在氨基酸1和3位修改的環(huán)孢菌素類似分子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了根據(jù)下式(I)的包含氨基酸1和3位取代基修改的環(huán)孢菌素A類似物。所公開的化合物包括對親環(huán)素包括親環(huán)素A具有親和性的化合物，且所述化合物與環(huán)孢菌素A及其僅在1位改性的類似物相比降低了免疫抑制性。
【專利說明】在氨基酸1和3位修改的環(huán)孢菌素類似分子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及屬于環(huán)孢菌素家族的新類似物的分子，包括環(huán)孢菌素A(CsA)的類似物和包括具有降低的或沒有免疫抑制活性且結(jié)合親環(huán)素(CyP)的類似物。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)孢菌素是具有有效免疫抑制劑活性的環(huán)狀多肽種類的成員。至少部分這類化合物(如環(huán)孢菌素A(CsA))是由物種多孢木屬真菌{Tolypocladium inf latum)的次級代謝物產(chǎn)生的。CsA為有效的免疫抑制劑，已證明其能抑制體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，諸如同種異體移植物排斥、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎、弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎和移植物抗宿主疾病。其被用于在器官移植中預(yù)防器官排斥；以及用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和用于治療銀屑病。
[0003]盡管環(huán)孢菌素家族中許多化合物是已知的，但CsA可能是醫(yī)學(xué)上最廣泛應(yīng)用的化合物。CsA的免疫抑制效應(yīng)涉及抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的激活事件。免疫抑制是通過環(huán)孢菌素與普遍存在的稱為親環(huán)素(cyclophilin) (CyP)的胞內(nèi)蛋白相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。該復(fù)合物又抑制鈣神經(jīng)素酶的鈣和鈣調(diào)蛋白-依賴性絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶的活性。鈣神經(jīng)素的抑制阻止轉(zhuǎn)錄因子如NFATP/。和NF-K B的激活，這對于T細(xì)胞激活中細(xì)胞因子基因iJL-2、IFN_Y、IL-4和GM-CSF)的誘導(dǎo)是必需的。
[0004]自從最初發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素以來，已經(jīng)分離和鑒定了廣泛多樣的天然存在的環(huán)孢菌素。另外，已經(jīng)通過部分或完全合成手段和通過應(yīng)用改良的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備了許多非天然存在的環(huán)孢菌素。因此，包含環(huán)孢菌素的物種基本上包括例如天然存在的環(huán)孢菌素A?Z ;多種非天然存在的環(huán)孢菌素衍生物；人工或合成的環(huán)孢菌素，包括二氫環(huán)孢菌素和異環(huán)孢菌素；衍生的環(huán)孢菌素(例如MeBm`t殘基的3’ -O-原子可被?；?，或3-位肌氨?；鶜埢峡梢肫渌〈?;其中MeBmt殘基存在異構(gòu)形式的環(huán)孢菌素(例如其中MeBmt殘基位置6’和7’位置上的構(gòu)型為順式而非反式)；和其中肽序列中特定位置上摻入變體氨基酸的環(huán)孢菌素。
[0005]在位置I含有改性氨基酸的環(huán)孢菌素類似物公開于WO 99/18120和WO 03/033527中，在此將其全文引入作為參考。這些申請描述了稱為“ ISATX247 ”或“ ISA247 ”或“ ISA”的環(huán)孢菌素衍生物。該類似物除了在氨基酸I位殘基上的修改外，結(jié)構(gòu)上與環(huán)孢菌素A相同。 申請人:先前發(fā)現(xiàn)，ISA247的順式和反式異構(gòu)體的一些混合物(包括主要包含反式ISA247的混合物)顯示出增強(qiáng)免疫抑制性效力和降低毒性的組合作用，優(yōu)于天然存在和目前已知的環(huán)孢菌素。
[0006]已經(jīng)確定環(huán)孢菌素有三個(gè)細(xì)胞靶標(biāo)；鈣神經(jīng)素，CyP亞型(包括但不限于CyP-A、CyP-B和CyP-D)，和P-糖蛋白(PgP)。環(huán)孢菌素與鈣神經(jīng)素的結(jié)合導(dǎo)致顯著的免疫抑制，且負(fù)責(zé)與移植和自體免疫跡象的傳統(tǒng)聯(lián)系。
[0007]親環(huán)素家族
CyPs(酶學(xué)委員會(huì)(EC)編號5.1.2.8)屬于一類蛋白質(zhì)，具有肽酰-脯氨酰順-反式異構(gòu)酶活性；這種蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為親免素，并包括FK-506-結(jié)合蛋白質(zhì)和小細(xì)胞蛋白(parvulins) □ CyPs被發(fā)現(xiàn)在所研究的所有生物體(原核生物和真核生物)的所有細(xì)胞中，且在進(jìn)化中是結(jié)構(gòu)上保守的。人類有7種主要CyPs，即CyP-A、CyP-B.CyP_C、CyP-D.CyP-E.CyP-40、和CyP_NK(首次從人天然殺傷細(xì)胞中鑒定出來)，總計(jì)16種獨(dú)特的蛋白質(zhì)(Galat A.Peptidylprolyl cis/trans isomerases (immunophilins): biologicaldiversity - targets - functions.Curr Top Med Chem 2003， 3:1315-1347 ；WaldmeierPC 等.Cyclophilin D as a drug target.Curr Med Chem 2003，10:1485-1506)。
[0008]在哺乳動(dòng)物中鑒定的第一個(gè)CyPs成員是CyP-A。CyP-A是18_kDa的細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)，且是CsA結(jié)合的最豐富蛋白質(zhì)。據(jù)估計(jì)，CyP-A組成0.6%的總細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)(Mikol
