定的方法中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌具有一種增強(qiáng)釋放系統(tǒng).在某些實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可以與其他已知的癌癥療法協(xié)同使用，這些核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.舉例來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可以與化療刑協(xié)同使用，這些核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.化療劑的實(shí)例包括，但不局限于，順鉑、異環(huán)磷酰胺、紫杉醇、taxanes、I型拓樸異構(gòu)醉抑制刑(如CPT-11、托泊替堪、9-AC和GG-211)、gemcitabine、長(zhǎng)春瑞賓、奧沙利鉑、5-象尿嘧咬(5-FU)、亞葉酸、長(zhǎng)春瑞賓、temodal、紫杉盼、細(xì)胞松他素B、短桿菌肽D、吐根堿、絲裂審素、鬼臼亞乙苷、tenoposide、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、阿審素、柔紅審素、二羥基炭疽菌素二稱(chēng)、二羥基蒽嗣、光輝審素、放線(xiàn)菌素D、l-去氬奪嗣、苯丙氨酸氮芥、糖皮質(zhì)激素、普香卡因、丁卡因、利多卡因、心得安，以及嘌呤審素同系物和環(huán)辨酰胺.作為選摔，經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌也可以與放射療法協(xié)同使用，這些核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.本發(fā)明包括定向于腫瘤的減毒細(xì)菌與抗癌刑的序貫給藥或伴隨給藥方法，其中的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白的一種或多種編碼核酸分子，本發(fā)明包括定向于腫瘤的減毒細(xì)菌與抗癌刑的具有附加作用或協(xié)同作用的組合方法，其中的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白的一種或多種編碼核酸分子.本發(fā)明還包括抗癌刑與經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的組合方法，這些核酸分子可編碼一種或多種作用部位不同的效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.這種組合方法無(wú)論具有協(xié)同作用還是具有附加作用，都可以提供一種基于這些治療刑的雙重作用的改進(jìn)療法.因此，本發(fā)明的新組合療法與采用兩種制刑之一的單制刑療法相比，可產(chǎn)生更高的療效.3.1.定義及縮略語(yǔ)文中使用的"沙門(mén)氏菌"包括所有沙門(mén)氏菌物種，其中包括傷寒沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌和腸炎沙門(mén)氏菌，本文還包括不同血清型的沙門(mén)氏菌，例如，通常稱(chēng)為鼠傷寒沙門(mén)氏菌的鼠傷寒血清型是腸炎沙門(mén)氏菌的一個(gè)亞群.類(lèi)似物文中使用的術(shù)語(yǔ)"類(lèi)似物"是指與初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的功能類(lèi)似或相同的一種多肽，該多肽并不一定含有與初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子類(lèi)似或相同的氨基酸序列，也不一定具有與初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子類(lèi)似或相同的結(jié)構(gòu).具有類(lèi)似氨基酸序列的多肽是指至少滿(mǎn)足以下條件之一的多肽(a)含有一種氛基酸序列的多肽，該序列與文中描述的初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的氨基酸序列具有至少30X、至少35X、至少40、至少45%、至少50、至少55X、至少60、至少65V至少70X、至少75X、至少80、至少85X、至少90%、至少95X或至少99X的同一性；(b)由一種核苷酸序列編碼的多肽，該序列能夠在嚴(yán)格條件下與編碼文中所述初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的核苷酸序列雜交，并且雜交序列為至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少50個(gè)連續(xù)氦基酸殘基、至少60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少70個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少80個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少90個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少100個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少125個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，或至少150個(gè)連續(xù)氨基酸殘基；以及(c)由一種核苷酸序列編碼的多肽，該序列與編碼文中所述初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的核苷酸序列具有至少30%、至少35X、至少40、至少45、至少50X、至少554、至少60、至少65X、至少70、至少75、至少80、至少85X、至少90%、至少95X或至少99X的同一性，具有文中所述初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的類(lèi)似結(jié)構(gòu)的多肽是指具有文中所述初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的類(lèi)似二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽.多肽的結(jié)構(gòu)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)測(cè)定，其中包括，但不局限于，肽測(cè)序方法、X-射線(xiàn)晶體學(xué)方法、核磁共振方法、圃二色方法和晶體電鏡檢測(cè)方法.抗血管生成因子抗血管生成因子是指具有抗血管生成活性的任何蛋白質(zhì)分子，或編碼這種蛋白質(zhì)分子的核酸.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的抗血管生成因子是一種較大的蛋白的肽片段或剪切片段.減毒減毒是指一種使微生物或栽體的致病性降低的修飾方法.減毒的最終結(jié)果是，當(dāng)把減毒微生物或栽體給藥于患者時(shí)，毒性及其他副作用的危除性降低.細(xì)菌素細(xì)菌素是指具有特定活性的細(xì)菌性蛋白毒素，細(xì)菌宿主對(duì)該毒素免疫.細(xì)菌素可由細(xì)菌宿主的基因組或質(zhì)粒編碼，其毒性針對(duì)的其他細(xì)菌的范圍可寬可窄，細(xì)菌素可以是只含一個(gè)或兩個(gè)亞基的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)，也可以是多亞基結(jié)構(gòu).此外，表達(dá)細(xì)菌素的宿主具有抵抗該細(xì)菌素的免疫力.螯合刑敏感性螯合刑敏感性的定義是，能夠影響細(xì)菌增殖的有效濃度，或能夠降低細(xì)菌存活力的濃度，細(xì)菌存活力由可再生的集落形成單位(c.f.u.)來(lái)確定.衍生物在本文的"一種多肽的衍生物"中使用的術(shù)語(yǔ)"衍生物"是指一種多肽，這種多肽含有諸如初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子等多肽的一種被改變的氨基酸序列，改變方法是引入氨基酸殘基取代、缺失或添加，或是多肽與任一類(lèi)型的分子發(fā)生共價(jià)聯(lián)接.在本文的"一種初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的衍生物"中使用的術(shù)語(yǔ)"衍生物"是指被修飾的一種初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子，修飾方法是，例如，初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子與任一類(lèi)型的分子發(fā)生共價(jià)聯(lián)接.作為非限定性的實(shí)例，可通過(guò)諸如蛋白水解性剪切或與一種細(xì)胞配體或其他蛋白相連接的方法對(duì)初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子進(jìn)行修飾.可以用化學(xué)修飾方法通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)對(duì)初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的衍生物進(jìn)行修飾(例如耽化、磷酸化、羧化、糖基化、硒修飾或疏酸化).此外，初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的衍生物可含有一個(gè)或多個(gè)非經(jīng)典氨基酸.多肽衍生物可具有與文中所述初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子類(lèi)似或相同的功能.在本文的"定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌突變體msbB-衍生物"中使用的術(shù)語(yǔ)"衍生物"是指國(guó)際公開(kāi)W099/13053的笫17頁(yè)中定義的修飾沙門(mén)氏菌msbB-突變體，該專(zhuān)利在此完整引入作為參考.片段文中使用的術(shù)語(yǔ)"片段"是指含有一種氨基酸序列的肽或多肽，該序列為初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的氨基酸序列的至少2個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少70個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少80個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少90個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少100個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少125個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少150個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少175個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少200個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，或至少250個(gè)連續(xù)氨基酸殘基.功能性片段文中使用的術(shù)語(yǔ)"功能性片段"是指初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的一種片段，該片段可保持初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的至少一種功能(如效應(yīng)分子的醉活性、抗血管生成活性，或抗腫瘤活性).融合蛋白文中使用的術(shù)語(yǔ)"融合蛋白"是指一種多肽，這種多肽含有初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的一種氨基酸序列，或其功能性片段或衍生物，和一種異源多肽(如非初級(jí)效應(yīng)分子或非次級(jí)效應(yīng)分子)的氨基酸序列.0mp樣蛋白文中的0mp樣蛋白包括任何細(xì)菌外膜蛋白或其部分(如信號(hào)序列、前導(dǎo)序列、周質(zhì)區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、多跨膜結(jié)構(gòu)域，或其組合).在特別實(shí)施方案中，0mp樣蛋白至少是0mpA、0mpB、0邁pC、0mpD、0mpE、0mpF、0mpT、孑L蛋白樣蛋白、PhoA、PhoE、lamB、p-內(nèi)耽胺酶、腸毒素、蛋白A、內(nèi)切葡聚糖睞、肽聚糖相關(guān)脂蛋白(PAL)、FepA、FhuA、NmpA、NmpB、NmpC，或一種主要的外膜脂蛋白(如LPP)等的一部分.純化的文中的"純化的"定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林基本不含污染性蛋白或氨基酸(如死亡細(xì)菌的碎片)或培養(yǎng)基.基本不含污染性蛋白或氨基酸的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌菌林包括，含有約30、20%、10%或5%(干重)以下的污染性蛋白或氨基酸的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌制刑。釋放因子文中的釋放因子包括可促進(jìn)細(xì)菌組分釋放的任何蛋白或其功能性部分.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的釋放因子為細(xì)菌素釋放蛋白，釋放因子包括，但不局限于，陰溝腸道菌素DF13質(zhì)粒編碼的細(xì)菌素釋放蛋白(BRP)、大腸桿菌素El-E9質(zhì)粒編碼的BRPs，或大腸桿菌素A、N或D質(zhì)粒編碼的BRPs,膿毒性休克膿毒性休克是由TNP-a引發(fā)、由復(fù)合細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成的一種內(nèi)臟衰竭狀態(tài).微生物或栽體誘導(dǎo)TNF-a的能力可作為一種衡量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)表示其誘導(dǎo)膿毒性休克的相對(duì)能力.定向于腫瘤定向于腫瘤的定義是，與對(duì)應(yīng)的非癌性細(xì)胞或組織相比，可優(yōu)先定位于相應(yīng)的癌性靶細(xì)胞或組織并復(fù)制的能力，因此，沙門(mén)氏菌等定向于肺瘤的減毒細(xì)菌可優(yōu)先附著和(或)感染癌性靶細(xì)胞，并且(或者)可在腫瘤環(huán)境中保持存活，毒力毒力是描述總致病能力的一個(gè)相關(guān)術(shù)語(yǔ)，包括殺死正常細(xì)胞的能力或誘導(dǎo)膿毒性休克的能力(見(jiàn)下文的詳細(xì)定義).文中使用的菌株名VNP20009(國(guó)際公開(kāi)WO99/13053)、YS1646和41.2.9可彼此互換，它們都是指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心中保藏的編號(hào)為202165的菌林，文中使用的菌林名YS1456和8.7可彼此互換，它們都是指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心中保藏的編號(hào)為202164的菌林.參考下文的發(fā)明詳迷、特別實(shí)施方案的說(shuō)明性實(shí)施例以及附困可以更全面地了解本發(fā)明，4-附圖簡(jiǎn)述困1:成熟的人TNF-a編碼序列，DNA序列(SEQIDNO:3)和蛋白序列(SEQIDNO:4)均給出，圖2:沙門(mén)氏菌VNP20009ser(T菌林的獲得方法.困3:鼠傷寒沙門(mén)氏菌中，由整合到染色體中的trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)TNF-a基因表達(dá)TNF-a.困4:與成熟的人TNF-a(笫67-543核苷酸)融合的合成OmpA信號(hào)序列(第1-63核苷酸)的編碼序列.DNA序列(SEQIDNO:7)和蛋白序列(SEQIDNO:8)均以融合構(gòu)建體形式表示.圖5:OmpA/TNF-a融合蛋白在大腸桿菌(JM109菌抹)中的周質(zhì)定位和表達(dá).圖6:與成熟的人TRAIL(笫67-801核苷酸)融合的O即A信號(hào)序列(笫l-63核苷酸)的編碼序列.融合構(gòu)建體的DNA序列(SEQIDNO:9)和蛋白序列(SEQIDNO:10)均表示在困中.圖7:OmpA/TRAIL融合蛋白在大脈桿菌(JM109菌林)中的表達(dá)和加工.圖8:成熟(C125A)的人IL-2(第64-462核苷酸)與修飾的OmpA信號(hào)序列(第1-63核苷酸)的融合蛋白編碼序列.融合構(gòu)建體的DNA序列(SEQIDNO:11)和蛋白序列(SEQIDNO:12)均表示在困中.困9:與phoA(8L)或ompA(8L)合成信號(hào)肽融合的成熟的人IL-2的表達(dá)和加工.圖10:與成熟(C125A)的人IL-2(笫64-462核苷酸)融合的修飾phoA信號(hào)序列(第1-63核苷酸)的編碼序列.融合構(gòu)建體的DNA序列(SEQIDNO:l3)和蛋白序列(SEQIDNO:l4)均表示在困中，圖11:表達(dá)成熟形式的人TNF-a的鼠傷寒沙門(mén)氏菌減毒菌林的體內(nèi)抗腫瘤作用.困12:BRP的表達(dá)對(duì)體內(nèi)抗腫瘤作用的影響.該困顯示患有B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠用(1)PBS對(duì)照；(2)VNP20009;和(3)帶有含BRP基因的pSWl質(zhì)粒的VNP20009處理后的平均腫瘤大小隨時(shí)間的變化.困13:對(duì)沙門(mén)氏菌中受pepT啟動(dòng)子調(diào)控的p-gal基因表達(dá)進(jìn)行無(wú)氣誘導(dǎo).圖13A說(shuō)明無(wú)氣條件對(duì)沙門(mén)氏菌YS1456菌林及VNP20009菌林的p-gal表達(dá)的體外誘導(dǎo)情況.困13B說(shuō)明表達(dá)BRP、p-gal,或BRP與p-gal均表達(dá)的VNP20009沙門(mén)氏菌對(duì)腫瘤和肝細(xì)胞內(nèi)的p-gal的體內(nèi)誘導(dǎo)情況比較.圖14:對(duì)沙門(mén)氏菌中受Tet啟動(dòng)子調(diào)控的p-gal基因表達(dá)進(jìn)行四環(huán)素誘導(dǎo).刑重-應(yīng)答曲線(xiàn)表明，對(duì)濃度約為0.15jig/ml以下的四環(huán)素可產(chǎn)生一種線(xiàn)性應(yīng)答，更高的濃度則使應(yīng)答減弱，推測(cè)其原因可能是四環(huán)素的抗生素功能.圖15:pTrc99a質(zhì)粒的六聚組氨酸-內(nèi)抑素(HexaHIS-內(nèi)抑素)表達(dá)，圖15A顯示轉(zhuǎn)化到沙門(mén)氏菌(VNP20009)中的3種獨(dú)立克隆的HexaHIS-內(nèi)抑素表達(dá).圖15B顯示轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DH5a)中的5種獨(dú)立克隆的HexaHIS-內(nèi)抑素表達(dá).編號(hào)為偶數(shù)的泳道顯示未誘導(dǎo)培養(yǎng)物的提取物，編號(hào)為奇數(shù)的誘導(dǎo)顯示IPTG誘導(dǎo)的相應(yīng)培養(yǎng)物的提取物.困16:YA3334質(zhì)粒的HexaHIS-內(nèi)抑素表達(dá)用抗組氨酸抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，使asd系統(tǒng)(采用trc啟動(dòng)子)中的HexaHIS-內(nèi)抑素顯示出HexaHIS-內(nèi)抑素的正確大小(~25kD)的條帶(1-8道相當(dāng)于8個(gè)獨(dú)立的克隆).圖17:表達(dá)內(nèi)抑素的VNP20009細(xì)胞對(duì)C38鼠結(jié)腸癌的作用.該困顯示患有C38肺瘤的小鼠用(1)PBS對(duì)照；(2)帶有空YA3334栽體的asd-VNP20009;(3)表達(dá)六聚組氨酸-內(nèi)抑素的asd-VNP20009;和(4)表達(dá)六聚組氨酸-內(nèi)抑素和BRP的VNP20009處理后的平均腫瘤大小隨時(shí)間的變化.困18:表達(dá)內(nèi)抑素的VNP20009細(xì)胞對(duì)DLD1人結(jié)腸癌的作用.該圖顯示患有DLD1腫瘤的棵鼠用(l)PBS對(duì)照；(2)帶有空YA3334栽體的as(TVNP20009;和(3)表達(dá)六聚組氨酸-內(nèi)抑素和BRP的VNP20009處理后的平均肺瘤大小隨時(shí)間的變化.圖19:表達(dá)人內(nèi)抑素的定向于胂瘤的減毒沙門(mén)氏菌的裂解物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗增殖活性.該閨顯示bFGF和相當(dāng)于8xIO'個(gè)細(xì)菌的裂解物對(duì)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)増殖的抑制.對(duì)照為含有空pTrc質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌.每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為1次典型試驗(yàn)獲得的4次測(cè)量值的平均數(shù).樣品均根據(jù)細(xì)菌數(shù)進(jìn)行了校正.圖20:表達(dá)血小板因子-4肽(血小板因子-4的笫47-70氨基酸)和血小板反應(yīng)蛋白肽(13.40)的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌的裂解物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗增殖活性.該閨顯示bFGF和相當(dāng)于3.2xio'個(gè)細(xì)菌的裂解物對(duì)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖的抑制.對(duì)照為含有空pTrc質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌.每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為1次典型試驗(yàn)獲得的4次測(cè)量值的平均數(shù).樣品均根據(jù)細(xì)菌數(shù)進(jìn)行了校正.圖21:pE3.shuttle-l栽體的構(gòu)建.圖22:ColE3-CA38栽體(GenBank編號(hào)AF129270)的構(gòu)建，ColE3-CA38栽體的核苷酸序列如SEQIDNO:1所述.ColE3-CA38栽體含有5種開(kāi)放讀碼框架，分別描述與SEQIDNO:2-5.圖23:ColE3-CA38/BRP-1栽體的構(gòu)建.圖24:柱狀囝顯示各菌林產(chǎn)生的大腸桿菌素E3的致死單位量.困25:對(duì)暴露于紫外光或x-射線(xiàn)的不同菌抹的牽測(cè)定.圖26:41.2.9/ColE3對(duì)C38鼠結(jié)腸癌的作用，圖27:41.2.9/Col/E3對(duì)NU/Nu小鼠中的DLD1人結(jié)腸癌的抗腫瘤活性.困28:41.2.9/ColE3對(duì)B16鼠黑色素瘤的作用.圖29:表達(dá)克隆的大腸桿菌CNF1的沙門(mén)氏菌的細(xì)胞毒性.圖30:與正常Hela細(xì)胞(B)相比，暴露于CNF1的Hela細(xì)胞(A)表現(xiàn)出增大和多核現(xiàn)象.困31:以3，-5，方向顯示的pCVD442-msbB栽體的msbB部分(如田32所示)，在msbB的中部有一段缺失，并且在其位置含有內(nèi)部的Notl、Pacl、Sphl、Sfil、Swal和Dral多接頭(SEQIDNO:61).見(jiàn)困32.困32:用于在DmsbB區(qū)域克隆DNA然后插入染色體的pCVD442-msbB栽體的限制醃困謙和示意困.msbBdel為DmsbB的5，及3，區(qū)域；mobRP4為轉(zhuǎn)移元件，用于將質(zhì)粒由一種菌株轉(zhuǎn)移到另一種菌林，bla為p-內(nèi)觥胺酶基因，可賦予對(duì)羧芐青審素和氨節(jié)青審素等b-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的敏感性.sacB為賦予蔗糖敏感性的基因.圖33:1)pCVD442-Tet-BRP-AB栽體，2)在沙門(mén)氏菌YS50102中與DmsbB染色體拷貝進(jìn)行的同源重組，3)在沙門(mén)氏菌YS50102中進(jìn)行的染色體整合，以及隨后進(jìn)行的噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)至VNP20009林，4)通過(guò)蔗糖篩選獲得41.2.9-Tet-BRP-AB菌株.oriR6K為質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；mobRP4為轉(zhuǎn)移因子，用于將質(zhì)粒由一種菌林轉(zhuǎn)移到另一種菌林.amp為p-內(nèi)酰胺酶基因，可賦予對(duì)羧節(jié)青審素和氨節(jié)青審素等b-內(nèi)耽胺類(lèi)抗生素的敏感性.sacB為賦予蔗糖敏感性的基因.注釋未按比例繪制.圖34:在暴露于SK0V3細(xì)胞72小時(shí)后，tetBRPAB的笫26號(hào)克隆和笫31號(hào)克隆與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照(HSC10和41.2.9)相比的細(xì)胞毒性百分率(平均數(shù)-8),Vero細(xì)胞毒素的表達(dá)由四環(huán)素誘導(dǎo)(見(jiàn)笫26和笫31號(hào)克隆).經(jīng)四環(huán)素處理(+);未經(jīng)四環(huán)素處理(-).細(xì)胞毒性百分率的陽(yáng)性對(duì)照為大腸桿菌HSCIO菌株.圖35:定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌在四環(huán)素不存在(1A)和存在(1B)情況下在血瓊脂上的暈形成情況.經(jīng)過(guò)加工而組成型表達(dá)SheA的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌在四環(huán)素不存在(2A)和存在(2B)情況下的暈形成情況.經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)可被四環(huán)素誘導(dǎo)的SheA的定向于胂瘤的減毒沙門(mén)氏菌在四環(huán)素不存在(3A)和存在(3B)情況下的牽形成情況.困36:(A)不含六聚組氨酸標(biāo)記的TAT-凋亡素融合蛋白的示意圖.(B)含有六聚組氨酸標(biāo)記的TAT-凋亡素融合蛋白的示意圖，(C)含有一種0mpA-8L信號(hào)序列的TAT-凋亡素融合蛋白的示意困圖37:TAT-凋亡素融合蛋白的編碼序列.DNA序列(SEQIDNO:57)和蛋白序列(SEQIDNO:58)均給出.圖38:六聚組氨酸-TAT-凋亡素融合蛋白的編碼序列.DNA序列(SEQIDNO:59)和蛋白序列(SBQIDNO:60)均給出.圖39:VNP20009/環(huán)確跣胺組合療法對(duì)C57BL/6小鼠中的M27肺癌生長(zhǎng)的作用.圖40:VNP20009/絲裂審素組合療法對(duì)C57BL/6小鼠中的M27肺癌生長(zhǎng)的作用.圖41:VNP20009/順鉑組合療法對(duì)C57BL/6小鼠中的M27肺癌生長(zhǎng)的作用，5.發(fā)明詳述本發(fā)明使用定向于腫瘸的減毒細(xì)菌菌林來(lái)向腫瘤遞送高水平的治療性初級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明的優(yōu)越性在于可避免某些初級(jí)效應(yīng)分子的潛在全身毒性(如TNF-a引起的膿毒性休克).本發(fā)明提供向?qū)嶓w瘤遞送一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的方法.更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明包括諸如沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的制備和用途，將其作為栽體把一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子遞送至適當(dāng)?shù)淖饔貌课?，如?shí)體瘤部位.明確地說(shuō)，本發(fā)明的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌是經(jīng)過(guò)加工可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的兼性需氣菌或兼性厭氧菌.基于定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的所述遞送系統(tǒng)可以將一種或多種效應(yīng)分子遞送至實(shí)體瘤部位.本發(fā)明提供一些安全并且有效的方法，用于通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，例如對(duì)宿主的毒性降低的沙門(mén)氏菌，將全身給藥于宿主時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性或?qū)е虏涣几弊饔?如不良的免疫學(xué)影響)的初級(jí)效應(yīng)分子局部遞送至肺瘤.本發(fā)明還提供通過(guò)一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌，來(lái)遞送一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的組合遞送方法.本發(fā)明還提供定向于肺瘤的不同減毒細(xì)菌的組合遞送方法，這些細(xì)菌帶有一種或多種不同的初級(jí)效應(yīng)分子和(或)一種或多種不同的次級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些方法，用于通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌將一種或多種含有效應(yīng)分子的融合蛋白局部遞送至實(shí)體瘤部位，這些細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)所述融合蛋白.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種含有信號(hào)肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種含有信號(hào)序列、蛋白水解性剪切位點(diǎn)和效應(yīng)分子的融合蛋白.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種含有運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白，在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種含有信號(hào)序列、運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.在另外一項(xiàng)實(shí)施方案中，定向于腫癀的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種含有信號(hào)序列、蛋白水解性剪切位點(diǎn)、運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.定向于肺瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種本發(fā)明的融合蛋白以及一種或多種本發(fā)明的效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些藥用組合物，這些組合物含有一種可藥用栽體和一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些藥用組合物，這些組合物含有一種可藥用栽體和一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.此外，本發(fā)明還提供一些藥用組合物，這些組合物含有一種可藥用栽體和一種經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些核酸分子可編碼一種或多種融合蛋白以及一種或多種效應(yīng)分子，本發(fā)明還提供一些方法，用于對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌給藥于需要這種治療的動(dòng)物，這些核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些方法，用于對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌給藥于需要這種治療的動(dòng)物，這些核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.此外，本發(fā)明還提供一些方法，用于對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將經(jīng)過(guò)加工而包含一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌給藥于需要這種治療的動(dòng)物，這些核酸分子可編碼一種或多種融合蛋白以及一種或多種效應(yīng)分子.優(yōu)選的是該動(dòng)物為哺乳動(dòng)物(如狗、貓、馬、牛、猴，或豬)，更優(yōu)選的是該動(dòng)物為人.實(shí)體瘤的實(shí)例包括，但不局限于，肉瘤、癌、淋巴瘸和其他實(shí)體瘤癌癥，其中包括，但不局限于，乳腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、生殖細(xì)胞系癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌和間皮瘰.盡管不受任何原理的限制，但本發(fā)明人認(rèn)為，本發(fā)明可通過(guò)遞送含有效應(yīng)分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，使該效應(yīng)分子在腫瘤部位定向表達(dá).為了解釋清除，本發(fā)明詳述分為以下幾個(gè)小節(jié)"細(xì)菌栽體"；"用于腫瘤治療的初級(jí)效應(yīng)分子"；"與初級(jí)效應(yīng)分子共表達(dá)的次級(jí)效應(yīng)分子"；"衍生物和類(lèi)似物"；"融合蛋白"；"表達(dá)栽體"；和"用于遞送的方法及組合物".5.1.細(xì)菌栽體任何定向于腫瘤的減毒細(xì)菌都可以在本發(fā)明的方法中使用.更詳細(xì)地說(shuō)，在本發(fā)明的方法中使用的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌為兼性需氧菌或兼性厭氧菌.可在本發(fā)明的方法中使用的定向于腫瘤的兼性需氧或兼性厭氧減毒細(xì)菌的實(shí)例包括，但不局限于，大腸桿菌，其中包括腸侵染性大腸桿菌，沙門(mén)氏菌、志賀菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、羊核細(xì)胞增多性李斯特菌、人型支原體，和鏈球菌.這里對(duì)影響減毒性質(zhì)和定向于肺瘤性質(zhì)的一些因素進(jìn)行描述，這些因素可用來(lái)構(gòu)建或篩選適于在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)菌菌林.例如，國(guó)際公開(kāi)WO96/40238的笫6.1節(jié)描述了定向于腫瘸的細(xì)窗的篩選和分離方法，第6.2節(jié)描述了細(xì)菌減毒的方法，在此均引入作為參考，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W099/13053中還描述了定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的一些實(shí)例，在此均完整引入作為參考.在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是采用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)修飾細(xì)菌，以將其減毒或高度減毒.本發(fā)明提供一些可作為栽體的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，用于一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子(如TNF家族成員、細(xì)胞毒性舦或多肽、腫瘤抑制性酶或抗血管生成因子)的單獨(dú)遞送，或與一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的協(xié)同遞送.本發(fā)明還提供一些可作為栽體的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，用于本發(fā)明的一種或多種融合蛋白的單獨(dú)遞送，或與一種或多種效應(yīng)分子的協(xié)同遞送.在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌，該細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.盡管以下章節(jié)特別參考沙門(mén)氏菌來(lái)進(jìn)行講述，但本發(fā)明的組合物和方法決不局限于沙門(mén)氏菌，而是還包括其他任何適用的細(xì)菌.適當(dāng)?shù)募?xì)菌物種包括，但不局限于，大腸桿菌，其中包括腸侵染性大腸桿菌，沙門(mén)氏菌、志賀菌、小脈結(jié)腸炎耶爾森菌、單核細(xì)胞增多性李斯特菌、人型支原體和鏈球菌，其中，這些細(xì)菌為兼性需氣菌或兼性厭氣菌.5丄1.沙n氏菌栽體利用本發(fā)明講述的方法可以使任何定向于腫瘸的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工而編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子，從而產(chǎn)生一種可將本發(fā)明的一種或多種效應(yīng)分子遞送至實(shí)體瘤的新穎的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，此外，利用本發(fā)明講述的方法可以使任何定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工而編碼本發(fā)明的一種或多種融合蛋白以及可選的一種或多種效應(yīng)分子，從而產(chǎn)生一種可將本發(fā)明的融合蛋白和效應(yīng)分子遞送至實(shí)體瘤的新穎的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌.沙門(mén)氏菌等細(xì)菌是人或動(dòng)物體內(nèi)的一種病原體.膿毒癥就是由沙門(mén)氏菌引起的一種疾病，由于膿毒性休克的發(fā)病會(huì)導(dǎo)致很高的死亡率，所以該疾病是一個(gè)有待解決的重要課趙(Bone，1993，ClinicalMicrobiol.Revs.6:57-68).因此，為了能在本發(fā)明中安全地使用沙門(mén)氏菌栽體，需要對(duì)沙門(mén)氏菌等細(xì)菌栽體的致病性毒力進(jìn)行減毒.在本申請(qǐng)中，減毒包括對(duì)微生物栽體進(jìn)行加工以降低該微生物栽體的致病性，這與其傳統(tǒng)定義相符，此外還要包括對(duì)微生物栽體進(jìn)行加工，使所得微生物栽體能夠以較低的滴度給藥于患者，同時(shí)仍獲得類(lèi)似于以較高滴度給予原微生物栽體的效果.最終結(jié)果是有利于減少因把栽體給藥于患者而導(dǎo)致毒素性休克或其他副作用的風(fēng)險(xiǎn).這種減毒細(xì)菌可采用多種技術(shù)來(lái)分離.舉例來(lái)說(shuō)，實(shí)現(xiàn)減毒的方法可以是去除或破壞那些確保細(xì)菌在宿主細(xì)胞中，尤其是在巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中存活的毒力因子的編碼DNA序列，這種去除或破壞技術(shù)已為本領(lǐng)域所熟知，其中包括，例如，同源重組、化學(xué)誘變、放射誘變，或轉(zhuǎn)座子誘變.與在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活有關(guān)的那些毒力因子通?？梢噪S酸化作用等應(yīng)激信號(hào)或巨噬細(xì)胞胞飲等宿主細(xì)胞防御機(jī)制而在巨噬細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)(Fieldsetal，，1986，Proc.NatLAcad.ScLUSA83:5189-5193).國(guó)際公開(kāi)WO96/40238的表4列舉了一些沙門(mén)氏菌毒力因子的實(shí)例，這些因子的缺失可以導(dǎo)致減毒.沙門(mén)氏菌等細(xì)菌栽體的另一種減毒方法是對(duì)導(dǎo)致該細(xì)菌具有毒性的取代基進(jìn)行修飾.舉例來(lái)說(shuō)，細(xì)菌性膿毒癥的病理效應(yīng)主要是由脂多糖(LPS)或內(nèi)毒素造成.導(dǎo)致這種反應(yīng)的LPS組分是脂質(zhì)A("LA").消除或減輕LA的毒性作用即可獲得減毒的細(xì)菌，因?yàn)?)患者產(chǎn)生膿毒性休克的風(fēng)險(xiǎn)降低，并且2)可以耐受更高水平的細(xì)菌栽體.沙門(mén)氏菌等細(xì)菌的LA含量的改變可通過(guò)在LPS生物合成途徑中引入突變的方法來(lái)實(shí)現(xiàn).目前已在沙門(mén)氏菌中確定了LPS生物合成途徑的幾個(gè)醃促步驟和調(diào)控這些步驟的基因位點(diǎn)(Raetz,1993，J.Bacteriol.175:5745-5753及其參考文獻(xiàn))，另外還發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的一些突變.例如，其中的一個(gè)突變firA是UDP-3-0(R-30輕基肉豆寇耽)-胍基乙酸N-酜基轉(zhuǎn)移酶編碼基因中的一種突變，這種醉可調(diào)節(jié)內(nèi)毒素生物合成的笫三個(gè)步碟("lleyetal.，1993，J.Biol.Chem,268:19866-19874).帶有此類(lèi)突變的細(xì)菌菌林可產(chǎn)生一種與野生型脂質(zhì)A不同的脂質(zhì)A，這種脂質(zhì)A含有一個(gè)笫7脂肪酸和一個(gè)棕櫚酸UoyandColeman,1994,J,Bacteriol.176:1639-1646)。Roy和Coleman指出，firA-突變不但能阻斷內(nèi)毒素生物合成的笫三個(gè)步脒，而且還可以降低脂質(zhì)A4，激酵的活性，這種酶可調(diào)節(jié)脂質(zhì)A生物合成的笫6個(gè)步驟.本發(fā)明的細(xì)菌栽體不但被減毒，而且還可以定向于腫瘤，也就是說(shuō)，與正常組織、非腫瘤或非腫瘤細(xì)胞相比，這些細(xì)菌可優(yōu)先附著、感染腫瘤或胂瘤細(xì)胞，并且(或者)可在腫瘤或腫瘤細(xì)胞中保持存活.國(guó)際公開(kāi)W096/40238的第6.1節(jié)(笫25-32頁(yè)；定向于腫瘤)和笫6.2.2節(jié)(笫43-51頁(yè)；減毒)描述了一些獲得定向于肺瘤的減毒細(xì)菌的適當(dāng)方法，在此均引入作為參考.由于所得栽體具有高度特異性和超感染性，因而隨著微生物培養(yǎng)物稀釋度的增加，在靶腫瘸或靶腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)的感染細(xì)菌數(shù)量與非癌性對(duì)應(yīng)物中出現(xiàn)的感染細(xì)菌數(shù)重的差距也越來(lái)越大，以至于使用更低滴度的微生物栽體也可獲得陽(yáng)性結(jié)果.國(guó)際公開(kāi)WO96/40238中講述的技術(shù)也可用來(lái)產(chǎn)生定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌或非沙門(mén)氏菌栽體.國(guó)際公開(kāi)WO99/13053中描述的msbB-沙門(mén)氏菌突變體是帶有LPS途徑突變的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的一個(gè)說(shuō)明性實(shí)例，該專(zhuān)利在此引入作為參考；尤其參考笫6.1，2節(jié)有關(guān)msbB-沙門(mén)氏菌突變體特性的描述.msbB-沙門(mén)氏菌的特性之一是誘導(dǎo)TNF-a應(yīng)答的能力低于野生型細(xì)菌栽體.msbB-沙門(mén)氏菌誘導(dǎo)的TNF-a表達(dá)水平約為野生型沙門(mén)氏菌的利用商品化的測(cè)定系統(tǒng)，如酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)系統(tǒng)，可以對(duì)完整細(xì)菌或分離的LPS或純化的LPS誘導(dǎo)的TNF-a應(yīng)答進(jìn)行體外或體內(nèi)評(píng)定，相對(duì)活性用每集落形成單位("c.f.u.")的TNF-a產(chǎn)量或基于pg/kg的TNF-a產(chǎn)量來(lái)判定.每集落形成單位的TNF-a產(chǎn)量越低，表明誘導(dǎo)TNF-a產(chǎn)生的水平越低.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，oisbB-沙門(mén)氏菌栽體經(jīng)過(guò)加工而含有本發(fā)明的一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子，本發(fā)明還包括定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌msbB-突變體的衍生菌的應(yīng)用.利用本發(fā)明講述的方法可以使定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌msbB-突變體的衍生菌經(jīng)過(guò)加工而編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子，從而產(chǎn)生一種可將本發(fā)明的一種或多種效應(yīng)分子遞送至實(shí)體瘤的新穎的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌.減毒表型的穩(wěn)定性十分重要，它使該菌林不會(huì)在對(duì)患者的治療過(guò)程中回復(fù)成一種毒力更強(qiáng)的表型.獲得這種穗定性的方法可以是，例如，通過(guò)染色體水平上的缺失或其他不可回復(fù)的突變來(lái)破壞毒力基因，而不是通過(guò)上位顯性方法.