專利名稱：環(huán)孢菌素a的hplc分析檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)孢菌素A單位的HPLC分析檢測方法。
背景技術(shù)：
環(huán)孢菌素最早于1970年由瑞士 Sandoz公司的科學(xué)家在光澤柱孢菌和多孔木霉發(fā) 酵液中研究發(fā)現(xiàn)，1983年被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床腎移植，由于其良好的免疫抑制活性， 作為第三代免疫抑制劑，取得了巨大的成功。其后，環(huán)孢菌素其他組分也受到科研工作者的 重視，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了 26個以上的天然環(huán)孢菌素組分(CsA、B……Z)。對于成分復(fù)雜的環(huán)孢菌 素發(fā)酵液來說，建立一種方便、快捷、可靠的目標(biāo)產(chǎn)物檢測方法顯得十分必要，特別是環(huán)孢 菌素的同系物C、B、D結(jié)構(gòu)與A十分相似，分離難度很大?！逗颖贬t(yī)藥》2006年10月第28卷第10期，《高效液相色譜法檢測人全血環(huán)孢素A濃 度》公開了一種檢測全血環(huán)孢素A的方法，采用的色譜條件是色譜柱Z0RBAX SB-C18(5), 4. 6 X 150mm，紫外檢測波長208nm，柱溫70°C，流速1. 4ml/min，流動相為乙腈甲醇水 異丙醇58 18 23 1 (V/V) o《沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報》2006年6月第8卷第2期，《反相高效液相色譜法測定人環(huán)孢 素A血藥濃度》公開了一種測定人血液中環(huán)孢素A的方法，采用的色譜條件是SphefiSOrb. C8型色譜柱，檢測波長為214nm，甲醇-水(75 25，V/V)為流動相，柱溫60°C?？傮w而言，在現(xiàn)有技術(shù)中，環(huán)孢菌素A與同系物之間雖能較好分離，但分析方法時 間較長，不但浪費時間和大量的溶劑，而且還會縮短色譜柱的使用壽命。特別是分析多個樣 品時，相互之間還會出現(xiàn)明顯的干擾，影響分析的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提高樣品中環(huán)孢菌素A單位分析的準(zhǔn)確性和快速性，提供一種 環(huán)孢菌素A方便、快捷、可靠的HPLC分析方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，通過大量試驗研究，發(fā)明人提出了一種環(huán)孢菌素A的高 效液相檢測方法，所述高效液相檢測方法采用如下色譜條件色譜柱十八烷基鍵合硅膠的C8柱或C18柱；檢測波長190 380nm，優(yōu)選 190_230nm ；流動相磷酸二氫鈉-乙腈緩沖液或磷酸二氫鈉_甲醇緩沖液。上述環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其中檢測器可以采用紫外檢測器或二極管 陣列檢測器。上述環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其中所述流動相為磷酸二氫鈉水溶液乙 腈=20%-40% 60%-80%，或磷酸二氫鈉水溶液甲醇=20%-40% 60%_0%，所述 磷酸二氫鈉水溶液的濃度為0. 01 0. 50mol/L，磷酸調(diào)pH值為2. 0 3. 0。優(yōu)選地，流動 相為磷酸二氫鈉水溶液乙腈=30% 70%，所述磷酸二氫鈉水溶液的濃度為O.Olmol/ L，磷酸調(diào)pH值為2.7。
上述環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其中流動相的流速為0. 5ml/min 1. 5ml/ min，柱溫為25 35°C。優(yōu)選地，流速為1. Oml/min,柱溫為30°C。上述環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，所述的環(huán)孢菌素A樣品是指經(jīng)過前處理的 環(huán)孢菌素A發(fā)酵液樣品，或者環(huán)孢菌素A發(fā)酵液提取過程中間樣品，或者其它環(huán)孢菌素A樣品。應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法，環(huán)孢菌素A和環(huán)孢菌素的同系物C、B、D完全分離，且主峰 明顯，分析時間縮短，選擇性，分辨率、靈敏度高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確可靠。


