用于真核細胞系的提高蛋白表達水平的mar轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及其表達系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種哺乳動物細胞系統(tǒng)，具體說，是一種用于真核細胞系的提高蛋白 表達水平的MR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及其表達系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 醫(yī)用蛋白質(zhì)藥物具有較強的生理活性，顯著的療效及較高的安全性等優(yōu)點，在目 前的醫(yī)藥市場上占有重要的比例，截止2014年，在全球范圍內(nèi)約占有1，000億美元（約 合6, 200億人民幣）的市場份額?？贵w作為機體免疫應(yīng)答的效應(yīng)分子，能夠特異性識別、 中和或清除誘發(fā)疾病的抗原，是理想的祀向治療藥物。目前歐美市場已有總計Ξ十余種治 療性抗體上市銷售。W上抗體藥物已經(jīng)在免疫性疾病、癌癥等治療領(lǐng)域取得巨大成功。W 羅氏公司的抗肥R2的Trastuzum油抗體為例，美國食品及藥物管理局師A)于1998年批 準其作為治療惡性腫瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺 癌的抗體藥物。并且已成為國際通行的針對肥R2陽性乳腺癌臨床治療的金標準（Golden standard)。據(jù)估計，到2023年肥R2陽性乳腺癌的市場份額將高達126億美元（約合780 億人民幣）。目前在國際上銷量最高由歐美主要生產(chǎn)廠家壟斷的幾種醫(yī)用抗體的專利在未 來幾年內(nèi)將陸續(xù)到期，從而為中國及其他發(fā)展中國家在運方面的發(fā)展提供了難得的發(fā)展機 遇。WTrastuzum油為例，它的歐洲專利保護期已于2014年到期，其美國專利于2019年到 期。因此在可W預(yù)見的未來10年，醫(yī)用抗體制藥業(yè)將呈現(xiàn)飛速發(fā)展且競爭更加激烈的局 面。
[0003] 中國醫(yī)用蛋白質(zhì)藥物的表達與純化業(yè)由于起步晚，其行業(yè)發(fā)展受限于諸多技術(shù)瓶 頸，如：工程細胞系構(gòu)建與篩選、大規(guī)模培養(yǎng)工藝開發(fā)，單抗的純化與質(zhì)控等，因此普遍存在 著細胞系表達水平低，培養(yǎng)規(guī)模小和純化能力不夠等技術(shù)問題。所W，上述產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù) 的突破可加快中國抗體產(chǎn)業(yè)的發(fā)展進程。數(shù)據(jù)表明，一個年銷售額達1億美元左右的蛋白 質(zhì)藥物，通常需要年產(chǎn)約100公斤重組蛋白的產(chǎn)能作為產(chǎn)品支撐。因此，蛋白質(zhì)藥物的表達 與純化，其技術(shù)水平和產(chǎn)能規(guī)模，將直接影響蛋白質(zhì)藥物的成本和盈利。
[0004] 在當前國際通用的各種醫(yī)用蛋白表達系統(tǒng)有很多種，如大腸桿菌為代表的原核 表達系統(tǒng)，W及W酵母、植物、昆蟲細胞為代表的真核細胞表達系統(tǒng)等。而運些表達系統(tǒng) 生產(chǎn)出的蛋白質(zhì)，無論是在理化性質(zhì)，還是在功能上都與天然蛋白質(zhì)存在較大的差異，因 此利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)來生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)是現(xiàn)代醫(yī)藥領(lǐng)域的研究重點。目前市場 上被美國抑A批準的蛋白質(zhì)藥物，超過50%來自于哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)，主要包括中 華倉鼠細胞Chinese hamster ovary cell(CH0)，人胚腎細胞human embiTonicki化ey cell(肥K-293)等表達細胞系。
[0005]高效的表達載體系統(tǒng)是醫(yī)用蛋白質(zhì)藥物的關(guān)鍵。構(gòu)建高效的表達載體細胞是提 高哺乳動物細胞醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)量的首要策略，也是目前制約醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。外 源基因可W通過質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入哺乳動物宿主細胞，表達目的蛋白。一般來講， 適用于哺乳動物細胞蛋白表達的載體，大多為穿梭載體，不僅含有便于載體擴增和大量制 備的原核序列，如復(fù)制子和抗生素基因等，還含有真核生物表達序列如調(diào)控外源基因轉(zhuǎn)錄 與翻譯活性的啟動子、增強子、終止子及polyA信號等。