確保減毒表型的另一種方法是用一種以上的減毒方式對(duì)細(xì)菌進(jìn)行加工，例如脂質(zhì)A產(chǎn)生途徑中的一種突變，如邁sbB-突變(WO99/13053),以及一種或多種營(yíng)養(yǎng)物或代謝物的一種或多種營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變，如Bochner，1980，J.Bacteriol.143:926-933描述的尿嘧啶生物合成、嚷呤生物合成和精氨酸生物合成的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，可編碼或表達(dá)至少一種初級(jí)效應(yīng)分子的定向于胂瘤的msbB-沙門(mén)氏菌同時(shí)具有嘌呤的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變.在某些實(shí)施方案中，可編碼或表達(dá)至少一種初級(jí)效應(yīng)分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌還通過(guò)AroA、msbB、Purl或SerC的突變進(jìn)行減毒.在其他實(shí)施方案中，可編碼或表達(dá)至少一種初級(jí)效應(yīng)分子的定向于胂瘤的減毒細(xì)菌還通過(guò)AroA、msbB、Purl或SerC的缺失進(jìn)行減毒.因此，在本發(fā)明的方法中可以用任何定向于胂瘤的減毒細(xì)菌來(lái)表達(dá)并向?qū)嶓w瘤遞送一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.在優(yōu)選實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌被構(gòu)建成能夠表達(dá)一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.此外，在本發(fā)明的方法中可以用任何定向于腫瘤的減毒細(xì)菌來(lái)表達(dá)并向?qū)嶓w瘤遞送一種或多種融合蛋白以及可選的一種或多種效應(yīng)分子.在優(yōu)選實(shí)施方案中，定向于腫瘸的減毒細(xì)菌被構(gòu)建成能夠表達(dá)一種或多種融合蛋白以及可選的一種或多種效應(yīng)分子.5.2.用于腫瘤治療的初級(jí)效應(yīng)分子本發(fā)明提供用沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌遞送初級(jí)(或可選的次級(jí))效應(yīng)分子的方法，本發(fā)明的效應(yīng)分子為蛋白質(zhì)分子(如蛋白，其中包括，但不局限于，肽、多肽、蛋白、翻譯后修飾的蛋白，等等)，本發(fā)明還提供本發(fā)明所述初級(jí)效應(yīng)分子的編碼核酸分子.初級(jí)效應(yīng)分子可來(lái)源于任何已知的生物，其中包括，但不局限于，動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌，以及原生生物和病毒.在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子來(lái)源于一種哺乳動(dòng)物.在一項(xiàng)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子來(lái)源于人.本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子包括TNF家族成員、抗血管生成因子、細(xì)胞毒性多肽或肽、腫瘤抑制性酶，及其功能性片段，在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為T(mén)NF家族成員或其功能性片段.TNF家族成員的實(shí)例包括，但不局限于，肺瘸壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子"f(TNF-(3)、TNF-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNF-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNF-a相關(guān)凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)、CD40配體(CD40L)、LT-a、LT-p、0X40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-lBBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17和AITR-L.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子-p(TNF-卩)、TNF-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNF-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNF-a相關(guān)凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)和CD40配體(CD40L)，或其功能性片段.有關(guān)綜述可參考，例如,Kwon，B.etal，，1999,Curr.Opin.Immunol.11:340-345對(duì)TNF家族成員的描迷，此外，下表1列舉了TNF家族的代表性成員的經(jīng)典命名和標(biāo)準(zhǔn)命名.在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為腫瘸壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子-卩(TNF-p)、TNF-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNP-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNF-a相關(guān)凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)和CD40配體(CD40L),表l<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為抗血管生成因子或其功能性片段.抗血管生成因子的實(shí)例包括，但不局限于，內(nèi)抑素、制管張素、apomigren、抗血管生成性抗凝血醉III、纖連蛋白的29kDaN-端蛋白水解片段和40kDaC-端蛋白水解片段、uPA受體拮抗刑、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24個(gè)氡基酸的抗血管生成性片段、被稱(chēng)為13.40的抗血管生成因子、血小板反應(yīng)蛋白I的含有22個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、層粘連蛋白的抗血管生成性小分子肽、纖連蛋白的抗血管生成性小分子肽、前膠原的抗血管生成性小分子肽、BGF的抗血管生成性小分子肽，以及整合蛋白o(hù)uP3的肽拮抗刑和VEGF受體的肽拮抗刑.在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為內(nèi)抑素.天然的內(nèi)抑素含有膠原蛋白XVIII的C端~180個(gè)氨基酸(兩種剪接形式的膠原蛋白的編碼cDNA的Genbank編號(hào)為AF18081和AF18082),在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為纖溶酶原片段(纖溶酴原編碼序列的Genbank編號(hào)為冊(cè)_000301和A33096),制管張素肽本身含有纖溶酶原的四種kringle結(jié)構(gòu)域，kringle1到kringle4.研究表明，重組的kringle1、2和3具有天然肽的抗血管生成特性，而kringle4不具有這種活性(Caoetal.，1996，J.Biol.Chem.271:29461-29467).因此，本發(fā)明的制管張素效應(yīng)分子含有至少一種，優(yōu)選至少一種以上選自kringle1、kringle2和fcringle3的kringle結(jié)構(gòu)域，在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子是選自40kDa同種型、42kDa同種型和45kDa同種型的一種人制管張素分子或其組合.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子為纖溶酶原的kringle5結(jié)構(gòu)域，它是一種比制管張素更有效的血管生成抑制刑(制管張素含有kringle1-4結(jié)構(gòu)域).在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為抗凝血酶III.抗凝血醃III，此后稱(chēng)為抗凝血醉，含有一種可將其連接于血管壁的肝素結(jié)合區(qū)和一種與凝血醉相互作用的活性位點(diǎn)環(huán)，抗凝血酶與肝素的結(jié)合可以使該蛋白產(chǎn)生一種構(gòu)象變化，從而使活性環(huán)能夠與凝血醉相互作用，導(dǎo)致凝血酶對(duì)該環(huán)區(qū)進(jìn)行蛋白水解性剪切.該剪切亊件可導(dǎo)致抗凝血酶產(chǎn)生另一種構(gòu)象變化，這種變化(i)可改變凝血酶與抗凝血醉的相互作用部位，并且(ii)使該復(fù)合物與肝素分離(Carrell，1999，Science285:1861-1862及其參考文獻(xiàn))，O，Rei1ly等人(1999，Science285:1926-1928)發(fā)現(xiàn)，剪切后的抗凝血酶具有很強(qiáng)的抗血管生成活性.因此，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗血管生成因子為抗血管生成性抗凝血酶.當(dāng)利用本發(fā)明的方法將該蛋白遞送至實(shí)體瘤時(shí)，可以對(duì)細(xì)菌栽體進(jìn)行加工，使其表達(dá)Genbank編號(hào)為NM-000488的全長(zhǎng)抗凝血醉和一種蛋白水解醉，該蛋白水解酶可催化抗凝血酶的剪切反應(yīng)，以產(chǎn)生抗血管生成性蛋白.該蛋白水解醉可選自凝血蘇、胰彈性蛋白睞和人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白醉.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的蛋白水解酶為胰彈性蛋白酶.功能性胰彈性蛋白醉的重組表達(dá)方法見(jiàn)Shirasu所述(Shirasuetal.,1987，J.Biochem.102:1555-1563).在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為纖連蛋白的40kDa和(或)29kDa蛋白水解片段.表達(dá)這些片段的栽體可以用纖連蛋白前體蛋白的全長(zhǎng)核酸編碼序列(Genbank編號(hào)X02761)和關(guān)于編碼蛋白成熟方法的敘述由常規(guī)方法來(lái)產(chǎn)生.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，纖連蛋白的40kDa和(或)29kDa片段是以胞質(zhì)蛋白的形式由trc啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)，例如可插入到pTrc99A質(zhì)粒中.在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為尿激酶纖溶酶原激活刑(uPA)受體的一種拮抗刑.在一種實(shí)施方案中，使用的拮抗刑為uPA的顯性失活突變體(參考，例如，Crowleyetal.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5021-5025).在另一種實(shí)施方案中，使用的拮抗刑為肽拮抗刑或其融合蛋白(Goodsonetal.，199、Pro"Natl.Acad.Sci.USA91:7129-7133),在又一種實(shí)施方案中，使用的拮抗刑為可溶的顯性失活uPA受體(Minetal.，1996，CancerRes.56:2428-2433),在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為催乳素的16kDaN-端片段，該片段約含有120個(gè)氨基酸，或其生物活性片段(催乳素編碼序列的Genbank號(hào)為NM-000948).在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，該催乳素片段含有一種Cys58-Ser58突變，從而避免該蛋白形成不必要的二疏鍵交聯(lián).在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為7.8kDa的血小板因子-4片段，在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，這種7.8kDa的血小板因子-4片段是以融合蛋白的形式表達(dá)，該融合蛋白的氨基端含有大腸桿菌p-葡糖搭酸糖苷酶的前35個(gè)氛基酸.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，血小板因子-4的肝素結(jié)合性賴(lài)氨酸被突變成谷氨酸，所得變異蛋白具有很強(qiáng)的抗血管生成活性(Maioneetal.，1991，CancerRes'51:2077-2083).血小板因子-4編碼序列的Genbank編號(hào)為NM一002619.在本發(fā)明的另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為血小板因子-4的含有13個(gè)氨基酸的抗血管生成性小分子肽片段、被稱(chēng)為13.40的抗血管生成因子、血小板反應(yīng)蛋白I的含有22個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、層粘連蛋白的抗血管生成性小分子肽、纖連蛋白的抗血管生成性小分子肽、前膠原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，或整聯(lián)蛋白av(33的小分子肽拮抗刑或VEGF受體的小分子肽拮抗刑.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，這些小分子肽以串聯(lián)的方式表達(dá)，以提高蛋白的穩(wěn)定性.除VEGF受體拮抗刑(Sokeretal.，1993,J.Biol.Chem,272:31582-31588A外，其余的小分子肽序列由Cao(1998，Prog,Mol.Subcell.Biol.20:161-176)提供，在一項(xiàng)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的小分子肽含有RGD或NGR基序.在某些實(shí)施方案中，含有RGD或NGR的肽是在宿主細(xì)菌的表面提供，方法是，例如，將讀框中的這種肽的編碼核酸與一種或多種0mpA細(xì)胞外環(huán)的編碼核酸進(jìn)行融合.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為細(xì)胞毒性多肽或肽，或其功能性片段.細(xì)胞毒性多肽或肽對(duì)細(xì)胞具有毒性作用或抑制作用，方法是，例如，通過(guò)干擾蛋白合成或擾亂細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng).此類(lèi)產(chǎn)物的作用機(jī)制可以是，剪切rRNA或核糖核蛋白、抑制延伸因子、剪切mRNA,或能夠減少蛋白合成從而使細(xì)胞無(wú)法存活的其他機(jī)制.細(xì)胞毒性多肽或肽的實(shí)例包括，但不局限于，細(xì)菌素家族成員、Vero細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒性壞死因子1(CNF1;如大腸桿菌CNF1和費(fèi)氏孤菌CNF1)、細(xì)胞毒性壞死因子2(CNF2)、多殺巴斯德菌毒素(PMT)、溶血素、法尼基轉(zhuǎn)移醉的強(qiáng)竟?fàn)幮砸种菩藽AAX四肽、皂革素、蓖蔴毒蛋白、相思豆毒蛋白、其他核糖體滅活蛋白(RIPs)、假單孢菌外毒素、DNA合成抑制劑、RNA合成抑制刑、蛋白合成抑制刑、反義核酸、其他代謝抑制刑(如DNA酶和核糖核酸酶等DNA或RNA剪切分子、蛋白睞、脂酶、磷脂酶)、前體藥物轉(zhuǎn)化酶(如HSV胸腺嘧啶激醉和細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶)、光激活卟啉、蓖蔴毒蛋白、蓖蔴毒蛋白A鏈、玉米R(shí)IP、gelonin、細(xì)胞致死性膨脹毒素、白喉毒素、白喉毒素A鏈、天花粉蛋白、tritin、美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)、Mirabilis抗病毒蛋白(MAP)、Dianthins32和30、相思豆毒蛋白、monodrin、bryodin、志賀菌毒素、黃瓜籽中的一種蛋白生物合成催化抑制刑(參考，例如，國(guó)際申請(qǐng)W093/24620)、假單孢菌外毒素、大腸桿菌熱不穗定毒素、大脈桿菌熱穗定毒素、EaggEC穩(wěn)定毒素-l(EAST)、細(xì)胞毒素的生物活性片段，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的其他細(xì)胞毒性多肽或肽.有關(guān)大腸桿菌及沙門(mén)氏菌毒素的綜述可參考，例如，0'BrianandHolmes,ProteinToxinsofEscherichiacoliandSalmonellainEscherichiaandSalmonella,CellularandMolecularBiology,Neidhardtetal.(eds.)，pp.2788，2802，ASMPress,Washington,D.C.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子為細(xì)菌素家族成員(參考，例如，Konisky，1982，Ann.Rev.Microbiol.36:125-144)，條件是該細(xì)菌素家族成員不是一種細(xì)菌素釋放蛋白(BRP)，細(xì)菌素家族成員的實(shí)例包括，但不局限于，ColEl、ColEla、ColElb、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大腸桿菌素A、大腸桿菌素K、大腸桿菌素L、大腸桿菌素M、陰溝脒道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、膿菌素Rl或AP41、巨桿菌素A-216、微生物素和孤菌素(JayawardeneandFarkas-Himsley，1970，J.BacteriologyVol.102pp382-388),盡管大腸桿菌素A、El、E2、Ia、Ib、K、L和M也可作為適當(dāng)?shù)某跫?jí)效應(yīng)分子，但最優(yōu)選的初級(jí)效應(yīng)分子為大腸桿菌素E3或V(參考，例如，Konisky，1982，Ann.Rev.Microbiol.36:125-144).在該實(shí)施方案中，另一種優(yōu)選的細(xì)菌素為陰溝腸道菌素，最優(yōu)選的是陰溝腸道菌素DF13.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子為ColEl、ColE2、ColE3、ColB4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9.研究表明，大腸桿菌素B3(ColB3)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有深度細(xì)胞毒性作用(Smardaetal.，1978，F(xiàn)oliaMicrobiol.23:272—277)，其中包括對(duì)一種白血病細(xì)胞模型系統(tǒng)的深度細(xì)胞毒性作用(Fiskaetal.，1978，Experimentia35:406-40).ColE3細(xì)胞毒性是一種通過(guò)抑制80S核糖體來(lái)終止蛋白合成的功能(Tur歸skyetal.，1973，Biochem.Biophys.Res.Comm.52:327-334).更詳細(xì)地說(shuō)，ColE3具有核糖核酸酶活性(Saunders,1978，Nature274:113-114).天然形式的ColE3是一種60kDa的蛋白復(fù)合物，含有比率為1:1的一種50kDa蛋白和一種10kDa蛋白，較大的亞基具有核酸酶活性，而較小的亞基具有抑制50kDa亞基的功能.所以50kDa的蛋白可作為一種細(xì)胞毒性蛋白(或毒素)，而10lcDa的蛋白可作為一種抗毒素.因此，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，當(dāng)利用ColE3作為次級(jí)效應(yīng)分子時(shí)，可以單獨(dú)表達(dá)或以髙于較小亞基的水平表達(dá)較大的ColE3亞基或其活性片段.本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案是用單一的質(zhì)粒在沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌中編碼ColE3的50kDa毒素和lOkDa抗毒素.在該實(shí)施方案中，毒素/抗毒素可作為帶有質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌的一種篩選系統(tǒng)，該系統(tǒng)可通過(guò)毒素將質(zhì)粒缺失的沙門(mén)氏菌殺死。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，10kDa抗毒素位于染色體上，而colE3毒素位于質(zhì)粒上，二者彼此分離，從而可阻礙向其他細(xì)菌傳播(見(jiàn)上文笫5.6節(jié)).在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子為陰溝腸道菌素DF13.陰溝腸道菌素DF13的作用方式與ColE3類(lèi)似.該蛋白復(fù)合物的分子量為67kDa.其單一組分的大小為57kDa和9kDa,DF13具有核糖核酸酶活性，此外還可導(dǎo)致細(xì)胞的鐘離子滲漏.在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子為大腸桿菌素V(Pugsley，A.P.andOudega，B."MethodsforStudyingColicinsandTheirPlasmids"inPlasmids，aPracticalApproach1987，ed.ByK.G.Hardy;Gilson，L.etal.BMBOJ.9:3875-3884).在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子為大腸桿菌素E2(與ColE3結(jié)構(gòu)類(lèi)似的一種雙亞基大腸桿菌素，但具有內(nèi)切核酸酶活性，而不是核糖核酸酶活性)；可形成離子滲透通道，從而破壞細(xì)胞質(zhì)子運(yùn)動(dòng)力并引起細(xì)胞死亡的大腸桿菌素A、El、Ia、Ib或K;可抑制蛋白、DNA及RNA合成的大腸桿菌素L;可改變細(xì)胞的滲透環(huán)境并導(dǎo)致細(xì)胞膿毒的大腸桿菌素M;作用方式與大脈桿菌素B類(lèi)似的鼠疫菌素A1122;葡萄球菌素1580，一種成孔細(xì)菌素；可通過(guò)未知的把作用物而間接抑制RNA、DNA及蛋白合成的丁酸梭菌素7423;可通過(guò)呼吸作用與溶質(zhì)運(yùn)輸?shù)慕馀悸?lián)來(lái)殺死細(xì)胞的膿菌素Pl或類(lèi)似于噬菌體尾蛋白的蛋白；作用方式類(lèi)似于大腸桿菌素E2的膿菌素AP41;或能引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏的一種碑脂酶，巨桿菌素A-216(有關(guān)細(xì)菌素的綜述，可參考Konisky,1982,Ann,Rev.Microbiol.36:125-144);大腸軒菌素A(Pugsley，A.P.and0udega，B."MethodsforStudyingColicinsandTheirPlasmids"inPlasmids,aPracticalApproach1987，ed.ByG.Hardy).因此，初級(jí)效應(yīng)分子可包括文中描述的或本領(lǐng)域已知的任何細(xì)菌素，條件是該細(xì)菌素不是一種細(xì)菌素釋放蛋白.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子為腫瘤抑制性酶或其功能性片段.腫瘤抑制性醉的實(shí)例包括，但不局限于，甲疏氨酸酶、天冬酰胺酶、脂醉、辨脂醉、蛋白酶、核糖核酸酶、DNA酶和糖苷酶.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子為甲硫氨酸醉.本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子可用于，例如，治療或預(yù)防實(shí)體瘤，如癌、黑色素瘤、淋巴瘤或肉瘤.本發(fā)明提供可編碼一種初級(jí)效應(yīng)分子的核酸分子.本發(fā)明還提供可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的核酸分子.本發(fā)明提供可編碼本發(fā)明的效應(yīng)分子并且與一種適當(dāng)?shù)膯?dòng)子可搮作性連接的核酸.這些編碼效應(yīng)分子的核酸可以和任選的參與轉(zhuǎn)錄、翻譯、定位、穗定性等等的元件進(jìn)行可採(cǎi)作性連接.編碼一種初級(jí)效應(yīng)分子的核酸分子的長(zhǎng)度約為6-100,000個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選的是該核酸的長(zhǎng)度約為20-50,000個(gè)堿基對(duì).更優(yōu)選的是該核酸分子的長(zhǎng)度約為20-10,000個(gè)堿基對(duì).再更優(yōu)選的是該核酸分子的長(zhǎng)度約為20-4000個(gè)堿基對(duì).5.3.與初級(jí)效應(yīng)分子共表達(dá)的次級(jí)效應(yīng)分子在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，初級(jí)效應(yīng)分子(如TNF家族成員、細(xì)胞毒性肽或多肽、抗血管生成因子，或腫瘤抑制性醉)可以在細(xì)菌栽體中選擇性地與另一種分子即次級(jí)效應(yīng)分子共表達(dá).次級(jí)效應(yīng)分子可以提供額外的治療功能和(或)促進(jìn)修飾的細(xì)菌栽體(能夠表達(dá)至少一種初級(jí)效應(yīng)分子和可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子)將內(nèi)容物釋放至周?chē)h(huán)境.文中使用的術(shù)語(yǔ)"額外的治療功能"是指，次級(jí)效應(yīng)分子可提供一種對(duì)腫瘸的附加或協(xié)同作用、細(xì)胞抑制作用，或細(xì)胞毒性作用，如初級(jí)效應(yīng)分子作用之外的作用.因而次級(jí)效應(yīng)分子可作為一種額外的治療因子和(或)釋放因子來(lái)發(fā)揮作用.優(yōu)選的是，無(wú)論作為治療因子還是釋放因子(或兩者都是)，次級(jí)效應(yīng)分子都可以在預(yù)定部位，即腫瘤部位，被優(yōu)先地或特異性地激活或表達(dá).在某些實(shí)施方案中，使用的次級(jí)效應(yīng)分子可具有兩種功能，即促進(jìn)細(xì)菌內(nèi)容物的釋放(如通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌裂解或準(zhǔn)裂解)和提供治療功能(如通過(guò)對(duì)肝瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性).在某些非限制性實(shí)施方案中，次級(jí)效應(yīng)分子的細(xì)胞毒性可以由患者的免疫系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)；而這種次級(jí)效應(yīng)分子可以具有免疫調(diào)節(jié)刑的作用.在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)至少一種具有抗腫瘤活性的次級(jí)效應(yīng)分子，也就是說(shuō)，該次級(jí)效應(yīng)分子的表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤或肺瘤細(xì)胞的死亡，或可抑制其生長(zhǎng).本發(fā)明的次級(jí)效應(yīng)分子可以是蛋白分子或核酸分子.核酸分子可以是雙鏈或單鏈DNA或雙鏈或單鏈RNA，也可以是三鏈核酸分子.這些核酸分子可以具有核醉或反義核酸等的作用.反義核酸是能夠以序列特異性方式與mRNA或DNA等核酸結(jié)合的寡核苷酸，當(dāng)反義核酸與含有互補(bǔ)序列的mRNA結(jié)合時(shí)可阻礙該mRNA翻譯(參考，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,168,053;5,190,931;5,135,917和5,087,617).三鏈核酸分子是指能夠與雙鏈DNA結(jié)合成一種共線(xiàn)三鏈分子并由此阻礙轉(zhuǎn)錄的單鏈DM(參考，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,176,996).核酶是一種RNA分子，它能夠特異性剪切RNA底物，如mRNA，從而抑制或干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)或表達(dá).至少有5種已知類(lèi)型的核酶可參與RNA鏈的剪切和(或)連接.核醉可作用于任何RNA轉(zhuǎn)錄體，并能夠催化剪切這些轉(zhuǎn)錄體(參考，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,272,262;美國(guó)專(zhuān)利5,144,019;和美國(guó)專(zhuān)利5,168,053、5,180,818、5,116,742和5,093,246).與上文有關(guān)初級(jí)效應(yīng)分子的敘述相同，本發(fā)明提供的編碼次級(jí)效應(yīng)分子或含有次級(jí)效應(yīng)分子的核酸均可搮作性連接了一種選定的啟動(dòng)子，并且還可以選擇性地與其他參與轉(zhuǎn)錄、翻譯、定位、穗定性等等的元件進(jìn)行可搮作性連接.此外，次級(jí)效應(yīng)分子的表達(dá)可采用與初級(jí)效應(yīng)分子相同的啟動(dòng)子和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)，也可以采用與初級(jí)效應(yīng)分子不同的啟動(dòng)子.編碼次級(jí)效應(yīng)分子的核酸分子的長(zhǎng)度約為6-100,000個(gè)堿基對(duì).優(yōu)選的是該核酸分子的長(zhǎng)度約為20-50,000個(gè)堿基對(duì).更優(yōu)選的是該核酸分子的長(zhǎng)度約為20-10,000個(gè)堿基對(duì).再更優(yōu)選的是該核酸分子的長(zhǎng)度約為20-4，000個(gè)堿基對(duì).可編碼次級(jí)效應(yīng)分子的效應(yīng)分子核苷酸序列已眾所周知(見(jiàn)GenBank).次級(jí)效應(yīng)分子的編碼核酸分子可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)分離，如擴(kuò)增(如PCR)、基因組庫(kù)或cDNA庫(kù)的探針雜交、表達(dá)庫(kù)的抗體篩選，或化學(xué)合成，或由商品來(lái)源或其他來(lái)源獲得，其中的次級(jí)效應(yīng)分子是一種細(xì)胞毒性因子或細(xì)胞抑制因子，或其生物活性片段、變異體或衍生物.用于按文中所述方法使用的核酸分子和寡核苷酸可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)合成(參考，例如，國(guó)際公開(kāi)WO93/01286、美國(guó)專(zhuān)利5，218，088;5，175，269;和5，109，124).可作為反義制刑使用的寡核苷酸及核醉的鑒定方法已為本領(lǐng)域所熟知.5.3.1.具有額外治療功能的因子在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌栽體可表達(dá)至少一種初級(jí)效應(yīng)分子，優(yōu)選的是該細(xì)菌栽體為沙門(mén)氏菌栽體，該細(xì)菌栽體還可以表達(dá)至少一種具有抗腫瘤活性的次級(jí)效應(yīng)分子，也就是說(shuō)，該次級(jí)效應(yīng)分子的表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤或腫瘤細(xì)胞的死亡，或可抑制腫瘤或腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，從而提高初級(jí)效應(yīng)分子的細(xì)胞毒性作用或細(xì)胞抑制作用.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，次級(jí)效應(yīng)分子對(duì)腫瘤的作用可作為初級(jí)效應(yīng)分子的作用的補(bǔ)充，在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，次級(jí)效應(yīng)分子的作用具有超附加或協(xié)同性，也就是說(shuō)，要高于單獨(dú)給藥的初級(jí)效應(yīng)分子和次級(jí)效應(yīng)分子的作用總和，在某些實(shí)施方案中，使用的次級(jí)效應(yīng)分子對(duì)細(xì)胞具有毒性作用或抑制作用，方法是通過(guò)干擾蛋白合成或擾亂細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng).此類(lèi)產(chǎn)物的作用機(jī)制可以是，例如，剪切rRNA或核糖核蛋白、抑制延伸因子、剪切mRNA，或能夠減少蛋白合成從而使細(xì)胞無(wú)法存活的其他機(jī)制。這種次級(jí)效應(yīng)分子的實(shí)例包括，但不局限于，皂草素、蓖蔴毒蛋白、相思豆毒蛋白和其他核糖體失活蛋白(RIPs).在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的次級(jí)效應(yīng)分子是一種前體藥物轉(zhuǎn)化酶或其編碼核酸，即能夠調(diào)節(jié)藥物的化學(xué)性質(zhì)從而產(chǎn)生一種細(xì)胞毒性刑的酶.在Pawelek等人的WO96/40238笫33頁(yè)和表2中列舉了一些前體藥物轉(zhuǎn)化酶的說(shuō)明性實(shí)例，在此引入作為參考.W096/40238還講述了一些方法，用于產(chǎn)生含有這種前體藥物轉(zhuǎn)化醉的分泌型融合蛋白.根據(jù)本發(fā)明，前體藥物轉(zhuǎn)化酶如果與BRP(見(jiàn)上文笫5.3.2節(jié))等釋放因子共表達(dá)則可以不是分泌蛋白.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，使用的前體藥物轉(zhuǎn)化醉是能夠作用于絲裂審素C和甲基絲裂審素的細(xì)胞色素p450NADPH氣化還原酶(Murrayetal.，1994,J.Pharmacol.Exp.Therapeut.270:645-649).在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，次級(jí)效應(yīng)分子與BRP等釋放因子共表達(dá)，并且可導(dǎo)致輔因子(如NADH、NADPH、ATP等)的釋放，這些輔因子可提高前體藥物轉(zhuǎn)化醉的活性.在該實(shí)施方案中，另一種方式是次級(jí)效應(yīng)分子與BRP等釋放因子共表達(dá)，并且可導(dǎo)致激活藥物(例如在細(xì)菌胞質(zhì)或周質(zhì)中激活，然后由細(xì)菌栽體釋放的一種藥物)的釋放.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的次級(jí)效應(yīng)分子是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS)或內(nèi)皮一氣化氮合酶的一種抑制刑.一氧化氮(NO)被認(rèn)為參與了血管生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)以及動(dòng)脈硬化.NO是由一氣化氮合酶(NOS)作用于L-精氡酸而形成，它可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)和心血管反應(yīng).在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的次級(jí)效應(yīng)分子可通過(guò)抑制參與細(xì)胞增殖的蛋白的產(chǎn)生或活性來(lái)形成對(duì)細(xì)胞的毒性作用或抑制作用，如癌基因或生長(zhǎng)因子(如bFGF、int-2、hst-l/K-FGF、FGF-5、hst-2/FGF-6、FGF-8)或細(xì)胞受體或配體.這種抑制可以在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平上進(jìn)行(由一種次級(jí)效應(yīng)分子介導(dǎo)，該次級(jí)效應(yīng)分子是一種核醉或三鏈DNA)，也可以在蛋白活性水平上進(jìn)行(由一種次級(jí)效應(yīng)分子介導(dǎo)，該次級(jí)效應(yīng)分子是生長(zhǎng)因子途徑的一種抑制刑，如一種顯性失活突變體).在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的次級(jí)效應(yīng)分子是一種細(xì)胞因子、趨化因子或免疫調(diào)節(jié)蛋白，或其編碼核酸，如白介素-l(IL-l)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-lO(IL-IO)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、內(nèi)皮單核細(xì)胞激活蛋白-2(EMAP2)、GM-CSF、IFN-y、IFN-a、MlP-3a、SLC、MIP-3卩或一種MHC基因，如HLA-B7.遞送這種免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)分子可以對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而提高宿主潛在的抗腫瘤免疫力.作為選擇，也可以遞送共刺激分子如CD28和CTLA-4的配體B7.1和B7.2的編碼核酸分子來(lái)增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫.另一種免疫調(diào)節(jié)刑為a-l，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，這種酶在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)可產(chǎn)生補(bǔ)體介導(dǎo)的殺細(xì)胞作用.此外，另一種免疫調(diào)節(jié)刑為腫瘤相關(guān)抗原，即由腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)，而非癌性對(duì)應(yīng)細(xì)胞不表達(dá)的一種分子，或在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平高于非癌性對(duì)應(yīng)細(xì)胞的一種分子.胂瘤相關(guān)抗原的說(shuō)明性實(shí)例在Kuby，Im咖nology，W.H.FreemanandCompany,NewYork,NY，1stEdition(1992)，pp.515-520中有所描述，該文獻(xiàn)在此引入作為參考.腫瘤相關(guān)抗原的其他實(shí)例已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的次級(jí)效應(yīng)分子為Flt-3配體或其編碼核酸.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的次級(jí)效應(yīng)分子為BRP,在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，當(dāng)初級(jí)效應(yīng)分子為T(mén)NF家族成員時(shí)，則次級(jí)效應(yīng)分子不使用TNF家族成員.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，當(dāng)初級(jí)效應(yīng)分子是一種抗血管生成因子時(shí)，則次級(jí)效應(yīng)分子不使用抗血管生成因子，在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，當(dāng)次級(jí)效應(yīng)分子是一種細(xì)胞毒性肽或多肽時(shí)，則次級(jí)效應(yīng)分子不使用細(xì)胞毒性肽或多肽.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，當(dāng)初級(jí)效應(yīng)分子是一種腫瘤抑制性醉時(shí)，則次級(jí)效應(yīng)分子不使用胂瘤抑制性酶.5.3.2.可促進(jìn)抗腫瘤效應(yīng)分子釋放到腫瘤環(huán)境中的因子在本發(fā)明的其他一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌栽體可表達(dá)至少一種初級(jí)效應(yīng)分子，優(yōu)選的是該細(xì)菌栽體為沙門(mén)氏菌栽體，該細(xì)菌栽體還可以表達(dá)至少一種次級(jí)效應(yīng)分子，該次級(jí)效應(yīng)分子能夠使細(xì)菌的細(xì)胞膜具有滲透性，或能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)成分釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，如腫瘤部位，從而加強(qiáng)初級(jí)效應(yīng)分子和(或)次級(jí)效應(yīng)分子的遞送.能夠使細(xì)菌具有滲透性或能夠促進(jìn)釋放的這種次級(jí)效應(yīng)分子被稱(chēng)為"釋放因子".在某些實(shí)施方案中，釋放因子的優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)具有抗腫瘤活性.由本發(fā)明的細(xì)菌栽體表達(dá)的釋放因子可以是修飾后的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的內(nèi)源因子，也可以是外源因子(例如由定向于腫瘤的減毒細(xì)菌本身不具有的一種核酸來(lái)編碼).釋放因子可以由質(zhì)粒等核酸來(lái)編碼，也可以由整合到定向于胂瘤的減毒細(xì)菌基因組中的核酸來(lái)編碼.釋放因子可以由編碼初級(jí)效應(yīng)分子的同一核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼，也可以由不同的核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼.釋放因子可以由編碼次級(jí)效應(yīng)分子的同一核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼，也可以由不同的核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，釋放因子的表達(dá)是在一種細(xì)胞中進(jìn)行，該細(xì)胞還能表達(dá)一種含有初級(jí)效應(yīng)分子和o叩樣蛋白的融合蛋白.在該實(shí)施方案中，釋放因子的共表達(dá)能夠促進(jìn)該融合蛋白從周質(zhì)空間釋放.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的釋放因子為細(xì)菌素釋放蛋白，或BRPs(此后在分類(lèi)上稱(chēng)為BRP).本發(fā)明使用的BRP可來(lái)自本領(lǐng)域已知的任何來(lái)源，其中包括，但不局限于，陰溝腸道菌素DF13質(zhì)粒、大腸桿菌素E1-E9質(zhì)粒，或大腸桿菌素A、N或D質(zhì)粒.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的BRP來(lái)自陰溝腸道菌素DF13(pCloDF13BRP),BRPs通常為45-52個(gè)氨基酸的肽，最初合成的是前體分子(PreBRP)，其中含有未被信號(hào)內(nèi)肽酶剪切的信號(hào)序列.BRP的活性至少有一部分是由洗涂刑抗性外膜磷脂酶A(PldA)來(lái)介導(dǎo)的，這種活性通常伴有外膜磷脂降解的加強(qiáng)(有關(guān)BRPs的綜述可參考vanderWaletal.，1995，F(xiàn)EMSMicrobiologyReview17:381-399).在不受原理限制的前提下，BRP可促進(jìn)周質(zhì)成分優(yōu)先釋放，但也可檢測(cè)到較低程度的胞質(zhì)成分釋放.當(dāng)BRP被適度過(guò)表達(dá)時(shí)可以使細(xì)菌膜變得脆弱，從而導(dǎo)致準(zhǔn)裂解狀態(tài)和胞質(zhì)成分的高度釋放.此外，當(dāng)BRP被超高水平地過(guò)表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞裂解，這樣就可通過(guò)裂解釋放來(lái)遞送細(xì)胞內(nèi)容物.在該實(shí)施方案中，BRP的表達(dá)可以與BRP活性(如細(xì)菌內(nèi)容物的釋放)相關(guān)聯(lián).例如，超高水平的BRP活性可導(dǎo)致幾乎所有的細(xì)菌細(xì)胞裂解，因此，文中使用的"超高水平的表達(dá)"被定義為可導(dǎo)致幾乎所有的細(xì)菌發(fā)生裂解的BRP表達(dá)水平.與不表達(dá)BRP的對(duì)照菌相比，適度的BRP活性可伴有細(xì)菌內(nèi)容物的部分釋放或釋放加強(qiáng)，但不導(dǎo)致細(xì)菌裂解.因此，在該實(shí)施方案中，BRP的適度過(guò)表達(dá)被定義為可加強(qiáng)胞質(zhì)成分釋放但不會(huì)導(dǎo)致幾乎所有的細(xì)菌發(fā)生裂解的表達(dá)水平.文中使用的"幾乎所有的細(xì)菌"是指60X以上的細(xì)菌，優(yōu)選的是70N以上的細(xì)菌，更優(yōu)選的是80X以上的細(xì)菌，再更優(yōu)選的是90X以上的細(xì)菌，最優(yōu)選的是90-100S的細(xì)菌.在本發(fā)明的一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，使用的BRP蛋白為pCloDF13BRP突變體，這種突變體的裂解功能已經(jīng)與蛋白釋放功能解偶聯(lián)，因而可在不導(dǎo)致細(xì)菌裂解的情況下加強(qiáng)蛋白的釋放(vanderWaletal.，1998,App.Env.Microbiol.64:392-398).