專利名稱：高純度環(huán)孢菌素a的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗生素的制備方法，該方法適用于醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域中背景技術(shù)本發(fā)明涉及一種新的高純度環(huán)孢菌素A的制備方法，該方法適用于醫(yī)藥工業(yè)中。根據(jù)該方法可以經(jīng)濟(jì)有利地制備醫(yī)藥上可接受的高純度的生物活性物質(zhì)即環(huán)孢菌素A(結(jié)構(gòu)式見下圖)，其完全符合美國藥典USP 27，歐洲藥典等的純度要求。
環(huán)孢菌素A環(huán)孢菌素是一類由真菌產(chǎn)生的環(huán)狀寡肽，其除了有環(huán)孢菌素A外還有B、C、D、U、L等20多種化合物，可以用字母A-Z來表示(Helv.Chim.Acta 70，1987)。環(huán)孢菌素這類化合物最早是在瑞士專利CH 589，716和CH 603，790中報道用Cylindrocarpon lucidum Booth和Trichoclerma polysporum Rifai發(fā)酵產(chǎn)生的。在所有的環(huán)孢菌素當(dāng)中，環(huán)孢菌素A(CsA)是首先從真菌培養(yǎng)物中分離出來的環(huán)孢菌素(Helv.Chim.Acta.59，1976)，起先它是因?yàn)榫哂锌咕钚远魂P(guān)注，后來又發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的免疫抑制活性(J.F.Borel et al.Immunology.32，1977)，這具有劃時代的意義，后來還陸續(xù)證明，CsA還具有抗炎癥、殺蟲等功效。
目前，CsA作為一種突出的免疫抑制劑已經(jīng)廣為接受，因此對于CsA的制備工藝革新也是人們不遺余力的追求。
當(dāng)前CsA主要是通過微生物發(fā)酵的方法獲得，其產(chǎn)生菌除了上述兩篇瑞士專利所提的菌外，還有Tolypocladium varium(HU 201，577)，Beaurveria nivea，F(xiàn)usarium nivale(US2003/0,186,856A1)等多種微生物。在含有活性物質(zhì)CsA的發(fā)酵液中除了含有CsA外，還含有B、C、D等其它幾種環(huán)孢菌素以及培養(yǎng)基成分、消泡劑、各種菌體代謝物等其它雜質(zhì)。怎樣獲得高純度、高收率的CsA的分離提取工藝革新則是CsA制備工作的重點(diǎn)。
通常，從發(fā)酵液中獲得產(chǎn)品是通過一系列的溶劑萃取來實(shí)現(xiàn)的，可以先將發(fā)酵液經(jīng)過離心、膜分離等使得固液分離，然后用溶劑(通常是甲醇、丙酮等)將活性成分從菌絲體萃取至溶劑中。另外還有一種方法是發(fā)酵液無需固液分離而直接加入與水不互溶的溶劑進(jìn)行萃取。這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，前一種方法可以驅(qū)除大部分的水溶性色素以及其它水溶性雜質(zhì)，后一種方法則是可以節(jié)約一步操作，從而節(jié)約成本。但是往往在操作過程中易形成乳化給后續(xù)操作帶來一定的難度，而且因?yàn)闆]有驅(qū)除水分，也在一定程度上增加了溶劑的消耗。
在活性成分萃取至有機(jī)相后，通常需要進(jìn)行脫脂等操作，可參見瑞士專利CH 589,716和德國專利DD 2,455,859。然后再經(jīng)一系列的萃取反萃操作后，將其活性成分真空干燥得到主要含有環(huán)孢菌素類物質(zhì)的CsA粗品。