由于蛋白質(zhì)藥物的表達通常采用 穩(wěn)定表達的細胞系，因此，為獲得蛋白的高效表達，不僅需要表達載體的優(yōu)化，同時還需要 提供適于載體表達的染色體環(huán)境，即所謂的"位置效應(yīng)"。表達載體的優(yōu)化，一般包括選用 較強的啟動子，表達基因進行密碼子優(yōu)化等；同時為增加表達載體在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)，在 表達載體中加入一些篩選基因如基于氨甲噪嶺（methotrexate,Ml%)的二氨葉酸還原酶 (dihy化ofolatere化ctase,DHFR)。"位置效應(yīng)"是優(yōu)化表達載體時應(yīng)當著重考慮的。當質(zhì) 粒攜帶表達基因轉(zhuǎn)入宿主細胞時，質(zhì)粒將被隨機整合到宿主染色體基因組上的某個區(qū)域， 此整合區(qū)域的空間構(gòu)象，顯著影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達。近年來，一些DNA順式調(diào)控元件，如 核基質(zhì)附著區(qū)（MatrixAttachmentRegion,MAR)被鑒定出來。功能上，當運些DNA元件與 外源基因處于同一順反子時，能夠保持外源基因的高表達而對插入位點所處的染色質(zhì)結(jié)構(gòu) 沒有影響。已發(fā)現(xiàn)的DNA元件包括基因座控制區(qū)化CR)、支架/基質(zhì)附著區(qū)（S/MAR)、絕緣 子、染色質(zhì)開放元件扣C0巧和抗阻遏物（STAR元件）等巧ef2)。運些DNA順式調(diào)控元件 構(gòu)建到表達載體上，可顯著提高基因的表達水平和蛋白的翻譯水平。
[0006] 篩選高效穩(wěn)定表達的細胞克隆是提高哺乳動物細胞蛋白質(zhì)產(chǎn)量的另一重要策略。 傳統(tǒng)質(zhì)粒載體需要轉(zhuǎn)染宿主細胞獲得穩(wěn)定表達，耗時且費力，不利于醫(yī)用蛋白質(zhì)的大規(guī)模 生產(chǎn)。雖然桿狀病毒載體和慢病毒載體可W較高的拷貝數(shù)整合到宿主的基因組，但病毒載 體的制備具有一定的難度，特別是大規(guī)模的制備；而且，慢病毒載體亦有安全性的潛在風(fēng) 險。另一方面，增加表達基因在宿主細胞內(nèi)的拷貝數(shù)，是篩選高效表達細胞株的有效方法。 當前常用的篩選高效穩(wěn)定表達克隆的體系有兩類：一類是基于氨甲噪嶺的二氨葉酸還原酶 篩選體系；另一類是基于甲硫氨酸亞諷的谷氨酷胺合成酶篩選體系。細胞培養(yǎng)在含有一定 濃度的氨甲噪嶺或甲硫氨酸亞諷的培養(yǎng)基中，外界環(huán)境的壓力使得表達基因在宿主細胞內(nèi) 擴增，拷貝數(shù)增加，進而提供蛋白質(zhì)藥物的表達產(chǎn)量。但是上述兩種篩選體系都存在耗時長 和成本高等缺點，不利于生物制藥的產(chǎn)業(yè)化。因此，采用一種非病毒載體，同時運種載體能 夠W較高的拷貝數(shù)并穩(wěn)定整合到宿主細胞的基因組內(nèi)，將極大地提高蛋白質(zhì)藥物的產(chǎn)量， 而且可大大縮短篩選細胞克隆所需的時間。
[0007] 用睡美人轉(zhuǎn)座子（Sle巧ingBeauty,SB)作為表達載體具有質(zhì)粒無可比擬的優(yōu)點。 轉(zhuǎn)座子是染色體上可自主復(fù)制和移位的DNA作用元件。睡美人轉(zhuǎn)座子是第一個應(yīng)用于高等 哺乳動物細胞相關(guān)研究的轉(zhuǎn)座子。SB轉(zhuǎn)座子由兩部分組成：轉(zhuǎn)座酶基因和能被轉(zhuǎn)座酶基因 所識別的兩端反向重復(fù)序列。SB轉(zhuǎn)座子采用"剪切-粘貼"的作用機制進行轉(zhuǎn)座。轉(zhuǎn)座酶 特異識別轉(zhuǎn)座子兩端反向重復(fù)序列，從轉(zhuǎn)座子載體上切下位于兩端反向重復(fù)序列的DNA元 件，并插入到新的整合位點上。因此，SB轉(zhuǎn)座子做為非病毒的基因載體，具有較高的生物安 全性；同時結(jié)構(gòu)簡單，容易操作；對位于兩端反向重復(fù)序列之間的DNA片段，沒有插入片段 的長度限制。重要的是，通過SB轉(zhuǎn)座子，可W使DNA片段穩(wěn)定地整合到基因組內(nèi)，從而實現(xiàn) 基因的穩(wěn)定表達。因此，利用睡美人轉(zhuǎn)座子作為醫(yī)用蛋白質(zhì)藥物的表達載體，有文獻報道， 可數(shù)倍提高蛋白質(zhì)藥物的產(chǎn)量，而且由于SB轉(zhuǎn)座子載體W較高的基因拷貝數(shù)穩(wěn)定整合，大 大縮短了篩選高效穩(wěn)定表達克隆的時間和過程。