該實(shí)施方案可延長(zhǎng)細(xì)菌栽體的蛋白釋放，同時(shí)可減少將栽體頻繁給藥的要求.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的BRP為C-端縮短的pCloDP13BRP，這種BRP不但能引起蛋白釋放，還可以導(dǎo)致細(xì)胞裂解(Luirinketal.，1989，J.Bacteriol.171:2673-2679),在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的增強(qiáng)釋放系統(tǒng)包括一種孔蛋白的過(guò)表達(dá)；可參考，例如，Sugawara，E.andNikaido，H,，1992，J.Biol.Chem.267:2507-11,在某些實(shí)施方案中，當(dāng)BRP是由本發(fā)明的細(xì)菌栽體表達(dá)時(shí)，這種BRP可以是修飾后的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌的內(nèi)源分子，也可以是外源分子(例如由定向于腫瘤的減毒細(xì)菌本身不具有的一種核酸來(lái)編碼).BRP可以由質(zhì)粒等核酸來(lái)編碼，也可以由整合到定向于腫瘤的減毒細(xì)菌基因組中的核酸來(lái)編碼.BRP可以由編碼初級(jí)效應(yīng)分子的同一核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼，也可以由不同的核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼.BRP可以由編碼次級(jí)效應(yīng)分子的同一核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼，也可以由不同的核酸或質(zhì)粒來(lái)編碼.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，BRP樣蛋白的表達(dá)是在一種細(xì)胞中進(jìn)行，該細(xì)胞還能表達(dá)一種含有效應(yīng)分子和0mp樣蛋白的融合蛋白.在該實(shí)施方案中，BRP的共表達(dá)能夠促進(jìn)該融合蛋白的釋放.在本發(fā)明的一項(xiàng)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，BRP的編碼核酸是由一種大腸桿菌素質(zhì)粒來(lái)編碼.在本發(fā)明的另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，BRP編碼核酸的表達(dá)是在天然BRP啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行，該啟動(dòng)子是一種能夠在正常宿主內(nèi)(BRP的正常宿主，陰溝腸球菌)對(duì)應(yīng)激條件(例如紫外光等可導(dǎo)致DNA損傷的條件)起反應(yīng)的S0S啟動(dòng)子，并且也是沙門(mén)氏菌中的部分組成型啟動(dòng)子.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，BRP編碼核酸的表達(dá)是在pepT啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行，該啟動(dòng)子可以反應(yīng)于腫痗環(huán)境的無(wú)氧性質(zhì)而被激活(參考，例如，Lombardoetal.,1997,J.Bacteriol.179:1909-17).作為選摔，使用的啟動(dòng)子也可以是抗生素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如TnlO轉(zhuǎn)座子的tet啟動(dòng)子.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的tet啟動(dòng)子為單體形式，這種單體可以對(duì)存在的四環(huán)素或其類(lèi)似物，如強(qiáng)力審素和無(wú)水四環(huán)素，產(chǎn)生全或無(wú)的反應(yīng)，因而可形成一種具有遺傳穂定性的開(kāi)閉開(kāi)關(guān).在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的tet啟動(dòng)子為多體形式，例如三體形式.這種多體啟動(dòng)子可以對(duì)存在的四環(huán)素產(chǎn)生分級(jí)的反應(yīng)，因而可形成一種用于控制效應(yīng)分子水平的更具有搮作性的系統(tǒng).當(dāng)利用本發(fā)明的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌對(duì)受試者進(jìn)行處理后，可將適當(dāng)刑量的四環(huán)素給藥于該受試者，以誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性，最初描迷的tet誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)是用于非洲粟酒裂殖酵母(FaryarandGatz，1992，CurrentGenetics21:345-349)等真核系統(tǒng)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(LangandFeingold，1996,Gene168:169-171),而最近的研究使其適用性擴(kuò)展到細(xì)菌細(xì)胞.例如，Stieger等人(1999，Gene226:243-252)已證明，當(dāng)安火蟲(chóng)榮光素醉基因與tet啟動(dòng)子可採(cǎi)作性連接后，可通過(guò)tet誘導(dǎo)獲得80倍的誘導(dǎo)作用.該啟動(dòng)子的優(yōu)勢(shì)在于，它可以在極低的四環(huán)素水平下被誘導(dǎo)，該水平約為抗生素活性所需劑量的十分之5.4.衍生物和類(lèi)似物本發(fā)明還包括經(jīng)過(guò)加工可編碼或遞送一種衍生物的細(xì)菌栽體，這些衍生物包括，但不局限于，初級(jí)效應(yīng)分子和(或)次級(jí)效應(yīng)分子或其編碼核酸的片段、類(lèi)似物或變異體.這些衍生物、類(lèi)似物或變異體具有功能活性，例如可表現(xiàn)出全長(zhǎng)野生型效應(yīng)分子的一種或多種功能活性，這種具有預(yù)期治療特性的衍生物、類(lèi)似物或變異體可用于，例如，抑制腫瘤的生長(zhǎng)或腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散(轉(zhuǎn)移).利用本領(lǐng)域已知的方法，包括本文描迷的方法，可以對(duì)所需的效應(yīng)分子的衍生物或類(lèi)似物的活性進(jìn)行測(cè)定.詳細(xì)地說(shuō)，變異體的制備方法可以是，通過(guò)取代、添加(如插入)或去除來(lái)改變效應(yīng)分子的編碼序列，使所得分子與野生型效應(yīng)分子相比具有相同的或更高的抗腫瘤功能.例如，本發(fā)明的變異體包括，但不局限于，一級(jí)氨基酸序列中含有一種效應(yīng)分子的全部或部分氨基酸序列，并且該氨基酸序列中含有改變的序列的那些分子，改變序列的殘基被功能上等價(jià)的在序列中導(dǎo)致沉默改變的氨基酸殘基取代，即被改變序列至少含有一個(gè)保守取代.利用本領(lǐng)域已知的方法可以使任何來(lái)源于噴乳動(dòng)物的初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的編碼核酸經(jīng)過(guò)加工而采用細(xì)菌的密碼子.優(yōu)選密碼子使用的實(shí)例見(jiàn)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishingAssociates,Inc，，andJohnWiley&Sons,Inc，NewYork,和Zhangetal.，1991，Gene105:61—72,在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的衍生物、類(lèi)似物或變異體含有一種核苷酸序列，該序列能夠與編碼初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子或其片段的核苷酸序列雜交，雜交條件為嚴(yán)格條件，例如在約451C的6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中與結(jié)合到濾膜上的DNA雜交，然后在約50-65iC的0.2xSSC/0.1XSDS中清洗一次或多次，或高度嚴(yán)格條件，例如在約451C的6xSSC中與結(jié)合到濾膜上的核酸雜交，然后在約68TC的0.lxSSC/O.SDS中清洗一次或多次，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他嚴(yán)格雜交條件(可參考，例如，Ausubel，F(xiàn).M.etal.，eds.,1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.I，GreenPublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.,NewYork的笫6.3.1-6.3.6頁(yè)和笫2.10.3頁(yè))，初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的衍生物或類(lèi)似物包括，但不局限于，含有與初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子或其片段基本同源的區(qū)域的分子(例如，在不同實(shí)施方案中，與不含任何插入或缺失的相同長(zhǎng)度的氨基酸序列相比，或與對(duì)比序列相比，至少有60X或70X或80X或或95X的同一性，其中的對(duì)比是由本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源性比較程序來(lái)完成)，或其編碼核酸能夠在高度嚴(yán)格條件、中度嚴(yán)格條件或低度嚴(yán)格條件下與一種效應(yīng)分子蛋白的效應(yīng)分子編碼序列雜交的分子.為了確定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的同一性百分率，例如一種初級(jí)效應(yīng)分子序列與另一種已知序列間的同一性百分率，可以將兩種序列進(jìn)行對(duì)比，以獲得最優(yōu)的比較結(jié)果(例如可以在笫一種氨基酸序列或核酸序列中引入空位，以獲得與笫二種氨基酸序列或核酸序列的最優(yōu)對(duì)比).然后將對(duì)應(yīng)氨基酸位置或?qū)?yīng)核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較.當(dāng)笫一種序列的一個(gè)位置與第二種序列的對(duì)應(yīng)位置是由相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，這兩種分子在該位置相同.兩種序列間的同一性百分率是這兩種序列共有的相同位置數(shù)量的函數(shù)(即，同一性百分率-相同位置的數(shù)量/位置(如重疊位置)的總數(shù)量x100).在一項(xiàng)實(shí)施方案中，這兩種序列的長(zhǎng)度相同.兩種序列間的同一性百分率可以用一種數(shù)學(xué)算法來(lái)確定.可用來(lái)比較兩種序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)非限制性?xún)?yōu)選實(shí)例是KarlinandAltschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268描述的算法，在KarlinandAltschul，1993，Proc,Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中對(duì)該算法進(jìn)行了修改.這種算法被整合到Altschul,etal.,1990，J.Mol.Biol.215:403-410描述的NBLAST和XBLAST程序中.以評(píng)分-100、字長(zhǎng)=12為參數(shù)用NBLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，即可獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列.以評(píng)分》50、字長(zhǎng)=3為參數(shù)用XBLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白技索，即可獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列.為了獲得有空位的對(duì)比來(lái)進(jìn)行比較，可以按Altschuletal.,1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402所述使用GappedBLAST程序.作為選擇，也可以用PSI-Blast程序進(jìn)行迭代搜索，以檢測(cè)分子間的距離關(guān)系(Id.)，當(dāng)使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以采用這些程序(如XBLAST和NBLAST)各自的默認(rèn)參數(shù).見(jiàn)http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov.可用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性?xún)?yōu)選實(shí)例是MyersandMiller,CABIOS(1989)描述的算法，該算法被整合到ALIGN程序(2.O版本)中，該程序是GCG序列對(duì)比軟件包的一部分.當(dāng)利用ALIGN程序進(jìn)行氨基酸序列比較時(shí)，可以采用PAM120權(quán)重殘基表，并將空位長(zhǎng)度罰分設(shè)為12，空位罰分設(shè)為4.用于序列分析的其他算法已為本領(lǐng)域所熟知，其中包括TorellisandRobotti，1994，Comput.Appl,Biosci.，10:3-5中描述的ADVANCE和ADAM;以及PearsonandLipman，1988,Pro"Natl.Acad.Sci.85:2444-8中描述的FASTA.在FASTA程序中，ktup是一個(gè)控制選項(xiàng)，該選項(xiàng)可設(shè)置搜索的靈敏度和速度.如果ktup=2，則是通過(guò)尋找對(duì)比殘基對(duì)來(lái)發(fā)現(xiàn)兩種比較序列中的相似區(qū)域；如果ktup-l，則是檢測(cè)單個(gè)排列的氨基酸.比較蛋白序列時(shí)可將ktup設(shè)為2或1，比較DNA序列時(shí)可設(shè)為1-6.如果不設(shè)定，則比較蛋白序列的默認(rèn)ktup為2，比較DNA序列的默認(rèn)ktup為6.有關(guān)FASTA程序的其他描述，可參考http://bioweb.pasteur.fr/docs/man/man/fasta.1.thml#sect2，其內(nèi)容在此引入作為參考.作為選摔，還可以用Higginsetal.，1996，MethodsEnzymol.266:383-402描述的CLUSTALW算法來(lái)進(jìn)行蛋白序列比較.兩種序列間的同一性百分率可以用類(lèi)似于上文所述的允許空位或不允許空位的技術(shù)來(lái)確定.在計(jì)算同一性百分率時(shí)，只計(jì)算完全匹配的情況.初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子，或其衍生物或類(lèi)似物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的不同方法來(lái)產(chǎn)生，可產(chǎn)生這些分子的搮作可以在核酸水平上進(jìn)行，也可以在蛋白水平上進(jìn)行.舉例來(lái)說(shuō)，可以用本領(lǐng)域已知的多種策略對(duì)，例如，編碼例如一種效應(yīng)分子的一種克隆的效應(yīng)分子編碼序列進(jìn)行修飾(Sambrooketal，，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork).可以在適當(dāng)?shù)牟课挥孟拗菩詢(xún)?nèi)切核酸醉將序列剪切，如果需要，還可以進(jìn)行其他的醉促修飾，然后進(jìn)行分離和體外連接.當(dāng)產(chǎn)生一種可編碼初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的衍生物或類(lèi)似物的改進(jìn)型效應(yīng)分子時(shí)，應(yīng)注意確保改進(jìn)型效應(yīng)分子的編碼序列在編碼所需初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子活性的效應(yīng)分子編碼序列區(qū)中仍能夠保持與天然蛋白相同的翻譯讀框，并且未被翻譯終止信號(hào)打斷.此外還可以對(duì)編碼效應(yīng)分子的核酸序列進(jìn)行體外或體內(nèi)突變，以產(chǎn)生和(或)破壞翻譯序列、起始序列和(或)終止序列，或在編碼區(qū)內(nèi)產(chǎn)生變異，以及(或者)形成新的或破壞原有的限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)，從而有利于其他體外修飾.在一項(xiàng)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，一種效應(yīng)分子的編碼核酸序列經(jīng)過(guò)突變可以，例如，產(chǎn)生一種更有效的變異體.本領(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)均可以使用，其中包括，但不局限于，化學(xué)誘變、體外定點(diǎn)論變(Hutchinsonetal.,1978，J.Biol.Chem.253:6551)、使用TAB⑧接頭(Pharmacia)、用含有突變的引物進(jìn)行PCR，等等，在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)一種效應(yīng)分子的一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基進(jìn)行了保守氨基酸取代，"保守氨基酸取代"是指，把氨基酸殘基替換成一種所帶側(cè)鏈具有類(lèi)似電荷的氨基酸殘基.本領(lǐng)域已經(jīng)對(duì)所帶側(cè)鏈具有類(lèi)似電荷的氨基酸殘基家族進(jìn)行了定義.這些家族包括，帶有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、帶有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、帶有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬耽胺、谷氨耽胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氦酸、半胱氨酸)、帶有非極性側(cè)鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硤氨酸、色氨酸)、帶有P分支側(cè)鏈的氨基酸(如蘇氨酸、蝴氨酸、異亮氨酸)和帶有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氦酸、組氨酸).作為選擇，也可以通過(guò)，例如，飽和誘變方法在全部或部分編碼序列中隨機(jī)引入突變，然后對(duì)所得突變體的生物活性進(jìn)行灘選，以鑒定出仍具有活性的突變體.誘變完成后，可以表達(dá)編碼的蛋白，并測(cè)定該蛋白的活性.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的效應(yīng)分子或融合蛋白經(jīng)過(guò)構(gòu)建而含有一種蛋白酶切位點(diǎn).5.5.融合蛋白在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供以融合蛋白(例如與一種不同的蛋白共價(jià)結(jié)合)的形式構(gòu)建的初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明提供這些融合蛋白的編碼核酸.在本發(fā)明的其他一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白編碼核酸與一種適當(dāng)?shù)膯?dòng)子可搮作性連接.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，效應(yīng)分子被構(gòu)建成一種嵌合蛋白或融合蛋白，該蛋白含有一種效應(yīng)分子或其片段(優(yōu)選由該效應(yīng)分子的至少一種結(jié)構(gòu)域或基序組成，或由該效應(yīng)分子的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少25個(gè)、至少50個(gè)、至少75個(gè)，或至少100個(gè)氨基酸組成)，并且通過(guò)肽鍵在效應(yīng)分子或其片段的氨基端或羧基端與一種不同蛋白的氨基酸序列連接，在特別實(shí)施方案中，融合蛋白含有一種異源多肽或其有活性功能的片段的至少2個(gè)、至少6個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少50個(gè)、至少75個(gè)，或至少I(mǎi)OO個(gè)連續(xù)氨基酸.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，這種融合蛋白或嵌合蛋白的產(chǎn)生方法是將與一種不同蛋白的編碼序列按讀框連接的初級(jí)效應(yīng)分子的編碼核酸(如TNF-編碼序列、抗血管生成因子編碼序列、腫瘤抑制性醉編碼序列，或細(xì)胞毒性多肽編碼序列)進(jìn)行重組表達(dá).這種嵌合產(chǎn)物的制備方法可以是，利用本領(lǐng)域已知的方法將編碼所需氨基酸序列的適當(dāng)核酸序列按適當(dāng)?shù)淖x碼框彼此連接，并利用本領(lǐng)域眾所周知的方法在選定的表達(dá)栽體中表達(dá)該嵌合產(chǎn)物.構(gòu)建的嵌合核酸可含有與任何異源多肽編碼序列融合的一種效應(yīng)分子的部分編碼核酸，有一項(xiàng)特別實(shí)施方案涉及一種嵌合蛋白，該蛋白含有初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少25個(gè)、至少50個(gè)，或至少I(mǎi)OO個(gè)氨基酸的一種片段，或含有一種可表現(xiàn)出全長(zhǎng)初級(jí)效應(yīng)分子或全長(zhǎng)次級(jí)效應(yīng)分子的一種或多種功能活性的片段，在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，使用的融合蛋白含有一種親和標(biāo)記，如六聚組氨酸標(biāo)記或用于純化、分離、鑒定或表達(dá)測(cè)定的其他親和標(biāo)記.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，融合蛋白含有一種蛋白醉切位點(diǎn)，如金屬蛋白酶切位點(diǎn)或絲氨酸酶切位點(diǎn).在該實(shí)施方案中，有時(shí)優(yōu)選的是在本發(fā)明的融合蛋白中構(gòu)建一種能夠在腫瘤部位具有活性的蛋白酶的相應(yīng)酶切位點(diǎn).在一些實(shí)施方案中，是將效應(yīng)分子與一種0mp樣蛋白或其片段(如信號(hào)序列、前導(dǎo)序列、周質(zhì)區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、多跨膜結(jié)構(gòu)域，或其組合，見(jiàn)上文笫3.1節(jié)對(duì)"0mp樣蛋白"的定義)構(gòu)建成一種融合蛋白.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的效應(yīng)分子(初級(jí)或次級(jí))是以一種具有外膜蛋白(0mp樣蛋白)的融合蛋白的形式表達(dá).細(xì)菌外膜蛋白是細(xì)菌外膜的整合膜蛋白，該蛋白具有多跨膜結(jié)構(gòu)域，并且常連接有一個(gè)或多個(gè)脂部分.最初表達(dá)的外膜蛋白是含有氨基端信號(hào)肽的前體形式(pro-0mp)，該信號(hào)肽可以將蛋白導(dǎo)向膜，然后在膜上被信號(hào)肽酶剪切，從而產(chǎn)生成熟蛋白.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，是將效應(yīng)分子與一種0mp樣蛋白構(gòu)建成一種融合蛋白.在該實(shí)施方案中，初級(jí)效應(yīng)分子向細(xì)菌外膜的遞送被加強(qiáng).盡管不希望受到原理的限制，但本發(fā)明人認(rèn)為0mp樣蛋白可作為效應(yīng)分子與外膜之間的一種錨定物或接接物，或可用來(lái)使效應(yīng)分子定位于細(xì)菌外膜.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，效應(yīng)分子與0mp樣蛋白的融合蛋白被用來(lái)促進(jìn)效應(yīng)分子定位于周質(zhì)，在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，效應(yīng)分子與0mp樣蛋白的融合蛋白被用來(lái)促進(jìn)效應(yīng)分子的釋放.在特別實(shí)施方案中，使用的0mp樣蛋白至少含有0mpA、0mpB、0mpC、0mpD、OmpE、OmpF、OmpT、孑L蛋白樣蛋白、PhoA、PhoE、lamB、P-內(nèi)酰胺蘇、一種腸毒素、蛋白A、內(nèi)切葡聚糖醉、肽聚糖相關(guān)脂蛋白(PAL)、FepA、FhuA、NmpA、NmpB、NmpC,或一種主要的外膜脂蛋白(如LPP)等的一部分.在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，構(gòu)建的信號(hào)序列具有更強(qiáng)的疏水性(例如在信號(hào)序列中插入或?qū)⑵渲械陌被崛〈墒杷园被?，如亮氨?.說(shuō)明性實(shí)施例見(jiàn)下文的笫7.1-7.4節(jié)，在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白含有一種蛋白水解性剪切位點(diǎn)，該蛋白水解性剪切位點(diǎn)可以是效應(yīng)分子的內(nèi)源位點(diǎn)，也可以是0mp樣蛋白的內(nèi)源位點(diǎn)，還可以是構(gòu)建到融合蛋白中的蛋白水解性剪切位點(diǎn).在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的Omp樣蛋白是含有來(lái)自不同蛋白的結(jié)構(gòu)元件的雜合Omp.在作為舉例的實(shí)施方案中，0mp樣蛋白為0mpA;構(gòu)建OmpA樣融合蛋白的原理也同樣適用于其他Omp融合蛋白，但要注意特定Omp樣蛋白的構(gòu)型.例如，天然OmpA蛋白在其170個(gè)氨基酸的N-端蛋白結(jié)構(gòu)城中含有8個(gè)反平行跨膜p-鏈.在每對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域之間是細(xì)胞外環(huán)或細(xì)胞內(nèi)環(huán)，這取決于跨膜結(jié)構(gòu)域的插入方向.由155個(gè)氨基酸組成的C-端結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞內(nèi)，并可能與充滿(mǎn)周質(zhì)空間的肽聚糖接觸，目前已獲得了利于產(chǎn)生OmpA融合蛋白的表達(dá)栽體.例如，Hobom等人(1995，Dev.Biol.Strand.84:255-262)開(kāi)發(fā)了一種栽體，該栽體含有O邁pA開(kāi)放讀碼框架，并且在笫三或第四細(xì)胞外環(huán)的編碼序列中插入了接頭，從而能夠按讀框插入選定的異源蛋白.在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，OinpA融合蛋白的含初級(jí)效應(yīng)分子部分在周質(zhì)中的表達(dá)加強(qiáng)，在該實(shí)施方案的一方面，成熟前的融合蛋白在初級(jí)效應(yīng)分子N-端含有信號(hào)序列或至少連接了一個(gè)OmpA跨膜結(jié)構(gòu)域的信號(hào)序列.信號(hào)序列被切除，因而成熟蛋白不含信號(hào)序列.在該實(shí)施方式的另一方面，初級(jí)效應(yīng)分子位于OmpA融合蛋白的N-端，只要融合蛋白具有穩(wěn)定性，可以改變使用的OmpA跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)量，這不會(huì)對(duì)初級(jí)效應(yīng)分子的定位產(chǎn)生影響.在該實(shí)施方式的另一方面，初級(jí)效應(yīng)分子位于OmpA的N-端結(jié)構(gòu)域與C-端結(jié)構(gòu)域之間，這種融合蛋白在周質(zhì)中被周質(zhì)蛋白酶剪切后，可形成含有初級(jí)效應(yīng)分子的可溶性周質(zhì)蛋白.在該實(shí)施方案的某些方式中，優(yōu)選的是表達(dá)周質(zhì)初級(jí)效應(yīng)分子的細(xì)菌栽體還可以同時(shí)表達(dá)BRP,因而可促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞釋放效應(yīng)分子，在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，OmpA融合蛋白含初級(jí)效應(yīng)分子的部分位于細(xì)菌的細(xì)胞外表面.在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，融合蛋白在初級(jí)效應(yīng)分子的N-端含有奇數(shù)個(gè)或偶數(shù)個(gè)OmpA跨膜結(jié)構(gòu)域.在另一方面，初級(jí)效應(yīng)分子位于OmpA的兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)之間，因而可被細(xì)菌呈遞至腫瘤細(xì)胞.在特別實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在細(xì)菌外表面表達(dá)效應(yīng)分子融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒.例如，被稱(chēng)為T(mén)rc(lpp)o叩A(chǔ)的質(zhì)粒含有trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的與o叫A的截短跨膜序列融合的脂多肽(lpp)錨序列.另一實(shí)例是被稱(chēng)為T(mén)rcompA的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ompA編碼信號(hào)序列.這些質(zhì)粒經(jīng)過(guò)構(gòu)建可含有一種編碼本發(fā)明的一種或多種效應(yīng)分子的核酸.作為選摔，還可以在效應(yīng)分子前或效應(yīng)分子側(cè)翼構(gòu)建一些能夠被大量存在于腫瘤內(nèi)的金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶識(shí)別的共有剪切位點(diǎn)，用于將這種效應(yīng)分子釋放到腫瘤環(huán)境中.蛋白醉切位點(diǎn)是在初級(jí)效應(yīng)分子之前還是在初級(jí)效應(yīng)分子側(cè)翼分別取決于該效應(yīng)分子是在融合蛋白的末端還是在融合蛋白的內(nèi)部.按照用于0mpA的上述策略，可以用任一種0mp樣蛋白構(gòu)建出類(lèi)似的融合蛋白.在構(gòu)建這種融合蛋白時(shí)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都明白，0mp樣蛋白的效應(yīng)分子融合部分的選擇取決于該效應(yīng)分子的需要表達(dá)部位(如周質(zhì)、細(xì)胞外、與膜結(jié)合，等等).此處描述的有關(guān)初級(jí)效應(yīng)分子融合蛋白的構(gòu)建方法也同樣適用于次級(jí)效應(yīng)分子.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，效應(yīng)分子是與一種運(yùn)送肽融合.研究表明，在融合蛋白中使用運(yùn)送肽有利于將目的多肽或肽遞送至處在其產(chǎn)生或引入的擴(kuò)散范圍內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞(可參考，例如，Bayley，1999，NatureBiotechnology17:1066-1067;Fernandezetal.,1998，NatureBiotechnology16:418-420;和Derossietal.,1998，TrendsCellBiol.8:84-87),因此，將定向于腫瘤的減毒細(xì)菌加工成可表達(dá)含有運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白的方法能夠提高效應(yīng)分子被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的能力.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種核酸分子，該核酸分子可編碼一種含有運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼一種或多種含有運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.這些實(shí)施方案中的效應(yīng)分子可以是初級(jí)效應(yīng)分子，也可以是次級(jí)效應(yīng)分子.運(yùn)送肽的實(shí)例包括，但不局限于，來(lái)源于HIVTAT蛋白的肽、觸角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)膜移位序列(MTS)、單純皰疹病毒VP22、多聚組氨酸(如六聚組氡酸；6H)、多聚賴(lài)氨酸(如六聚賴(lài)氨酸；6K),以及多聚精氨酸(如六聚精氨酸；6R)(參考，例如，Blankeetal.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8437-8442).在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白含有一種信號(hào)肽、一種運(yùn)送肽和一種效應(yīng)分子.在該實(shí)施方案中，一種方式是定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼一種或多種含有信號(hào)序列、運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白，在這種方式的實(shí)施方案中，效應(yīng)分子可以是初級(jí)效應(yīng)分子，也可以是次級(jí)效應(yīng)分子.在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌將含有一種信號(hào)肽、一種蛋白水解性剪切位點(diǎn)、一種運(yùn)送肽和一種效應(yīng)分子的融合蛋白遞送至實(shí)體瘸.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼一種或多種含有信號(hào)序列、蛋白水解性剪切位點(diǎn)、運(yùn)送肽和效應(yīng)分子的融合蛋白.該實(shí)施方案中的效應(yīng)分子可以是初級(jí)效應(yīng)分子，也可以是次級(jí)效應(yīng)分子.在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，是通過(guò)在添加來(lái)源于HIVTAT、單純皰滲病毒VP22、觸角足同源域、6H、6K和6R的肽來(lái)提高大腸桿菌素的活性?？梢允荂-端、N-端或內(nèi)部融合.融合位置位于N-端信號(hào)序列剪切肽之后的內(nèi)部融合特別優(yōu)選.該融合蛋白還可另含有0mpA等N-端信號(hào)序列或hlyA等C-端信號(hào)序列.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，效應(yīng)分子與一種毒素的遞送部分融合.已知有多種毒素具有自主遞送能力，在這些毒素中有一部分可作為另一部分的遞送刑.例如，BalUrdetal.，1996，Proc.Natl.Acad,Sci.USA93:12531-12534證明，炭疽防護(hù)刑(PA)可介導(dǎo)致死因子(LF)和水肺因子進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞質(zhì)腔，還可以介導(dǎo)與截短形式的LP(LPn;255個(gè)氨基酸殘基)融合的蛋白的進(jìn)入.因此，除了在細(xì)胞外發(fā)揮功能的效應(yīng)分子外，本發(fā)明的效應(yīng)分子都可以與LFn或其他毒素系統(tǒng)融合，其中包括，但不局限于，白喉毒素A鏈的笫1-193殘基(Blankeetal.，1996，Proc.Natl，Acad.Sci，USA93:8437-8442)、霍亂毒素、Vero細(xì)胞毒素、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LTs)、大腸桿菌熱穩(wěn)定毒素(STs)、脈溶血素、腸毒素、細(xì)胞毒素、EAggEC穩(wěn)定毒素l(EAST)、CNFs、細(xì)胞致死性膨脹毒素、cr溶血素、P-溶血素，以及SheA溶血素(有關(guān)綜述可參考，例如，O'BrienandHolmes,1996,ProteintoxinsofEscherichiacoliandSalmonella.CellularandMolecularBiology,Neidhardtetal.(eds)，ASMPressWashington,D.C.，pp2788-2802)在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，是將初級(jí)效應(yīng)分子與一種毒素的遞送部分融合.在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，是將次級(jí)效應(yīng)分子與一種毒素的遞送部分融合.在細(xì)菌中表達(dá)的融合蛋白的構(gòu)建方法已為本領(lǐng)域所熟知，這些方法均處在本發(fā)明的范圍內(nèi).(參考，例如，Makrides，S.，1996,Microbiol.Revs60:512-538，在此完整引入作為參考)5.6.表達(dá)栽體本發(fā)明提供一些經(jīng)過(guò)加工而編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的定向于胂瘤的減毒細(xì)菌.本發(fā)明提供一些含有效應(yīng)分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些效應(yīng)分子由質(zhì)?；蚩赊D(zhuǎn)染核酸編碼.在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的定向于胂瘤的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.當(dāng)沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可表達(dá)一種以上的效應(yīng)分子時(shí)(如初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子)，這些效應(yīng)分子可由相同的質(zhì)?；蚝怂醽?lái)編碼，也可由一種以上的質(zhì)?；蚝怂醽?lái)編碼.本發(fā)明還提供一些含有效應(yīng)分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些效應(yīng)分子由整合到細(xì)菌基因組中的核酸分子編碼.整合的效應(yīng)分子可以是沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的內(nèi)源分子，也可以被引入定向于腫瘤的減毒細(xì)菌中(例如引入一種可編碼效應(yīng)分子的核酸，如質(zhì)粒、可轉(zhuǎn)染核酸、轉(zhuǎn)座子，等等)，使得編碼效應(yīng)分子的該核酸分子能夠整合到定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的基因組中.在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.本發(fā)明提供一種與適當(dāng)啟動(dòng)子可採(cǎi)作性連接的可編碼效應(yīng)分子的核酸分子.與編碼效應(yīng)分子的核酸可採(cǎi)作性連接的啟動(dòng)子可以是同源的(即本身的)，也可以是異源的(即編碼效應(yīng)分子的核酸本身不具有的).編碼本發(fā)明的效應(yīng)分子或其功能活性類(lèi)似物或片段或其他衍生物的核苷酸序列可以被插入到一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)栽體中，例如含有轉(zhuǎn)錄或翻譯插入的蛋白編碼序列所必需的元件的質(zhì)粒.轉(zhuǎn)錄或翻譯的必需信號(hào)可以由效應(yīng)分子和(或)其側(cè)翼區(qū)域提供.作為選摔，表達(dá)栽體的構(gòu)建方法還可以是，利用本領(lǐng)域已知的多種DNA搮作方法在可搮作的讀碼階段將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列以及適當(dāng)?shù)姆g起始信號(hào)和終止信號(hào)插入到功能性啟動(dòng)子中，通?？蓞⒖糞ambrooketal.，1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY^Ausubeletal.，1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishing，NewYork,NY.這些方法可包括DNA體外重組以及合成技術(shù)和體內(nèi)重組(遣傳重組)方法.本發(fā)明提供一種與適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的可編碼效應(yīng)分子的核酸分子.本發(fā)明還提供一些經(jīng)過(guò)加工而編碼一種或多種融合蛋白以及可選的一種或多種效應(yīng)分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌.本發(fā)明提供一些含有融合蛋白的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，這些融合蛋白由質(zhì)?；蚩赊D(zhuǎn)染核酸編碼。當(dāng)沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可表達(dá)一種以上的融合蛋白和(或)效應(yīng)分子(如初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子)時(shí)，這些融合蛋白和(或)效應(yīng)分子可由相同的質(zhì)粒或核酸來(lái)編碼，也可由一種以上的質(zhì)粒或核酸來(lái)編碼.本發(fā)明還提供一些含有融合蛋白的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，這些融合蛋白由整合到細(xì)菌基因組中的核酸編碼.本發(fā)明還提供一種與適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的可編碼融合蛋白的核酸分子.編碼本發(fā)明的融合蛋白的核苷酸序列可以被插入到一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)栽體中，例如含有轉(zhuǎn)錄或翻譯插入的蛋白編碼序列所必需的元件的質(zhì)粒.在本發(fā)明的某些特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)栽體是一種質(zhì)粒.有大量的質(zhì)粒適于產(chǎn)生本發(fā)明的重組構(gòu)建體，這些質(zhì)粒已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，并且能以商品形式獲得.上述商品化質(zhì)粒包括，例如，pKK223-3(PharmaciaFineChemicalsUppsala,Sweden)和GEM1(PromegaBiotec,Madison,WI，USA).這些質(zhì)粒是將PBR322的"主鏈"部分與一種適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和要表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列相結(jié)合.pBR322被認(rèn)為是一種低拷貝數(shù)的質(zhì)粒.如果要獲得高水平的表達(dá)，可以采用高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，如含有pUC主鏈的質(zhì)粒.pUC質(zhì)粒包括，但不局限于，pUC19(參考，例如，Yanisch-Perronetal.，1985，Gene33:103-119)和pBluescript(Stratagene)作為范例提供的以下質(zhì)粒都可以與本發(fā)明的方法協(xié)同使用.細(xì)菌pBs、phagescript、phiX174、pbluescriptSK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene);pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia).也可以使用含有pBR322"主鏈"的商品化質(zhì)粒，如pKK223-3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden)和GEM1(PromegaBiotec，Madison,WI，USA).這些質(zhì)粒可以與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和要表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列相結(jié)合.pCET、pTS(如本文笫6節(jié)所述).在本發(fā)明的特別實(shí)施方案中，編碼效應(yīng)分子的質(zhì)粒為pTS-TNF-a質(zhì)粒、pTS-BRP質(zhì)?；騪TS-BRPTNF-a質(zhì)粒，有關(guān)這些質(zhì)粒的描述見(jiàn)本文第6節(jié).