V等.X-ray structure of monmeric cyclophilin A-cycloporin A crystal complexat 2.1 A resolution.J.MoL Biol.1993，234:1119-1130 ;Galat A，MetcalfeSM.Peptidylproline cis/trans isomerases.Prog.Biophys.MoL Biol.1995，63:67-118)o
[0009]親環(huán)素的細(xì)胞位置
CyPs可發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)組織的大多數(shù)細(xì)胞腔隙中，且編碼獨(dú)特的功能。在哺乳動(dòng)物中，CyP-A和CyP-40是細(xì)胞溶質(zhì)的，而CyP-B和CyP-C具有氨基-末端的信號序列，使其革巴向于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)分泌途徑(綜述于Galat，2003 ；Dornan J等.Structuresof immunophilins and their ligand complexes.Curr Top Med Chem 2003，3:1392-1409)。CyP-D 具有信號序列，使其指向線粒體(Andreeva L 等.Cyclophilins andtheir possible role in the stress response.1nt J Exp Pathol 1999， 80:305—315 ；Hamilton GS 等.1mmunophilins: beyond immunosuppression.J Med Chem 1998，41:5119-5143) ； CyP-E具有氨基-末端的RNA-結(jié)合域，且位于胞核(Mi H等.A nuclearRNA-binding cyclophilin in human T cells.FEBS Lett 1996， 398:201-205)，和 CyP-40 具有 TPRs，且位于胞液(Kieffer LJ 等.cyclophilin-40，a protein withhomology to the P59 component of the steroid receptor complex.Cloning of thecDNA and further characterization.J Biol Chem 1993， 268:12303-12310)。人CyP-NK是最大的CyP，具有巨大的親水性和帶正電荷的羧基端，且位于胞液(Anderson SK等.Α cyclophiI in-related protein involved in the function of natural killercells.Proc Natl Acad Sci USA 1993，90:542-546 ;Rinfret A 等.The N-terminalcyclophiI in-homologous domain of a 150-kilodalton tumor recognition moleculeexhibits both peptidylprolyl cis transisomerase and chaperone activities.Biochemistry 1994， 33:1668-1673)。
[0010]親環(huán)素的功能與活性
CyPs是在許多細(xì)胞過程中涉及的多功能蛋白質(zhì)。因?yàn)镃yPs在進(jìn)化中`始終是高度保守的，這表明CyPs有至關(guān)重要的作用。最初，人們發(fā)現(xiàn)CyPs具有催化肽基_脯氨酰鍵順反異構(gòu)化的特異酶性能(Galat，1995 ；Fisher GA 等.A phase I study of paclitaxel(taxol) (T) in combination with SDZ valspodar, a potent modulator of multidrugresistance (MDR).Anti cancer Drugs.1994 ；5 (Suppl I): 43)。因此，CyPs 被稱為妝酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶(PPI酶)，它可以在新合成的蛋白質(zhì)固有折疊中充當(dāng)加速因子，PPI酶也參與修復(fù)由于環(huán)境應(yīng)激受損的蛋白質(zhì)，所述環(huán)境應(yīng)激包括熱應(yīng)激、紫外線照射、細(xì)胞環(huán)境的PH變化、和用氧化劑的治療。此功能被稱為分子陪伴活性(Yao Q等.Rolesof cyclophilins in Cancers and Other Organs Systems.World J.Surg.2005, 29:276-280)。
[0011]此外，最近顯示，CyPs的PPI酶活性涉及不同的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸(Andreeva, 1999 ；Caroni P 等.New member of the cyclophilin familyassociated with the secretory pathway.J Biol Chem 1991，266:10739-42)、線粒體功會(huì)泛(Halestrap AP 等.CsA binding to mitochondrial cyclophilin inhibitsthe permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury.Mol Cell Biochem 1997， 174:167-72 ;Connern CPj HalestrapAP.Recruitment of mitochondrial cyclophilin to the mitochondrial innermembrane under conditions of oxidative stress that enhance the opening of acalcium-sensitive non-specific channel.Biochem J 1994，302:321-4)、mRNA 前體力口工(Bourquin JP等.Α serine/argininerich nuclear matrix cyclophilin interactswith the Cterminal domain of RNA polymerase I1.Nucleic Acids Res 1997，25:2055-61)、和多蛋白復(fù)合體穩(wěn)定性維護(hù)(Andreeva，1999)。