CsA粗品中主要雜質(zhì)就是與其結(jié)構(gòu)上異常相似的B、C、D等環(huán)孢菌素，為此通常需要經(jīng)過一系列的層析分離才能得到純度較高的CsA產(chǎn)品。這些步驟不僅增加了工藝的復(fù)雜性而且也大大增加了成本。此外，使用的層析溶劑有許多是氯仿、甲苯等物質(zhì)，同時也給環(huán)境保護(hù)帶來了很大的壓力。層析過程使用的介質(zhì)除了硅膠外，還有許多工藝采用了十分昂貴的Sephadex LH20(US 5,656,459、US 2003/0,186,856A1等)以及采用材質(zhì)較脆難于工業(yè)化使用的氧化鋁(US 4,117,118、DD298,276等)。當(dāng)然，也有只采用一次層析分離CsA的專利報道，如US 5,382,655和WO 92/13094以及WO 96/12031等。但是有些是粗提液需要在上柱前進(jìn)行熱處理，而且最后產(chǎn)品的純度也達(dá)不到要求。因?yàn)槿狈ο鑼?shí)的數(shù)據(jù)資料，目前仍不能精確的對這些方法進(jìn)行判斷。
在CsA的粗品提純工藝中，除了采用硅膠60、氧化鋁或者Sephadex LH20作為介質(zhì)的層析工藝外，還有用超臨界流體萃取(參見US5,976,381等)，吸附樹脂XAD系列(參見WO97/46575)等進(jìn)行分離的報道。但是往往因?yàn)槌杀靖呋虍a(chǎn)品回收率低而不能得到廣泛認(rèn)同。
通常醫(yī)藥級的CsA在經(jīng)過色譜分離后，往往需要經(jīng)過結(jié)晶或重結(jié)晶等步驟才可以得到成品。通常CsA的固態(tài)存在形式有無定形和晶體形態(tài)兩種。而其晶體形態(tài)又有四角錐形和斜方晶形兩種(參見加拿大專利CA 1,341，396)。四角錐形晶體含有兩個分子的結(jié)晶水，參見奧地利專利AT 353,961。斜方晶體是通過一系列的重結(jié)晶步驟后再通過較長時間的結(jié)晶而得到的，這種晶體中有許多溶劑存在。

發(fā)明內(nèi)容
我們在長期的實(shí)踐過程中發(fā)現(xiàn)，CsA經(jīng)過幾步簡單的前期處理后，可在濃度很高的情況下在丙酮/己烷/水的環(huán)境中結(jié)晶出無色的，得率純度均較高的斜方晶體。為此，本發(fā)明綜合現(xiàn)有專利的優(yōu)缺點(diǎn)，以結(jié)晶為主要突破點(diǎn)，設(shè)計一條十分簡單的工藝路線。首先結(jié)合了現(xiàn)有路線的特點(diǎn)，直接用丙酮對發(fā)酵液進(jìn)行溶劑萃取。這與以往工藝相比節(jié)省了固液膜分離操作，同時也無須用無水硫酸鎂等進(jìn)行脫水，大大節(jié)約了成本。在將CsA轉(zhuǎn)移至丙酮后，驅(qū)除出部分丙酮后采用不溶于水的己烷進(jìn)行萃取，再經(jīng)過兩步操作后，基本將產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至有機(jī)相。這步操作不光驅(qū)除了大部分的色素還同時驅(qū)除了水以及許多水溶性的雜質(zhì)。將得到的己烷相經(jīng)過濃縮，再加入一定體積的丙酮與水，在-5℃左右進(jìn)行結(jié)晶。經(jīng)過約3天左右的時間可以得到無色的斜方晶體。將晶體過濾同時用水、己烷進(jìn)行洗滌然后溶于一定體積的乙酸乙酯，而后直接用硅膠60一步柱層析進(jìn)行分離雜質(zhì)。在取得CsA的洗脫級份后，將之進(jìn)行濃縮加入一定體積的丙酮在-15℃的環(huán)境中進(jìn)行重結(jié)晶即可獲得符合USP27等藥典要求的CsA產(chǎn)品。
本發(fā)明的核心部分就是路線中間的結(jié)晶操作，通過此操作不僅可以驅(qū)除大部分的色素及脂肪，還可以驅(qū)除部分其它分離方法很難分離的環(huán)孢菌素雜質(zhì)，為下一單元的一步柱層析分離創(chuàng)造了條件。本工藝路線同以往的路線相比，做到了一步色譜分離得到純品，并大大簡化了工藝步驟，同時都使用了常規(guī)溶劑減少了對環(huán)境的危害，同時因?yàn)槿軇╊悇e少也方便了其回收再利用，從而大大節(jié)約了成本。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明由下述實(shí)施例進(jìn)一步說明，但不僅限于以下實(shí)施例所表述的內(nèi)容。