在本發(fā)明的一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，用于分泌到周質(zhì)空間的含有OmpA信號(hào)序列和初級(jí)效應(yīng)分子的本發(fā)明所迷融合蛋白是由pIN-III-ompA-Hind質(zhì)粒編碼，該質(zhì)粒含有ompA信號(hào)序列的DNA編碼序列，該序列位于能夠克隆初級(jí)效應(yīng)分子編碼序列的接頭序列的上游，在一項(xiàng)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，pIN-III-ompA-Hind栽體的lac誘導(dǎo)型啟動(dòng)子被替換成pepT或tet啟動(dòng)子(參考Rentier-Delrueetal.，(1988)，Nuc.AcidsRes,16:8726).本發(fā)明還提供對(duì)效應(yīng)分子進(jìn)行轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的染色體整合的方法.只要能將效應(yīng)分子的編碼核酸構(gòu)建到轉(zhuǎn)座子盒中，本領(lǐng)域已知的任何轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒都可以在本發(fā)明的方法中使用.例如，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有一種轉(zhuǎn)座子或微轉(zhuǎn)座子以及MCS.在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的質(zhì)粒是一種轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，也就是說(shuō)，該質(zhì)粒含有一種轉(zhuǎn)座子，其中插入了目的效應(yīng)分子的編碼序列，轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒含有轉(zhuǎn)座子盒，這些轉(zhuǎn)座子盒能夠整合到細(xì)菌基因組中，因此，可以將效應(yīng)分子或其融合蛋白的編碼核酸插入到轉(zhuǎn)座子盒中，這樣就可以通過(guò)轉(zhuǎn)座子盒將轉(zhuǎn)座子插入序列整合到細(xì)菌基因組中。效應(yīng)分子的編碼序列可以與一種啟動(dòng)子可操作性連接，也可以不含啟動(dòng)子.當(dāng)不含啟動(dòng)子時(shí)，可選標(biāo)記的表達(dá)由轉(zhuǎn)座子插入部位的細(xì)菌基因組啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng).對(duì)含有轉(zhuǎn)座子插入序列的細(xì)菌菌落進(jìn)行篩選，以獲得可滿(mǎn)足本發(fā)明要求的表達(dá)水平，例如足以促進(jìn)腫瘤的細(xì)胞毒性、郁積或退化的細(xì)胞因子表達(dá)水平.在某些實(shí)施方案中，使用的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒除含有轉(zhuǎn)座子外，還在轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)區(qū)外含有一種可催化轉(zhuǎn)座子插入細(xì)菌基因組中的轉(zhuǎn)座酵基因，但該基因不會(huì)隨轉(zhuǎn)座子一同插入，從而可產(chǎn)生帶有穗定轉(zhuǎn)座子插入序列的細(xì)菌菌林.可供本發(fā)明使用的轉(zhuǎn)座子包括，但不局限于，Tn7、Tn9、TnlO和Tn5.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒為pM2883(ATCC)，該質(zhì)粒在TnlO插入元件外含有氛節(jié)青霉素抗性基因，并且在兩個(gè)TnlO插入元件之間(如轉(zhuǎn)座子盒內(nèi))含有一種或多種效應(yīng)分子的編碼核酸.優(yōu)選地，在制備構(gòu)建體時(shí)還可以將編碼其他元件的類(lèi)外序列插入到兩個(gè)TnlO插入元件之間.在特別實(shí)施方案中，這些元件可選擇性地包括(1)可選標(biāo)記的無(wú)啟動(dòng)子拷貝(如SerC、AroA,等等)，用于篩選含有質(zhì)粒的陽(yáng)性細(xì)菌；(2)—種BRP基因；(3)適于效應(yīng)分子使用的一種啟動(dòng)子(如trc)，該啟動(dòng)子與一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子(如TNF-a或其融合蛋白，如0mpA-TNF-a融合蛋白)的編碼核酸可操作性連接；(4)適于一種或多種效應(yīng)分子的編碼核酸使用的一種終止子.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，當(dāng)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行適當(dāng)搮作并利用質(zhì)粒編碼的氨爺青審素抗性特征篩選出含有所需構(gòu)建體的克隆之后，可以通過(guò)質(zhì)粒的喪失來(lái)去除抗生素篩選，然后挑選含有染色體轉(zhuǎn)座子插入序列的菌林(如平鋪在選摔培養(yǎng)基上)，用于向人類(lèi)受試者給藥.另一項(xiàng)特別實(shí)施方案是采用pTS質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有一種靶特異性不同的轉(zhuǎn)座酶基因和一種微轉(zhuǎn)座子，這種微轉(zhuǎn)座子含有無(wú)啟動(dòng)子serC基因和MCS的編碼序列.另一項(xiàng)特別實(shí)施方案是采用pTS-BRP質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有一種靶特異性不同的轉(zhuǎn)座酶基因和一種微轉(zhuǎn)座子，這種微轉(zhuǎn)座子含有無(wú)啟動(dòng)子serC基因、烷化刑誘導(dǎo)型細(xì)菌素釋放因子以及MCS的編碼序列，在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于篩選轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的染色體整合菌林的轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中含有a)位于轉(zhuǎn)座子插入序列之外(如轉(zhuǎn)座子盒之外)的一種轉(zhuǎn)座酶基因，用于轉(zhuǎn)座子的切除和整合；b)與細(xì)菌菌林缺失的篩選基因(如serC)對(duì)應(yīng)的一種野生型編碼序列以及野生型基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子，但缺少啟動(dòng)子.優(yōu)選的是該序列直接位于左側(cè)TN10轉(zhuǎn)座子插入序列之后；c)可選的一種核酸序列，該序列位于左右兩側(cè)插入序列之間，可編碼一種釋放促進(jìn)性核酸(如BRP);以及d)位于左右兩側(cè)插入序列之間的一種多克隆位點(diǎn)(MCS)，含有質(zhì)粒中單一的限制性位點(diǎn)，用于插入效應(yīng)分子.優(yōu)選的是該MCS直接位于釋放增強(qiáng)型核酸(如果使用的話(huà))之后，并且恰好在右側(cè)TN10插入序列之前.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，效應(yīng)分子在宿主染色體上的隨機(jī)整合可導(dǎo)致基因中斷，由此可確定基因位置是否適用于效應(yīng)插入.在另外一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的表達(dá)栽體是一種染色體外質(zhì)粒，這種質(zhì)粒能夠在不含所需的抗生素篩選基因的條件下保持穗定，也就是說(shuō)該質(zhì)粒能夠自我維護(hù).在一個(gè)非限制性實(shí)施例中，可自我維護(hù)的表達(dá)質(zhì)粒為沙門(mén)氏菌毒力質(zhì)粒，舉例來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，質(zhì)粒篩選系統(tǒng)的維持方法是為沙門(mén)氏菌等細(xì)菌提供一種原本不具備的功能，并在此基礎(chǔ)上清除那些仍不具備這種功能的沙門(mén)氏菌，從而篩選出具備這種功能的沙門(mén)氏菌.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的沙門(mén)氏菌是一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體菌林，而表達(dá)質(zhì)粒可以為該突變體提供其缺乏的生物合成醉的功能，在缺乏營(yíng)養(yǎng)成分的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)這些細(xì)胞，只有所需細(xì)胞能夠在這種培養(yǎng)基上進(jìn)行代謝，也就是只有包含所述表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞能夠進(jìn)行代謝，從而可篩選出含有這種表達(dá)質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌.在該實(shí)施方案中，高度優(yōu)選的方式是本發(fā)明的沙門(mén)氏菌對(duì)DAP(中二氨基庚二酸)有必然的需求，最優(yōu)選的是asd基因缺失.DAP是存在于革蘭氏陰性菌周質(zhì)中的肽聚糖的一種成分，這種成分是細(xì)菌外膜保持完整所必需的.DAP缺乏可導(dǎo)致細(xì)菌外膜的完整性無(wú)法保持，從而引起細(xì)菌裂解.asd(P天冬氨酸半醛脫氬酶)基因可編碼DAP生物合成途徑中的一種醃.缺乏asd功能的革蘭氏陰性菌可以在補(bǔ)加有DAP的培養(yǎng)基上生長(zhǎng).帶有與一種同源或異源啟動(dòng)子可採(cǎi)作性連接的asd基因序列的質(zhì)粒，如本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒，可以通過(guò)在缺乏DAP的條件下培養(yǎng)不具有asd活性的革蘭氏陰性菌的方法來(lái)加以篩選(參考，例如，授予Curtiss，的美國(guó)專(zhuān)利5，840，483第III部分).本領(lǐng)域已知的其他非抗生素型篩選系統(tǒng)也處在本發(fā)明的范圍內(nèi).例如，有一種篩選系統(tǒng)采用的是含有一種穩(wěn)定毒素和一種穩(wěn)定性較低的抗毒素的一種質(zhì)粒，該系統(tǒng)可用來(lái)篩選維持有這種質(zhì)粒的細(xì)菌.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的表達(dá)栽體是一種能夠用非抗生素方法進(jìn)行篩選的染色體外質(zhì)粒，如一種大腸桿菌素質(zhì)粒.此處使用的大腸桿菌素質(zhì)粒至少可編碼一種大腸桿菌素毒素和一種抗-大腸桿菌素，大腸桿菌素毒素比抗-大腸桿菌素更加穩(wěn)定，從而喪失這種大腸桿菌素質(zhì)粒的所有細(xì)菌都會(huì)因大腸桿菌素毒素的持久性而被殺死.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的大腸桿菌素毒素為ColE3大亞基，使用的抗-大腸桿菌素為ColE3小亞基.在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的表達(dá)栽體為X栽體，更明確地說(shuō)是溶原性X栽體.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，含有X栽體的細(xì)菌宿主另含有一種能夠在30"C而不是371C發(fā)揮功能的溫度敏感型k阻遏物.因此，該細(xì)菌宿主在301C下生長(zhǎng)和進(jìn)行體內(nèi)搮作時(shí)不會(huì)表達(dá)對(duì)細(xì)菌具有毒性的初級(jí)效應(yīng)分子和(或)次級(jí)效應(yīng)分子.一旦該細(xì)菌菌林被引入受試者，則會(huì)因正常體溫而將X阻遏物滅活，同時(shí)激活初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的次級(jí)效應(yīng)分子的表達(dá).效應(yīng)分子編碼核酸序列或融合蛋白編碼核酸序列的表達(dá)可以由另一種核酸序列來(lái)調(diào)控，從而使效應(yīng)分子能夠在這種重組DNA分子轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中表達(dá).例如，可以用本領(lǐng)域已知的任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件來(lái)調(diào)控效應(yīng)分子的表達(dá)，啟動(dòng)子/增強(qiáng)子可以是同源的(即自身的)，也可以是異源的(即非自身的).可用來(lái)調(diào)控細(xì)菌中的效應(yīng)分子，如細(xì)胞因子，或融合蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子包括，但不局限于，原核啟動(dòng)子，如P-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroffetal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)或lac啟動(dòng)子(DeBoeretal.，1983，Proc.Natl，Acad.Sci，U.S，A.80:21-25;ScientificAmerican,1980，242:74-94).本發(fā)明還包括其他啟動(dòng)子，其中包括，但不局限于，lacl、UcZ、T3、T7、gpt、XP，、3J\、trc、pagC、sulA、polII(dinA)、ruv、recA、uvrA、uvrB、uvrD、umuDC、lexA、cea、caa和recN(參考，例如，Schnarretal.，1991，Biochimie73:423-431),在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的啟動(dòng)子為trc(參考，例如，Amannetal.，l"8，Gene69:301-15).在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子是在SOS-反應(yīng)性啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)的一種大腸桿菌素，該減毒細(xì)菌菌林可以用X-射線(xiàn)、紫外線(xiàn)、烷化刑或其他DNA破壞性制刑進(jìn)行處理，以提高大腸桿菌素的表達(dá).SOS-反應(yīng)性啟動(dòng)子的實(shí)例包括，但不局限于，recA、sulA、umuC、dinA、ruv、uvrA、uvrB、uvrD、lexA、cea、caa、recN,等等，在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子在腫瘤環(huán)境中的活性加強(qiáng)；例如，pepT基因的Pl啟動(dòng)子等啟動(dòng)子可以被腫瘤的無(wú)氧環(huán)境激活.Pl啟動(dòng)子的激活取決于FNR轉(zhuǎn)錄激活因子(Strauchetal.，1985,J.Bacteriol.156:743-751).在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，使用的P1啟動(dòng)子是一種突變體，該啟動(dòng)子與天然P1啟動(dòng)子相比，可以在無(wú)氣條件下被更高水平地誘導(dǎo)，例如pepT200啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子對(duì)無(wú)氧條件的反應(yīng)活性是由CRP-cAMP誘導(dǎo)，而不是FNR(Lombardoetal.，1997，J,Bacteriol.179:1909-1917).在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的是無(wú)氣謙導(dǎo)型啟動(dòng)子，如potABCD啟動(dòng)子.potABCD是一種能夠在無(wú)氧條件下從pepT背馳表達(dá)的搮縱子(Lombardoetal.，1997，J.Bacteriol.179:1909-1917)，它可以根據(jù)本發(fā)明的方法加以使用.作為選擇，也可以使用抗生素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如TnlO轉(zhuǎn)座子的tet啟動(dòng)子.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的tet啟動(dòng)子為多體，如三體.當(dāng)利用本發(fā)明的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌對(duì)受試者進(jìn)行處理后，將適當(dāng)刑量的四環(huán)素給藥于該受試者即可誘導(dǎo)該啟動(dòng)子的活性，最初描述的tet誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)是用于非洲栗酒裂殖酵母(FaryarandGatz，1992，CurrentGenetics21:345-349)等真核系統(tǒng)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(LangandFeingold，1996，Gene168:169-171)，而最近的研究可使其適用性擴(kuò)展到細(xì)菌細(xì)胞.例如，Stieger等人(1999，Gene226:243-252)已證明，當(dāng)安火蟲(chóng)榮光素酶基因與tet啟動(dòng)子可搮作性連接后，可通過(guò)tet誘導(dǎo)獲得80倍的誘導(dǎo)作用.該啟動(dòng)子的優(yōu)勢(shì)在于，它可以在極低的四環(huán)素水平下被誘導(dǎo)，該水平約為抗生素活性所需刑量的十分之一旦含有效應(yīng)分子或融合蛋白的質(zhì)粒被引入定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，即可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法對(duì)效應(yīng)分子或融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，這些方法包括，但不局限于，生物學(xué)活性測(cè)定法、醉學(xué)活性測(cè)定法、RNA印跡分析法，和蛋白印跡分析法，(參考Sambrooketal.，1989，MolecularBiology,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NYjAusubeletal.，1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishing,NewYork,NY).5.7.組合療法在某些實(shí)施方案中，定向于胂瘸的減毒細(xì)菌可以與其他已知的癌癥療法協(xié)同用于實(shí)體瘤的治療，在其他一些實(shí)施方案中，經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可以與其他已知的癌癥療法協(xié)同用于實(shí)體瘤的治療，這些核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.舉例來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可以與化療刑協(xié)同使用，這些核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.化療刑的實(shí)例包括，但不局限于，順鉑、異環(huán)褲酰胺、taxanes如紫杉醉和paclitaxol、I型拓樸異構(gòu)酶抑制刑(如CPT-ll、托泊替堪、9-AC和GG-211)、gemcitabine、長(zhǎng)春瑞賓、奧沙利鉑、5-氣尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸、長(zhǎng)春瑞賓、temodal、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、吐根堿、絲裂莓素、鬼臼亞乙普、tenoposide、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、阿審素、柔紅審素、二羥基炭疽菌素二嗣、二羥基蒽酮、光輝霉素、放線(xiàn)菌素D、l-去氬辛嗣、糖皮質(zhì)激素、普香卡因、丁卡因、利多卡因、心得安，以及噪呤審素同系物和環(huán)褲酰胺，作為選擇,經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌也可以與放射療法(如Y射線(xiàn)或x射線(xiàn))協(xié)同使用，這些核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.根據(jù)要處理的癌癥的類(lèi)型，可以采用任何射線(xiàn)治療方案.作為非限定性實(shí)例，可以用x射線(xiàn)進(jìn)行處理；詳細(xì)地說(shuō)，可以用兆伏級(jí)的高能射線(xiàn)(能量高于1MeV的射線(xiàn))處理深部腫瘤，用電子束和常電壓x射線(xiàn)處理皮趺癌.為了使組織暴露于射線(xiàn)，還可以使用發(fā)射y射線(xiàn)的放射性同位素，如鐳、鈷或其他元素的放射性同位素.本發(fā)明包括抗癌刑與定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的序貫給藥或伴隨給藥方法，本發(fā)明包括抗癌刑與定向于腫瘸的減毒細(xì)菌的具有附加作用或協(xié)同作用的組合方法.本發(fā)明還包括一種或多種抗癌劑與一種或多種作用部位不同的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的組合方法.這種組合方法無(wú)論具有協(xié)同作用還是具有附加作用，都可以提供一種基于這些治療刑的雙重作用的改進(jìn)療法，因此，本發(fā)明的新組合療法與采用這兩種制刑之一的單制刑療法相比，可產(chǎn)生更高的療效.本發(fā)明還包括一種抗癌刑與定向于肺瘤的減毒細(xì)菌的順序給藥或伴隨給藥方法，其中的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白的一種或多種編碼核酸分子.本發(fā)明包括抗癌刑與定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的具有附加作用或協(xié)同作用的組合方法，其中的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種效應(yīng)分子和(或)融合蛋白的一種或多種編碼核酸分子.本發(fā)明還包括一種或多種抗癌刑與經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的組合方法，這些核酸分子可編碼一種或多種作用部位不同的效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.這種組合方法無(wú)論具有協(xié)同作用還是具有附加作用，都可以提供一種基于這些治療刑的雙重作用的改進(jìn)療法.因此，本發(fā)明的新組合療法與采用兩種制刑之一的單制刑療法相比，可產(chǎn)生更高的療效.5.8.用于遞送的方法及組合物本發(fā)明提供一些方法，用于通過(guò)對(duì)宿主的毒性較低的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌將一種或多種全身給藥于宿主時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性的初級(jí)效應(yīng)分子局部遞送至肺瘸.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子可用來(lái)治療肉瘤、淋巴瘤、癌或其他實(shí)體瘤.在某些非限制性實(shí)施方案中，使用的效應(yīng)分子可用于在腫瘤部位誘導(dǎo)局部的免疫應(yīng)答.根據(jù)本發(fā)明，可以在一些方法中有利地使用含有一種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌栽體來(lái)抑制患有實(shí)體瘤的動(dòng)物，包括人類(lèi)患者的腫瘤生長(zhǎng)，或縮小其腫瘤體積，或防止腫癀細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)散，其中的核酸分子可編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明提供一些遞送一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子的方法，用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將一種藥用組合物給藥于需要這種治療的動(dòng)物，該組合物含有一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼與一種或多種適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一些遞送一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子的方法，用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將一種藥用組合物給藥于需要這種治療的動(dòng)物，該組合物含有一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼與一種或多種適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的初級(jí)效應(yīng)分子為T(mén)NF家族成員、細(xì)胞毒性肽或多肽、抗血管生成因子、肺瘤抑制性酶，或其功能性片段.本發(fā)明提供一些遞送本發(fā)明的一種或多種融合蛋白的方法，用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步驟包括，將一種藥用組合物給藥于需要這種治療的動(dòng)物，該組合物含有一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼與一種或多種適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種本發(fā)明所述融合蛋白.本發(fā)明還提供一些遞送本發(fā)明的一種或多種融合蛋白以及一種或多種效應(yīng)分子的方法，用于對(duì)實(shí)體瘤進(jìn)行治療，這些方法的步稞包括，將一種藥用組合物給藥于需要這種治療的動(dòng)物，該組合物含有一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼與一種或多種適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種本發(fā)明所述融合蛋白以及一種或多種效應(yīng)分子.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，使用的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌具有一種增強(qiáng)釋放系統(tǒng)，在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物.在一項(xiàng)高度優(yōu)選實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為人.本發(fā)明還提供通過(guò)一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌，來(lái)遞送一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的組合遞送方法.本發(fā)明還提供定向于腫瘤的不同減毒細(xì)菌的組合遞送方法，這些細(xì)菌帶有一種或多種不同的初級(jí)效應(yīng)分子和(或)一種或多種不同的次級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供通過(guò)一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌，來(lái)遞送本發(fā)明的一種或多種融合蛋白的組合遞送方法.本發(fā)明還提供通過(guò)一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌，來(lái)遞送一種或多種本發(fā)明的融合蛋白以及可選的一種或多種本發(fā)明的效應(yīng)分子的組合遞送方法.本發(fā)明還提供定向于肺瘤的不同減毒細(xì)菌的組合遞送方法，這些細(xì)菌帶有一種或多種不同的初級(jí)效應(yīng)分子和(或)可選的一種或多種不同的效應(yīng)分子.實(shí)體瘤包括，但不局限于，肉瘤、癌和其他實(shí)體瘤，其中包括，但不局限于，生殖細(xì)胞系腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胂瘤、乳腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰膜癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌和間皮瘤.優(yōu)選地，所述受試者是一種動(dòng)物，其中包括，但不局限于，牛、豬、雞、狗、貓、馬等動(dòng)物，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選的是人.文中使用的"實(shí)體瘤的治療"包括，但不局限于，抑制肺瘸生長(zhǎng)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、減小肺瘸體積，或抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到身體的其他部分(轉(zhuǎn)移).本發(fā)明提供一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼與一種或多種適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼與一種或多種適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子和一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.本發(fā)明提供一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼與一種或多種適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種本發(fā)明所述融合蛋白.本發(fā)明提供一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘸的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種核酸分子，這些核酸分子可編碼與一種或多種適當(dāng)啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種本發(fā)明所述融合蛋白和一種或多種效應(yīng)分子.本發(fā)明還提供一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌.本發(fā)明還提供一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子.這些組合物含有治療有效劑量的一種定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌栽體和一種可藥用栽體，其中的沙門(mén)氏菌栽體含有一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子，本發(fā)明還提供一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌，這種減毒沙門(mén)氏菌含有一種或多種部分的融合蛋白以及可選的一種或多種效應(yīng)分子.這些組合物含有治療有效刑量的一種定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌栽體和一種可藥用栽體，其中的沙門(mén)氏菌栽體含有一種或多種本發(fā)明的融合蛋白以及可選的一種或多種效應(yīng)分子.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"藥用的"是指聯(lián)邦政府或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或美國(guó)藥典或用于動(dòng)物的，更優(yōu)選的是用于人的，其他公認(rèn)藥典上列舉的.術(shù)語(yǔ)"栽體"是指稀釋刑、佐刑、賦形刑，或用來(lái)將治療刑給藥的承栽物.這些藥用媒介物可以是無(wú)菌液體，如水和油，包括來(lái)源于石油、動(dòng)物或植物油或合成的油，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油、橄梘油，等等.當(dāng)藥用組合物是用于靜脈內(nèi)給藥時(shí)，優(yōu)選的媒介物是生理鹽水.還可以用鹽溶液和水溶葡萄糖和甘油溶液作為流體媒介物，特別是作為可注射的溶液，適當(dāng)?shù)乃幱觅x形刑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、甘醇、水、乙醇，等等.如果需要，組合物中還可以含有少量的潤(rùn)濕刑或乳化刑，或pH緩沖刑.這些組合物可采用溶液、懸浮液、乳狀液、片刑、丸刑、膠嚢刑、粉刑、緩釋制刑等形式.口服制刑可含有標(biāo)準(zhǔn)的媒介物，例如藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂，等等.適當(dāng)藥用媒介物的實(shí)例在E.W.Martin的"Remington，sPharmaceuticalSciences"中有所描述，這些組合物將含有治療有效刑量的定向于腫瘤的治療性純化減毒細(xì)菌，同時(shí)含有適當(dāng)刑量的媒介物，從而可采用適于向患者給藥的形式.刑型應(yīng)該與給藥方式相符合.在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，是按照常規(guī)方法將組合物作為適于向人類(lèi)靜脈內(nèi)給藥的藥用組合物來(lái)加以配制.用于靜脈內(nèi)給藥的組合物通常是等張的無(wú)菌緩沖水溶液.如果需要，組合物中還可包含一種懸浮刑和一種局部麻醉刑，如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛，一般而言，各成分可以單獨(dú)提供，也可以混合后以單位刑重形式提供，例如以?xún)龈煞勰┗驘o(wú)水濃縮物的形式裝在標(biāo)有活性刑分量的安瓶刑或sachette等密封容器中.當(dāng)組合物用于灌注給藥時(shí)，可將其配制在裝有藥用級(jí)無(wú)菌水或生理鹽水的灌注瓶中.當(dāng)組合物用于注射給藥時(shí)，可提供一種裝有注射用無(wú)菌水或生理鹽水的安瓿刑，以便給藥前將各成分混合，可有效治療或預(yù)防實(shí)體瘤的本發(fā)明所述藥用組合物的刑量取決于腫瘤的特性，該刑量可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來(lái)確定.此外，還可以選摔性地進(jìn)行體外測(cè)定，以幫助確定最佳的刑量范圍.制刑中應(yīng)使用的確切刑量還取決于給藥途徑和癌癥的嚴(yán)重程度，該刑重應(yīng)根據(jù)醫(yī)師的判斷和患者的狀況來(lái)加以確定.但適當(dāng)?shù)男塘糠秶话慵s為1.0-lxl01。c.f，u./kg;可選大約1.0-1x10'c.f.u./kg;可選大約1x102-1xlO'c.f.u./kg;可選大約lxio4-lxio'c.f.u./kg;以及可選大約lxl04-lxio1。c,f.u./kg,有效刑量可以由體外測(cè)試系統(tǒng)或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的刑量-反應(yīng)曲線(xiàn)外推獲得.有多種不同的已知遞送系統(tǒng)可用于將本發(fā)明的藥用組合物給藥.引入方法包括，但不局限于，真皮內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、腹膜內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、皮下途徑、鞘內(nèi)途徑、鼻內(nèi)途徑、硬膜外途徑，以及口服途徑.引入方法還可以是腫痛內(nèi)途徑(例如直接給藥于腫瘤區(qū)域)，本發(fā)明的組合物可通過(guò)任何方便的途徑進(jìn)行給藥，例如灌注或快速濃注，或由上皮層或粘膜層吸收(如口腔粘膜、直腸粘膜和腸粘膜等)，也可以與其他生物活性劑一同給藥.給藥方法可以是全身的，也可以是局部的.此外，還可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)耐緩綄⒈景l(fā)明的藥用組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如室內(nèi)注射和鞘內(nèi)注射；用一種腦室內(nèi)導(dǎo)管可以方便地實(shí)現(xiàn)腦室內(nèi)注射，例如與一種貯器相聯(lián)接，如0咖aya貯器.也可以采用肺部給藥，方法是，例如，使用一種吸入器或噴霧器，并且用一種氣霧刑進(jìn)行配制.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的藥用組合物局部給藥于需要治療的區(qū)域；其實(shí)現(xiàn)方法可以是，例如，但不局限于，在手術(shù)過(guò)程中進(jìn)行局部灌注、注射、使用一種導(dǎo)管，或使用一種植入物，該植入物可以是多孔材料、無(wú)孔材料或膠狀材料，其中包括纖維或膜，如sialastic膜.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，給藥方法可以是直接在惡性腫瘤或腫瘤性組織或前腫瘤性組織部位(或形成部位)進(jìn)行注射，含有一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可以用一種控釋系統(tǒng)來(lái)遞送.含有本發(fā)明的一種或多種融合蛋白以及可選的一種或多種效應(yīng)分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌也可以用一種控釋系統(tǒng)來(lái)遞送.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，可以使用一種泵(參考Langer，Supra;Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed,Eng.14:201(1987);Buchwaldetal.,1980，Surgery88:507;和Saudeketal.，1989，N.Engl.J.Med,321:574).在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，可以用聚合材料(可參考MedicalApplicationsofControlledRelease,LangerandWise(eds.)，CRCPres,，BocaRaton,Florida(1974);ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,SmolenandBall(eds.)，Wiley,NewYork(1984)jRangerandPeppas,J.Macromol,Sci.Rev曙Macromol.Chem.23:61(1983);還可以參考Levyetal.,1985，Science228:190jDuringetal.，1989,Aim.Neurol.25)351;和Howardetal.，1989，J.Neurosurg.71:105).在另夕卜一項(xiàng)實(shí)施方案中，可以將一種受控釋放系統(tǒng)放在治療目標(biāo)的附近，即腦的附近，這樣就只需使用全身刑量的一部分(可參考，例如，Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease,supra，vol.2，pp.115-138(1984)).其他受控釋放系統(tǒng)在Langer(1990,Science249:1527-1533)的綜述中有所描述，這些系統(tǒng)均可用于含有一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及可選的一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌的給藥，本發(fā)明還提供一種藥包或藥用試刑盒，其中含有一個(gè)或多個(gè)容器，容器中裝有本發(fā)明所述藥用組合物的一種或多種成分.這些容器還可以選擇性地?cái)y帶一份說(shuō)明，其形式符合管理藥品或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的政府機(jī)構(gòu)的規(guī)定，該說(shuō)明可反映生產(chǎn)、使用或銷(xiāo)售的管理機(jī)構(gòu)已批準(zhǔn)將其給藥于人類(lèi).本發(fā)明還提供一些治療實(shí)體瘤的方法，這些方法的步驟包括，將本發(fā)明的一種藥用組合物給藥于需要這種治療的動(dòng)物，并且對(duì)該動(dòng)物實(shí)施至少一種已知的其他癌癥療法.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，是將本發(fā)明的一種藥用組合物和至少一種化療劑給藥于患有實(shí)體瘤的動(dòng)物.化療刑的實(shí)例包括，但不局限于，順鉑、異環(huán)磷酰胺、taxanes如紫杉醇和paclitaxol、I型拓樸異構(gòu)醉抑制刑(如CPT-11、托泊替堪、9-AC和GG-211)、gemcitabine、長(zhǎng)春瑞賓、奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸、長(zhǎng)春瑞賓、temodal、細(xì)胞松他素B、短桿菌肽D、吐根堿、絲裂審素、鬼臼亞乙苷、tenoposide、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、阿莓素、柔紅審素、二羥基炭疽菌素二稱(chēng)、二羥基蒽新、光輝審素、放線(xiàn)菌素D、l-去氬睪稱(chēng)、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安，以及噪呤審素同系物和環(huán)磷耽胺.本發(fā)明包括本發(fā)明所述藥用組合物與化療刑等抗癌刑的序貫給藥或伴隨給藥方法.在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物是在抗癌刑給藥前進(jìn)行給藥(如2小時(shí)前、6小時(shí)前、12小時(shí)前、l天前、4天前、6天前、12天前、14天前、l個(gè)月前或數(shù)月前).在另一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物是在抗癌刑給藥后進(jìn)行給藥(如2小時(shí)后、6小時(shí)后、12小時(shí)后、l天后、4天后、6天后、12天后、14天后、l個(gè)月后或數(shù)月后).在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥用組合物是伴隨抗癌刑給藥.本發(fā)明包括抗癌刑與經(jīng)過(guò)加工可編碼一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的組合方法，這些核酸分子可編碼一種或多種具有附加作用或協(xié)同作用的效應(yīng)分子和(或)融合蛋白，本發(fā)明還包括抗癌刑與經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)一種或多種核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的組合方法，這些核酸分子可編碼一種或多種作用部位不同的效應(yīng)分子和(或)融合蛋白.這種組合方法無(wú)論具有協(xié)同作用還是具有附加作用，都可以提供一種基于這些治療刑的雙重作用的改進(jìn)療法.因此，本發(fā)明的新組合療法與采用兩種制刑之一的單制刑療法相比，可產(chǎn)生更高的療效.在一項(xiàng)實(shí)施方案中，是將本發(fā)明的一種藥用組合物給藥于患有實(shí)體瘤的動(dòng)物，并且用放射療法(如y射線(xiàn)或x射線(xiàn))對(duì)該動(dòng)物進(jìn)行處理。在一項(xiàng)特別實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，用于治療或預(yù)防放射療法難以控制的腫瘤.本發(fā)明的藥用組合物可以在進(jìn)行放射療法的同時(shí)進(jìn)行給藥，作為選擇，也可以在本發(fā)明所述藥用組合物給藥后進(jìn)行放射療法，優(yōu)選的是在藥用組合物給藥至少1小時(shí)后、5小時(shí)后、12小時(shí)后、l天后、l周后、l個(gè)月后再進(jìn)行放射療法，更優(yōu)選的則是數(shù)月后(如多達(dá)3個(gè)月后)再進(jìn)行放射療法.可利用本領(lǐng)域已知的任何方法在本發(fā)明所述藥用組合物給藥前、給藥的同時(shí)，或給藥后實(shí)施放射治療.根據(jù)要處理的腫瘤的類(lèi)型，任何放射治療方案都可以使用.作為非限定性實(shí)例，可以用x射線(xiàn)進(jìn)行處理；詳細(xì)地說(shuō)，可以用兆伏級(jí)的高能射線(xiàn)(能量高于1MeV的射線(xiàn))處理深部腫瘤，用電子束和常電壓x射線(xiàn)處理皮膚癌.為了使組織暴露于射線(xiàn)，還可以使用發(fā)射y射線(xiàn)的放射性同位素，如鐳、鈷或其他元素的放射性同位素.此外，本發(fā)明還提供用一種藥用組合物替代放射療法來(lái)治療腫瘤的方法，其中的放射療法已被證明或可被證明能夠?qū)μ幚淼幕颊弋a(chǎn)生過(guò)高的毒性，也就是可導(dǎo)致無(wú)法接受的或無(wú)法承受的副作用.5.9.關(guān)于本發(fā)明所述藥用組合物的治療或預(yù)防實(shí)用性的證明在將本發(fā)明的藥用組合物用于人類(lèi)之前，優(yōu)選的是對(duì)其預(yù)期的治療活性或預(yù)防活性進(jìn)行體外測(cè)試，然后進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試.例如，可通過(guò)體外測(cè)試方法來(lái)確定是否必須將特定的藥用組合物進(jìn)行給藥，這些測(cè)試方法包括體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法，該方法是將患者的組織樣品培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，并使其暴露于藥用組合物，或用其他方式將藥用組合物給藥，然后觀測(cè)該組合物對(duì)該組織樣品的影響.可以對(duì)本發(fā)明所述藥用組合物使激活免疫細(xì)胞增加的能力進(jìn)行測(cè)試，方法是用測(cè)試的藥用組合物或?qū)φ战佑|免疫細(xì)胞，并檢測(cè)該藥用組合物對(duì)免疫細(xì)胞生物活性的調(diào)節(jié)(如提高)能力.