[0012]環(huán)孢菌素在疏水口袋內(nèi)經(jīng)由接觸以納摩爾親和力結(jié)合CyP-A (Colgan J等.Cyclophilin A-Deficient Mice Are Resistant to Immunosuppression byCyclosporine.The Journal of Immunology 2005， 174: 6030-6038， Mikolj 1993)，并抑制PPI酶活性。然而，這種效應(yīng)被認(rèn)為是與免疫抑制不相關(guān)的。更正確地，CsA和CyP-A之間的復(fù)合體建立了組合表面，其結(jié)合并阻止鈣神經(jīng)素調(diào)控細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄(Friedman J等.Two cytoplasmic candidates for immunophilin action are revealedby affinity for a new cyclophilin: one in the presence and one in the absenceof CsA.Cell 1991，66: 799-806 ；Liu J 等.Calcineurin is a common target ofcyclophiIin-CsA and FKBP-FK506 complexes.Cell 1991 ， 66: 807-815)。
`[0013]親環(huán)素的同源性
CyP-A，典型的家族成員，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高度保守的蛋白質(zhì)(Handschumacher RE等.Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for CsA.Science 1984，226: 544-7)。人CyP-A的序列同源性分析顯示，其與人CyP_B、CyP_C、和CyP-D是高度同源的(Harding MWj Handschumacher RE，Speicher DW.1solation and amino acidsequence of cyclophilin.J Biol Chem 1986，261:8547-55)。通過高度保守區(qū)域的約109個(gè)氨基酸，形成了所有CyPs的環(huán)孢菌素結(jié)合口袋。已知的CyPs中，CyP-D具有與CyP-A的最高同源性。事實(shí)上，CyP-A和CyP-D之間在這一區(qū)域的序列同一性是2003 ;Kristal BS 等.The Mitochondrial Permeability Transition as a Target forNeuroprotection.Journal of Bioenergetics and Biomembranes 2004， 36 ( 4)；309-312)。因此，CyP-A親和性是CyP-D親和性非常好的預(yù)言者，反之亦然(Hansson MJ等.The Nonimmunosuppressive Cyclosporine analogues NIM811 and UNIL025 DisplayNanomolar Potencies on Permeability Transition in Brain-Derived Mitochondria.Journal of Bioenergetics and Biomembranes， 2004, 36 (4): 407-413)。這種關(guān)系已經(jīng)反復(fù)得到環(huán)孢菌素類似物的經(jīng)驗(yàn)性證明(Hansson，2004 ；Ptak Rg等.1nhibition ofHuman Immunodeficiency Virus Type I Replication in Human Cells by Debio-025,a Novel Cyclophilin Binding kgent.Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2008:1302-1317 ；Millay DP 等.Genetic and pharmacologic inhibition of mitochondrialdependent necrosis attenuates muscular dystrophy.Nature Medicine 2008， 14(4):442-447 ；Harris R 等.The Discovery of Novel Non-1mmunosuppressive CyclosporineEthers and Thioethers With Potent HCV Activity.Poster # 1915， 59th AnnualMeeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD),2008)。CyPs的序列同源性提議，所有CyPs是環(huán)孢菌素類似物的潛在靶標(biāo)。因?yàn)镃yPs涉及的眾多細(xì)胞過程，這進(jìn)一步提議，保持顯著結(jié)合CyP的CsA類似物可用于治療許多疾病的適應(yīng)證。
[0014]親環(huán)素介導(dǎo)的疾病
人免疫缺陷病毒(HIV):
HIV是逆轉(zhuǎn)錄病毒家族的慢病毒屬，并在某些病毒感染和復(fù)制過程中充當(dāng)CyP參與的實(shí)例。CyP-A在十年前就已被確定為抗HIV化療中有效的祀標(biāo)(Rosenwirth BA等.Cyclophilin A as a novel target in ant1-HIV-1 chemotherapy.1nt.Antivir.News 1995，3:62-63)。CyP-A在HIV-1復(fù)制周期中滿足早期的基本功能。它被發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合 HIV-1 Gag 多聚蛋白(Luban JKL 等.Human immunodeficiency virus type