并且，由于穩(wěn)定地整合到宿主細胞基因組 內(nèi)，因此在大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的過程中，不會出現(xiàn)質(zhì)粒載體中的基因丟失等 缺點，使得單位體積的細胞培養(yǎng)基最大可能地生產(chǎn)出表達蛋白質(zhì)，從而最大限度地利用培 養(yǎng)基，最終降低了生產(chǎn)成本，同時提高了產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種用于真核細胞系的提高蛋白表達水平的 MR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及表達系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)并鑒定了新型的DNA調(diào)控元件；W此調(diào)控元件為基礎(chǔ)， 結(jié)合基因轉(zhuǎn)座子技術(shù)，優(yōu)化和構(gòu)建了真核表達載體。隨后通過轉(zhuǎn)染及篩選，所獲得的細胞 株，可高效，穩(wěn)定地表達醫(yī)用蛋白質(zhì)藥物。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于真核細胞系的提高 蛋白表達水平的MR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，所述MR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為具有增強轉(zhuǎn)錄的功能的DNA 順式作用元件，嫩3轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為嫩1?1，嫩1?2，嫩1?3.嫩1?4，嫩1?5中的任意一種，嫩1?1的核 巧酸序列為SEQIDNO. 1，MR2的核巧酸序列為SEQIDNO. 2，MR3的核巧酸序列為SEQID NO. 3,MAR4的核巧酸序列為沈QIDNO. 4和MAR5的核巧酸序列為沈QIDNO. 5。
[0010] 所述MR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件提取于中國倉鼠卵巢細胞系CHO。
[0011] 含有所述MR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的高效穩(wěn)定的醫(yī)用重組抗體的哺乳動物細胞表達載 體，包括：1)使得基因高效表達的DNA順式作用元件MAR，2)睡美人轉(zhuǎn)座子載體表達抗體基 因，其核巧酸序列如SEQIDNO. 6所示；3)篩選標記基因，其核巧酸序列如SEQIDNO. 7所 示；4)IRES序列沈QIDNO. 8。
[0012] 所述睡美人轉(zhuǎn)座子載體，含有可被轉(zhuǎn)座酶識別的反向重復(fù)序列，其核巧酸序列如 沈QIDNO. 9所示。
[001引所述篩選基因為二氨葉酸還原酶基因DHFR，所述IRES元件為基因合成的FMDVIRES序列。
[0014] 所述MR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為MR2。
[0015] 一種高效穩(wěn)定表達重組抗體的穩(wěn)定細胞株的篩選方法，利用上述的哺乳動物細胞 表達載體，將目標基因轉(zhuǎn)染到哺乳動物宿主細胞，篩選獲得高表達目標基因的穩(wěn)定細胞株。
[0016] 所述哺乳動物宿主細胞是中華倉鼠卵巢細胞C冊和人胚腎上皮細胞肥K293。
[0017] 所述篩選方法包括針對篩選標記的抗生素篩選和針對擴增標記基因的藥物加壓 篩選。
[0018] 所述的高效穩(wěn)定表達重組抗體的穩(wěn)定細胞株的篩選方法獲得的高效穩(wěn)定表達的 細胞株。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：首次利用C冊細胞克隆出具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的DNA調(diào)控元 件（MAR)，通過一系列載體構(gòu)建及穩(wěn)定細胞株篩選，證明了此DNA調(diào)控元件可提高蛋白質(zhì)的 表達產(chǎn)量。W此為基礎(chǔ)，還首次將此MAR調(diào)控元件與睡美人轉(zhuǎn)座子載體結(jié)合，從而構(gòu)建了一 種適用于高效穩(wěn)定表達醫(yī)用蛋白質(zhì)藥物的表達系統(tǒng)。并W表達純化抗肥R2的IgG為例，證 明了與傳統(tǒng)的質(zhì)粒表達系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有如下優(yōu)點：較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量（與質(zhì)粒系統(tǒng) 相比，高達10倍的產(chǎn)量）；穩(wěn)定持久地蛋白表達（細胞系傳50代后，仍保持相近的蛋白表 達產(chǎn)量）；大大縮短篩選克隆的時間（一個月左右）；快速便捷的基因克隆。
【附圖說明】
[0020] 圖1是中華倉鼠卵巢上皮細胞培養(yǎng)的生長曲線。
[0021] 圖2是用抗H4的抗體進行染色體免疫沉淀，經(jīng)一系列處理，所得的DNA樣品進行 1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0022] 圖3是微陣列分析試驗中，從染色體免疫共沉淀所得的DNA樣品中擴增β-actin 用于PCR擴增的陽性對照。
[002引 圖4是表達EGFP的真核表達載體的圖譜（比較祀GFP-Control(A)和 祀GFP-