測(cè)試組合物對(duì)免疫細(xì)胞生物活性的調(diào)節(jié)能力的評(píng)定方法可以是，檢測(cè)細(xì)胞因子或抗原的表達(dá)、檢測(cè)免疫細(xì)胞的增殖、檢測(cè)信號(hào)分子的激活、檢測(cè)免疫細(xì)胞的效應(yīng)功能，或檢測(cè)免疫細(xì)胞的分化.用于測(cè)定這些活性的技術(shù)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解.舉例來(lái)說(shuō)，可通過(guò)'H-胸腺嘧啶核苷摻入測(cè)定和錐蟲(chóng)蘭細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的增殖.可通過(guò)，例如，免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞因子和抗原的表達(dá)，其中包括，但不局限于，竟?fàn)幮詼y(cè)定系統(tǒng)和非竟?fàn)幮詼y(cè)定系統(tǒng)，這些系統(tǒng)采用的技術(shù)有蛋白印跡法、免疫組織化學(xué)放射免疫測(cè)定法、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)、"夾層"免疫測(cè)定法、免疫沉淀測(cè)定法、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定法、凝集測(cè)定法、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定法、免疫放射性測(cè)量法、熒光免疫測(cè)定法、蛋白A免疫測(cè)定法和FACS分析方法.信號(hào)分子的激活可通過(guò)，例如，激酶測(cè)定法和電泳遷移羋分析法(BMSAs)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，T細(xì)胞的效應(yīng)功能可通過(guò)，例如，51Cr幹放測(cè)定法來(lái)加以測(cè)量(參考，例如，Palladinoetal.，1987，CancerRes.47:5074-5079和Blachereetal,，1993，J.Immunotherapy14:352-356)可以測(cè)試本發(fā)明所述藥用組合物使患有癌癥的動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤形成降低的能力.還可以測(cè)試本發(fā)明所述藥用組合物緩解與實(shí)體瘤相關(guān)的一種或多種癥狀的能力.此外，還可以測(cè)試本發(fā)明所述藥用組合物使患有實(shí)體瘤的患者的存活期延長(zhǎng)的能力.用于在動(dòng)物體內(nèi)分析本發(fā)明所述藥用組合物的這些功能的技術(shù)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解.在不同的特別實(shí)施方案中，可以用實(shí)體瘤相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型的代表性細(xì)胞來(lái)進(jìn)行體外測(cè)定，以確定本發(fā)明的藥用組合物能否對(duì)這種類(lèi)型的細(xì)胞產(chǎn)生預(yù)期的影響.在進(jìn)行人體測(cè)試之前，可以在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型系統(tǒng)中對(duì)用于治療的本發(fā)明所述藥用組合物進(jìn)行測(cè)試，其中包括，但不局限于，大鼠、小鼠、雞、牛、猴、豬、狗、兔，等等.在向人類(lèi)給藥之前，可以用本領(lǐng)域已知的任何動(dòng)物模型系統(tǒng)進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試.下列實(shí)施例只作為說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍.6.實(shí)施例由定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏苗表達(dá)TNF-ot下述實(shí)施例說(shuō)明，含有一種TNF家族成員編碼核酸分子的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌，可以表達(dá)該TNF家族成員.6.1.TNF-a質(zhì)粒的構(gòu)建文中描述的質(zhì)粒可作為本發(fā)明的特別實(shí)施方案的說(shuō)明性實(shí)例.本領(lǐng)域的技術(shù)人員都很清除，通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法可以用其他適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或效應(yīng)分子替換諸如trc啟動(dòng)子和(或)TNF-a編碼核酸等啟動(dòng)子和(或)效應(yīng)分子編碼核酸.效應(yīng)分子編碼核酸的基于質(zhì)粒的細(xì)菌表達(dá)采用trc啟動(dòng)子和Trc99A質(zhì)粒(可從Pharmacia購(gòu)買(mǎi))或TrcHisB質(zhì)粒(可從InVitrogen購(gòu)買(mǎi))，兩種質(zhì)粒都是用Ncol位點(diǎn)作為起始密碼子，然后是一個(gè)多克隆位點(diǎn).6.1.1.pCET質(zhì)粒效應(yīng)分子編碼核酸的基于質(zhì)粒的細(xì)菌表達(dá)采用雙X^啟動(dòng)子或雙J^啟動(dòng)子，pCET質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下.用限制性酶Clal剪切pCE33質(zhì)粒(Elvinetal.，1990,Gene87:123-126),再用綠豆核酸醉使末端鈍化，然后用限制性醉Ba礎(chǔ)I剪切.接著將獲得的1.4kb片段連接到pUC19(可從GIBCO購(gòu)買(mǎi))的2.1kbSspI/BamHI片段中，即產(chǎn)生pCI質(zhì)粒.用限制性酶BamHI剪切pCI質(zhì)粒，再用綠豆核酸醉使末端鈍化，然后用限制性醉AflIII剪切.然后將獲得的含有微順?lè)醋雍徒K止子的0.6kb片段連接到pCI的3.lkb片段中，即獲得pCET質(zhì)粒.pCET與Trc99A或TrcHisB—樣，用Ncol位點(diǎn)作為起始密碼子，然后是一個(gè)多克隆位點(diǎn).于30TC培養(yǎng)帶有任何包含趴或^啟動(dòng)子的質(zhì)粒的細(xì)菌，6.1.2.pTS質(zhì)粒pTS質(zhì)粒采用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的染色體整合方法，并且含有效應(yīng)分子編碼核酸的絲氨酸原養(yǎng)型篩選基因，該質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下.用限制性酶BamHI剪切pNK2883質(zhì)粒(可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)購(gòu)買(mǎi))，并分離出4.8kb片段.利用PCR方法從鼠傷寒沙門(mén)氏菌14028菌林(可從ATCC購(gòu)買(mǎi))中分離出鼠傷寒沙門(mén)氏菌serC編碼核酸，PCR使用的正向引物的序列為GAAGATCTTCCGGAGGAGGGGAAATG(SEQIDNO:1)，反向引物的序列為CGGGATCCGAGCTCGAGGGCCCGGGAAAGGATCTAAGAAGATCC(SEQIDNO:2).用限制性醉BglII和BamHI剪切PCR反應(yīng)混合物并分離出l.lkb的PCR產(chǎn)物，將該產(chǎn)物連接到pNK2883的4.8kb片段中，即獲得被稱(chēng)為pTS的質(zhì)粒.直接位于serC編碼核酸3，端的克隆位點(diǎn)可用來(lái)插入效應(yīng)分子編碼核酸.6.1.3.pTS-TNF-a質(zhì)粒有一種質(zhì)粒(pTS-TNP-ot)可以使trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人TNF-a編碼核酸進(jìn)行pTS介導(dǎo)的染色體整合，該質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下.ASD質(zhì)粒PYA272(參考，例如，Curtiss,III的美國(guó)專(zhuān)利5，840,483)的復(fù)制起始點(diǎn)被colEl質(zhì)粒(參考，例如，BazaralandHelsinki,1970，Biochem9:399-406)的復(fù)制起始點(diǎn)替換后就成為PYA3332質(zhì)粒，用限制性酶NcoI剪切PYA3332質(zhì)粒，并用緣豆核酸酶使末端鈍化.然后用限制性酶HindIII剪切所得的飩末端片段，并分離出3.3kb的DNA片段.然后用限制性酶NdeI剪切圖1所示的經(jīng)大腸桿菌優(yōu)化的人TNF-a編碼核酸(參考Pennicaetal.，1984Nature312:724-729;和Salztman，etal.，1996,CancerBiotherapy11:145-153)，并用T4DNA聚合酶使末端鈍化，然后用限制性酶HindIII剪切.將所得的0.5kb片段連接到PYA3332的3.3kb片段中，即獲得Asd34TNF-a質(zhì)粒.然后用限制性酶BglII剪切Asd34TNF-a質(zhì)粒，并將編碼trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的TNF-a編碼核酸的1.1kb片段連接到pTS的BamHI位點(diǎn)中，即獲得pTS-TNF-a質(zhì)粒.6,1.4.pTS-BRP質(zhì)粒pTS-BRP含有經(jīng)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)而整合到染色體中的BRP編碼核酸，并且含有效應(yīng)分子編碼核酸的絲氨酸原養(yǎng)型篩選基因，該質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下.利用PCR方法從pSWl質(zhì)粒(可從BiolOl，Vista,CA購(gòu)買(mǎi))中分離出BRP編碼核酸，并克隆到T0P0-TA克隆質(zhì)粒中(可從InVitrogen，Carlsbad,CA購(gòu)買(mǎi))，即獲得被稱(chēng)為pBRP#5的質(zhì)粒，PCR使用的正向引物的序列為CCGACGCGTTGACACCTGAAAACTGGAG(SEQIDNO:5)，反向引物的序列為CCGACGCGTGAAAGGATCTCAAGAAGATC(SEQIDNO:6),用限制性酶Apal和BamHI剪切pBRP#5質(zhì)粒，并將獲得的含有BRP編碼核酸的0.6kb片段連接到proto-pTS的5.9kbApal/BamHI片段中，即獲得pTS-BRP質(zhì)粒.BRP編碼核酸的5，和3，端的克隆位點(diǎn)可用來(lái)插入效應(yīng)分子編碼核酸.6.1.5.pTS-BRPTNF-a質(zhì)粒有一種質(zhì)粒(pTS-BRPTNF-a)可以使BRP編碼核酸和trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的TNF-a編碼核酸進(jìn)行pTS介導(dǎo)的染色體整合，該質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下'用限制性酶BglII剪切上述用于構(gòu)建pTS-TNF-a的Asd34TNF-a質(zhì)粒，然后將編碼trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的TNF-a編碼核酸的1，1kb片段連接到pTS-BRP的BamHI位點(diǎn)中，即獲得pTS-BRPTNF-a質(zhì)粒.6,2.將效應(yīng)分子編碼核酸整合到沙門(mén)氏菌宿主的染色體中此處描述的系統(tǒng)采用絲氨酸或甘氨酸的AserC-營(yíng)養(yǎng)缺陷型沙門(mén)氏菌菌株，以及整合到染色體的活性轉(zhuǎn)錄區(qū)后可重建絲氨酸/甘氨酸原養(yǎng)型的質(zhì)粒.但本領(lǐng)域的技術(shù)人員都了解，染色體整合菌的篩選也可以使用其他篩選標(biāo)記，這些標(biāo)記也處在本發(fā)明的范圍內(nèi).可參考，例如，Kleckneretal.,1991，Meth.Enzymol.204:139—180,有多種本領(lǐng)域熟知的方法可用來(lái)將含有效應(yīng)分子編碼核酸的PTS或pTS-BRP質(zhì)粒引入serC-沙門(mén)氏菌菌林，其中包括化學(xué)轉(zhuǎn)化法和電穿孔法.引入效應(yīng)分子編碼核酸后，在含有氨節(jié)青審素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中將沙門(mén)氏菌至少培養(yǎng)2小時(shí)，更優(yōu)選的是培養(yǎng)6小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間.然后將細(xì)菌放在可篩選絲氨酸原養(yǎng)型細(xì)菌的培養(yǎng)基中.Atlas,R.M."微生物培養(yǎng)基手冊(cè)"L.C.Parks,ed.CRCPress,BocaRaton,Florida,1993.含有染色體整合效應(yīng)分子編碼核酸的細(xì)菌可以在這種選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng).然后如下所述測(cè)定效應(yīng)分子編碼核酸的表達(dá).效應(yīng)分子編碼核酸的表達(dá)可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何幾種方法來(lái)測(cè)量，如酶學(xué)活性、生物活性、RNA印跡分析，或蛋白印跡分析.6.2.1.由沙門(mén)氏菌表達(dá)的TNF-a的遞送與表達(dá)如上文所述將trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的TNF-ot編碼核酸插入到pTS-BRP的BamHI位點(diǎn)中，即獲得pTS-BRPTNF-a質(zhì)粒.利用本領(lǐng)域的常規(guī)方法將pTS-BRPTNF-a質(zhì)粒電穿孔到鼠傷寒沙門(mén)氏菌減毒菌林VNP20009菌林中(參考國(guó)際專(zhuān)利W099/13053)，該菌林被構(gòu)建成serC-缺陷型，因而其基因型為AmsbB、Apurl、AserC(圖2).盡管不受原理的限制，但這種質(zhì)粒整合到該細(xì)菌的基因組中后可以使serC編碼核酸澉活，從而產(chǎn)生ser(T表型.因此，將電穿孔后的細(xì)菌鋪在補(bǔ)加有腺噪呤的M56瓊脂平板上，即可篩選出帶有染色體整合TNF-a編碼核酸的細(xì)菌.細(xì)菌的進(jìn)一步鑒定顯示其喪失了氨節(jié)青審素抗性，這表示質(zhì)粒已喪失，并且基于質(zhì)粒的TNF-a表達(dá)也隨之喪失.為了對(duì)定向于腫瘤的細(xì)菌的TNF-a表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)和定量，將帶有染色體整合TNF-a編碼核酸的沙門(mén)氏菌培養(yǎng)過(guò)夜，然后取培養(yǎng)物樣品進(jìn)行蛋白印跡分析測(cè)定.閨3特別顯示一種代表性的氨芐青審素敏感性serC+克隆的TNF-a表達(dá)，該克隆被稱(chēng)為pTS-BRPTNF-a克隆2.蛋白印跡分析結(jié)果表明，3.9x10'cfu的pTS-BRPTNF-a克隆2細(xì)菌(笫l泳道)表達(dá)了50ng以上的TNF-a蛋白(笫5泳道)，說(shuō)明TNF-a的表達(dá)水平高于10ng/l(T細(xì)菌.因此，沙門(mén)氏菌中由trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的染色體整合TNF-a編碼核酸成功地表達(dá)出人TNF-a,7.實(shí)施例表達(dá)OMPA融合蛋白的定向于腫瘤的減泰細(xì)苗蛋白與不同信號(hào)肽融合后的周質(zhì)定位與使用的信號(hào)肽和蛋白都有關(guān).例如，信號(hào)肽與蛋白的氨基端融合可以使該蛋白定位于細(xì)菌的周質(zhì)腔.盡管不受原理的限制，但本發(fā)明人認(rèn)為周質(zhì)定位可促進(jìn)細(xì)菌成分(如蛋白)的釋放，因?yàn)樵摮煞种恍杩缭絾螌幽ぜ纯杀会尫诺街車(chē)h(huán)境中.相比之下，胞質(zhì)定位的成分需要跨越細(xì)菌的內(nèi)膜和外膜才能被釋放到周?chē)h(huán)境中，此外，某些蛋白的周質(zhì)定位還對(duì)其生物活性有利.有多種本領(lǐng)域已知的方法可用于將本發(fā)明的效應(yīng)分子導(dǎo)向周質(zhì).該實(shí)施例說(shuō)明，ompA信號(hào)肽與TNF-a、TRAIL(與TNF-a相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體)和白介素-2等效應(yīng)分子的氨基端融合可以使這些蛋白定位于周質(zhì)并隨后被加工.7.1'0MPA-TNF-a融合蛋白的加工利用全細(xì)胞裂解物的蛋白印跡分析方法檢測(cè)四種不同克隆的TNF-a表達(dá)，這四種克隆都可以在JM109細(xì)菌中進(jìn)行基于質(zhì)粒的trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ompA-TNF-a融合蛋白表達(dá).周質(zhì)定位的證明方法是，前體融合蛋白可以被定位于周質(zhì)的一種信號(hào)肽酶剪切成成熟的TNF-a.用IPTG誘導(dǎo)后，所有四種克隆的TNP-a過(guò)表達(dá)都使TNF-a表現(xiàn)為約20kd的二條遷移線(xiàn)(困5，第4-7泳道)，這兩條線(xiàn)相當(dāng)于未加工的和加工的形式，為便于比較，用一種帶有染色體整合TNF-a編碼核酸并能夠表達(dá)成熟(加工)形式TNF-a的沙門(mén)氏菌菌林作為陽(yáng)性對(duì)照(圖5，第3泳道).在不含TNF-a編碼核酸的細(xì)菌中未檢測(cè)到TNF-a表達(dá)(圖5，第2泳道).這些結(jié)果說(shuō)明，成熟形式的人TNF-a蛋白與大腸桿菌o叩A(chǔ)信號(hào)肽的融合蛋白(如圍4所示)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致周質(zhì)定位和加工.此外，還不知道一種分泌蛋白的過(guò)表達(dá)是否會(huì)因?yàn)閴褐普５姆置谘b置而對(duì)宿主細(xì)菌產(chǎn)生毒性.加工形式的ompA-TNF-a的該表達(dá)結(jié)果則表明，正常的分泌裝置可以容納高水平的分泌蛋白表達(dá).7.2.OMPA-TRAIL融合蛋白的加工將onipA信號(hào)肽使TNF家族成員定位于周質(zhì)的能力擴(kuò)展到另一種TNF家族成員TRAIL(與TNF-a相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體).在這些實(shí)驗(yàn)中，是將表達(dá)成熟形式人TRAIL(hTRAIL)的trc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的TRAIL編碼核酸與ompA信號(hào)肽的編碼序列相融合(如困6所示).共檢測(cè)了兩種不同的ompA/TRAIL連接形式，一種可編碼一個(gè)Ncol位點(diǎn)，另一種可編碼一個(gè)Ndel位點(diǎn)(參考困6的含有Ndel的序列).困7顯示兩種類(lèi)型的克隆的蛋白印跡分析結(jié)果.蛋白印跡分析采用的是一種抗hTRAIL抗體，其結(jié)果表明，采用Ncol連接方式的ompA-TRAIL在細(xì)菌中過(guò)表達(dá)后，可同時(shí)產(chǎn)生加工形式的(28.2kd)和未加工形式的(30.2kd)hTRAIL(困7,笫2-4泳道)，而采用Ndel連接方式的ompA-TRAIL在細(xì)菌中過(guò)表達(dá)后只產(chǎn)生加工形式的hTRAIL(圖7，第4-7泳道)，這說(shuō)明Ndel連接方式可獲得更有效的加工.這些結(jié)果說(shuō)明，成熟形式的人TRAIL蛋白與大腸桿菌ompA信號(hào)肽的融合蛋白可導(dǎo)致周質(zhì)定位和加工，此外，還不知道分泌蛋白的過(guò)表達(dá)是否會(huì)因?yàn)閴褐普５姆置谘b置而對(duì)宿主細(xì)菌產(chǎn)生毒性.加工形式的ompA-TRAIL的該表達(dá)結(jié)杲則表明，正常的分泌裝置可以容納高水平的分泌蛋白表達(dá).7，3.0MPA(8L)-IL-2融合蛋白的加工以融合蛋白形式表達(dá)一種次級(jí)效應(yīng)分子(IL-2).將成熟(C125A)hIL-2與上文用于TNF-a和TRAIL的野生型ompA信號(hào)肽融合不會(huì)引起對(duì)IL-2的加工.為了檢測(cè)人IL-2效應(yīng)分子的周質(zhì)定位和加工，將成熟形式的人(C125A)IL-2與表示為ompA(8L)的一種ompA修飾信號(hào)肽相融合，如困8所示.這種ompA修飾信號(hào)肽的改進(jìn)方法是，用困8所示的氨基酸替換ompA信號(hào)肽中的笫6-17位氨基酸.困9顯示其表達(dá)和加工的檢測(cè)結(jié)果(笫6和笫7泳道).每個(gè)泳道代表一個(gè)單克隆，蛋白印跡分析的結(jié)果表明，使用ompA(8L)信號(hào)肽可導(dǎo)致基本徹底的加工(圖9，第6和笫7泳道).7.4.PHOA(8L)-IL-2融合蛋白的加工檢測(cè)人IL-2的另一種融合蛋白的周質(zhì)定位和加工，并與笫7.3節(jié)的融合蛋白進(jìn)行比較.進(jìn)行表達(dá)和加工檢測(cè)的是困IO所示的成熟形式的人(C125A)IL-2與phoA修飾信號(hào)肽的融合蛋白，該融合蛋白表示為phoA(8L).圖9顯示其表達(dá)和加工的檢測(cè)結(jié)果.使用phoA(8L)合成信號(hào)肽可導(dǎo)致部分加工(困9，第4和笫5泳道)，而使用ompA(8L)信號(hào)肽可導(dǎo)致更徹底的加工(困9，笫6和笫7泳道).這些結(jié)果表明IL-2的定位和加工可以用不同的信號(hào)肽來(lái)提供.這些結(jié)果還說(shuō)明，蛋白與不同信號(hào)肽融合后的周質(zhì)定位與使用的信號(hào)肽和蛋白都有關(guān).這些融合蛋白的研究結(jié)果表明，可通過(guò)與0mpA或PhoA等蛋白信號(hào)肽融合的方法使IL-2等本發(fā)明的次級(jí)效應(yīng)分子表達(dá)并定位于細(xì)菌周質(zhì).本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都明白，還可以用其他信號(hào)肽來(lái)實(shí)現(xiàn)效應(yīng)分子的周質(zhì)定位.本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還知道，可以用本發(fā)明的其他效應(yīng)分子替代這些實(shí)施例中描述的效應(yīng)分子.8.實(shí)施例表達(dá)成熟形式TNF-a的沙門(mén)氏菌(AMSBB，APURI)的抗腫瘤作用下述實(shí)施例說(shuō)明，含有一種初級(jí)效應(yīng)分子(如一種TNF家族成員)的編碼核酸的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌可以將這種初級(jí)效應(yīng)分子遞送至哺乳動(dòng)物的肺瘤，并且可導(dǎo)致胂瘤體積減小，在特定時(shí)期的鼠結(jié)腸38癌模型中評(píng)定TNP-a表達(dá)使鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抗肝瘤作用提高的能力.這些實(shí)驗(yàn)是把結(jié)腸38腫瘤的lmm3腫瘤碎片移植到C57BL/6小鼠中，使胂瘤生長(zhǎng)到平均大小約0.3g，此時(shí)將這些動(dòng)物隨機(jī)分組(n-10)并進(jìn)行如下處理1)不處理；2)鼠傷寒沙門(mén)氏菌(AmsbB、Apurl、serC"(親代菌林)；和3)pTS-BRPTNF-a(上述的克隆2).各組小鼠或是不處理，或是接受lxl06cfu適當(dāng)菌林的單次靜脈內(nèi)注射.從細(xì)菌接種時(shí)開(kāi)始，每周測(cè)量腫瘤大小.在注射可表達(dá)TNF-a的定向于肺瘤的減毒沙門(mén)氏菌的一組中，處理后笫2周即表現(xiàn)出明顯的肺瘤退化，在處理后的4周內(nèi)發(fā)現(xiàn)6只小鼠的腫瘤完全退化(圖11).在不處理組中，腫瘸的大小逐漸增加，而在親代鼠傷寒沙門(mén)氏菌(AmsbB、Apurl、ser(T)菌林處理的一組中，處理后第3-笫4周之間表現(xiàn)出腫瘤的部分退化，此后，腫瘤的大小逐漸增加(圖11),這些結(jié)果說(shuō)明，定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌能夠表達(dá)并向腫瘸遞送TNF家族成員等效應(yīng)分子.這種沙門(mén)氏菌可用于腫瘤的治療，并且與不表達(dá)TNF家族成員的親代沙門(mén)氏菌菌株相比可促進(jìn)腫瘤的退化.由染色體整合核酸表達(dá)TNF-a的沙門(mén)氏菌能夠使腫瘤完全退化，這說(shuō)明染色體整合的效應(yīng)分子編碼核酸可以進(jìn)行生物學(xué)意義上的有效表達(dá).9.實(shí)施例由表達(dá)BRP的細(xì)菌加強(qiáng)核酸分子的遞送為了證明BRP活性可促進(jìn)沙門(mén)氏菌等定向于胂瘤的減毒細(xì)菌的質(zhì)粒釋放，對(duì)一種定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌菌林進(jìn)行構(gòu)建，使其含有位于質(zhì)粒上的BRP，并且含有另一種作為幹放標(biāo)記的質(zhì)粒(帶有AMP標(biāo)記的pTrc99a).為了測(cè)定BRP的活性，利用常規(guī)方法將含BRP或不含BRP的沙門(mén)氏菌培養(yǎng)在培養(yǎng)基中.再通過(guò)離心或過(guò)濾清除所得上清液中存留的任何細(xì)菌，然后將澄清的上清液添加到處于感受態(tài)的細(xì)胞中，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng).然后將這些"接受"細(xì)胞平鋪在LBamp上，以觀測(cè)AMP標(biāo)記質(zhì)粒的攝取量.若BRP使AMP抗性菌落的數(shù)量增加，則說(shuō)明表達(dá)BRP的菌林把更多的質(zhì)粒釋放到培養(yǎng)基中.結(jié)果總結(jié)于下表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>這些結(jié)果說(shuō)明，BRP的存在使分泌到培養(yǎng)基中的amp質(zhì)粒數(shù)量增加.因此，用表達(dá)BRP的細(xì)胞的上清液對(duì)"接受細(xì)胞"進(jìn)行轉(zhuǎn)化可獲得更多的菌落.這些結(jié)果表明，BRP加強(qiáng)了次級(jí)效應(yīng)分子的釋放，其中包括核酸質(zhì)粒的釋放.因而這些結(jié)果說(shuō)明BRP可用于質(zhì)粒釋放或DNA遞送.此外，這些沙門(mén)氏菌菌抹能夠表達(dá)BRP,能夠遞送DNA,并且可保持群體的復(fù)制能力.10.實(shí)施例BRP的表達(dá)不會(huì)降低定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌的腫瘤導(dǎo)向或腫瘤抑制能力下述實(shí)施例說(shuō)明，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可協(xié)同表達(dá)BRP和一種或多種效應(yīng)分子，并且可以在不抑制細(xì)菌的腫瘤導(dǎo)向能力的條件下促進(jìn)效應(yīng)分子向腫瘤的遞送.將B16黑色素瘤細(xì)胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右側(cè)后肋，以獲得實(shí)體瘤模型.肺痛移植的方法是，通過(guò)胰蛋白醉消化由燒瓶分離細(xì)胞，清洗，并以2,5xl0'細(xì)胞/ml的濃度懸浮在磷酸緩沖鹽溶液中，笫0天，取0.2ml細(xì)胞懸浮液試樣進(jìn)行注射，總量為5x105個(gè)細(xì)胞/鼠.移植約IO天后，腫瘤的體積達(dá)到150-200mm3,此時(shí)將小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，每組小鼠接受不同的處理.對(duì)照組(困12的曲線(xiàn)l)接受O.2mlPBS.另一組的每只小鼠接受0.2ml含有2x10'c.f.u.的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌菌林VNP20009(困12的曲線(xiàn)2).第三組的每只小鼠接受0.2ml含有2xl06c.f.u.的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌菌林，該菌林含有一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有BRP基因，該基因受其天然啟動(dòng)子調(diào)控(閨12的曲線(xiàn)3).BRP基因在大腸桿菌中是一種SOS誘導(dǎo)型基因，但是在不受原理限制的條件下，本發(fā)明人認(rèn)為該基因在沙門(mén)氏菌中是一種部分組成型基因，可以產(chǎn)生低水平或中等水平的BRP蛋白，這種水平可以被肺瘤環(huán)境的SOS特性進(jìn)一步提高.用表達(dá)BRP的VNP20009沙門(mén)氏菌或不表達(dá)BRP的VNP20009沙門(mén)氏菌注射的小鼠可表現(xiàn)出幾乎相同的抗肺瘤反應(yīng)，這說(shuō)明BRP的表達(dá)沒(méi)有改變這些沙門(mén)氏菌的存活能力或腫瘤導(dǎo)向能力.BRP表達(dá)和HSV-胸腺嘧啶核苷激醉(HSV-TK)表達(dá)對(duì)定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌的影響恰好相反，HSV-TK的表達(dá)可導(dǎo)致VNP20009的腫瘤抑制能力喪失(Paweleketal.,1997，CancerRes.57:4537-4544).因此，該BRP系統(tǒng)無(wú)需改變即可用來(lái)提高初級(jí)效應(yīng)分子和(或)次級(jí)效應(yīng)分子向肺瘤的遞送.11.實(shí)施例pepT啟動(dòng)子表達(dá)栽體該實(shí)施例說(shuō)明，編碼p-gal等報(bào)告基因的一種核酸分子能夠在pepT啟動(dòng)子的調(diào)控下在沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌的體外和體內(nèi)表達(dá).11.1.pepT-BRP-BGAL表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建pepT啟動(dòng)子的克隆方法是，對(duì)來(lái)源于野生型鼠傷寒沙門(mén)氏菌(ATCC14028)分離菌落的該區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用的引物如下正向引物5，-AGTCTAGACAATCAGGCGAAGAACGG-3，(SEQIDNO:15)反向引物:5，AGCCATGGAGTCACCCTCACTTTTC-3，(SEQIDNO:16),PCR的條件包括1個(gè)循環(huán)95TC5分鐘；35個(gè)循環(huán)951C1分鐘，65"C1分鐘，72TC2分鐘；1個(gè)循環(huán)72TC10分鐘.將PCR產(chǎn)物克隆到PCR2.1克隆栽體中(Invitrogen，Carlsbad,California),即形成PepT/PCR2.1,用Ncol和Xbal消化PepT/PCR2.1栽體，凝集分離出pepT片段，并將其連接到已用相同的醉消化的P-galZterm栽體中.Zterm(GenbankBankit臨時(shí)編號(hào)296495)是一種無(wú)啟動(dòng)子的p-gal質(zhì)粒，其產(chǎn)生方法是pGal可讀框克隆到pUC19中.所得質(zhì)粒稱(chēng)為pepT-pGAL.11.2.pepT-(3GAL的體外表達(dá)及pepT-BGAL的活性測(cè)量在無(wú)氣或有氣條件下將帶有pepT-pGAL的沙門(mén)氏菌菌林YS1456(圖13A的CC14;用于菌林的基因裝配，參考W096/40238)或VNP20009(圖13A的CC16)培養(yǎng)至0D"。為~0,5-0.8.利用BirgeandLow(1974，J.Mol.Biol.83:447-457)的方法測(cè)量p-gal活性，結(jié)果顯示于困13A,該結(jié)果說(shuō)明這些細(xì)菌在無(wú)氣條件下生長(zhǎng)可誘導(dǎo)出的14-24倍的p-gal活性.11.3.pepT-0GAL的體內(nèi)表達(dá)及pepT-BGAL的活性測(cè)量用含有pepT-pgal表達(dá)質(zhì)粒或一種BRP表達(dá)質(zhì)粒(BI0101的pSWl(Vista,California),該質(zhì)粒含有pCloDF13BRP編碼序列，該序列受其天然啟動(dòng)子調(diào)控)的沙門(mén)氏菌YS1456菌抹細(xì)胞，或這兩種質(zhì)粒均包含的沙門(mén)氏菌YS1456菌林細(xì)胞對(duì)患有腫瘤的小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)注射.注射5天后，將腫瘤和肝臟勻漿并分離出細(xì)菌，用于證明pepT-pgal質(zhì)粒和(或)BRP質(zhì)粒的存在不會(huì)干擾這些細(xì)菌的腫瘤導(dǎo)向能力.此外還測(cè)重腫瘤和肝臟勻漿物的pgal活性，用于確定能否在體內(nèi)測(cè)量到Pgal活性，以及pepT啟動(dòng)子是否在肺瘤的無(wú)氣環(huán)境中被誘導(dǎo).結(jié)果顯示于圖13B,這些結(jié)果表明在胂瘤環(huán)境中獲得了極高水平的pepT啟動(dòng)子活性.與背景水平相比，肝臟中的pgal表達(dá)水平?jīng)]有明顯的提高，其原因可能是pepT啟動(dòng)子在肝臟的有氣環(huán)境中活性較低，并且(或者)細(xì)菌栽體的肝臟導(dǎo)向能力較弱.12.實(shí)施例四環(huán)素誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)該實(shí)施例說(shuō)明，編碼p-gal等報(bào)告基因的一種核酸分子能夠在tet啟動(dòng)子的調(diào)控下在沙門(mén)氏菌等定向于腫瘸的減毒細(xì)菌中表達(dá).通過(guò)PCR擴(kuò)增從TN10微轉(zhuǎn)座子中克隆tet啟動(dòng)子，使用的引物如下正向引物5，-GGATCCTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGT-3，(SEQIDNO:17)反向引物5，-GGTTCCATGGTTCACTTTTCTCTATCAC-3，(SEQIDNO:18).PCR條件如下l個(gè)循環(huán)95C5分鐘；35個(gè)循環(huán)95X21分鐘，60"Cl分鐘，72TC2分鐘；以及1個(gè)循環(huán)721CIO分鐘，凝集分離出~400bp的PCR片段，并將其克隆到PCR2.1栽體中(Invitrogen).用Ncol和BamHI消化PCR2.1/tet啟動(dòng)子栽體.凝集分離出400bp的tet啟動(dòng)子片段，并將其連接到已用相同的兩種醉消化的無(wú)啟動(dòng)子的p-gal栽體Zterm中.用連接混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪在四環(huán)素/X-gal平板上.根據(jù)藍(lán)顏色分離出陽(yáng)性菌落.制備幾個(gè)陽(yáng)性菌落的提取物，并在含有四環(huán)素的條件下用BirgeandLow(1974，J.Mol.Biol.83:447-457)的方法測(cè)定卩-gal活性.分離出一種克隆，并測(cè)定在四環(huán)素的一種濃度范圍內(nèi)的P-gal表達(dá).測(cè)定結(jié)果顯示于圖14,該結(jié)果說(shuō)明四環(huán)素可誘導(dǎo)出刑重依賴(lài)性的p-gal活性.13.實(shí)施例表達(dá)內(nèi)抑素的定向于腫瘤的咸毒沙門(mén)氏菌對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制下述實(shí)施例說(shuō)明表達(dá)內(nèi)抑素的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌的產(chǎn)生方法和這種沙門(mén)氏菌對(duì)腫瘤的體內(nèi)治療效果，13.1.內(nèi)抑素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用PCR方法從人胎盤(pán)cDNA庫(kù)中擴(kuò)增出內(nèi)抑素，使用的引物如下正向引物5，-GTGTCCATGGGGCACAGCCACCGCGACTTCCAG-3，(SEQIDNO:19)反向引物5，-ACACGAGCTCCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCT-3，(SEQIDNO:20),將所得PCR稱(chēng)為克隆到PCR2.1栽體中(Invitrogen),以構(gòu)建的上述質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增出六聚組氨酸-內(nèi)抑素，使用的引物如下正向引物5，-GTGTCCATCGCTCGGCGGGCAAGTGTCGGGACTGACCATCATCATCATCATCATCACAGCCACCGCGACTTC-3，(SEQIDNO'.21)反向引物5，-GTGCGGATCCCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGCTG-3，(SEQIDNO:22).PCR擴(kuò)增的條件包括1個(gè)循環(huán)951C5分鐘；30個(gè)循環(huán)95TC1分鐘，55"Cl分鐘，72TC2分鐘；以及1個(gè)循環(huán)721CIO分鐘.所得產(chǎn)物是一種含有Ncol(5，)和BamHI(3，)限制性位點(diǎn)的DNA片段，該片段可編碼氨基端含有MARRASVGTDHHHHHH肽序列(SEQIDNO:23)的人內(nèi)抑素.用Ncol和BamHI消化PCR產(chǎn)物，凝集分離出550bp的產(chǎn)物，并將其連接到已用相同的酶剪切的pTrc99A栽體中.將連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a和定向于胂瘤的減毒沙門(mén)氏菌VNP20009菌林中，還將六聚組氨酸編碼序列克隆到表達(dá)栽體YA3334的NcoI/BamHI片段中.asd質(zhì)粒PYA272(CurtissIII，美國(guó)專(zhuān)利5，840，483)的復(fù)制起始點(diǎn)被colEl(BazaralandHelsinki,1970，Biochem9:399-406)的復(fù)制起始點(diǎn)替換后就是PYA3334質(zhì)粒.分離出陽(yáng)性克隆產(chǎn)生的質(zhì)粒DNA，并將其轉(zhuǎn)化到沙門(mén)氏菌8324菌抹中，該菌林是含有asd突變的VNP20009,該菌抹是根據(jù)CurtissIII(美國(guó)專(zhuān)利5,840,483)描述的方法產(chǎn)生的。13.2,由定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌進(jìn)行內(nèi)抑素的體外表達(dá)將含有pTrc99A-六聚組氨酸-內(nèi)抑素質(zhì)粒的不同沙門(mén)氏菌VNP20009和大腸桿菌DH5a菌林培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(0.D.6。。~0.6-0.8),此時(shí)將各培養(yǎng)物分成兩份，一份用0.1mMIPTG誘導(dǎo)trc啟動(dòng)子活性，另一份不加IPTG.再培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)，然后制備細(xì)菌提取物，并利用抗-組氨酸抗體(Clontech，PaloAlto，California)進(jìn)行蛋白印跡分析，以證明六聚組氨酸-內(nèi)抑素的表達(dá).困15A和15B顯示的蛋白印跡結(jié)果分別證明了大腸桿菌DH5a和沙門(mén)氏菌VNP20009中的pTrc99A-六聚組氨酸-內(nèi)抑素(HexHIS-內(nèi)抑素)表達(dá).trc啟動(dòng)子在缺乏IPTG的情況下不顯示活性，但該啟動(dòng)子在沙門(mén)氏菌中具有組成型活性.六聚組氨酸-內(nèi)抑素表現(xiàn)為約25kD的單一條帶，這與該融合蛋白的推導(dǎo)分子量相符.用trc啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的YA3334質(zhì)粒也可以類(lèi)似地表達(dá)六聚組氨酸-內(nèi)抑素融合蛋白.用抗-組氨酸抗體可以檢測(cè)到具有25kDa的推導(dǎo)分子量的一種蛋白，該結(jié)果顯示于困16.困16中的所有細(xì)菌培養(yǎng)物樣品都用0.1mMIPTG誘導(dǎo)了3個(gè)小時(shí).13.3.表達(dá)內(nèi)抑素的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏苗對(duì)C38鼠結(jié)腸癌的療逸用2x2x2imn'的結(jié)腸38肺瘤碎片對(duì)9周齡的雌性C57BL/6小鼠進(jìn)行皮下移植.當(dāng)腫瘤的體積達(dá)到1000咖3時(shí)，取出肺瘸并切成2x2x2mn^的小塊，再將小塊連續(xù)傳代幾次，然后把獲得的2x2x2邁m3小塊皮下移植到雌性C57BL/6小鼠的右肋.移植約24天后，肺瘤的體積達(dá)到150-200mm3，此時(shí)將小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，每組小鼠接受不同的處理.對(duì)照組接受0.2mlPBS.另一對(duì)照組接受0.2ml含有l(wèi)xio'c.f.u.的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌VNP20009菌林，該菌林帶有對(duì)照asd質(zhì)粒，即上文笫5.6節(jié)描述的不含插入序列的asd質(zhì)粒.笫一試驗(yàn)組接受0,2ml含有1x10'c.f.u.的一種VNP20009菌林，該菌林可表達(dá)一種位于asd質(zhì)粒上的六聚組氨酸-內(nèi)抑素融合蛋白.笫二試驗(yàn)組接受另一種VNP20009菌林，該菌林含有與笫一試驗(yàn)組相同的表達(dá)構(gòu)建體，并且還可以表達(dá)BRP.圖17顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示六聚組氨酸-內(nèi)抑素表達(dá)VNP20009菌林的腫瘤抑制效力.處理60天后，用內(nèi)抑素表達(dá)VNP20009沙門(mén)氏菌處理的小鼠的中位腫瘤大小約為對(duì)照小鼠的13、并且比含有空栽體的VNP20009沙門(mén)氏菌處理的小鼠低30X以上.在存活的小鼠中，有許多小鼠表現(xiàn)為肺瘤大小的凈變化值很低，這說(shuō)明腫瘸生長(zhǎng)的停滯，有一只小鼠表現(xiàn)出腫瘤的明顯退化■O，Reilly等人(1997，Cell88:277-285)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)抑素可以在包涵體中積累，所以該處理方法的不完全穿透性或效率不足是這種內(nèi)抑素遞送系統(tǒng)不完善的最可能原因.BRP的表達(dá)可以提高這種內(nèi)抑素遞送系統(tǒng)的效率.BRP表達(dá)受其天然啟動(dòng)子調(diào)控，這種啟動(dòng)子在細(xì)菌中通常表現(xiàn)為一種SOS反應(yīng).實(shí)驗(yàn)表明，BRP的表達(dá)可以使小鼠的平均腫瘤體積降低到對(duì)照小鼠平均腫瘤體積的約6%.此外，在用六聚組氨酸-內(nèi)抑素和BRP處理的小鼠中，有幾只小鼠表現(xiàn)為腫瘤體積隨時(shí)間延長(zhǎng)而顯著減小，這些腫瘤的體積退說(shuō)明書(shū)第87/141頁(yè)化為原腫瘤體積的約IOX或更低，BRP的作用可能有兩方面一是BRP本身具有抗肺瘤活性，二是BRP可促進(jìn)周質(zhì)成分釋放，同時(shí)在一定程度上促進(jìn)胞質(zhì)成分的釋放，其中包括內(nèi)抑素，從而可避免這種蛋白在包涵體中積累，13.4.表達(dá)內(nèi)抑素的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏苗對(duì)DLD人結(jié)腸癌的療逸將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的DLD1細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行胰蛋白酶消化，用PBS清洗，然后在PBS中形成5xl0'細(xì)胞/ml的懸浮液.從單細(xì)胞懸浮液中取O.lml試樣，其中含有5xl0'個(gè)細(xì)胞，將試樣皮下注射到9周齡的雌性棵鼠(CharlesRiver的Nu/Nu-CD1)的右肋.將小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，然后在注射后10-15天或胂瘤體積達(dá)到200-400mm3時(shí)進(jìn)行分期.第一組小鼠為對(duì)照組，每只小鼠接受0.3ml的PBS注射.笫二組小鼠接受0.3ml含有l(wèi)x106c.f.u.的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌VNP20009菌林，該菌抹帶有對(duì)照asd質(zhì)粒.笫三組小鼠接受0.3ml含有l(wèi)xlO6c.f.u,的定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌VNP20009菌林，該菌林含有一種asd質(zhì)粒，該質(zhì)?？杀磉_(dá)六聚組氨酸-內(nèi)抑素融合蛋白和BRP,對(duì)肺瘤進(jìn)行監(jiān)控并每周測(cè)量?jī)纱?田18是經(jīng)過(guò)這三種處理后的腫瘤體積的示意圖，該結(jié)果說(shuō)明由定向于腫瘸的減毒沙門(mén)氏菌表達(dá)的六聚組氨酸-內(nèi)抑素對(duì)DLD1人結(jié)腸癌的抑制作用.帶有PYA3332空質(zhì)粒的VNP20009不能明顯抑制肺瘤的生長(zhǎng).而表達(dá)內(nèi)抑素和BRP的VNP20009能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng).這些結(jié)果說(shuō)明，內(nèi)抑素與BRP的組合可提高帶有PYA3332栽體的VNP20009(8324菌林)的抗腫瘤活性.14.實(shí)施例由定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌表達(dá)抗血管生成因子下述實(shí)施例說(shuō)明對(duì)沙門(mén)氏菌等定向于腫痛的減毒細(xì)菌進(jìn)行加工的方法，這些細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)抗血管生成因子、血小板反應(yīng)蛋白AHR、血小板因子-4和apomigren,14,1.