IGag protein binds to cyclophilins A and B.Cell 1993，73: 1067-1078)。衣殼蛋白p24(CA)的G89和P90周圍確定的氨基酸序列被鑒定為CyP-A的結(jié)合位點(diǎn)(Bukovsky AAA 等.Transfer of the HIV-1 cyclophiI in-binding site to simianimmunodeficiency virus from Macaca mulatta can confer both cyclosporinesensitivity and cyclosporine dependence.Proc.Natl.Acad.ScL USA 1997，94:10943-10948 ；Gamble TRF 等.Crystal structure of human cyclophilin A bound tothe amino-terminal domain of HIV-1 capsid.Cell 1996， 87: 1285-1294)。 CyP-A 對CA的親和力促進(jìn)CyP-A在組裝中摻入病毒體顆粒(Thali MA等.Functional associationof cyclophilin A with HIV-1 virions.Nature 1994，372: 363-365)。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，CyP-A-CA的相互作用是HIV-1復(fù)制必不可少的；抑制這種相互作用會(huì)損害人類細(xì)胞中HIV-1 的復(fù)制(Hatziioannou TD 等.Cyclophilin interactions with incoming humanimmunodeficiency virus type I capsids with opposing effects on infectivity inhuman cells.J.Virol.2005，79: 176-183 ;Steinkasserer AR 等.Mode of actionof SDZ NIM 811， a nonimmunosuppressive CsA analog with activity against humanimmunodeficiency virus type I (HIV-1):1nterference with early and late eventsin HIV-1 replication.J.Virol 1995, 69: 814-824)。在CyP-A涉及的病毒復(fù)制周期中的步驟被證明是在病毒顆粒滲透后和雙鏈病毒DNA整合到細(xì)胞基因組前的事件(BraatenDEK 等.Cyclophilin A is required for an early step in the life cycle of humanimmunodeficiency virus type I before the initiation of reverse transcription.J.Virol 1996 70: 3551-3560 ；Mlynar ED 等.The non-1mmunosuppressive CsAanalogue SDZ NIM 811 inhibits cyclophilin A incorporation into virions andvirus replication in human immunodeficiency virus type 1—infected primaryand growth-arrested T cells.J.Gen.Virol 1996，78: 825—835 ;Steinkasserer，1995) o CsA 抗 HIV-1 的活性首先報(bào)道于 1988 年(Wainberg MA 等.The effect of CsAon infection of susceptible cells by human immunodeficiency virus type 1.Blood 1998，72: 1904-1910)。對CsA和許多衍生物抑制HIV-1復(fù)制的評價(jià)揭示了非免疫抑制的CsA類似物具有抗HIV-1的活性，其相當(dāng)于或者甚至優(yōu)于那些免疫抑制的類似物(Bartz SRE 等.1nhibition of human immunodeficiency virus replication bynon immunosuppressive analogs of CsA.Proc.Natl.Acad.ScL USA 1995， 92:5381-5385，Billich AF等.Mode of action of SDZ NIM 811，a nonimmunosuppressiveCsA analog with activity against human immunodeficiency virus (HIV) type 1:1nterference with HIV protein-cyclophilin A interactions.J.Virol 1995， 69:2451-2461 ;Ptak， 2008)。
[0015]炎癥
疾病中的炎癥涉及白細(xì)胞(白血細(xì)胞)流入感染區(qū)域。白細(xì)胞被趨化因子(化學(xué)吸引劑家族)吸引到該區(qū)域。體外研究表明，細(xì)胞外的CyP-A是人白細(xì)胞和T細(xì)胞的有效化學(xué)吸弓I劑(Kamalpreet A Extracellular cyclophilins contribute to the regulationof inflammatory responses Journal of Immunology 2005 ；175: 517—522 ；YurchenkoVG 等.Active-site residues of cyclophilin A are crucial for its signalingactivity via CD147.J.BioL Chem.2002 ；277: 22959-22965 ;Xu QMC 等.Leukocytechemotactic activity of cyclophilin.J.Biol.Chem.1992 ；267: 11968-11971;Allain FC 等.Interaction with glycosaminoglycans is required for cyclophilinB to trigger integrin-mediated adhesion of peripheral blood T lymphocytesto extracellular matrix.Proc.Natl.Acad.ScL USA 2002 ；99: 2714-2719)。此外，當(dāng)體內(nèi)注入時(shí)，CyP-A可誘導(dǎo)迅速的其特征在于白細(xì)胞流入的炎癥應(yīng)答(Sherry BN等.1dentification of cyclophilin as a proinflammatory secretory product oflipopoIysaccharide-activated macrophages.Proc.Natl.Acad.ScL USA 1992 ；89:3511-3515)。CyP-A普遍分布在細(xì)胞內(nèi)，然而在炎癥應(yīng)答過程中，CyP-A通過活的和瀕死的細(xì)胞釋放到細(xì)胞外組織間隙(Sheiry，1992)。事實(shí)上，在幾種不同的炎癥性疾病(包括敗血癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)和血管平滑肌細(xì)胞疾病中，已經(jīng)報(bào)告了升高水平的CyP-A(Jin ZG等.Cyclophilin A is a secreted growth factor induced by oxidative stress.Circ.Res.2000 ；87: 789-796 ；Teger, 1997 ；Billich, 1997)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的情形中，報(bào)道了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑液中的CyP-A水平和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量之間的正相關(guān)性(Billich，1997)。