圖1實施例1所述檢測方法的色譜圖，其中圖譜中出峰時間5. 177處為環(huán)孢菌素 C，5. 855處為環(huán)孢菌素B，9. 034為環(huán)孢菌素D，7. 782為環(huán)孢菌素A，可以看出在該條件下環(huán) 孢菌素A可以和三個雜質(zhì)很好的分離。圖2實施例2所述檢測方法的色譜圖，其中圖譜中出峰時間5. 181處為環(huán)孢菌素 C，5. 853處為環(huán)孢菌素B，9. 036為環(huán)孢菌素D，7. 771為環(huán)孢菌素A，可以看出在該條件下環(huán) 孢菌素A可以和三個雜質(zhì)很好的分離。圖3實施例3所述檢測方法的色譜圖，其中圖譜中出峰時間5. 186處為環(huán)孢菌素 C，5. 862處為環(huán)孢菌素B，9. 039為環(huán)孢菌素D，7. 785為環(huán)孢菌素A，可以看出在該條件下環(huán) 孢菌素A可以和三個雜質(zhì)很好的分離。圖4實施例4所述檢測方法的色譜圖，其中圖譜中出峰時間5. 065處為環(huán)孢菌素 C，6. 326處為環(huán)孢菌素B，9. 073為環(huán)孢菌素D，7. 687為環(huán)孢菌素A，可以看出在該條件下環(huán) 孢菌素A可以和三個雜質(zhì)很好的分離。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的技術(shù)方案并不限于如下實施例。實施例1取10. 104g環(huán)孢菌素A發(fā)酵液，完全轉(zhuǎn)移至一 250mL三角瓶中，然后用量筒量取 80mL甲醇進(jìn)行浸泡，再加入lmL 2N NaOH溶液，封口，將三角瓶置于搖床上，于室溫、轉(zhuǎn)速 250rpm下進(jìn)行振搖提取1小時，用50mL離心管取40mL浸提液于4000rpm離心10分鐘，得 到經(jīng)過前處理的環(huán)孢菌素A發(fā)酵上清液。用反相HPLC方法分析經(jīng)過處理的環(huán)孢菌素A發(fā)酵液。將上清液直接進(jìn)樣分析即 可。色譜柱為Alltima HP C18反相柱(5um，250_X 4. 6mm)，紫外檢測器，檢測波長214nm， 流動相乙腈-0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液(pH2. 7) = 70 30，流速1. OmL/min,柱溫30°C。 利用該方法，12分鐘樣品即可分析完畢，主成分峰明顯，柱壓無明顯變化，能較好的確保發(fā) 酵液含量的檢測。見圖1實施例2取12. 025g環(huán)孢菌素A發(fā)酵液，完全轉(zhuǎn)移至一 250mL三角瓶中，然后用量筒量取 90mL甲醇進(jìn)行浸泡，再加入lmL 2N NaOH溶液，封口，將三角瓶置于搖床上，于室溫、轉(zhuǎn)速 250rpm下進(jìn)行振搖提取1. 5小時，用50mL離心管取40mL浸提液于4000rpm離心10分鐘， 得到經(jīng)過前處理的環(huán)孢菌素A發(fā)酵上清液。
用反相HPLC方法分析經(jīng)過處理的環(huán)孢菌素A發(fā)酵液。將上清液直接進(jìn)樣分析即 可。色譜柱為Alltima HP C18反相柱(5um，250_X 4. 6mm)，紫外檢測器，檢測波長190nm， 流動相乙腈-0. 10mol/L磷酸鹽緩沖液(pH2. 0) = 80 20，流速0. 8mL/min,柱溫25°C。 利用該方法，12分鐘樣品即可分析完畢，主成分峰明顯，柱壓無明顯變化，能較好的確保發(fā) 酵液含量的檢測。實施例3取11. 324g環(huán)孢菌素A發(fā)酵液，完全轉(zhuǎn)移至一 250mL三角瓶中，然后用量筒量取 90mL甲醇進(jìn)行浸泡，再加入lmL 2N NaOH溶液，封口，將三角瓶置于搖床上，于室溫、轉(zhuǎn)速 250rpm下進(jìn)行振搖提取1. 5小時，用50mL離心管取40mL浸提液于4000rpm離心10分鐘， 得到經(jīng)過前處理的環(huán)孢菌素A發(fā)酵上清液。用反相HPLC方法分析經(jīng)過處理的環(huán)孢菌素A發(fā)酵液。將上清液直接進(jìn)樣分析即 可。色譜柱為Alltima HP C8反相柱(5um，250mmX 4. 6mm)，紫外檢測器，檢測波長380nm，流 動相乙腈-0. 20mol/L磷酸鹽緩沖液(pH3. 0) =60 40，流速1. 2mL/min，柱溫35°C。利 用該方法，12分鐘樣品即可分析完畢，主成分峰明顯，柱壓無明顯變化，能較好的確保發(fā)酵 液含量的檢測。實施例4用分析天平稱量提取終端產(chǎn)品(未精制，含量約95% ) 12mg，置于10mL容量瓶中， 加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度lmg/mL的環(huán)孢菌素溶液。然后取對照品用流 動相分別配成濃度0. lmg/mL和0. 5mg/mL的溶液，利用外標(biāo)法作標(biāo)線。用反相HPLC方法分析經(jīng)過處理的環(huán)孢菌素A粗品溶液。色譜柱為Alltima HP C18 反相柱(5um，250mmX4. 