構(gòu)建含有血小板反應(yīng)蛋白AHR核酸編碼序列的質(zhì)粒對(duì)肽序列TiP13.40:AYRWRLSHRPKTGFIRVVMYEG(SBQIDNO:24)進(jìn)行反向設(shè)計(jì)和密碼子優(yōu)化，用于在沙門(mén)氏菌中表達(dá)，該序列相當(dāng)于血小板反應(yīng)蛋白的抗血管生成同源區(qū)(AHR)(參考，例如，專(zhuān)利申請(qǐng)C07K-14/78),所得DNA序列為GCGTACCGCTGGCGCCTGTCCCATCGCCCGAAAACCGGCTTTATCCGCGTGGTGATGTACGAAGGC(SEQIDNO:25)。用互補(bǔ)寡核苷酸(01igol3:40-1和01igol3:40-2)合成這種肽.在5，端添加一段0MPA加工區(qū)編碼序列和一種Spel限制性位點(diǎn).在3，端添加終止密碼子和BamHI限制性位點(diǎn).將兩種寡核苷酸退火，以產(chǎn)生雙鏈DNA片段.用Spel/BamHI剪切該DNA片段，然后與Spel/BamHI剪切的pTrc801IL2栽體相連接，即產(chǎn)生含有全長(zhǎng)OmpA修飾前導(dǎo)序列的pTrc801-13.40質(zhì)粒，該序列被加工后可產(chǎn)生全長(zhǎng)13.40血小板反應(yīng)蛋白肽.Oligo13.40-1:5'gtgta"剛gtggcgcaggcgGCGTACCGCTGGCGCCTGTCCCATCGCCCGAAAACCGGCTTTA丁CCGCGTGG丁GATGTACGAAGGCTAAg^/"gcgc3'(SEQIDNO:26)Oligo13.40-2:GA丁GGGACAGGCGCCAGCGGTACGCcgcctgcgccacac,agZacac3'(SEQIDIs'0:27)(斜體字為限制性位點(diǎn)，加下劃線(xiàn)的為OmpA加工的識(shí)別位點(diǎn))14.2.構(gòu)建含有編碼血小板因子-4肽(47-70)的核酸序列的質(zhì)粒對(duì)含有血小板因子-4(PF-4;參考，例如，Maioneetal.，1990，Science247:77-79和Jouanetal.，1999,Blood94:984-993)的C-端第47-70位氨基酸殘基的肽進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在沙門(mén)氏菌中表達(dá).這種肽，如下所示，含有一種使PF-4對(duì)CFU-GM祖細(xì)胞具有抑制活性的DLQ基序，并且含有一種堿性氨基酸簇，它是一種主要肝素結(jié)合區(qū).血小板因子-4:MSSAAGFCASRPGLLFLGLLLLPLWAFASAEAEEDGDLOCLCVKTTSOVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAOL1ATLKNGRKICLDLOAPLYKKHKKLLES(SEQIDNO:28)信號(hào)肽-加下劃線(xiàn)的黑體字Lys61、62、65、66-主要肝素結(jié)合區(qū)(黑體字)DLQ(7-9，54-56)-對(duì)CPIMJM祖細(xì)胞的抑制活性(黑體字)用互補(bǔ)寡核苷酸(OligoPP4-l和01igoPF4-2)合成這種肽.在5，端添加一段OmpA加工區(qū)編碼序列和一種Spel限制性位點(diǎn).在3，端添加終止密碼子和BamHI限制性位點(diǎn)，將兩種寡核苷酸退火，以產(chǎn)生雙鏈DNA片段.將限制性消化后的該DNA片段與Spel/BamHI消化的pTrc801栽體相連接，即產(chǎn)生pTrc801-PF4質(zhì)粒.該序列被加工后可產(chǎn)生全長(zhǎng)PF-4(47-70)肽.OligoPF4-15，crtc齒g/gtggcgcaggct;AACGGCCGCAAAATCTGCCTGGACCTGCAGGCGCCGCTGTACAAAAAAATCATCAAAAAACTGCTGGAAAGCTAAgga〖ccgcg3'(SEQ1DNO:29)OligoPF4-2CAGGTCCAGGCAGATTTTGCGGCCGTTcgcctgcgccac飾，咖ag3,(SEQIDNO:30)(斜體字為限制性位點(diǎn)，加下劃線(xiàn)的為OmpA加工識(shí)別位點(diǎn))14.3.構(gòu)建含有編碼apomigren的核酸序列的質(zhì)粒抗血管生成性apomigren肽(IYSFDGRDIMTDPSWPQKVIWHGSSPHGVRLVDNYCEA31);參考，例如，國(guó)際專(zhuān)利W099/29856)相當(dāng)于restin的C-端，它是膠原蛋白XV的一種蛋白水解片段.設(shè)計(jì)寡核苷酸(OligoApom5F和01igoApotn6F)，用于從人cDNA中擴(kuò)增該DNA片段.在5，端添加一段0mpA加工區(qū)編碼序列和一種Spel限制性位點(diǎn).在3，端添加終止密碼子和BamHI限制性位點(diǎn).OligoApom5F:5'.ggcttcac啤/gtggcgcaggcgATATAC丁CCTTTGATGGTCG-3'(SEQIDNO:32)OligoApom6R:5'-cgcgga,ccTTACTTCCTAGCGTCTGTCATGAAACTG-3'(SEQIDNO:33)(斜體字為限制性位點(diǎn)，加下劃線(xiàn)的為OmpA加工的識(shí)別位點(diǎn))以胎盤(pán)cDNA為模板用PCR方法獲得具有正確大小的一種片段.用Spel/BamHI剪切該P(yáng)CR產(chǎn)物，然后與Spel/BamHI消化的含有OmpA修飾信號(hào)序列的pTrc801栽體相連接，即產(chǎn)生pTrc801-Apoffl質(zhì)粒.該序列被加工后可產(chǎn)生Apomigren肽.14.4.由沙門(mén)氏苗產(chǎn)生的抗血管生成肽抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖將pTrcOmpA-內(nèi)抑素、pTrc801-PP4和pTrc801-13'40質(zhì)粒電穿孔到定向于腫瘤的減毒沙門(mén)氏菌VNP20009菌株中.篩選出表達(dá)pTrcOmpA-內(nèi)抑素、pTrc801-PF4和pTrc801-13.40的沙門(mén)氏菌菌林，并按Feld陽(yáng)etal，，2000，CancerRes.60:1503-1506和Blezingeretal.，1999，NatureBiotech.17:343-348所述測(cè)定其抗增殖活性，將5ml單菌落培養(yǎng)物培養(yǎng)4小時(shí).把細(xì)胞沉淀重懸于1/20體積的含有100邁g/ml慶大審素的HUVEC培養(yǎng)基中，并連續(xù)進(jìn)行3次凍/融循環(huán)，即獲得細(xì)胞裂解物，離心并用0.2mm針筒式濾器過(guò)濾除菌，以使裂解物澄清.將10、25或50ml裂解物添加到含有人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和100ml基本培養(yǎng)基、FCS和10ng/mlFGF的96孔板中，對(duì)照采用含有pTrc空質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌.將板保溫72小時(shí)，并用MST測(cè)定法(Mosmanetal.，1983，J.I咖咖l.Methods65:55-63)進(jìn)行增殖測(cè)量.閨19和20中顯示的初步結(jié)果表明，沙門(mén)氏菌表達(dá)的血小板因子-4肽(PF4-2)、血小板反應(yīng)蛋白肽13.40(13.40-3)和內(nèi)抑素似乎具有40-60S的抗增殖活性.15.實(shí)施例由定向于腫癍的減毒沙門(mén)氏菌表達(dá)細(xì)苗素家族成員該實(shí)施例說(shuō)明，含有一種細(xì)菌素家族成員編碼核酸的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌，可以表達(dá)該細(xì)菌素家族成員.15.1.C0LE3質(zhì)粒的構(gòu)建文中描述的質(zhì)?？勺鳛楸景l(fā)明的特別實(shí)施方案的說(shuō)明性實(shí)例.本領(lǐng)域的技術(shù)人員都很清除，通過(guò)本領(lǐng)城已知的方法可以用其他適當(dāng)?shù)膯?dòng)子或效應(yīng)分子替換諸如trc啟動(dòng)子和(或)細(xì)菌素編碼核酸等啟動(dòng)子和(或)效應(yīng)分子編碼核酸，15.1.1.pE3.shuttle-l中間栽體質(zhì)粒pE3.shuttle-l是一種中間栽體，可用于將含有多克隆位點(diǎn)和具有克隆/篩選作用的lacZ片段的盒創(chuàng)建到ColE3-CA38質(zhì)粒栽體中.為便于將BRP克隆到E3中，首先把BRP克隆到一種中間穿梭栽體上(困21).該栽體含有一種lacZ片段，可用于在乳糖上從染色體lacZ含有突變的細(xì)菌菌抹中篩選克隆.然后將BRP片段作為含有l(wèi)acZa互補(bǔ)片段的一種盒克隆到E3質(zhì)粒的Smal位點(diǎn)中(圖22).該步騍可借助lacZ片段來(lái)篩選插入序列(即Lac+).盡管天然E3質(zhì)粒不含抗生素篩選標(biāo)記(圖23)，但可以用暈測(cè)定法(K.G.Hardy，"質(zhì)粒實(shí)用方法"，1987，ed.中的Pugsley,A.P.andOudega，B."大腸桿菌素及其質(zhì)粒的研究方法"；Gilson,L.etal.EMBOJ.9:3875-3884))對(duì)質(zhì)粒的存在情況進(jìn)行篩選.這種穿梭栽體有利于將BRP克隆到E3質(zhì)粒上，而且對(duì)任何能夠與E3或E3/BRP連接的DNA都是如此，然后將新產(chǎn)生的E3/BRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到41.2.9中，并進(jìn)行活性測(cè)試.暈形成測(cè)定的初步結(jié)果說(shuō)明，質(zhì)粒上的BRP不會(huì)干擾這種菌林的E3產(chǎn)生.為了確定41.2.9E3/BRP是否比41.2.9E3具有更高的活性，對(duì)各菌林產(chǎn)生的E3致死單位量進(jìn)行測(cè)定(圖24).41.2.9E3/BRP產(chǎn)生的致死單位重比41.2.9E3高100、這說(shuō)明該菌林具有比41.2.9E3更高的活性.15.1.2.用于測(cè)量E3活性的暈"穿刺"測(cè)定法將敏感型測(cè)試菌林(SK522)培養(yǎng)至OD"。為0.8.在3ml預(yù)熱的(的LB軟瓊脂中添加IOOjil測(cè)試菌林(用于100x15咖平皿)，并快速倒在LB瓊脂平板上.將平板溫和振蕩以使復(fù)蓋物在平板上均勻鋪展，然后使瓊脂凝固10-15分鐘.用牙簽挑取用于E3活性測(cè)定的大腸桿菌或沙門(mén)氏菌菌林，并"穿刺"到瓊脂中.然后于371C將瓊脂平板倒置培養(yǎng)過(guò)夜.笫二天，在E3穿刺位置周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)牽或亮區(qū)，這是因?yàn)榉置诘拇竽c桿菌素E3殺死了敏感型細(xì)菌.還可以用坑化刑(如絲裂審素)、紫外線(xiàn)或X-射線(xiàn)等多種SOS-誘導(dǎo)物中的任一種對(duì)菌落做進(jìn)一步誘導(dǎo)，以提高E3的產(chǎn)量或分泌量.圖25顯示一次暈測(cè)定的結(jié)果.在生長(zhǎng)有一種敏感型菌林菌苔的培養(yǎng)JBL中，當(dāng)一種細(xì)菌菌林分泌大腸桿菌素時(shí)，分泌的大腸桿菌素可向外擴(kuò)散并殺死菌苦中包含的細(xì)菌，這些細(xì)菌裂解后即形成一個(gè)亮區(qū)或暈，暈的大小與大腸桿菌素的分泌重相關(guān).困25顯示多種菌林的測(cè)定結(jié)果.在不含colE3-CA38質(zhì)粒的菌林周?chē)鷽](méi)有觀測(cè)到暈.這些沙門(mén)氏菌菌林可以在不誘導(dǎo)的情況下產(chǎn)生大腸桿菌素.另外還可以看出，經(jīng)過(guò)不同類(lèi)型的誘導(dǎo)后(即烷化刑、紫外線(xiàn)，X-射線(xiàn))，所有暈的大小都呈劑量依賴(lài)性地增加.15.1.3.用于選擇性E3克隆的覆蓋測(cè)定法將不同稀釋度(最高1:10，000)的轉(zhuǎn)化體鋪在LB上，37TC培養(yǎng)2小時(shí).然后按上文牽測(cè)定部分的描述制備敏感型測(cè)試菌林，并將其復(fù)蓋在軟瓊脂上.使平板凝固IO分鐘，然后于37TC倒置培養(yǎng)過(guò)夜.笫二天即出現(xiàn)小亮區(qū)(類(lèi)似于嗜菌斑)，在亮區(qū)的中間有一個(gè)(或多個(gè))小菌落.15.1.4."噬斑"或暈純化測(cè)定法然后用無(wú)菌巴斯德吸管分離出位于上述復(fù)蓋瓊脂的亮區(qū)中心的小菌落.當(dāng)一個(gè)牽中沒(méi)有可見(jiàn)菌落或有多個(gè)菌落時(shí)，可以用無(wú)菌巴斯德吸管挑出整個(gè)暈.將挑出的菌落或暈轉(zhuǎn)移到500KlLB中.進(jìn)行不同程度的稀釋(最高1:10，000),并重新鋪在LB瓊脂上，然后于37"培養(yǎng)2小時(shí)，再用上述的敏感型測(cè)試菌復(fù)蓋.第二天，所有的或幾乎所有的菌落周閨都應(yīng)出現(xiàn)暈.16.實(shí)施例體內(nèi)注射E3，并測(cè)定沙門(mén)氏菌中的質(zhì)粒存留百分率下述實(shí)施例說(shuō)明，colE3-CA38質(zhì)?？梢源媪粼诨铙w沙門(mén)氏菌中，該研究使用的是41.29(或41.2.9E3-CA38)注射30天后的兩只小鼠的腫瘤勻漿物和肝臟勻漿物.在以下的描迷中，b肝臟，T-腫瘤.將所有四種勻漿物鋪平板，以產(chǎn)生CFU,挑取菌落并進(jìn)行msbBPCR分析和大腸桿菌素產(chǎn)量測(cè)定.用四種勻漿物獲得與41.2,9類(lèi)似的菌落的幾乎純凈的培養(yǎng)物.各挑出5個(gè)菌落用于大麻桿菌素和PCR分析.由于在41.2.9E3肝臟勻漿物的平板中似乎混合有產(chǎn)大腸桿菌素群體和不產(chǎn)大腸桿菌素群體，所以再?gòu)?1.2.9E3T平板和L平板中挑30個(gè)菌落用于進(jìn)一步分析.根據(jù)這些結(jié)果，再?gòu)?1.2.9E3的腫瘤平板和肝臟平板中挑取100個(gè)菌落，用于大腸桿菌素產(chǎn)量及msbBPCR測(cè)定.由綜合數(shù)據(jù)計(jì)算出質(zhì)粒的分布和存留率.B3體內(nèi)注射及沙門(mén)氏菌中質(zhì)粒存留百分率的測(cè)定結(jié)果顯示于下表3,表3<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>為了能在體內(nèi)發(fā)揮作用，并將其他基因攜帶至體內(nèi)的腫瘤部位，colE3質(zhì)粒必須有效地存留在體內(nèi).該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果令人驚奇并且十分有益，由于效應(yīng)刑的目標(biāo)是腫瘤，因而對(duì)肝臟本身的影響會(huì)比較低.17.實(shí)施例不同41,2.9,菌抹在M27肺腫痛模型中的腫瘤定向下述實(shí)施例可說(shuō)明41.2.9colE3、41.2.9colE3BRP以及41.2.9colE3BRP-m(修飾的BRP)沙門(mén)氏菌菌林的腫瘤導(dǎo)向能力.將下表4列舉的沙門(mén)氏菌菌林注射到患有M27肺腫瘌的動(dòng)物中，并在笫7天將這些動(dòng)物處死.次日，測(cè)量器官重量并計(jì)算出cfu/g.將腫瘸和肝臟勻漿并鋪在msbB上，以測(cè)定集落形成單位(c.f.u.).在笫1、第2、笫4和笫6組中，積累在腫瘤內(nèi)的菌林都約為4xl0'cfu/g，而在肝臟中的聚集量各不相同，范圍是6xl0L4xl0'cfu/g.各組數(shù)據(jù)的平均cfu/g總結(jié)于表4.所有菌林都表現(xiàn)出良好的紳瘤聚集作用(高于10'cfu/g組織)，并且在腫瘸和肝臟中聚集的比率都呈陽(yáng)性，由BRPcolE3獲得的比率最高，但不一定比其他所有可用的菌林都高.E3和E3BRP菌林在腫瘤內(nèi)的聚集水平算比較高，在肺瘸和肝臟中積累的比率為100-200:1,表4<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>BRP.是指在第96位(G突變成A,導(dǎo)致甘氨酸變?yōu)榫彼?和笫114位(T突變?yōu)锳,導(dǎo)致絲氨酸變?yōu)樘K氨酸)含有點(diǎn)突變的一種修飾BRP.BRP,突變體不再引起準(zhǔn)裂解，但仍能夠使細(xì)菌分泌蛋白(vanderVal,F.，Koningstein，G.,TenHagen，C，M,，Oudega，B.andLuirink.J.(1998)通過(guò)大腸桿菌對(duì)細(xì)菌素釋放蛋白(BRP)介導(dǎo)的蛋白釋放進(jìn)行優(yōu)化來(lái)源于pCloDF13的BRP基因的隨機(jī)誘變使致死性和準(zhǔn)裂解與蛋白釋放解偶聯(lián).AppliedandEnvironmentalMicrobiologyvol.64pp392-398),18.實(shí)施例41.2.9/COLE3對(duì)C38鼠結(jié)腸癌的療效下述實(shí)施例說(shuō)明41.2.9/ColE3對(duì)C38鼠結(jié)腸癌生長(zhǎng)的抑制能力，將結(jié)腸38腫瘤碎片(2x2x2nun3)移植到C57BL/6小鼠(雌性，9周齡)的皮下.當(dāng)腫瘤的體積達(dá)到l，OOO咖3時(shí)，在無(wú)菌條件下從小鼠中取出肺瘤并切成小塊(約2x2x2咖7塊)，將上述過(guò)程重復(fù)5次.用肺瘤移植針把小塊移植到小鼠右肋的皮下，此時(shí)間記為腫瘤移植笫0天.當(dāng)肝瘤體積達(dá)到150-200mm3時(shí)，用沙門(mén)氏菌對(duì)小鼠進(jìn)行隨機(jī)給藥，此時(shí)間記為沙門(mén)氏菌給藥笫0天.室溫下將冷凍保存的41.2.9和41.2.9/ColE3融解，分別用PBS稀釋至終濃度為7.5xl06cfu/ml.笫0天時(shí)，按照指定組別用0.2ml細(xì)菌懸浮液試樣(1.5x10'CFU/鼠)對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥.將細(xì)菌懸浮液稀釋成lx103CFU，然后鋪在平板上并保溫過(guò)夜，以確定給藥的細(xì)菌數(shù).每周對(duì)腫瘤進(jìn)行兩次測(cè)量，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每組(ColE3)解剖3個(gè)腫瘤并進(jìn)行處理，以確定cfu和腫瘸存留情況.組:<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>41.2.9/ColE3對(duì)C38鼠結(jié)腸癌的作用結(jié)果顯示于圖26.這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，靜脈內(nèi)注射VNP20009(41.2.9)的小鼠能夠顯著抑制C38鼠結(jié)腸癌的生長(zhǎng)，此外，用含有ColE3質(zhì)粒的VNP20009處理的小鼠可表現(xiàn)出腫瘤退化(即實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘸比開(kāi)始時(shí)小).19.實(shí)施例VNP20009/COLE3對(duì)棵鼠中的DLD1人結(jié)腸癌的抗腫瘤活逸下述實(shí)施例說(shuō)明，沙門(mén)氏菌突變體VNP20009/ColE3(41.2.9/ColE3)與沙門(mén)氏菌突變體41.2.9相比具有更高的抑制DLD1人結(jié)腸癌生長(zhǎng)的能力.通過(guò)胰蛋白酶消化取出生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的DLD1細(xì)胞，用PBS清洗，并在PBS中重懸為5xl(T細(xì)胞/ml.笫O天時(shí)，將單細(xì)胞懸浮液(O.lml)注射到棵鼠(雌性Nu/Nu-CD1，9周齡；CharlesRiver)的右肋皮下(5xl0'細(xì)胞/鼠).肺瘤移植約10-15天后，當(dāng)胂瘤體積達(dá)到300-400咖3時(shí)，將小鼠以每組IO只進(jìn)行隨機(jī)分組并分期.l天以前需計(jì)算沙門(mén)氏菌突變體41.2.9和41.2.9/ColE3的CFU.將細(xì)菌(41.2.9和41.2.9/ColE3)稀釋成1x107CFU/ml.在指定的天數(shù)時(shí)，用0.2ml細(xì)菌懸浮液試樣(2x10tFU/鼠)對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)注射.將細(xì)菌懸浮液稀幹成1x103CFU，各溶液取100jtl鋪在msbB平板上并保溫過(guò)夜.笫二天對(duì)細(xì)菌菌落計(jì)數(shù).每周對(duì)腫瘸進(jìn)行兩次測(cè)量.組:<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>41.2.9/ColE3對(duì)裸鼠中DLD1人結(jié)腸癌的抗肺瘤活性結(jié)果顯示于圖27.含有大腸桿菌素E3的41.2.9菌林可表現(xiàn)出比41.2.9菌林更高的活性q20.實(shí)施例41.2.9/COLE3對(duì)C57BL/6小鼠中的B16鼠黑色素瘤的療逸下述實(shí)施例說(shuō)明沙門(mén)氏菌突變體41.2.9/ColE3對(duì)B16-F10黑色素瘤生長(zhǎng)的抑制能力.通過(guò)胰蛋白醉消化取出生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的B16-F10細(xì)胞，用PBS清洗，并在PBS中重懸為5xl0'細(xì)胞/ml.笫0天時(shí)，將單細(xì)胞懸浮液(0.1ml)注射到C57BL/6小鼠(雌性，9周齡)的右肋皮下(5^105細(xì)胞/鼠).第9天，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到150-200mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分組，每組10只。室溫下將冷凍保存的沙門(mén)氏菌克隆41.2.9和41.2.9/ColE3融解，分別用PBS稀釋至終濃度為7.5xl0'cfu/ml.笫9天時(shí)，按照指定組別用0.2ml細(xì)菌懸浮液試樣(1,5xlO'CFU/鼠)對(duì)小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥.將細(xì)菌懸浮液稀釋成lxlO'CFU,然后鋪在msbB平板上并保溫過(guò)夜，以確定給藥的細(xì)菌cfu數(shù).每周對(duì)腫瘤進(jìn)行兩次測(cè)量，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束.組:<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>41.2.9/CoiE3對(duì)小鼠中B16鼠黑色素瘤的作用結(jié)果顯示于圖28.這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，靜脈內(nèi)注射41.2.9(41.2.9)的小鼠能夠顯著抑制B16鼠黑色素瘤的生長(zhǎng).此外，用41.2.9/ColE3處理的小鼠與只用41.2.9處理的小鼠相比，可在早期時(shí)點(diǎn)(37天以前)表現(xiàn)出腫瘤尺寸的明顯減小.這一發(fā)現(xiàn)極為重要，因?yàn)槟[瘤尺寸越小，對(duì)其他療法(例如化療刑和X-射線(xiàn)等輻射)就越敏感.21.實(shí)施例與BRP結(jié)合的41.2.9/E3的抗腫瘤作用下述實(shí)施例說(shuō)明，BRP和E3在沙門(mén)氏菌突變體41.2.9中的共表達(dá)可提高該突變體的抗胂瘸作用.BRP和E3在沙門(mén)氏菌突變體41,2.9中的共表達(dá)可提高該細(xì)菌在體外的E3分泌量.如果BRP能夠提髙沙門(mén)氏菌在體內(nèi)的E3分泌量，則可以斷定細(xì)胞外E3的增加使其更易于接觸腫瘤細(xì)胞，并由此提高對(duì)這些細(xì)胞的細(xì)胞毒性.在該實(shí)驗(yàn)中共測(cè)試4組動(dòng)物(每組10只)<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>該實(shí)驗(yàn)使用的模型是人肺癌HTB177系.笫1天時(shí)，將細(xì)胞移植到小鼠的肋部皮下.笫14天時(shí)，當(dāng)腫瘤達(dá)到約500mm3，用1xio'cfu的上表所述菌林對(duì)動(dòng)物進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，笫1組則注射生理鹽水.每周測(cè)量腫瘤體積，直到笫24天.表5顯示的結(jié)果說(shuō)明，盡管41.2.9本身能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)(抑制但與E3組合后可以使抗腫瘤效力提高(63%),而在該模型中使用含有E3及BRP的菌林可以進(jìn)一步提高抗腫瘤效力(與不處理對(duì)照相比可抑制67X),這種抑制作用的增強(qiáng)在早期時(shí)點(diǎn)尤其明顯(表5),表5:與不處理對(duì)照相比的腫瘤生長(zhǎng)抑制百分羋<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>結(jié)論是，與不處理的對(duì)照和只用41.2.9/E3處理相比，用含有細(xì)胞毒性大腸桿菌素E3及增強(qiáng)釋放系統(tǒng)BRP的沙門(mén)氏菌處理可提高抗腫瘤效力.22.實(shí)施例舍有大腸桿苗素E3的沙門(mén)氏苗與X線(xiàn)治療相結(jié)合下述實(shí)施例說(shuō)明，與只用X-線(xiàn)處理相比，用41.2.9和2次X-線(xiàn)組合處理可明顯延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間.進(jìn)度表如下第0天，利用B16F10黑色素瘤給藥(5><105細(xì)胞/鼠)的方法將腫瘤移植到100只C57B6雌性小鼠(5-7周齡)的右側(cè)腹部皮下.第8天，注射含有大腸桿菌素E3的沙門(mén)氏菌41,2.9，并在笫12和笫26天進(jìn)行x-線(xiàn)處理.表6顯示用含有大腸桿菌素E3的沙門(mén)氏菌及x-射線(xiàn)組合處理的結(jié)果，表6<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，與只用X-線(xiàn)處理相比，用41.2.9和2次X-線(xiàn)組合處理可明顯延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間.與41.2.9和2次X-射線(xiàn)組合處理相比，用B3處理可進(jìn)一步延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間.23,實(shí)施例由定向于胂瘤的細(xì)菌表達(dá)細(xì)胞毒性壞死因子下述實(shí)施例說(shuō)明，定向于肺瘤的細(xì)菌可以表達(dá)大腸桿菌細(xì)胞毒性壞死因子1(CNF1).細(xì)胞毒性壞死因子包括，但不局限于，大腸桿菌細(xì)胞毒性壞死因子1(CNF1;Falboetal.,1993，Infect,I咖un,61:4904-4914)、費(fèi)氏弧菌CNF2(Linetal.,1998，Biochem.Biophys.Res.Comm.250:462-465)和大腸桿菌細(xì)胞毒性壞死因子2(CNF2;Sugaietal.,1999，Infect.I咖un,67:6550-6557).CNF家族還包括多殺巴斯德菌毒素(PMT),該毒素與CNF2的N-端部分有27X的殘基完全相同，并且有80X的保守殘基(Oswaldetal.，1994,Proc.Acad.Sci.USA91:3814-3818).利用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法從大脈桿菌J96(ATCC700336)中克隆出CNFl，使用的引物為(正向)5，-GTGTCATGAAAATGGGTAACCAATGGCAAC-3，(SBQIDNO:35)和(反向)5,-CACAGAGCTCGCGCTAACAAAACAGCACAAGGGAG-3，(SEQIDNO:36).獲得的產(chǎn)物約為3100bp,將該產(chǎn)物克隆到用于蛋白表達(dá)的pTrc99a的Ncol和Sacl位點(diǎn)中，并用大腸桿菌作為DNA克隆宿主進(jìn)行DNA測(cè)序.DNA測(cè)序是在YaleUniversityKeckBiotechnologylaboratory用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行.DNA測(cè)序的結(jié)果證曰月該P(yáng)CR克隆產(chǎn)物是在3065個(gè)堿基對(duì)中含有6個(gè)次要變異的CNP1.將CNFl質(zhì)粒電穿孔到大腸桿菌DNA克隆宿主DH5a和沙門(mén)氏菌YS1646菌林中(國(guó)際專(zhuān)利WO99/13053).利用標(biāo)準(zhǔn)的LDH測(cè)定法(Promega，Madison,WI，Cytotox96)檢測(cè)大腸桿菌DNA克隆宿主和沙門(mén)氏菌YS1649菌株中的CNFl表達(dá).困29顯示，含CNF質(zhì)粒的存在可以使細(xì)胞毒性加強(qiáng)，后來(lái)的測(cè)定結(jié)果表明，帶有含CNF質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌還可以表現(xiàn)出CNFl的其他已知特性，如多核化作用(Ryckeetal.,1990，J.Clin.Microbiol,28:694-699).利用光學(xué)顯微鏡觀測(cè)暴露于CNFl的Hela細(xì)胞的細(xì)胞核.圖30的結(jié)果清除地表明，含有CNFl的沙門(mén)氏菌可導(dǎo)致預(yù)期的多核化及細(xì)胞增大.24.實(shí)施例由定向于腫痏的細(xì)菌表達(dá)Vero細(xì)胞毒素下述實(shí)施例說(shuō)明，經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)Vero細(xì)胞毒素AB的定向于腫瘤的細(xì)菌可以產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的Vero細(xì)胞毒素AB.Vero細(xì)胞毒素(又名HSC10毒素、Shiga毒素、志賀樣毒素、志賀菌毒素).該毒素分離自能夠產(chǎn)生大場(chǎng)桿菌素的大腸桿菌HSC10菌林,起初認(rèn)為它是大脈桿菌素(Parkas-Himsleyetal.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92(15):6996-7000).很早以前就發(fā)現(xiàn)該毒素具有抗肺瘸活性，尤其是對(duì)卵巢癌和腦腫瘤，但是只發(fā)現(xiàn)純化制品具有這種抗腫瘤活性，而不是完整的活細(xì)菌.利用基于已發(fā)表序列的引物從大腸桿菌HSC10(ATCC55227)中克隆出Vero細(xì)胞毒素，并通過(guò)在YaleKeck生物技術(shù)中心用標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行DNA測(cè)序來(lái)加以證明Vero細(xì)胞毒素的表達(dá)采用了受四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控的BRP基因和含有Vero細(xì)胞毒素A亞基和B亞基的多順?lè)醋?利用msbB基因?qū)⑦@種四環(huán)素誘導(dǎo)型BRPVero細(xì)胞毒素AB克隆到一種用于染色體整合的栽體中.24.1.栽體的構(gòu)建24，1.1.AB的擴(kuò)增與克隆利用PCR方法產(chǎn)生Vero細(xì)胞毒素AB(AB),使用的引物如下H19B-7:正向引物5，-GTGTCCATGGCTAAAACATTATTAATAGCTGCATCGC-3，(SEQIDNO:37);和QSTX-R1:反向引物:5，-GTGTCTGCAGAACTGACTGAATTGAGATG_3，(SEQIDNO:38)這些引物還含有外部Ncol(5，)及PstI(3，)限制性?xún)?nèi)切核酸醉位點(diǎn)，用于克隆到ptrc99a的NcoI和Pstl位點(diǎn)中.24.1.2.TetBRP的擴(kuò)增和克隆將TetBRP-AB構(gòu)建到中間栽體pSP72-F6/R6中.利用PCR方法產(chǎn)生TetBRP，使用的引物如下Tet-5，正向引物5，-GTGTAGATCTTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTG-3，(SEQIDNO:39)和BRP-TET-3，'.反向引物5，-CACAGGATCCTTACTGAACCGCGATCCCCG-3，(SEQIDNO:40),這些引物含有BglII(5，)和BamHI(3，)限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)，用于克隆到pSP72-F6/R6栽體的BglII和BamHI位點(diǎn)中，24.1.3.將AB亞克隆到pSP72-F6/R6-TetBRP中用BamHI和Aval限制性?xún)?nèi)切核酸醉消化ptrc99A-AB，以獲得AB，用于插入到同樣被BamHI和Aval限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化的pSP72-F6/R6-TetBRP中.pSP72F6/R6栽體含有多種限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)，可用來(lái)克隆與lacZ-a反向互補(bǔ)的部分p-gal基因.在0,8X1xTAE瓊脂糖凝膠上分析栽體(pSP72F6/R6-TetBRP)和AB插入序列，然后用Qiagen凝膠提取試刑盒進(jìn)行純化.用T4連接酶連接栽體和插入序列，再用熱休克法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a細(xì)胞中，然后將細(xì)胞鋪在含有100jig/mlAmp和40jig/mlX-gal的LB平板上.篩選具有氨芐青審素抗性和功能性p-gal基因(陽(yáng)性集落呈藍(lán)色)的陽(yáng)性克隆，24.1.4.將TetBRP-AB亞克隆到pCDV442中用Notl和Sfil限制性?xún)?nèi)切核酸醉消化pSP72F6/R6-TetBRP-AB,用于亞克隆到同樣被Notl和Sfil限制性?xún)?nèi)切醉消化的pCVD442栽體中.24.1'5.msbB染色體栽體利用白殺栽體pCVD442(DonnenbergandKaper，1991，InfectionandImmunity59:4310-4317)構(gòu)建一種能夠通過(guò)DmsbB基因與VNP20009菌林(在國(guó)際專(zhuān)利WO99/13053中又名YS1626)的染色體進(jìn)行同源重組的栽體.在VNP20009中存在msbB5，和3，端區(qū)域的部分缺失，設(shè)計(jì)PCR引物以分別產(chǎn)生這兩種產(chǎn)物(msbB-5，正向5，-GTGTGAGCTCGATCAACCAGCAAGCCGTTAACCCTCTGAC-3，(SE(JIDNO:41)和反向5，-GTGTGCATGCGGGGGGCCATATAGGCCGGGGATTTAAATGCAAACGTCCGCCGAAACGCCGACGCAC-3，(SEQIDNO:42);以及msbB-3，正向5，-GTGTGCATGCGGGGTTAATTAAGGGGGCGGCCGCGTGGTATTGGTTGAACCGACGGTGCTCATGACATCGC-3，(SE(JIDNO:43)和反向5，-GTGTCTCGAGGATATCATTCTGGCCTCTGACGTTGTG-3，(SBQIDNO:44))，這些引物還含有外部Sacl(5，)和Aval(3，)限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)，可用來(lái)克隆到pCVD442的Sacl和Sail位點(diǎn)中，當(dāng)這兩種片段通過(guò)普通的Sphl位點(diǎn)連接后，可產(chǎn)生內(nèi)部的Notl、Pacl、Sphl、Sfil、Swal和Dral,可用于將DNA片段克隆到DmsbB中，以獲得不含抗生素抗性的穩(wěn)定染色體整合(困31),該栽體被稱(chēng)為pCVD442-msbB(參考圖32和閨33).為了把Tet-BRP-AB克隆到pCVD442-msbB中，將Tet-BRP-AB質(zhì)粒DNA限制性消化并純化出適當(dāng)?shù)腄NA，再用T4連接醉將兩種成分連接.然后用連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5lpir，并根據(jù)Tet-BRP-AB的存在和取向篩選菌落，將Tet-BRP-AB轉(zhuǎn)化到SMlOlpir菌林中(Donnenbergand"per1991，見(jiàn)上文)，所得質(zhì)粒稱(chēng)為pCVD442-Tet-BRP-AB.利用PCR方法篩選含有Tet-BRP-AB基因的SMlOlpir菌落，并挑選一個(gè)pCVD442-Tet-BRP-AB的陽(yáng)性SMlOlpir菌落作為與沙門(mén)氏菌菌林結(jié)合的供體，利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Davis,R.W.,Botstein,D.，andRoth,J丄1980,AdvancedBacterialGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor)將含有pCVD442-Tet-BRP-AB的SMlOlpir與沙門(mén)氏菌YS50101菌林(四環(huán)素抗性YS82菌林(Lowetal.，1999，見(jiàn)上文)的一種天然衍生物，具有更強(qiáng)的DifcoMacConkey瓊脂抗性)結(jié)合，并在含有50pg/ml羧節(jié)青審素(carb)和300ng/ml鏈審素(strep)的平板上進(jìn)行篩選.PCR檢測(cè)所得YS50102-pCVD442-Tet-BRP-AB克隆中的pCVD442-Tet-BRP-AB基因.24.2.將染色體整合pCVD442-Tet-BRP-AB轉(zhuǎn)移到41.2.9(YS1646)中，以產(chǎn)生41.2.9-Tet-BRP-AB菌抹以YS50102-Tet-BRP-AB菌林為供體，用噬菌體P22(HT105/1int-201突變體；Davisetal.，1980)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，使41.2.9獲得羧千青審素抗性.利用pCVD442上存在的bla和sacB基因篩選含有DmsbB和DmsbB-Tet-BRP-AB基因的carbr(或amp')suc'菌林，該菌株稱(chēng)為41.2.9-pCVD-Tet-BRP-AB-l(圖33，#3)，將41,2.9-Tet-BRP-AB-l菌抹鋪在LB蔗糖平板上，以篩選不含DmsbB基因但保留DmsbB-Tet-BRP-AB基因的sucfcarb'衍生物，這里采用上文DonnenbergandKaper,1991的方法，只是LB-蔗糖瓊脂平板中不含NaCl，而且是將平板保溫于當(dāng)這些平板上長(zhǎng)出菌落后，將其按原有網(wǎng)格轉(zhuǎn)移到msbB平板上，并將復(fù)制物平鋪在含有羧芐青審素或蔗糖的平板上，以檢測(cè)不含抗生素和蔗糖標(biāo)記的克隆.用PCR方法驗(yàn)證所得克隆中存在Tet-BRP-AB基因.如此獲得的衍生物含有染色體整合Tet-BRP-AB，而且不具有蔗糖敏感型和羧千青審素抗性，這種菌林稱(chēng)為41.2.9-Tet-BRP-Vero細(xì)胞毒素AB.利用標(biāo)準(zhǔn)的U)H細(xì)胞毒性測(cè)定法(Cytotox96⑧，Promega，MadisonWisconsin)對(duì)41.2,9-Tet-BRP-Vero細(xì)胞毒素AB的細(xì)胞毒性進(jìn)行體外檢測(cè).困34顯示的結(jié)果說(shuō)明表達(dá)Vero細(xì)胞毒素的克隆26和克隆31的毒性特性與不用四環(huán)素處理相比，用四環(huán)素處理后的克隆26和克隆31具有明顯更高的細(xì)胞毒性百分率.25.實(shí)施例由定向于腫瘤的細(xì)菌表達(dá)溶血素下述實(shí)施例說(shuō)明，定向于腫瘤的細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可以組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)溶血素等溶血蛋白.眾所周知，溶血素是能夠裂解紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性蛋白(參考，例如,Beutin，1991，Med.Microbiol.Immunol180:167-182),SheA(Genbank編號(hào)EC0238954)是大多數(shù)野生型大腸桿菌中都存在的一種非正常表達(dá)的沉默溶血素(Fernandezetal.,1998，F(xiàn)EMSMicriobiolLett168:85-90).在標(biāo)準(zhǔn)PCR條件下從野生型大脈桿菌(2507睹林，YaleUniversityE，coliGeneticStockCenter)中克隆出SheA(又名hlyB;Genbank編號(hào)U57430),使用的引物如下(正向)5，-TTTTTTCCATGGCTATTATGACTGAAATCGTTGCAGATAAAACGG-3，(SEQIDNO:45)和(反向)5，-TTTTTTAAGCTTCCCGGGTCAGACTTCAGGTACCTCAAGAGTGTC-3，(SEQIDNO:46).將正確大小的PCR產(chǎn)物克隆到ptrc99a(Pharmacia)的Ncol和HindIII位點(diǎn)中，使其受部分組成型trc啟動(dòng)子調(diào)控.另外還將PCR產(chǎn)物克隆到用Ncol和EcoRV剪切的tet-bgal-Z-term栽體中(見(jiàn)上文所述).用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(Gibco),然后鋪在添加或不添加0.2jig/ml四環(huán)素的血瓊脂上(含有5S羊血的狹胨豆胨瓊脂，Biomerieux,Lombard,IL).挑取在菌落周?chē)斜硎救苎那辶習(xí)灥年?yáng)性菌落.對(duì)陽(yáng)性菌落進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒純化，然后用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化沙門(mén)氏菌YS501并再此進(jìn)行牽篩選.圖35(2A和2B)顯示trc99a構(gòu)建體的組成型牽形成，此時(shí)添加或不添加四環(huán)素都可觀測(cè)到牽.圖35(3A和3B)顯示四環(huán)素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SheA的四環(huán)素依賴(lài)型暈形成，此時(shí)不添加四環(huán)素則不形成暈.這些結(jié)果說(shuō)明，定向于腫瘤的細(xì)菌即可以組成型表達(dá)溶血蛋白，也可以誘導(dǎo)型表達(dá)溶血蛋白.26.實(shí)施例由定向于腫瘤的細(xì)苗表達(dá)甲硤氨酸蘇下述實(shí)施例說(shuō)明，沙門(mén)氏菌等定向于腫瘤的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)甲疏氨酸醉.甲疏氨酸酶是降解甲疏氨酸的一種醉，甲硫氨酸是腫瘤生長(zhǎng)所需的一種必需氨基酸.利用純化甲硤氨酸酶給藥或編碼甲疏氨酸醉的DNA或病毒栽體的給藥來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法已有所描述(XuandTan的國(guó)際專(zhuān)利WO00/29589).但XuandTan沒(méi)有提到用腫瘤特異性細(xì)菌栽體遞送甲硫氨酸醉的方法，也沒(méi)有指出用純化蛋白進(jìn)行治療需要使用大量的甲疏氨酸醃，可將甲硫氨酸酶直接遞送至腫瘤的新方法是用定向于肺瘤的細(xì)菌來(lái)表達(dá)這種睞.利用下述引物產(chǎn)生Genbank編號(hào)L43133的Pneudomasputida甲硫氨酸酶正向METH-XHOI5，-CCGCTCGAGATGCACGGCTCCAACAAGCTCCCA-3，(SEQIDNO:47);和反向METH-BAM5，-CGCGGATCCTTAGGCACTCGCCTTGAGTGCCTG-3，(SEQIDNO:48)通過(guò)PCR方法以假單孢菌單菌落為模板用上述引物擴(kuò)增出甲硫氨酸酶序列，PCR的條件如下l個(gè)循環(huán)94TC5分鐘，然后是35個(gè)循環(huán)94匸l分鐘，60TCl分鐘，721C2分鐘.PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增步驟是72TC，IO分鐘.在0.lxTAE瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，并鑒定具有甲硫氨酸酶預(yù)期大小(~1196bp)的PCR產(chǎn)物.從膠上切下這條帶，然后用Qiagen凝膠提取試刑盒進(jìn)行純化.用限制性酶Xhol和BamHI消化pSP72栽體和上述凝膠分離純化的甲硫氨酸醉基因.然后在lxTAE瓊脂糖凝膠上對(duì)消化的栽體和甲硫氨酸酶基因進(jìn)行分析.從凝膠上切下相當(dāng)于線(xiàn)性化栽體和甲硫氨酸酶消化基因的消化產(chǎn)物，并用Qiagen凝膠抽提試刑盒進(jìn)行純化.用T4連接酶連接線(xiàn)性化栽體和插入序列(甲疏氨酸酶).再用熱休克法將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a細(xì)胞中.然后將恢復(fù)的細(xì)胞鋪在含有100ng/ml氨千青審素(Amp)的LB培養(yǎng)基上，以篩選含有完整pSP72栽體的細(xì)胞.挑取Amp抗性菌落，并用Qiagenmini-prep試刑盒制備質(zhì)粒，然后用EcoRI和BspHI限制性醉進(jìn)行消化，以證實(shí)含甲疏氨酸酶基因pSP72栽體的存在.將笫9號(hào)克隆送至YalesequencyingFacility,YaleUniversitySchoolofMedicine進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序時(shí)采用SP6(正向)和T7(反向)測(cè)序引物.結(jié)果表明，除終止密碼子TGA在PCR時(shí)被改為T(mén)AA外，其余序列與發(fā)表的甲疏氨酸醉序列匹配，甲疏氨酸醉活性的測(cè)定可采用Horietal.，1996，CancerResearch56:2116-2122中描述的甲碟氨酸醉測(cè)定法.27.實(shí)施例以TAT融合體形式在定向于腫瘤的咸毒細(xì)苗中表達(dá)凋亡素胥白下述實(shí)施例說(shuō)明，定向于腫瘸的減毒細(xì)菌經(jīng)過(guò)加工可表達(dá)和分泌含有效應(yīng)分子和諸如TAT、觸角足同源域、VP22及卡波西FGFMTS等運(yùn)送肽的融合蛋白.27,1.TAT-凋亡素栽體的構(gòu)建已知由腺病毒栽體遞送的金絲雀病毒(CAV)蛋白凋亡素可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的消亡(參考，例如，Notebornetal.,1999，GeneTherapy6:882-892).