[0016]癌癥
最近在許多癌癥組織和細(xì)胞系中，包括但不限于在小和非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌和乳腺癌中，CyP-A顯示出過度表達(dá)(Li, 2006 ；Yang H等.Cyclophilin A isupregulated in small cell lung cancer and activates ERK1/2 signal.Biochemicaland Biophysical Research Communications 2007 ；361:763-767 ；Campa, 2003)。在提供外源性CyP-A的情況下，顯示出刺激癌細(xì)胞的生長(Li，2006 ；Yang, 2007)，而CsA阻止該生長(Campa，2003)。最近，已經(jīng)證明了 CyP(A和B)錯(cuò)綜復(fù)雜地參與允許人乳腺癌細(xì)胞生長的生化途徑，和CyP敲除實(shí)驗(yàn)降低了癌細(xì)胞的生長、增殖和運(yùn)動(dòng)(Fang F等.The expression of Cyclophilin B is Associated with Malignant Progressionand Regulation of Genes Implicated in the Pathogenesis of Breast Cancer.TheAmerican Journal of Pathology 2009 ；174 (I): 297-308 ； Zheng J等.Prolyl IsomeraseCyclophilin A Regulation of Janus-Activated Kinase 2 and the Progression ofHuman Breast Cancer.Cancer Research 2008 ；68 (19): 7769-7778)。最有趣地，CsA治療異種移植乳腺癌細(xì)胞的小鼠，誘發(fā)了腫瘤壞死和完全地抑制轉(zhuǎn)移(Zheng，2008)。研究人員得出“親環(huán)素B的作用可顯著地促成人乳腺癌的發(fā)病機(jī)制”和“親環(huán)素的抑制可能是一種人乳腺癌治療的新治療策略” (Fang, 2009 ；Zheng, 2008)。
[0017]丙型肝炎
丙型肝炎病毒(HCV)是世界上最普遍的肝臟疾病，被世界衛(wèi)生組織視為流行病。因?yàn)镠CV可以在被發(fā)現(xiàn)之前感染患者數(shù)十年，它通常被稱為“靜息的”流行病。研究表明，全世界超過2億人感染了 HCV，世界人口約3.3%的總發(fā)病率。僅在美國，近4百萬人感染或已經(jīng)感染HCV ;其中270萬人經(jīng)歷慢性感染。所有HCV感染個(gè)體處于正發(fā)展為嚴(yán)重威脅生命的肝臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。慢性丙型肝炎的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)治療為兩種廣義抗病毒劑聚乙二醇干擾素與利巴韋林組合的聯(lián)用(Craxi A等.Clinical trial results of peginterferons incombination with ribavirin.Semin Liver Dis 2003 ；23 (Suppl I): 35-46)。這種治療的失敗率約為 50% (MoIino BF.Strategic Research Institute: 3rd annual viralhepatitis in drug discovery and development world summit 2007.AMRI TechnicalReports ； 12 (I))。
[0018]最近已證實(shí)，CyP-B是HCV基因組有效復(fù)制的關(guān)鍵(Watashi K等.CyclophilinB Is a Functional Regulator of Hepatitis C Virus RNA Polymerase.Molecular Cell2005, 19: 111-122)。對于其有效的基因組復(fù)制，病毒依賴于宿主衍生的因子諸如CyP_B。CyP-B與HCV RNA聚合酶NS5B相互作用，以直接刺激其RNA結(jié)合活性。RNA干擾(RNAi)介導(dǎo)的內(nèi)源性CyP-B表達(dá)的減少和N`S5B結(jié)合CyP-B引起的損失均降低了 HCV的復(fù)制水平。因此，CyP-B充當(dāng)HCV復(fù)制機(jī)構(gòu)中NS5B的刺激調(diào)節(jié)劑。這種對病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)機(jī)制可鑒別CyP-B為抗病毒治療策略的靶標(biāo)。
[0019]不像HCV的其他治療，CyP抑制不直接靶向于HCV病毒。因此認(rèn)為，對CyP結(jié)合藥物的耐受將比目前HCV治療藥物出現(xiàn)得更慢(Manns MP等.The way forward inHCV treatment-finding the right path.Nature Reviews Drug Discovery 2007 ；6: 991-1000)。此外，通過在宿主-病毒相互作用水平的干擾，CyP抑制可能會(huì)打開抗HCV治療的新途徑，它不僅對干擾素為基礎(chǔ)的治療，而且對直接靶向HCV復(fù)制酶如蛋白酶和聚合酶抑制劑的未來治療均可為互補(bǔ)的(Flisiak R, Dumont JM, Crabbe R.Cyclophilin inhibitors in hepatitis C viral infection.Expert Opinion onInvestigational Drugs 2007, 16(9): 1345-1354)。影響 HCV 病毒復(fù)制的新型抗 HCV藥物的開發(fā)已顯著受礙于缺乏合適的實(shí)驗(yàn)室HCV模型。