6mm)，紫外檢測器，檢測波長230nm，流動相乙腈-0. 30mol/L磷酸 鹽緩沖液(PH2. 5) ==50 50，流速l.OmL/min，柱溫30°C。利用該方法，12分鐘樣品即 可分析完畢，主成分峰明顯，柱壓無明顯變化，能較好的確保提取過程中間樣品的檢測。實施例5用分析天平稱量提取終端產(chǎn)品(未精制，含量約95% ) 12mg，置于10mL容量瓶中， 加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度lmg/mL的環(huán)孢菌素溶液。然后取對照品用流 動相分別配成濃度0. lmg/mL和0. 5mg/mL的溶液，利用外標(biāo)法作標(biāo)線。用反相HPLC方法分析經(jīng)過處理的環(huán)孢菌素A粗品溶液。色譜柱為Alltima HP C18 反相柱(5um，250mmX4. 6mm)，紫外檢測器，檢測波長214nm，流動相乙腈-0. 40mol/L磷酸 鹽緩沖液=50 50，流速l.OmL/min，柱溫30°C。利用該方法，12分鐘樣品即可分析完畢， 主成分峰明顯，柱壓無明顯變化，能較好的確保提取過程中間樣品的檢測。實施例6用分析天平稱量提取終端產(chǎn)品(未精制，含量約95% ) 12mg，置于10mL容量瓶中， 加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度lmg/mL的環(huán)孢菌素溶液。然后取對照品用流 動相分別配成濃度0. lmg/mL和0. 5mg/mL的溶液，利用外標(biāo)法作標(biāo)線。用反相HPLC方法分析經(jīng)過處理的環(huán)孢菌素A粗品溶液。色譜柱為Alltima HP C8 反相柱(5um，250mmX4. 6mm)，紫外檢測器，檢測波長190nm，流動相乙腈-0. 50mol/L磷酸 鹽緩沖液(PH2.7) =70 30，流速l.OmL/min，柱溫30°C。利用該方法，12分鐘樣品即可 分析完畢，主成分峰明顯，柱壓無明顯變化，能較好的確保提取過程中間樣品的檢測。
權(quán)利要求
一種環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其特征在于，色譜條件為色譜柱十八烷基鍵合硅膠的C8柱或C18柱；檢測波長190～380nm；流動相磷酸二氫鈉-乙腈緩沖液或磷酸二氫鈉-甲醇緩沖液。
2.如權(quán)利要求1所述的環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其特征在于，采用紫外檢測器 或二極管陣列檢測器。
3.如權(quán)利要求2所述的環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其特征在于，檢測波長為 190-230nm。
4.如權(quán)利要求1所述的環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其特征在于，流動相為 磷酸二氫鈉水溶液乙腈=20 % -40 % 60% -80%，或磷酸二氫鈉水溶液甲醇= 20% -40% 60%-0%，所述磷酸二氫鈉水溶液的濃度為0.01 0. 50mol/L，磷酸調(diào)pH值 為 2. 0 3. 0。
5.如權(quán)利要求4所述的環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其特征在于，流動相為磷酸二 氫鈉水溶液乙腈=30% 70%，所述磷酸二氫鈉水溶液的濃度為O.Olmol/L，磷酸調(diào)pH 值為2.7。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其特征在于，流速為 0. 5ml/min 1. 5ml/min,柱溫為 25 35°C。
7.如權(quán)利要求6所述的環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，其特征在于，流速為1.Oml/ min，柱溫為30°C。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)孢菌素A單位的HPLC分析檢測方法。本發(fā)明提出了一種環(huán)孢菌素A的高效液相檢測方法，所述高效液相檢測方法采用如下色譜條件色譜柱十八烷基鍵合硅膠的C8柱或C18柱；檢測波長190～380nm，優(yōu)選190-230nm；流動相磷酸二氫鈉-乙腈緩沖液或磷酸二氫鈉-甲醇緩沖液。本發(fā)明的HPLC分析方法，可以進(jìn)行多個環(huán)孢菌素A樣品的分析，之間的相互干擾大大減少，極大的提高了環(huán)孢菌素A樣品分析的準(zhǔn)確性和快速性。
文檔編號A61K38/13GK101852781SQ20091013200
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日
發(fā)明者趙志全 申請人:魯南制藥集團(tuán)股份有限公司