將凋亡素蛋白與來(lái)自人免疫缺陷病毒(HIV)TAT蛋白的一種肽融合，以產(chǎn)生一種能夠在沙門(mén)氏菌細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄，然后可被運(yùn)輸?shù)诫狭黾?xì)胞的細(xì)胞核從而引起凋亡的蛋白(參考，例如，Schwartzeetal.,1999，Science285:1569-1572).另外還發(fā)現(xiàn)，TAT蛋白融合體與多聚組氨酸(六聚組氡酸)融合后仍具有功能，而多聚組氨酸能夠增加正電荷，從而有利于蛋白純化(Schwartzeetal.，1999,見(jiàn)上文)，所以還產(chǎn)生了含有六聚組氨酸和不含六聚組氨酸的TAT-凋亡素融合蛋白(圖36A和B).此外，還可以產(chǎn)生含有0帥A-8L信號(hào)序列和不含0mpA-8L信號(hào)序列的TAT-凋亡素融合蛋白(圖36A和C).利用重疊寡核苷酸組裝凋亡素和六聚組氨酸凋亡素.PCR產(chǎn)生凋亡素的編碼核酸序列，使用的寡核苷酸如下TAP1:5，，GATCCCATGGC丁TATGGCAGAAAAAAACGCCGTCAGCGCCGTCGCATGAACGCGCTGCAGGAAGATACCCCGCCGGGCCCGTCCACCGTGTTTCGCCCGCCG-3'(SEQIDNO:49)TAP2:5'-GGGACAGGGTGATGGTGATGCCCGCGATGCCG八TGCGGATTTCGCGGCAATGCGGGGTTTCCAGCGGGCGGGAGGAGGTCGGCGGGCGAAACACGGTGGACGG-3，(SEQIDNO:50)TAP3:5'-GGCATCGCGGGCATCACCATCACCC丁GTCCCTGTGCGGCTGCGCGAACGCGCGCGCGCCGACCCTGCGCTCCGCGACCGCGGAT八ACTCCGAAAACACCGGC-3,(SEQIDNO:51)'丁AP4:5，-GCGATATTCGGACGGATCGCAGGAGCGTTTTTTGGACGGCGGTTTCGGCTGA丁CGGTGCGCAGATCCGGGACGTTTTTAAAGCCGGTGTTTTCGGAGTTATCCGCGGTCGC-3,(SEQ!DNO:52)TAP5:5'-CC丁GCGATCCGTCCGAATATCGCGTCTCCGAACTGAAAGAATCCCTGATCACCACCACCCCGTCCCGCCCGCGCACCGCCCGCCGCTGCATCCGCCTCTGAAAGCTTCATG-3'(SEQIDNO:53)TAP6:5,-CATGAAGCTTTCAGAGGCGGATGCAGCGGCGGGCGGTGCGC-3'(S￡QIDNO:54)用TAP2-TAP6寡核苷酸和TAP6H1寡核苷酸(5，-GATCCCATGGCTCATCACCATCACCACCATTATGGCCGCAAAAAACGCCGTCAGCGCCGTCGCATGAACGCGCTGCAGGAAGATACCCCGCCGGGCCC-3，;SEQIDNO:55)產(chǎn)生含有六聚組氨酸的TAT-凋亡素融合蛋白的編碼核酸序列.通過(guò)PCR方法用TAP6寡核苷酸和omp8LFl寡核苷酸(5，-GATCCCATGGCTAAAAAGACGGCTCTGGCGCTTCTGCTCTTGCTGTTAGCGCTGACTAGTGTAGCGCAGGCCTATGGCCGCAAAAAACGCCGTCAGCGCC-3，；SEQIDNO:56)從TAP1-TAP6的PCR產(chǎn)物中獲得含有0mpA8L的TAT-凋亡素融合蛋白的編碼核酸序列.將每種寡核苷酸配成濃度為4fiM的儲(chǔ)液.反應(yīng)采用預(yù)混的PCR反應(yīng)珠(Pharmacia,Ready-to-godeads),每種寡核苷酸使用2jil,PCR反應(yīng)包括l個(gè)循環(huán)951C5分鐘；35個(gè)循環(huán)95t:1分鐘，601Cl分鐘，72TCl分鐘；和l個(gè)循環(huán)72"CIO分鐘.然后對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，重溶于水，并用Ncol和HindIII進(jìn)行限制性消化.利用凝膠電泳方法對(duì)限制性消化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，從凝膠上切下具有正確大小的產(chǎn)物(TAT-凋亡素和六聚組氡酸-TAT-凋亡素分別約為420bp和450bp),然后用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分離.將這些產(chǎn)物與Ncol和HindIII消化的ptrc99a(Pharmacia)連接，即獲得ptrc99a-TAT-凋亡素構(gòu)建體.獲得的DNA序列分別為正確的TAT-凋亡素(困37)和六聚組^酸-TAT-凋亡素(困38).27.2.TAT-凋亡素分泌和攝取的證明通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法(如熱休克或電穿孔方法)用ptrc99a-TAT-凋亡素構(gòu)建體轉(zhuǎn)化定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，然后在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng).利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(如蛋白印跡分析或EUSA)檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)物上清液中是否存在TAT-凋亡素，若證實(shí)細(xì)菌培養(yǎng)物的上清液中存在TAT-凋亡素，則將細(xì)菌培養(yǎng)物的上清液與哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如NIG3T3、CHO、293和293T細(xì)胞)共保溫，并利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的凋亡素測(cè)定法證實(shí)細(xì)胞中存在TAT-凋亡素.27.3.腫瘤內(nèi)TAT-凋亡素?cái)z取的證明用經(jīng)過(guò)加工而表達(dá)TAT-凋亡素或凋亡素的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌對(duì)B16腫瘤模型進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥.將細(xì)菌給藥數(shù)天后，處死小鼠并測(cè)定器官重重.利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的凋亡測(cè)定方法(如DNA分梯和熒光素原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試刑盒(BoehringerMannheim,Mannheim,Germany))檢測(cè)肺瘤內(nèi)TAT-凋亡素或凋亡素的存在和定位，此外還測(cè)定肺瘤的大小，以確定TAT-凋亡素的抗肺痗活性.另外還將腫瘤勻漿并鋪板培養(yǎng)，以測(cè)定集落形成定位(c.f,u.),28.實(shí)施例VNP20009與化療劑的組合對(duì)小鼠中M27肺癌生長(zhǎng)的效力下述實(shí)施例說(shuō)明，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌與化療刑的組合給藥可以協(xié)同抑制或加成抑制肺癌等實(shí)體痗的生長(zhǎng).28.1,VNP20009與環(huán)磷酰胺的組合或VNP20009與絲裂窠素C的組合對(duì)小鼠中M27肺癌生長(zhǎng)的效力于371C將液氮保存的M27鼠肺癌細(xì)胞(1x107mlx1ml)快速融解，使其恢復(fù)，然后于371C、C02的條件下培養(yǎng)在10ml含有10X胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中，在細(xì)胞兩次傳代后，將對(duì)數(shù)期的M27細(xì)胞通過(guò)胰蛋白酶消化進(jìn)行分離，lxPBS清洗，然后以2.5x10'細(xì)胞/ml的濃度重懸在lxPBS中，用于植入腫瘤.第O天，將M27細(xì)胞懸浮液植入100只C57BL/6小鼠(雌性，8周齡，20g;5><105細(xì)胞/鼠)的右肋皮下.將小鼠隨機(jī)分成10組，每組IO只.通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的稀釋方法用1xPBS將沙門(mén)氏菌VNP20009菌林稀釋至5xl06CFU/ml,第12天時(shí)，按照下表6用0.2ml稀釋的沙門(mén)氏菌(1xlO'CFU/鼠)對(duì)每只小鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥.為了確定細(xì)菌的實(shí)際注射量，將5>U06CFU/ml的細(xì)菌懸浮液進(jìn)一步稀釋到1x103CFU/ml,并鋪在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上(MsbB平板；國(guó)際專(zhuān)利WO99/13053).笫二天對(duì)形成的菌落計(jì)數(shù).按照下表7用絲裂霉素C(Sigma)和環(huán)磷跣胺(Sigma)對(duì)小鼠進(jìn)行給藥.笫22天時(shí)，對(duì)組合給藥組進(jìn)行絲裂審素C的2次給藥，但只用絲裂審素C處理的組由于腫瘤過(guò)大而沒(méi)有2次給藥.當(dāng)在VNP20009+環(huán)礴酜胺處理組中觀測(cè)到嚴(yán)重的毒性反應(yīng)時(shí)，對(duì)只用VNP卩0009處理或用VNP20009+化療刑處理的各組小鼠進(jìn)4亍200邁pk的Cipro(BayerInc.,WestHaven,CT)處理.每周2次測(cè)量肺瘤體積，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束.每天觀察動(dòng)物的行為、外觀和死亡率.小鼠始終保持在清潔的恒溫實(shí)驗(yàn)室中，動(dòng)物窩墊每周更換2次，并且為小鼠提供充足的食物和飲用水，表7<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>如困39所示，VNP20009+環(huán)鱗酰胺組合處理對(duì)M27肺癌生長(zhǎng)的抑制要強(qiáng)于只用VNP20009或只用環(huán)磷酰胺處理.如困40所示，7^20009+絲裂審素C組合處理對(duì)M27肺癌生長(zhǎng)的抑制要強(qiáng)于只用絲裂審素C處理.但VNP20009+絲裂審素C組合處理對(duì)M27肺癌生長(zhǎng)的抑制并不強(qiáng)于只用VNP20009處理(圖40).這些結(jié)果表明，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌與化療刑的組合給藥可以協(xié)同抑制或加成抑制肺癌等實(shí)體病的生長(zhǎng).28.2.VNP20009與順鉑的組合對(duì)小鼠中M27肺癌生長(zhǎng)的效力于37X:將液氮保存的M27鼠肺癌細(xì)胞(1x10Vmlxlml)快速融解，使其恢復(fù)，然后于37X:、COz的條件下培養(yǎng)在25ml含有10X胎牛血清(FCS)的DMEM培養(yǎng)基中，在細(xì)胞兩次傳代后，將對(duì)數(shù)期的M27細(xì)胞(約90-95X的飽和度)通過(guò)胰蛋白醉消化進(jìn)行分離，lxPBS清洗，然后以2.5x10'細(xì)胞/ml的濃度重懸在1xPBS中，用于植入腫瘤.笫0天，將M27細(xì)胞懸浮液(O.2ml)植入36只C57BL/6小鼠(雌性，8周齡，20g;5><105細(xì)胞/鼠)的右肋皮下，將小鼠隨機(jī)分組，每組9只.通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的稀釋方法用1xPBS將沙門(mén)氏菌VNP20009菌林稀釋至5xl06CFU/ml.笫12天時(shí),按照下表8用0.2ml沙門(mén)氏菌(1x106CFU/鼠)對(duì)每只小鼠進(jìn)行尾部靜脈給藥.為了確定細(xì)菌的實(shí)際注射量，將5xl06CFU/ml的細(xì)菌懸浮液進(jìn)一步稀釋到1x103CFU/ml，并鋪在MsBb平板上.笫二天對(duì)形成的菌落計(jì)數(shù).第14天時(shí)，也就是細(xì)菌注射2天后，將順鉑給藥于小鼠(下表8).給藥前用正常的生理鹽水將順鉑稀釋成0.5mg/ml.每周2次測(cè)量腫瘤體積，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束.每天觀察動(dòng)物的行為、外觀和死亡率.小鼠始終保持在清潔的恒溫實(shí)驗(yàn)室中.動(dòng)物的窩墊每周更換2次，并且為小鼠提供充足的食物和飲用水.表8<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>如困41所示，VNP20009+順鉑組合處理對(duì)M27肺癌生長(zhǎng)的抑制要強(qiáng)于只用VNP20009或只用順鉑處理，這些結(jié)果表明，定向于腫瘤的減毒細(xì)菌與順鉑等化療刑的組合給藥可以協(xié)同抑制或加成抑制肺癌等實(shí)體瘤的生長(zhǎng).本發(fā)明的范圍并不局限于文中描述的特別實(shí)施方案.實(shí)際上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員從上文的描述和附困中可以看出，本發(fā)明除上文所述之外還有多種不同的變化.這些變化將被包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)，文中引用了很多出版物，其公開(kāi)內(nèi)容均完整引入，以供參考.序列表<110>維昂藥品公司<120>用于將效應(yīng)分子定向遞送至腫瘤的組合物及方法<130>8002-059-001<140〉<141〉<150〉60/157,581<〗51>1999-10-04<150>60/157,637<151〉1999-10-04<160>61<170〉FastSEQforWindowsVersion3.0<210〉1<211〉26<212〉瞧<213>人工序列<220><223〉正向引物<400〉1gaagatcttccggaggaggggaaatg26<210〉2<211〉44<212>DNA<213〉人工序列<220><223>反向引物<400>2cgggatccgagctcgagggcccgggaaaggatctaagaagatcc44<210>3<211>477<212>隨<213〉人(Homosapiens)<220〉<221>CDS<222〉(1)…(474)<400〉3atggtacgtagetectctcgcactccgtecgataagccggttgetcat48MetValArgSerSerSerArgThrProSerAspLysProValAlaHis151015gtagttgetaaccctcaggcagaaggtcagctgcagtggctgaaccgt96ValValAlaAsnProGinAlaGluGlyGinLeuGinTrpLeuAsnArg202530cgcgetaacgccctgctggcaaacggcgttgagetccgtgataaccag144ArgAlaAsnAlaLeuLeuAlaAsnGlyValGluLeuArgAspAsnGin354045etcgtggtaccttctgaaggtctgtacctgatetattctcaagtactg192LeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeulieTyrSerGinValLeu505560ttcaagggtcagggctgcccgtegactcatgttctgctgactcacacc240PheLysGlyGinGlyCysProSerThrHisValLeuLeuThrHisThr65707580ateagecgtattgetgtatcttaccagaccaaagttaacctgctgage288lieSerArglieAlaValSerTyrGinThrLysValAsnLeuLeuSer859095getateaagtctccgtgccagcgtgaaactcccgagggtgcagaagcg336AlalieLysSerProCysGinArgGluThrProGluGlyAlaGluAla100105110aaaccatggtatgaaccgatetacctgggtggcgtatttcaactggag384LysProTrpTyrGluProlieTyrLeuGlyGlyValPheGinLeuGlu115120125aaaggtgaccgtctgtecgcagaaateaaccgtcctgactatetagat432LysGlyAspArgLeuSerAlaGlulieAsnArgProAspTyrLeuAsp130135140ttcPhe145taagetgaatctggccaggtgtacttcggtattategcactgAlaGluSerGlyGinValTyrPheGlylielieAlaLeu150155474Met1ValArgLeuPhe65lieAlaLysLysPhe145<210>4〈211〉158<212〉PRT<213>人(Homosapiens)<400〉4ValArgSerValAlaAsn20AlaAsn35ValVal50LysSerlieProGly130AlaGlyArgLysTrp115AspGluAlaProGinlieSer100TyrArgSerSerSer5ProGinLeuLeuSerGluGlyCys70AlaVal85ProCysGluProLeuSerGlyGin150ArgThrProSerAsp10AlaGluGlyGinLeu25AlaAsnGlyVal40LeuTyrLeuGly55ProSerGinlieAla135ValGlulieSerThrHisTyrGinThr90ArgGluThr105TyrLeuGly120GlulieAsnTyrPheGlyVal75LysProGlyArglie155GinLeuTyr60LeuValGluValPro140lieProTrpArg45SerLeuAsnGlyPhe125AspAlaValAlaHis15LeuAsn30AspAsnGinValThrHisLeuLeu95AlaGlu110GinLeuTyrLeuLeuArgGinLeuThr80SerAlaGluAsp<210〉<211><212><213>528DNA人工序列<220〉<223〉正向引物<400>5ccgacgcgttgacacctgaaaactggag477<210〉<211〉<212〉<213>629DNA人工序列<220><223>反向引物<400>6ccgacgcgtgaaaggatctcaagaagatc29<210>7<211〉543<212>瞧<213〉人工序列<220〉〈223〉融合構(gòu)建體<221>CDS<222〉(1).(540)<400>7atgaaaaagacagetategcgattgcagtggcactggetggtttcget48MetLysLysThrAlalieAlalieAlaValAlaLeuAlaGlyPheAla151015accgtagcgcaggcccatatggtacgtagetectctcgcactccgtec96ThrValAlaGinAlaHisMetValArgSerSerSerArgThrProSer202530gataagccggttgetcatgtagttgetaaccctgcagaaggtcag144AspLysProValAlaHisValValAlaAsnProGinAlaGluGlyGin354045ctgcagtggctgaaccgtcgcgetaacgccctgctgaacggcgtt192LeuGinTrpLeuAsnArgArgAlaAsnAlaLeu匕euAlaAsnGlyVal505560gagetccgtgataaccagetcgtggtaccttctg肌ggtctgtacctg240GluLeuArgAspAsnGinLeuValValProSerGluGlyLeuTyrLeuatetattctcaagtactgttcaagggtcagggctgcccgtegactcatlieTyrSerGinValLeuPheLysGlyGinGlyCysProSerThrHis859095288gttctgctgactcacaccateagecgtattgetgtatcttaccagaccValLeuLeuThrHisThrlieSerArglieAlaValSerTyrGinThr100105110336aaagttaacctgctgagegetateaagtctccgtgccagcgtgaaactLysValAsnLeuLeuSerAlalieLysSerProCysGinArgGluThr115120125384cccgagggtgcagaagcgaaaccatggtatgaaccgatetacctgggtProGluGlyAlaGluAlaLysProTrpTyrGluProlieTyrLeuGly130135140432ggcGly145gtaValtttPheGinctgLeugagGlu150aaaggtgaccgtLysGlyAspArgctgLeu155tecSergcaAlag肪GluatelieaacAsn160480cgtcctgactatetagatttcgetgaatctggccaggtgtacttcggtArgProAspTyrLeuAspPheAlaGluSerGlyGinValTyrPheGly165170175528attlieateliegcaAlactgLeu180taa543<210>8<211〉180<212〉PRT<213〉人工序列<220〉<223>融合構(gòu)建體<400〉8MetLysLysThrAlalieAlalieAlaValAlaLeuAlaGlyPheAla151015ThrValAlaGinAlaHisMetValArgSerSerSerArgThrProSer202530AspLysP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140PheAlaGinSerlielieSerThrLeuThr145150<210>13<211〉465<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉融合構(gòu)建體〈221〉CDS〈222〉(l),.，(462)'<400〉13atgaaacagtcgactMetLysGinSerThr15agtgtggccaaagcgSerValAlaLysAla20ctgcaattggagcatLeuGinLeuGluHis35ateaataactacaaglieAsnAsnTyrLys50ttctacatgccgaaaPheTyrMetProLys65gaagaggaactgaagGluGluGluLeuLys85aagaacttccacctg133ctgLeugcgcttctgAlaLeuLeuetcttgctgLeuLeuLeu10ttaLeugcgctgactAlaLeuThr1548getAlacctactageProThrSer25tcgageactSerSerThr卿Lys肌aactc犯LysThrGin3096ctgLeuctgctggatLeuLeuAsp40ctgcagatgLeuGinMetlie45ctg貼tggcLeuAsnGly144aacAsncctaagctgProLysLeu55actcgcatgThrArgMet60ctgleuactttcaaaThrPheLys192卿Lys70getaccgagAlaThrGluetcaaacatLeuLysHis75etcLeucagtgcctgGinCysLeu80240ccgctggaggaagtacttaacProLeuGluGluValLeuAsn90ctggcacagtctLeuAlaGinSer95288cgtccgcgtgacctgatetecaacateaatgtaLysAsnPheHisLeuArgProArgAspLeulieSerAsnlieAsnVal100105110ategttcttgagctgaagggatecgaaaccaccttcatgtgcgaatac384lieValLeuGluLeuLysGlySerGluThrThrPheMetCysGluTyr115120125getgacgaaaccgccaccattgtggagttcctgaaccgttggateacc432AlaAspGluThrAlaThrlieValGluPheLeuAsnArgTrplieThr130135140tttgcccaategateattageacgttaacttaa465PheAlaGinSerlielieSerThrLeuThr145150<210>14<2U>154<212〉PRT<213〉人工序列<220><223>融合構(gòu)建體<400>14MetLysGinSerThrLeuAlaLeuLeuLeuLeuLeuLeuAlaLeuThr151015SerValAlaLysAlaAlaProThrSerSerSerThrLysLysThrGin202530LeuGinLeuGluHisLeuLeuLeuAspLeuGinMetlieLeuAsnGly354045lieAsnAsnTyrLysAsnProLysLeuThrArgMetUuThrPheLys505560PheTyrMetProLysLysAlaThrGluLeuLysHisUuGinCysLeu65707580GluGluGluLeuLysProLeuGluGluValLeuAsnLeuAlaGinSer859095LysAsnPheHisLeuArgProArgAspLeulieSerAsnlieAsnVal100105U0lieValLeuGluLeuLysGlySerGluThrThrPheMetCysGluTyrU5120125AlaAspGluThrAlaThrlieValGluPheUuAsnArgTrplieThr130135140PheAlaGinSerlielieSerThrLeuThr145150<210>15<211>26<212>睡<213>人工序列<220〉<223〉正向引物<400>15agtctagacaatcaggcgaagaacgg26<210〉16<211〉25<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>反向引物<400〉16agccatggagtcaccctcacttttc25<210〉17<211〉31<212〉畫(huà)<213>人工序列<220><223>正向引物"00〉17ggatccttaagacccactttcacatttaagt<210>18<211>28<212>眺<213〉人工序列31<220><223>反向引物<400>18ggttccatggttcacttttctctatcac28<210>19<211〉33<212>瞧〈213〉人工序列<220><223〉正向引物<400〉19gtgtccatggggcacagccaccgcgacttccag<20〉20<211>34<212〉隨<213〉人工序列<220〉<223〉反向引物<400〉20acacgagctcct.acttggaggcagtcatgaagct3334<210>21<211>72<212〉瞧<213>人工序列<220〉<223〉正向引物<400>21gtgtccatggctcggcgggcaagtgtcgggactgaccatcatcatcatcatcatcacagc60caccgcgacttc72<210>22<211〉35<212〉碰<213〉人工序列<220〉<223>反向引物<400〉22gtgcggatccctacttggaggcagtcatgaagctg35<210>23<211〉16<212>PRT<213〉人(Ho邁osapiens)<400〉23MetAlaArgArgAlaSerValGlyThrAspHisHisHisHisHisHis151015<210〉<211〉<212〉<23>2422PRT人工序列<220><223>TiP13.40的肽序列<400>24TyrArgTrpAla1ValValMetTyr20ArgLeuSerHisArgProLysThrGlyPhelieArg51015GluGly<210〉<211〉〈212〉<213>2566薩人工序列<220><223>編碼TiP13.40的核苷酸序列<400>25gcgtaccgctggcgcctgtcccatcgcccgaaaaccggctttatccgcgtggtgatgtac6066<210>26<211〉101<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>寡核苷酸<400>26gtgtactagtgtggcgcaggcggcgtaccgctggcgcctgtcccatcgcccgaaaaccgg60ctttatccgcgtggtgatgtacgaaggctaaggatccgcgc101<210〉27<211>101<212>纖<213>人工序列<220〉<223〉寡核苷酸<400>27gcgcggatccttagccttcgtacatcaccacgcggataaaacaggcgccagcggtacgccgcctgcgccacactagtacagccggttttcgggcgatggg60c101<210〉28<211〉101<212>PRT<213〉人(Homosapiens)Met1LeuAlaGinPro65LysLys<400>SerSerGlyGluVal50HislieLeuLeuGlu35ArgCysCysLeu28Alaleu20AspProProLeuGlu100Ala5LeuGlyArgThrAsp85SerGlyPheCysLeuProLeuAspLeuGin40HislieThr55AlaGinLeuAlaSerArg10ValValAla25CysLeuCysSerLeuGlulieAlaThr7075LeuGinAlaProLeuTyr90ProGlyPheAlaValLys45Vallie60LeuLysLysLysLeuLeuPhe15SerAlaGlu30ThrThrSerLysAlaGlyAsnGlyArg80lielieLys95<210>29<211〉106<212〉瞧<213>人工序列〈220〉<223>寡核苷酸<400〉29cttcactagtgtggcgcaggcgaacggccgcaaaatctgcctggacctgcaggcgccgct60gtacaaaaaaatcatcaaaaaactgctggaaagctaaggatccgcg106<210〉30<211〉106<212〉歸<213>人工序列<220><223〉寡核苷酸<400〉30cgcggatccttagctttccagcagttttttgatgatttttttgtacagcggcgcctgcag60gtccaggcagattttgcggccgttcgcctgcgccacactagtgaag106<210〉31<211>85<212〉PRT<213〉人(Homosapiens)<柳〉31lieTyrSerPheAsp15GinLysVallieTrp20AspAsnTyrCysGlu35LeuAlaSerProLeu50SerCysAlaAsnArg65ThrAspAlaArgLys85<210〉32<211〉44<212>DNA<213〉人工序列<220〉139GlyArgAsplieMetThrAspProSerTrpPro1015HisGlySerSerProHisGlyValArgLeuVal2530AlaTrpArgThrAlaAspThrAlaValThrGly4045SerThrGly匕yslieLeuAspGinLysAlaTyr5560LeulieValLeuCyslieGluAsnSerPheMet707580<223>寡核苷酸<400〉32ggcttcactagtgtggcgcaggcgatatactcctttgatggtcg44<210〉33<211〉37<212>瞧<213〉人工序列<220><223>寡核苷酸<400〉33cgcggatccttacttcctagcgtctgtcatgaaactg37<210〉34<211>7117<212>腿<213〉大腸桿菌(E.coli)<400>34cccgggcacttccggggcatgagtatgtgatatccggggctgcaccccggaccccgccaa60cacatcacgggccacaaaattttttgtggcccgctctgcgttttctaagtgttatccctc120ctgatttctaaaaaattttccacctgaacttgacag幼aaaacgatgacgagtacttttt180gatctgtacataaacccagtggttttatgtacagtattaatcgtgt幼tc站ttgtttta240acgcttaaaagagggaatttttatgagcggtggcgatggacgcggccataacacgfegcgc300gcatagcacaagtggtaacattaatggtggcccgaccgggcttggtgtaggtggtggtgc360ttctgatggctccggatggagttcggaaaataacccgtggggtggtggttccggt叫cgg420cattcactggggtggtggttccggtcatggtaatggcggggggaatggtaattccggtgg480tggttcgggaacaggcggtaatctgtcagcagtagctgcgccagtggcatttggttttcc540ggcactttccactccaggagctggcggtctggcggtcagtatttcagcgggagcattatc600ggcagctattgctgatattatggctgccctgaaaggaccgtttaaatttggtctttgggg660ggtggctttatstggtgtattgccatcacaaatagcgaaagatgaccccaatatgatgtc720aaagattgtgacgtcattacccgcagatgatattactgaatcacctgtcagttcattacc780tctcgataaggcaacagtaaacgtaaatgttcgtgttgttgatgatgtaaaagacgagcg840acagaatatttcggttgtucaggtgttccgatgagtgttccggtggttgatgcaaaacc900taccgaacgtccgggtgtttttacggcatc肌ttccaggtgcacctgttctgaatatttc960agtacgccagcagtacagacattaagcccaggtgttacaaat肌tactga1020taaggatgttcgcccggcaggatttactcagggtggtaataccagggatgcagttattcg1080attcccgaaggacagcggtcataatgccgtgtgagtgatgttcttagccc1140tgaccaggtaaaacaacgtcaagatgaagaaaatcgccgtcagcaggaatgggatgctac畫(huà)gcatccggttgaagcggctgagcgaaattatgaacgcgcgcgtgcagagctgaatcaggc1260aaatg肌gatgttgccagaaatc柳agcgacaggctaaagctgttcaggtttataattc1320gcgt肪幼gcgaacttgatgcagcgaataaaactcttgctgatgcaatagctga幼taaa1380acaattt幼tcgatttgcccatgacccaatggctggcggtcacagaatgtggcaaatggc1440cgggcttaaagcccagcgggcgcagacggatgta站taataagcaggctgcatttgatgc1500tgctgca肌agagaagtcagatgctgatgctgcattgagttctgcUtgg1560gaagaaagaagat貼gaaaaggagtgctgaaaat幼tttaaacgatgaaa1620caga肌aggttttaaagattacgggcatgattatcatccagctccgaaaactgagaatat1680t肌agggcttggtgatcttaagcctgggataccaaaaacaccaaagcagaatggtggtgg1740aaaacgcaagcgctggactgg叫ataaagggcgtaagatttat柳tgggattctcagca1800tggtg柳ttgaggggtatcgtgccagtgatggtcagcatcttggctcatttgaccctaa1860aacaggcaatcagttgaaaggtccagatccgaaacgaaatatctttgaga1920ggaagtutgggacttaaattggatttaacttggUtgataaaagtacagaagattttaa1980gggtgaggagtattcaaaagattttgg叫atgacggttcagttatgga肪gtctaggtgt2040gccttttaaggataatgttaat犯cggttgctttgatgttatagctgaatgggtaccttt2100gctac肌ccatactttaatcatcaaattgatatttccgataatgagtattttgtttcgtt2160gatggtgattggtgatcaaatattatcagggatgagttgatatacgggct2220tctagtgttcatggatgaacgctggagcctccaaatgtagaaatgttatattttttattg2280agttcttggttataattgctccgcaatgatttaaataagcattatttaaaacattctcag2340gagaggtgaaggtggagcta幼aaaaagtattggtgattacactga幼ccgaattcaaaa2400aatttattgaaattgtgaaggtgatg幼aaaaaacaggatgataacctcg2柳agtattttataaatgttsctgagcatcctagtggttctgatctgatttat2520gtaataatgatggUgccctg肌ggtgttatt肌agagattaaagaatggcgagccgcta2580acggtaagtcaggatttaaacagggctg犯atatgaatgccggttgtttatggstgaatg2640gctggcattctttcacaacaaggagtcgtttaacagggattattttattg2700cttcttgcagtcattattctgtctgcatgtcaggc祖actatatccgggatgttcagggc2760ggg咖gtatctccgtcatcaacagctgaagtgaccggattagc犯cgcagtaacccgaa2820atcctctttgac幼aaacaaagcgtgtcaggctgattctgatgcgctttttttttgaaat2880gtcaca犯犯Uccatgtgggagatgggatctaaaatcctcgtgcagaactttccatcca2,acttgtcgttttgagccgttcggtgttcagaacgcacgaaaccgatcgcg3000cgcatcgctttcgtgaatagttatgcaggcccctgaaaacgattctgacgcgttttttcg3060gUUgcctggtgttttcctgtctttttgcgtttUtgcgtcagaacgcgtctgagggcg3120ttUaaggggtgcgtacaacgggagttatggtaaatggatcggtttttcgggaaggatcg31803c3ggatttgccgttgggtgtagtgtaagcgactg肌aaaC幼ElCgCCCCgtaaatcgtg3240ctctcaccgccaagattgatcacgaaattacagggcgccgggttccgcgtttcccgatgg3300ga肌gcgcggttagttaaactgtgtaccgagagaaatcgtatcacatgagcgccgtactt3360caacgcttcagggaaaaattaccgcacaaaccgtactgtacgaacgatttcgcgtacggc3420gttcgcattctgccgaaaaacattgccattcttgcccgtttcatccagcagaaccagcca3480catgcactgtactggcttccctttgacgtggaccggacgggggcatcaatcgactggagc3540gaccggaattgtccggccccgaacatcaccgta肌aaatccccgt幼cgggcacgcgcat3600ctgctctacgcgctcgcccttcctgtgagaactgcgccggatgcatcggcttcggcgctc3660agatacgctgccgctattgagcgtgcgttgtgtgaaaaactgggcgcggatgtgaattac3720agcggcctgatctgcaaaaatccgtgccaccctgaatggcaggaagtggaatggcgcgag3780gaaccctacactctcgacgaactggctgattatctcgatttgagcgcctcagcgcgccgt3840agcgtcgataaaaattacgggctggggcgaaactgctatctgttcgaaaagggccgtaaa3900tgggcttaccgggctattcgtcagggctggccggcattctcacaatggcttgatgcggtg3960attcagcgtgtcgaaatgtacaacgcatcgctccccgttccgctttcacctcctgaatgt4020cgggctattggcaagagtattgcgaaatacacgcacaggaacttcacgccggaaactttc4080gcacagtatggcacacgccagaaattcaggctacacgcggtcgc幼gggc4140ggttctaagtctaagcgcggcacagtagctacatcagcacgcacgctgaaaccttgggag4200aaattagggatcagtcgcgcctggtattaccaactgaaaaaacgaggtctcgtagagtag4260accaaataagcctatatcagataacagcgcctttttggcgcctttttgagcagcttggtt4320tgttgctatttccctogttgaatcccgcaatggcgcggctttccgcatgattgaggtggt4380agcgctcgccgcagtctcatgaccgagcgtagcgagcgaatgagcgaggaagcgcaaagg4440cgtccggtggtgcatgtggcacttacgcgccggggcttagtggUctgcggtUcgccgg4500tggtctgggtagcttctccagctcgttaatcagcggttgtagtcggttcacatccacctg4560tcttgtgacttcctttcgcag幼actggagcagg肌cgcacgcagttgcgcttcttccgg4620cctccgtacccttgccagcatggetgcccccacaatgactttttgcgccgtgtccaggct4680tcggctcttcgccttcaggcgctgtaatctggcctcagcttcggcaatcttctgttcgag4740tgttctgctcatUcgtgactccgtgcgcggtgaaaaatcgcattttagcgcgtcactgg4800tagtttaa肌actaaactggcataatgcacggcacatcacgaagtgcgcacttatacaeit4860ctccacttcgtttcgattgtgtgcggtctgcgacgctaaaag肌肌cggcaaaaaggcat4920tacggcag肌atggcgatttatcatctcagcatga貼atcatttcgcgaaaaaacggcta4980cagtgctgttgcttctgctgcctaccgttccggctctgtcatacccgatgaccgtaccgg5040attaatccacgattacacccgtaaacgcggcgttgatgatgcggtcattctcacccctgc5100g幼tgcaccgtcctggtgtgttgaccgttccgttctttggaatgcggtcgaga幼gccga5160acagcgccggaactcccagctggcaagggaggttgaactcgccattccccgtgagatttc5220ccgcgaggccgcacgggagaccguctcgctttgtccgggaaaactttgtC鄰tGggggC5280atgattgccgatgtggcgttccatcacatggaccggaccaatccccatgcgcacatcatg5340ctgaccacgagagctgtcggggaaacgggattcgcaggaaaggtcagggatggaacgacc5400gggcactcgccgagacgtggcgcgcatcatgggctgaccatgcgoacagagcgcttgcga5460acgccggctaccaggaagagatagaccatcgttcatacgagcgtcagggactggagaaag5520cgccggccttcacctcggaaaggctgcctgtgcgatggaaaaacggggaatggaaacaga5580acgcggtgagcagaaccgtctgattaacagccttaacctggaaatacaggtttcccgcac5640gcagcttgctctcaggacggttcaggaaacgcagcgtaaggcgatgctgc5700acgtcgtgcagtgg肌gcccttaacctgaccattcccgctgcgaatgcctcagcggatac5760cctgcgggaattcattgccacgctgccgcaggaatgcgggaacgcgtgggagatgacccc5820ggagttcctggcgatgagcgggaaggtgaacgacatcgaacgtg柳ggaatgcgctgct5880gaaagagcaggccattctcga肌Bggagatgaccggactcaaaaaagcacgccctgtcgc5940gtcccttctgtcagagattcccctgatgacatgggctgaaccggaataccgcaaaagetca6000actccgtttcttggaaactcgggaaacBgattgaatctcttcgccgcacctac柳gccg6060tg站agaacgggacattcccgcccgtcgtcaggcctttgaaacgcagtggaatacgtgga6120ttgcgccggaatggcagagctga幼gaaaaactgtcagcacgggaagcggagcggcgcag6180ggaggagcccgaagcggaagcgcgccggaaggaaoaggagcatgaggcgcggctgaaacg6240tcatgataaccaccgtctgagccgtgaaacggcattagtcggggttattacggagctggg6300gcgtgccagagagccgggaacgggc柳ataacccgctacatgatgttgagtaacagagc6360cggagaattcacggtatggggtgatgagctggcgcattacccccagagtgttcatgaccc6420ggtg肌tgtttacctgtcgccaggcggggctgtgatggtctcggatatacgtgagggaat6480gccagaatctcatgagacgatggcgcggcctgagcgtgtgagaatgtattccggtgcgac6540ggtccggcatgtactggaacagatgcgccaggggtggccctcttacggttttccggcgct6600gccgcatcactggccggataatttttatttcagcgacgaccgcaggcccgtagcctctcc6660gctgccgtctgcgcaccgggtggacgtcaccgcttatgcggcaccggagcaactcatgcc6720cgttgtattttcgacagagcgaaacagcaggacgctgaatctgctgttgtgcaaagggcc6780ggaggaagtgcttgtcggatttgtgcgccaggaggacgggctgcgtcccgttcttgcgct6840tccgtcgccggattacagtcatctgatggtcagcaccatcacggagaacggggtatgcct6900ggcaggttacggagaagctataaaccatgatgcggatactccgtacccaccggaaccgca6960cctgatgcagttccggctcaaaggccatcatgacaggcttttggctgctgtccacaaacc7020ggaagagatgccggattatctcttccgtcaactcggttvtaatcagacctggcatgagtg7080gaagcgggacgaacagcacaggcaacaacaacgccgc7117<210〉35<211〉30<212〉DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>35gtgtcatgaaaatgggtaaccaatggcaac30<210>36<211>35<212>瞧<213>人工序列<220〉<223>反向引物<400>36cacagagctcgcgctaacaaaacagcacaagggag<210>37<2U>37<212>DNA<213>人工序列35<220〉<223>正向引物<400>37gtgtccatggctaaaacattattaatagctgcatcgc<210>38<211〉29<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>反向引物<柳>38gtgtctgcagaactgactgaa"gagatg29<210>39<211>37<212〉■<213>人工序列<220〉<223〉正向引物<400>39gtgtagatctttaagacccactttcacatttaagttg37<210〉40<211〉30<212>隨<213〉人工序列<220><223>反向引物<働>40cacaggatccttact.gaaccgcgatccccg30<210〉41<211>40<212>隱<213>人工序列<220〉<223>正向引物<400〉41gtgtgagctcgatcaaccagcaagccgttaaccctctgac40<210>42<211>67<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>反向引物<400>42gtgtgcatgcggggggccatataggccggggatttaaatgcaaacgtccgccgaaacgccgacgcac<210〉43<211>71<212>瞧<213〉人工序列<220〉<223>正向引物〈400〉43gtgtgcatgcggggUaattaagggggcggccgcgtggtattggttgaaccgacggtgctcatgacatcgc<210〉44〈211〉37<212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉反向引物<44gtgtct.cgaggatatcattctggcctctgacgttgtg37<210>45<211>45<212〉瞧<213>人工序列<220〉<223>正向引物6071<400>45ttttttccatggctattatgactgaaatcgttgcagataaaacgg45<210〉46<211>46<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉反向引物<400>46ttttttaagcttcccgggtcagacttcaggtacctcaaagagtgtc46<210〉47<211〉33<212>隨<213〉人工序列<220><223〉正向引物<400>47ccgctcgagatgcacggctccaacaagctccca33<210〉48<21>33<212>歸<213〉人工序列<220〉<223〉反向引物<400〉48cgcggatccttaggcactcgccttgagtgcctg33<210>49<211>102<212>隨<213〉人工序列<220〉<223>寡核苷酸<400>49gatcccatggcttatggcagaaaaaaacgccgtcagcgccgtcgcatgaacgcgctgcag60gaagataccccgccgggcccgtccaccgtgtttcgcccgceg102<210>50<2U>103<212〉讓<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400〉50gggacagggtgatggtgatgcccgcgatgcegatgeggatttcgcggcaatgcggggttt60ccagcgggcgggaggaggtcggcgggcgaaacacggtggaegg103<210>51<211>102<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉寡核苷酸<400〉51ggcatcgegggcatcaccatcaccctgtccctgtgcggctgcgcgaacgcgcgcgcgccg60accctgcgctccgcgaccgcggataactccgaaaacaccggc102<210>52<2U〉111<212〉,<213>人工序列<220><223〉寡核苷酸<400>52gegatatteggaeggategeaggagcgttttttggacggcggtttcggctgatcggtgcg60cagatcegggacg"tttaaagccggtgttttcggagttatccgcggtcgc111<210〉53<211〉111<212〉隠<213〉人工序列<220〉〈223>寡核苷酸<400〉53cctgcgatccgtccgaatatcgcgtctccgaactgaaagaatccctgatcaccaccaccc60cgtcccgcccgcgcaccgcccgccgctgcatccgcctctgaaagcttcatg111<210〉54〈211〉41<212〉隠<213〉人工序列<220〉<223>寡核苷酸<400>54catgaagctttcagaggcggatgcagcggcgggcggtgcgc41<210>55<211>98<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉寡核苷酸<400〉55gatcccatggctcatcaccatcaccaccattatggccgcaaaaaacgccgtcagcgccgt60cgcatgaacgcgctgcaggaagataccccgccgggccc98<210>56<211>100〈212〉DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>56gatcccatggctaaaaagacggctctggcgcttctgctcttgctgttagcgctgactagt60gtagcgcaggcctatggccgcaaaaaacgccgtcagcgcc100<210>57<211>551<212〉DNA<213>噬菌體〈220〉<221>CDS〈222〉(7)…(408)<221〉修飾的堿基<222〉0〉..