這一障礙最近通過開發(fā)幾種合適的細(xì)胞培養(yǎng)模型(Subgenomic HCV Replicon Systems)和含有人肝細(xì)胞的小鼠模型(Goto K等.Evaluation of the ant1-hepatitis C virus effects of cyclophilininhibitors, CsAj and NIM811.Biochem Biophys Res Comm 2006 ；343: 879-884;Mercer DF等.Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers.Nat Med 2001 ；7: 927-933)才得到克服。環(huán)孢菌素最近在篩選模型和小型臨床試驗(yàn)中被證實(shí)了抗 HCV 活性(Watashi K 等.CsA suppresses replication of hepatitis Cvirus genome in cultured hepatocytes.Hepa to logy 2003 ;38:1282—1288 ;Inoue K，Yoshiba M.1nterferon combined with cyclosporine treatment as an effectivecountermeasure against hepatitis C virus recurrence in liver transplantpatients with end—stage hepatitis C virus related disease.Transplant Proc2005 ；37:1233-1234)o
[0020]肌肉退行性障礙
CyP-D是所有細(xì)胞中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MTP)的組成部分。MTP孔的功能是提供細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)。在正常條件下，MTP孔的開放和關(guān)閉是可逆的。在涉及過量鈣流入細(xì)胞內(nèi)的病理?xiàng)l件下，這使線粒體超負(fù)荷且誘導(dǎo)MPT孔的不可逆開放，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。據(jù)報(bào)道，CsA在烏爾里希(Ullrich)先天性肌營養(yǎng)不良癥和Bethlam肌病的患者中糾正了其線粒體的功能障礙和肌細(xì)胞凋亡[(Merlini L 等.CsA corrects mitochondrial dysfunction andmuscle apoptosis in patients with collagen VI myopathies.PNAS 2008 ； 105 (13):5225-5229]。CsA已在體外證實(shí)了其劑量依賴性地抑制離體心肌線粒體的MTP開放，從而阻止細(xì)胞凋亡和允許細(xì)胞有寶貴的修復(fù)時(shí)間(Gomez L等.Inhibition of mitochondrialpermeability transition improves functional recovery and reduces mortalityfollowing acute myocardial infarction in mice Am J Physiol Heart Circ Physiol2007，293: H1654-H1661)。在58例存在急性心肌梗死患者的臨床研究中，與安慰劑所觀察的結(jié)果相比，證實(shí)了在再灌注時(shí)間施用CsA與較少的梗死相關(guān)(Piot C等.Effect ofCyclosporin on Reperfusion Injury in Acute Myocardial Infarction.New EnglandJournal of Medicine 2008 ；395 (5): 474-481))。
[0021]慢性神經(jīng)退行性疾病
`CsA可用作由于頭部外傷的急性腦缺血和損壞情況中的神經(jīng)保護(hù)劑(Ke印M等.1ntrathecal cyclosporine prolongs survival of late—stage ALS mice.BrainResearch 2001 ；894: 327-331)。相對在缺乏治療時(shí)只有10%存活率，經(jīng)CsA治療的動(dòng)物顯示出引人注目的80%的存活率。經(jīng)后來確定，這主要是Csk結(jié)合線粒體CyP-D的結(jié)果。經(jīng)隨后確定，CsA的效用延伸到慢性神經(jīng)退行性變,如同后來被盧伽雷(Lou Gerhig)氏病(ALS)的大鼠模型所證實(shí)(美國專利號5，972，924)，其中CsA治療增加了一倍以上的剩余壽命。最近還表明，在CyP-D敲除小鼠中CyP-D失活保護(hù)了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(多發(fā)性硬化癥的動(dòng)物模型)的軸突(Forte M等.Cyclophilin D inactivationprotects axons in experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model ofmultiple sclerosis.PNAS 2007 ； 104 (18): 7558-7563)。在阿爾茨海默氏病小鼠模型中，CyP-D缺乏基本上提高了學(xué)習(xí)、記憶和突觸的功能(Du H等.Cyclophilin D deficiencyattenuates mitochondrial and neuronal perturbation and ameliorates learning andmemory in Alzheimer’s disease Nature Medicine 2008, 14(10): 1097-1105)。此外，CsA在亨廷頓病大鼠模型中被證明是有效的(Leventhal L等.CsA protects striatalneurons in vitro and in vivo from 3-nitropropionic acid toxicity.Journal ofComparative Neurology 2000，425(4): 471-478)，和在帕金森病小鼠模型是部分有效的(Matsuura K等.CsA attenuates degeneration of dopaminergic neurons induced by6-hydroxydopamine in the mouse brain.Brain Research 1996， 733(1): 101-104)。因此，線粒體依賴性壞死代表突出的發(fā)病機(jī)制，提議抑制CyP-D可以提供這些疾病的新藥理學(xué)治療策略(Du，2008)。
[0022]由于細(xì)胞鈣離子(Ca2+)穩(wěn)態(tài)喪失的細(xì)胞、組織和器官的損傷