實(shí)施例15L丙酮加入至2L的發(fā)酵液中(CsA的濃度為5.104mg/ml)，過濾得到含CsA的丙酮溶液。真空濃縮完全驅(qū)除出丙酮，加入1.5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，然后蒸干有機(jī)相。將其溶于100ml的丙酮并加入一定體積的水和正己烷，經(jīng)過兩次正己烷萃取后合并己烷相并濃縮至一定體積。加入一定體積的丙酮與水，將其置于-5℃的環(huán)境下靜置約3天，即可見到大量無色斜方形晶體。在過濾洗滌完晶體后，將其溶于50ml的乙酸乙酯中，并將其進(jìn)行硅膠60的柱層析分離驅(qū)除其它環(huán)孢菌素類雜質(zhì)。在得到約2L的乙酸乙酯洗脫級份后，加入一定量的活性炭進(jìn)行脫色。脫色完液體進(jìn)行真空干燥并溶于約30ml的丙酮置于-15℃的環(huán)境里結(jié)晶，將晶體過濾洗滌后即是可以達(dá)到要求的CsA產(chǎn)品(5.62g，純度高于98.5％)。
實(shí)施例25L丙酮加入至2L的發(fā)酵液中(CsA的濃度為5.363mg/ml)，過濾得到含CsA的丙酮溶液。真空濃縮至一定體積后，加入等體積的正己烷萃取兩次，合并正己烷相并濃縮至一定體積。其后操作同實(shí)施例1，最后得到達(dá)到純度的CsA產(chǎn)品(6.96g，純度高于98.5％)。
實(shí)施例35L丙酮加入至2L的發(fā)酵液中(CsA的濃度為4.852mg/ml)，過濾得到含CsA的丙酮溶液。其后操作同實(shí)施例2。最后得到6.02gCsA產(chǎn)品，純度高于98.5％。
權(quán)利要求
1.一種從含有環(huán)孢菌素A(CsA)的發(fā)酵液中制備純度達(dá)到USP27等藥典要求的醫(yī)藥級CsA的方法，其特征在于所包含的工藝步驟有加入丙酮將CsA從固相轉(zhuǎn)移至液相；驅(qū)除全部或部分丙酮并用乙酸乙酯或正己烷將CsA轉(zhuǎn)移至有機(jī)相；在合適的環(huán)境里進(jìn)行結(jié)晶；對獲得的晶體進(jìn)行進(jìn)一步的硅膠柱層析純化；收集CsA級份進(jìn)行脫色或者直接重結(jié)晶得到產(chǎn)品。
2.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于發(fā)酵液不經(jīng)固液分離而直接加入丙酮進(jìn)行處理。
3.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在發(fā)酵液經(jīng)過丙酮處理后，可以驅(qū)除部分或全部的丙酮減輕后續(xù)的萃取操作所需的溶劑量。
4.據(jù)權(quán)利要求1或3的方法，其特征在于將CsA從含有水的相轉(zhuǎn)移至有機(jī)相所使用的溶劑是正己烷或乙酸乙酯，萃取操作進(jìn)行兩次或更多以提高CsA得率。
5.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于CsA第一次結(jié)晶的條件為溫度為-5℃，溶劑為含有一定配比的丙酮、水和正己烷，時間為3天或稍長。
6.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于硅膠柱層析的洗脫溶劑為乙酸乙酯。
7.據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于CsA產(chǎn)品結(jié)晶的條件為-15℃，溶劑為丙酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的高純度環(huán)孢菌素A的制備方法，該方法適用于醫(yī)藥工業(yè)中。根據(jù)該方法可以經(jīng)濟(jì)有利地制備醫(yī)藥上可接受的高純度的生物活性物質(zhì)即環(huán)孢菌素A，其完全符合美國藥典USP 27，歐洲藥典等的純度要求。
文檔編號C07K1/36GK1763084SQ20051010809
公開日2006年4月26日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者趙志全, 徐正軍 申請人:山東新時代藥業(yè)有限公司