，(1)<223>n-a,c,g,ort<400〉57nagaccatggettatggcagaaaaaaaagaagacagagaagaagaatg48MetAlaTyrGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgMet1510aacgcgctgcaggaagataccccgccgggcccgtecaccgtgtttcgc96AsnAlaLeuGinGluAspThrProProGlyProSerTThrVaiPheArg15202530ccgccgacctecteccgcccgctggaaaccccgcattgccgcgaaate144ProProThrSerSerArgProUuGluThrProHisCysArgGlulie354045cgcateggcategcgggcateaccateaccctgtecctgtgcggctgc192ArglieGlylieAlaGlylieThrlieThrUuSerLeuCysGlyCys505560gcgaacgcgcgcgcgccgaccctgcgctecgcgaccgcggataactec240AlaAsnAlaArgAlaProThrLeuArgSerAlaThrAlaAspAsnSer657075gaaaacaccggctttaaaaacgtcccggatctgcgcaccgatcagccg288GluAsnThrGlyPheLysAsnVaiProAspUuArgThrAspGinPro808590aaaccgccgtecaaaaaacgctectgcgatccgtecgaatatcgcgtc336LysProProSerLysLysArgSerCysAspProSerGluTyrArgVai95100105110tecgaactgaaagaatecctgateaccaccaccccgteccgcccgcgc384SerGluLeuLysGluSerUulieThrThrThrProSerArgProArg115120125accgcccgccgctgcatecgcetctgaaagcttggctgttttggeggatgagag438ThrAlaArgArgCyslieArgLeu130aagattttcagectgatacagattaaatcagaacgcagaageggtctgataaaacagaat498ttgcctggcggeagtagegeggtggtcccacctgaccccatgccgaactcaga551<210〉58<211>134<212>PRT<213>噬菌體<400〉58MetAlaTyrGlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgMetAsnAla151015LeuGinGluAspThrProProGlyProSerThrValPheArgProPro202530ThrSerSerArgProLeuGluThrProHisCysArgGlulieArglie354045GlylieAlaGlylieThrlieThrLeuSerLeuCysGlyCysAlaAsn505560AlaArgAlaProThrLeuArgSerAlaThrAlaAspAsnSerGluAsn65707580ThrGlyPheLysAsnValProAspLeuArgThrAspGinProLysPro859095ProSerLysLysArgSerCysAspProSerGluTyrArgYalSerGlu100105110LeuLysGluSerLeulieThrThrThrProSerArgProArgThrAla115120125ArgArgCyslieArgLeu130<210>59<211>444<212>隠<213>噬菌體<220〉<221>修飾的堿基<222〉(1)...(1)<223>n=a,c,g,ort<221〉CDS<222>(7)...(427)<柳〉59nagaccatggetcatcaccatcaccaccattatggccgcaaaaaacgcMetAlaHisHisHisHisHisHisTyrGlyArgLysLysArg151048cgtArg15cagGincgcArgcgtArgcgcatgaacArgMetAsn20gcgctgAlaLeucagGingaaGlu25gataccccgAspThrProccgggcProGly3096ccgProtecSeraccThrgtgValtttcgcccgPheArgPro35ccgProseeThrtecSer40tecSercgcccgctgArgProLeugaaaccGluThr45144ccgProcatHistgcCyscgcArg50gaaatecgcGlulieArgatelieggcGly553tCliegcgAlaggcateaccGlylieThr608tC3CClieThr192ctgLeutecSerctgLeu65tgcCysggctgcgcgGlyCysAlaaacAsn70gcgAlacgcArggcgAlaccgaccctgProThrLeu75cgctecArgSer240gcgAlaaccThr80gcgAlagatAspaactecgaaAsnSerGlu85aacAsnaccThrggcGlytttPheaaaaacgtctysAsnVal90ccggatProAsp288ctgLeu95cgcArg3CCThrgatAspcagccgaaaGinProLys100ccgProccgProtecSeraaaLys105aaacgctecLysArgSertgcgatCysAsp110336ccgProtecSergaaGlutatTyrcgcgtctecArgValSer115g肌GluctgLeuaaaLys120g站GlutecctgateSerLeulieaccbccThrThr125384accThrccgProtecSercgcArg130ccgcgcaccProArgThrgcccgcAlaArg135cgcArgtgcCysatecgcetclieArgLeu140427gaaagcttggctgtttt444<210〉60<211〉140<212>PRT<213〉噬菌體<400〉60MetAlaHisHisHisHisHisHisTyrGlyArgLysLysArgArgGin151015ArgArgArgMetAsnAlaLeuGinGluAspThrProProGlyProSer202530ThrValPheArgProProThrSerSerArgProLeuGluThrProHis354045CysArgGlulieArglieGlylieAlaGlylieThrlieThrLeuSer505560LeuCysGlyCysAlaAsnAlaArgAlaProThrUuArgSerAlaThr65707580AlaAspAsnSerGluAsnThrGlyPheLysAsnValProAspLeuArg859095ThrAspGinProLysProProSerLysLysArgSerCysAspProSer100105110GluTyrArgValSerGluLeuLysGluSerLeulieThrThrThrPro115120125SerArgProArgThrAlaArgArgCyslieArgLeu130135140<210>61<211>1565<212>隱<213>沙門(mén)氏菌(Salmonella)<400〉61gatatcattctggcctctgacgttgtgatggtcgcacgtggcgatctgggcgttgaaatc60ggcgatccggagctggttggtatccagaaagcgctgattcgccgtgcgcgtcagctaaac120cgcgcagtcatcaccgcaacgcaaatgatggagtcgatgatcaccaacccgatgccgacc180cgtgcggaagtgatggacgtggcgaacgccgtcctggatggcacggatgcggttatgctg240tctgccgaaaccgcagccggtcagtatccttctgaaaccgttgccgcaatggcgcgcgtc300tgcctgggcgcagaaaaaatccccagcatcaatgtgtctaaacaccgtctcgacgtgcag360ttcgacaacgttgaagaagccattgccatgtctgcgatgtatgcggcaaaccatctgaaa420ggcgttaccgcgatcatcaccatgacggaatccggtcgtaccgcgctaatgacttcccgt480atcagctccggcctgccgattttcgccatgtcgcgccatgaacgcacgctgaacctgacc540gcgctctatcgcggagtaacgccggtgcattttgatagcgcggctgatggcgttgtcgcg600gcacatgaagctgttaatctgctgcgcgataaagggtatctggtttccggcgacctggtt660atcgtgacccagggcgatgtcatgagcaccgtcggttcaaccaatacc加gcggccgccc720ccttaattaaccccgcatgcggggggccatataggccggggatttaaatgcaaacgtccg780ccgaaacgccgacgcactgtgttccagatatagtcaaaaaccggattaccctgattatga840aacatcgccgccattttttgcccctgagaggccatcagcatggctggaatgtcgacgccc900cagccatgcggtacgagaaaaatgactttttcgtcgttacgacgcatctcctcgataatc960tccagaccttcccagtcaacacgctgttgaatttttttcggaccgcgcatcgcc幼ctca畫(huà)gccatcatcgccattgcctgtggcgcggtggcg幼catctcatcgacaatcgcttcgcgc1080tcagcttcgctacgctgcggaaagcacaacgacagattaattagcgcccggcgacgagaa1140ctcttccccagccgtccggcaaaacgccccagcgtcgccagcaaagggtcgcggaatgat1200gccggtgttaatgcgatccccgccattgccgccgcgcccaaccaggcgccccaatactgt1260ggatagcgaaaggatttttcgaattcagggatatactcactattattttttttggtttcc1320atgcttttccagggtctgctgacgcgaaaaggaattgtgaatagtgtagcgacgtctgcg1380tctcacacaaaacaaaaaagccggcacacatcgcgtaccggctctgtcagcgcatttgtt1440aatcgaagcgcagttgcggcagaacctctttcacctgtgccaggtattcacgacgatctg1500accccgtcagaccttccgtgcgcggcaattttgctgtcagagggttaacggcttgctggt1560tgatc156權(quán)利要求1.一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可操作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氧菌或兼性厭氧菌。2.—種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氧菌或兼性厭氣菌.3.權(quán)利要求1或2的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是TNF家族成員.4.權(quán)利要求3的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中TNF家族成員為肺瘤壞死因子-a(TNF-a)、腫瘸壞死因子-卩(TNF-p)、TNF-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNF-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNP-a相關(guān)凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)、CD40配體(CD40L)、LT-a、LT-卩、0X40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-lBBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17或AITR-L.5.權(quán)利要求1或2的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是抗血管生成因子.6.權(quán)利要求5的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌，其中抗血管生成因子為內(nèi)抑素、制管張素、抗血管生成性抗凝血睞III、纖連蛋白的29kDaN-端蛋白水解片段和40kDaC-端蛋白水解片段、uPA受體拮抗刑、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24個(gè)氨基酸的抗血管生成性片段、被稱(chēng)為13.40的抗血管生成因子、血小板反應(yīng)蛋白I的含有22個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、層粘連蛋白的抗血管生成性小分子肽、纖連蛋白的抗血管生成性小分子肽、前膠原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整聯(lián)蛋白o(hù)tvp3的肽拮抗劑或VEGF受體的肽拮抗刑.7.權(quán)利要求1或2的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是細(xì)菌素家族成員，條件是該細(xì)菌素不是BRP.8.權(quán)利要求7的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中細(xì)菌素家族成員為ColEl、ColEla、ColElb、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大腸桿菌素A、大腸桿菌素K、大腸桿菌素L、大腸桿菌素M、陰溝腸道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、膿菌素R1或AP41、巨桿菌素A-216、孤菌素、或微生物素M15.9.權(quán)利要求1或2的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，其中初級(jí)效應(yīng)分子是腫瘸抑制性醉.10.權(quán)利要求9的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中胂瘤抑制性醉為甲疏氨酸酶、天冬酰胺酶、脂酶、磷脂酶、蛋白酶、DNA醉或糖苷醉.11.權(quán)利要求1或2的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，其中初級(jí)效應(yīng)分子是溶血素、Vero細(xì)胞毒素、CNF1、CNF2或PMT,12.權(quán)利要求1或2的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，其中初級(jí)效應(yīng)分子來(lái)源于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、或病毒.13.權(quán)利要求2的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，其中次級(jí)效應(yīng)分子是免疫調(diào)節(jié)刑、抗腫瘤蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶、反義分子、核酶、或抗原.14.權(quán)利要求1或2的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中定向于肺瘸的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.15.權(quán)利要求1的定向于腫瘸的減毒細(xì)菌，其中定向于肺瘤的減毒細(xì)菌另含有一種增強(qiáng)釋放系統(tǒng).16.權(quán)利要求2的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中次級(jí)效應(yīng)分子是細(xì)菌素釋放因子(BRP).17.—種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種融合蛋白，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氧菌或兼性厭氧菌，并且所述融合蛋白含有一種信號(hào)序列和一種效應(yīng)分子.18.—種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種融合蛋白，其中，所述定向于腫瘸的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氣菌，并且所述融合蛋白含有一種運(yùn)送肽和一種效應(yīng)分子.19.權(quán)利要求18的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中融合蛋白另含有一種信號(hào)序列.20.權(quán)利要求17或19的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中信號(hào)序列是一種OmpA樣蛋白.21，權(quán)利要求18或19的定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，其中運(yùn)送肽來(lái)源于HIVTAT蛋白、觸角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)膜移位序列(MTS)、單純皰疹病毒VP22、六聚組氨酸、六聚賴(lài)氨酸、或六聚精氨酸.22.權(quán)利要求17、18或19的定向于肺瘸的減毒細(xì)菌，其中效應(yīng)分子是初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子.23.權(quán)利要求17、18或19的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，其中定向于腫瘤的減毒細(xì)菌另含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所迷核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子.24.權(quán)利要求23的定向于肺瘤的減毒細(xì)菌，其中效應(yīng)分子是初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子.25.—種藥用組合物，該組合物含有可藥用栽體和定向于腫痗的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氧菌.26.—種藥用組合物，該組合物含有可藥用栽體和定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子，其中，所迷定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氧菌.27.權(quán)利要求25或26的藥用組合物，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是TNF家族成員.28.權(quán)利要求27的藥用組合物，其中TNP家族成員為肺瘤壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子-P(TNF-p)、TNP-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNF-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNF-a相關(guān)凋亡弱資導(dǎo)物(TWEAK)、CD40g己體(CD40L)、LT一a、LT一p、0X40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-lBBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17或AITR-L,29.權(quán)利要求25或26的藥用組合物，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是抗血管生成因子.30.權(quán)利要求29的藥用組合物，其中抗血管生成因子為內(nèi)抑素、制管張素、抗血管生成性抗凝血酶III、纖連蛋白的29kDaN-端蛋白水解片段和40kDaC-端蛋白水解片段、uPA受體拮抗刑、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7，8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24個(gè)氛基酸的抗血管生成性片段、被稱(chēng)為13.40的抗血管生成因子、血小板反應(yīng)蛋白I的含有22個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、層粘連蛋白的抗血管生成性小分子肽、纖連蛋白的抗血管生成性小分子肽、前膠原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整聯(lián)蛋白cup,的肽拮抗刑或VEGF受體的肽拮抗刑.31.權(quán)利要求25或26的藥用組合物，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是細(xì)菌素家族成員，條件是該細(xì)菌素不是BRP.32.權(quán)利要求31的藥用組合物，其中細(xì)菌素家族成員為ColEl、ColEla、ColElb、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大腸桿菌素A、大腸桿菌素K、大腸桿菌素L、大腸桿菌素M、陰溝腸道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、膿菌素R1或AP41、巨桿菌素A-216、孤菌素、或微生物素M15.33.權(quán)利要求25或26的藥用組合物，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是腫瘤抑制性酶.34.權(quán)利要求33的藥用組合物，其中腫瘤抑制性酶為甲疏氡酸酶、天冬跣胺酶、脂酶、磷脂醃、蛋白酶、DNA醉或糖苷蘇.35.權(quán)利要求25或26的藥用組合物，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是溶血素、Vero細(xì)胞毒素、CNF1、CNF2、或PMT.36.權(quán)利要求25或26的藥用組合物，其中初級(jí)效應(yīng)分子來(lái)源于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、或病毒.37.權(quán)利要求26的葯用組合物，其中次級(jí)效應(yīng)分子是免疫調(diào)節(jié)刑、抗腫瘤蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶、反義分子、核醉、或抗原.38.權(quán)利要求25或26的藥用組合物，其中定向于腫瘤的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.39.權(quán)利要求25的藥用組合物，其中定向于腫瘤的減毒細(xì)菌另含有一種增強(qiáng)釋放系統(tǒng).40.權(quán)利要求26的藥用組合物，其中次級(jí)效應(yīng)分子是細(xì)菌素釋放因子.41.一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所迷核酸分子編碼一種或多種融合蛋白，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氧菌或兼性厭氧菌，并且所述融合蛋白含有信號(hào)序列和效應(yīng)分子.42.—種藥用組合物，該組合物含有一種可葯用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種融合蛋白，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氣菌，并且所述融合蛋白含有運(yùn)送肽和效應(yīng)分子.43.權(quán)利要求42的藥用組合物，其中融合蛋白另含有一種信號(hào)序列.44.權(quán)利要求41或43的藥用組合物，其中信號(hào)序列是一種0mpA樣蛋白。45.權(quán)利要求42或43的藥用組合物，其中運(yùn)送肽來(lái)源于HIVTAT蛋白、觸角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)膜移位序列(MTS)、單純皰滲病毒VP22、六聚組氨酸、六聚賴(lài)氨酸、或六聚精氨酸.46.權(quán)利要求41、42或43的藥用組合物，其中效應(yīng)分子是初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子.47.權(quán)利要求41、42或43的藥用組合物，其中定向于腫瘤的減毒細(xì)菌另含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子.48.用于將治療實(shí)體瘤癌癥的一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子遞送至需要這種治療的受試者的方法，該方法包括給予一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可操作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氣菌.49.用于將治療實(shí)體瘤癌癥的一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子遞送至需要這種治療的受試者的方法，該方法包括給予一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氧菌或兼性厭氣菌.50.權(quán)利要求48或49的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是TNF家族成員.51.權(quán)利要求50的方法，其中TNF家族成員為腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子-P(TNF-p)、TNF-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNF-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNF-a相關(guān)凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)、CD40配體(CD40L)、LT-a、LT-(3、0X40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-lBBL、APRIL、LIGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17或AITR-L.52.權(quán)利要求48或49的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是抗血管生成因子，53.權(quán)利要求52的方法，其中抗血管生成因子為內(nèi)抑素、制管張素、抗血管生成性抗凝血醉III、纖連蛋白的29kDaN-端蛋白水解片段和40kDaC-端蛋白水解片段、uPA受體拮抗刑、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24個(gè)氨基酸的抗血管生成性片段、被稱(chēng)為13.40的抗血管生成因子、血小板反應(yīng)蛋白I的含有22個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、層粘連蛋白的抗血管生成性小分子肽、纖連蛋白的抗血管生成性小分子肽、前膠原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整聯(lián)蛋白o(hù)uP3的肽拮抗刑或VEGF受體的肽拮抗刑，54，權(quán)利要求48或49的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是細(xì)菌素家族成員，條件是該細(xì)菌素不是BRP.55.權(quán)利要求54的方法，其中細(xì)菌素家族成員為ColEl、ColEla、ColElb、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大腸桿菌素A、大腸桿菌素K、大腸桿菌素L、大腸桿菌素M、陰溝腸道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、膿菌素R1或AP41、巨桿菌素A-216、孤菌素、或微生物素M15.56.權(quán)利要求48或49的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是腫瘸抑制性酶.57.權(quán)利要求56的方法，其中腫瘤抑制性酶為甲碟氨酸醉、天冬醜胺酶、脂醉、辨脂醉、蛋白醉、DNA醉或糖苷醉.58.權(quán)利要求48或49的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是溶血素、Vero細(xì)胞毒素、CNF1、CNF2、或PMT.59.權(quán)利要求48或49的方法，其中初級(jí)效應(yīng)分子來(lái)源于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、或病毒.60.權(quán)利要求49的方法，其中至少一種次級(jí)效應(yīng)分子是抗腫瘤蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶、反義分子、核蘇、或抗原.61.權(quán)利要求48或49的方法，其中定向于腫癌的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.62，權(quán)利要求48的方法，其中定向于腫瘤的減毒細(xì)菌另含有一種增強(qiáng)釋放系統(tǒng).63，權(quán)利要求49的方法，其中次級(jí)效應(yīng)分子是細(xì)菌素釋放因子.64，用于將治療實(shí)體瘤癌癥的一種或多種融合蛋白遞送至需要這種治療的受試者的方法，該方法包括給予一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所迷核脧分子可編碼一種或多種融合蛋白，其中，所迷定向于胂瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氣菌，并且所述融合蛋白含有一種信號(hào)序列和一種效應(yīng)分子.65,用于將治療實(shí)體瘤癌癥的一種或多種融合蛋白遞送至需要這種治療的受試者的方法，該方法包括給予一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子可編碼一種或多種融合蛋白，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氧菌，并且所述融合蛋白含有一種運(yùn)送肽和一種效應(yīng)分子.66,權(quán)利要求65的方法，其中融合蛋白另含有一種信號(hào)序列，67.權(quán)利要求64或66的方法，其中信號(hào)序列是一種OmpA樣蛋白.68.權(quán)利要求65或66的方法，其中運(yùn)送肽來(lái)源于HIVTAT蛋白、觸角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)膜移位序列(MTS)、單純皰滲病毒VP22、六聚組氨酸、六聚賴(lài)氨酸、或六聚精氨酸.69.權(quán)利要求64、65或66的方法，其中效應(yīng)分子是初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子.70.權(quán)利要求64、65或66的方法，其中定向于腫瘤的減毒細(xì)菌另含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種效應(yīng)分子.71.用于治療動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)體瘤癌癥的方法，該方法包括給予一種或多種化療刑以及一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氣菌，72.用于治療動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)體瘤癌癥的方法，該方法包括給予一種或多種化療刑以及一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子以及一種或多種次級(jí)效應(yīng)分子，其中，所迷定向于肺瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氣菌.73.權(quán)利要求71或72的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是TNF家族成員.74.權(quán)利要求73的方法，其中TNF家族成員為腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子-P(TNF-p)、TNF-a相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、TNF-a相關(guān)激活誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(TRANCE)、TNF-a相關(guān)凋亡弱誘導(dǎo)物(TWEAK)、CD40配體(CD40L)、LT-a、LT-p、0X40L、CD40L、FasL、CD27L、CD30L、4-lBBL、APRIL、UGHT、TL1、TNFSF16、TNFSF17或AITR-L.75.權(quán)利要求71或72的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是一種抗血管生成因子.76.權(quán)利要求75的方法，其中抗血管生成因子為內(nèi)抑素、制管張素、抗血管生成性抗凝血醉III、纖連蛋白的29kDaN-端蛋白水解片段和40kDaC-端蛋白水解片段、uPA受體拮抗刑、催乳素的16kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的含有24個(gè)氨基酸的抗血管生成性片段、被稱(chēng)為13.40的抗血管生成因子、血小板反應(yīng)蛋白I的含有22個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、SPARC的含有20個(gè)氨基酸的抗血管生成性肽片段、含有RGD和NGR的肽、層粘連蛋白的抗血管生成性小分子肽、纖連蛋白的抗血管生成性小分子肽、前膠原的抗血管生成性小分子肽、EGF的抗血管生成性小分子肽，以及整聯(lián)蛋白o(hù)up3的肽拮抗刑或VEGF受體的肽拮抗刑.77.權(quán)利要求71或72的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是細(xì)菌素家族成員，條件是該細(xì)菌素不是BRP.78.權(quán)利要求77的方法，其中細(xì)菌素家族成員為ColEl、ColEla、ColElb、ColE2、ColE3、ColE4、ColE5、ColE6、ColE7、ColE8、ColE9、大腸桿菌素A、大腸桿菌素K、大腸桿菌素L、大腸桿菌素M、陰溝腸道菌素DF13、鼠疫菌素A1122、葡萄球菌素1580、丁酸梭菌素7423、膿菌素R1或AP41、巨桿菌素A-216、孤菌素、或微生物素M15.79.權(quán)利要求71或72的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是腫瘤抑制性酶.80.權(quán)利要求79的方法，其中腫瘤抑制性酶為甲硫氨酸酶、天冬醜胺酶、脂酶、辨脂酶、蛋白醉、DNA酶或糖苷酶.81.權(quán)利要求71或72的方法，其中至少一種初級(jí)效應(yīng)分子是溶血素、Vero細(xì)胞毒素、CNP1、CNP2、或PMT.82.權(quán)利要求71或72的方法，其中初級(jí)效應(yīng)分子來(lái)源于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、或病毒.83.權(quán)利要求82的方法，其中次級(jí)效應(yīng)分子是免疫調(diào)節(jié)刑、抗腫瘤蛋白、前體藥物轉(zhuǎn)化酶、反義分子、核酶，或抗原.84.權(quán)利要求71或72的方法，其中定向于腫瘸的減毒細(xì)菌為沙門(mén)氏菌.85.權(quán)利要求71的方法，其中定向于腫瘤的減毒細(xì)菌另含有一種增強(qiáng)釋放系統(tǒng).86.權(quán)利要求72的方法，其中次級(jí)效應(yīng)分子是細(xì)菌素釋放因子.87.用于治療動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)體瘤癌癥的方法，該方法包括給予一種或多種化療刑以及一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種融合蛋白，其中，所述定向于腫瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氣菌或兼性厭氧菌，并且所述融合蛋白含有一種信號(hào)序列和一種效應(yīng)分子.88.用于治療動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)體瘤癌癥的方法，該方法包括給予一種或多種化療刑以及一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌，該細(xì)菌含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種融合蛋白，其中，所述定向于肺瘤的減毒細(xì)菌是一種兼性需氧菌或兼性厭氧菌，并且所述融合蛋白含有一種運(yùn)送肽和一種效應(yīng)分子.89.權(quán)利要求88的方法，其中融合蛋白另含有一種信號(hào)序列.90.權(quán)利要求87或89的方法，其中信號(hào)序列是一種OmpA樣蛋白.91.權(quán)利要求88或89的方法，其中運(yùn)送肽來(lái)源于HIVTAT蛋白、觸角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)膜轉(zhuǎn)移位序列(MTS)、單純皰疹病毒VP22、六聚組氨酸、六聚賴(lài)氡酸、或六聚精氨酸.92.權(quán)利要求87、88或89的方法，其中的效應(yīng)分子是一種初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子.93.權(quán)利要求87、88或89的方法，其中定向于腫瘸的減毒細(xì)菌另含有與一種或多種啟動(dòng)子可搮作性連接的一種或多種核酸分子，所述核酸分子可編碼一種或多種效應(yīng)分子.94.用于治療動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)體瘤癌癥的方法，該方法包括給予一種或多種化療刑以及一種藥用組合物，該組合物含有一種可藥用栽體和一種定向于腫瘤的減毒細(xì)菌.95.—種融合蛋白，該融合蛋白含有一種OmpA樣蛋白和一種效應(yīng)分子.96.—種融合蛋白，該融合蛋白含有一種信號(hào)序列、一種運(yùn)送肽和一種效應(yīng)分子.97.權(quán)利要求96的融合蛋白，其中信號(hào)序列是一種OmpA樣蛋白.98.權(quán)利要求96的融合蛋白，其中運(yùn)送肽來(lái)源于HIVTAT蛋白、觸角足同源域(穿透蛋白)、卡波西成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)膜轉(zhuǎn)移序列(MTS)、單純皰疹病毒VP22、六聚組氨酸、六聚賴(lài)氨酸、或六聚精氨酸.99.權(quán)利要求95或96的融合蛋白，其中效應(yīng)分子是初級(jí)效應(yīng)分子或次級(jí)效應(yīng)分子.全文摘要本申請(qǐng)涉及用于將效應(yīng)分子定向遞送至腫瘤的組合物及方法。具體地說(shuō)，本申請(qǐng)公開(kāi)了定向于腫瘤的減毒細(xì)菌載體的制備和用途，該細(xì)菌載體可用于將一種或多種初級(jí)效應(yīng)分子遞送至實(shí)體瘤部位。在本發(fā)明的方法中，本發(fā)明的初級(jí)效應(yīng)分子可用來(lái)治療癌、黑色素瘤、淋巴瘤或肉瘤等實(shí)體瘤癌癥。本發(fā)明涉及一項(xiàng)驚人的發(fā)現(xiàn)，即利用定向于腫瘤并且對(duì)宿主的毒性較低的減毒細(xì)菌可將全身給藥于宿主時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性的效應(yīng)分子局部遞送至腫瘤。本申請(qǐng)還公開(kāi)一種或多種可選效應(yīng)分子(稱(chēng)為次級(jí)效應(yīng)分子)的遞送方法，這些效應(yīng)分子可通過(guò)定向于腫瘤的減毒細(xì)菌與初級(jí)效應(yīng)分子協(xié)同遞送。文檔編號(hào)A61K48/00GK101579362SQ200910128059公開(kāi)日2009年11月18日申請(qǐng)日期2000年8月24日優(yōu)先權(quán)日1999年10月4日發(fā)明者C·A·克萊爾蒙特,D·G·貝爾穆德斯,I·C·金,M·貝爾庫(kù)特,S·L·林申請(qǐng)人:維昂藥品公司