Ca2+在細(xì)胞水平上參與許多生理進(jìn)程，包括健康的線粒體功能。在某些病理?xiàng)l件如心肌梗死、中風(fēng)、急性肝毒性、膽汁淤積、和移植器官的存儲(chǔ)/再灌注損傷中，線粒體喪失調(diào)節(jié)鈣水平的能力，過多鈣累積在線粒體基質(zhì)中，導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜大量的孔開放(Rasola A等.The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in celldeath and in disease pathogenesis.Apoptosis 2007, 12: 815-833)。通過孔的高達(dá)1.5千道爾頓的離子和分子的非選擇性傳導(dǎo)，被稱為線粒體通透性轉(zhuǎn)變的過程，導(dǎo)致線粒體膨脹和達(dá)到細(xì)胞死亡包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的其他事件。MTP的成分之一是CyP-D。CyP-D是親免素分子，其異構(gòu)酶活性調(diào)節(jié)MPTP的開放，通過Csk或Csk類似物抑制異構(gòu)酶活性可抑制MPTP產(chǎn)生，從而防止細(xì)胞死亡。
[0023]非免疫抑制的環(huán)孢菌素類似物親環(huán)素抑制劑
盡管Csk在上述適應(yīng)證中的有利效應(yīng)，但免疫抑制伴發(fā)的效應(yīng)限制了 Csk作為CyP抑制劑在臨床實(shí)踐中的實(shí)用性。目前，只有少數(shù)CsA類似物已被證明有很少或降低的免疫抑制活性(即〈10%的CsA免疫抑制效能)，并仍然保留其結(jié)合CyP的能力(即與CsA相比>10%的結(jié)合能力)。
[0024]NIM 811 (Melle4 _ 環(huán)孢菌素)
NIM 811是真菌雪白彎頸霉{Tol`ypocladium niveum)的發(fā)酵產(chǎn)物,其在氨基酸4位上被修改并顯示無免疫抑制活性(由于缺乏鈣神經(jīng)素結(jié)合)，但保留對CyP-A的結(jié)合親和力(Rosenwirth BA 等.1nhibition of human immunodeficiency virus type Ireplication by SDZ NIM 811， a nonimmunosuppressive Cyclosporine Analogue.Antimicrob Agents Chemother 1994，38: 1763—1772)。
[0025]DEBIO 025 (MeAla3EtVal4-環(huán)孢菌素)
DEBIO 025是在氨基酸3和4位上雙元化學(xué)改性的CsA。DEBIO 025也顯示沒有免疫抑制活性，仍還保留對CyP-A PPI酶活性的結(jié)合親和力(Kristal，2004)。
[0026]SCY-635 (二甲氨基乙基硫代Sar3-羥基Leu4-環(huán)孢菌素)
SCY-635在氨基酸3和4位上雙元化學(xué)改性的CsA。SCY-635也顯示沒有免疫抑制活性，仍還保留對CyP-A PPI酶活性的結(jié)合親和力(PCT公布號W02006/039668)。
[0027]—般來說，這些化合物具有對負(fù)責(zé)結(jié)合鈣神經(jīng)素的CsA方面的修改，且一般需要修改氨基酸3和4位。氨基酸3和4位的修改是艱苦和復(fù)雜的，因?yàn)檫@一做法通常涉及開放環(huán)孢菌素的環(huán)、取代和/或修改這些氨基酸、然后閉合環(huán)以產(chǎn)生修改的環(huán)孢菌素。
[0028]與此相反，側(cè)鏈氨基酸I位的改性不需要打開環(huán)孢菌素的環(huán)。然而，氨基酸I位與CyP結(jié)合(而不是結(jié)合鈣神經(jīng)素)相關(guān)，且修改增加了 CsA的免疫抑制效果。例如美國專利號6，605，593公開了氨基酸I位的單一修改，其導(dǎo)致CsA類似物具有增加的免疫抑制效能。[0029]因此，容易合成的且在治療CyP介導(dǎo)的疾病中有效的環(huán)孢菌素類似分子(“CAM”)應(yīng)是令人想要擁有的。還令人想要地提供CsA類似物，該類似物提供至少一些CsA的原來功能，但它相對于原來的CsA具有改善的或額外的性質(zhì)、效果和功能。
[0030]發(fā)明概沭
根據(jù)一方面，本發(fā)明的化合物包括根據(jù)本文定義的非免疫抑制的環(huán)孢菌素A類似物。根據(jù)另一方面，本發(fā)明化合物對親環(huán)素包括親環(huán)素A具有親和性。根據(jù)其它方面，本發(fā)明的化合物包括環(huán)孢菌素A類似物，其對親環(huán)素介導(dǎo)的疾病或病癥是有用的，并發(fā)展了這些疾病或病癥的療法。
[0031]根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明涉及式L的化合物:
【權(quán)利要求】
1.式L的化合物:
2.權(quán)利要求1的化合物，其中取代基R1-R2選自:
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R2選自
4.權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)的化合物，其中R’為H。
5.權(quán)利要求1或4的化合物，其中基團(tuán)R1-R2包含2到5個(gè)碳的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪族鏈，其任選被選自氫、酮、羥基、腈、齒素、氧代、羧酸、酯、和1，3-二氧戊烷的取代基取代。
6.權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)的化合物，其中R23選自:
7. 權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)的化合物，其中R23包括任選取代的C1-C3烷基。
8. 權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)的化合物，其中R23被氨基取代。
9.權(quán)利要求7或8的化合物，其中R23為Cl-C3-Ala，且其中所述化合物包含D-差向異構(gòu)體。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中R23為MeAla。
11.權(quán)利要求10的化合物，其中式L中
12.權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)的化合物，其中R23是I-6個(gè)、I-5個(gè)、I-4個(gè)、I-3個(gè)或2個(gè)碳長度的直鏈或支鏈的脂肪族碳鏈。
13.藥物組合物，其包括權(quán)利要求1-12任何一項(xiàng)的化合物和一種或多種藥用賦形劑。
14.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中親環(huán)素介導(dǎo)的疾病的方法，其包括在治療親環(huán)素介導(dǎo)的疾
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病或損傷是由親環(huán)素過表達(dá)介導(dǎo)的，或該疾病是親環(huán)素先天性過表達(dá)的。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述親環(huán)素介導(dǎo)的疾病或損傷選自:病毒感染；炎癥性疾??；癌癥;肌肉障礙；神經(jīng)障礙；和與缺血、再灌注、細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)喪失、離子穩(wěn)態(tài)喪失、自由基生產(chǎn)增加、或誘導(dǎo)線粒體功能障礙的毒素相關(guān)的損傷；其中所述病毒感染任選是由選自以下的病毒引起的:人類免疫缺陷病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、SARS-CoV, hCoV-NL63、hCoV-HKU-K hCoV_0C43、hC0V-229E、冠狀病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、和傳染性胃腸炎病毒；其中所述炎癥性疾病任選地選自哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎癥、慢性前列腺炎、腎小球腎炎、過敏性疾病、炎性腸病、敗血癥、血管平滑肌細(xì)胞疾病、動(dòng)脈瘤、盆腔炎性疾病、再灌注損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植`排斥、和脈管炎；其中所述癌癥任選地選自小和非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、和前列腺癌；其中所述肌肉障礙任選地選自心肌再灌注損傷、肌營養(yǎng)不良癥、膠原VI肌病、心臟驟停后綜合征(PCAS)、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、和腹主動(dòng)脈瘤；其中所述神經(jīng)障礙任選地選自阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、多系統(tǒng)萎縮、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、中風(fēng)、糖尿病神經(jīng)病變、肌萎縮側(cè)索硬化(盧伽雷氏病)、雙相障礙、興奮毒性損傷、肝性腦病、低血糖、錳中毒、神經(jīng)元靶標(biāo)剝奪、毒性脂肪酸如花生四烯酸、機(jī)械性神經(jīng)損傷、脊髓損傷、和腦損傷；和其中所述與細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)喪失相關(guān)的損傷任選地選自心肌梗死、中風(fēng)、急性肝毒性、膽汁淤積、和移植器官的存儲(chǔ)/再灌注損傷。
17.制備式L化合物的方法，
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述式L的制備包括在所述溶劑中加入過量的LiCl以主要形成式L的L-差向異構(gòu)體，或所述式L的制備在LiCl缺失下進(jìn)行，以主要形成式L的D-差向異構(gòu)體。
19.權(quán)利要求17-18任何一項(xiàng)的方法，其中所述堿性烷基氨基鋰為二異丙基氨基鋰。
20.權(quán)利要求17-19任何一項(xiàng)的方法，其中所述親電試劑選自下表中定義的組，以生成所述表中提出的相應(yīng)R23:`
21.制備權(quán)利要求1中所定義式L的方法，其包括以下步驟:1)將式IA的化合物與二甲氨基吡啶在適當(dāng)?shù)娜軇┑拇嬖谙逻M(jìn)行反應(yīng)，以形成式2化合物
22.制備權(quán)利要求1中所定義式L的方法，其包括以下步驟:將其中R’和R1-R2如權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)中所定義的式5化合物與堿性烷基氨基鋰，在合適的親電試劑存在下，在適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行反應(yīng)，以形成式L的化合物，其中R23包括任選取代的C1-C3烷基.,MeLeu
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述堿性烷基氨基鋰為二異丙基氨基鋰.
24.權(quán)利要求1-12任何一項(xiàng)的化合物或權(quán)利要求13的組合物在制備治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中親環(huán)素介導(dǎo)的疾病或損傷的藥物中的用途.
25.權(quán)利要求24的用途，其中所述親環(huán)素介導(dǎo)的疾病或損傷選自:a.病毒感染；b.炎癥性疾??；c.癌癥；d.肌肉障礙；e.神經(jīng)障礙；和f.與缺血、再灌注、細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)喪失、離子穩(wěn)態(tài)喪失、自由基生產(chǎn)增加、或誘導(dǎo)線粒體功能障礙的毒素相關(guān)的損傷；其中所述病毒感染任選是由選自以下的病毒引起的:人類免疫缺陷病毒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、SARS-CoV, hCoV-NL63、hCoV-HKU-K hCoV_0C43、hC0V-229E、冠狀病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、和傳染性胃腸炎病毒；其中所述炎癥性疾病任選地選自哮喘、自身免疫性疾病、慢性炎癥、慢性前列腺炎、腎小球腎炎、過敏性疾病、炎性腸病、敗血癥、血管平滑肌細(xì)胞疾病、動(dòng)脈瘤、盆腔炎性疾病、再灌注損傷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植排斥、和脈管炎；其中所述癌癥任選地選自小和非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤、和前列腺癌；其中所述肌肉障礙任選地選自心肌再灌注損傷、肌營養(yǎng)不良癥、膠原VI肌病、心臟驟停后綜合征(PCAS)、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、和腹主動(dòng)脈瘤；其中所述神經(jīng)障礙任選地 選自阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、多系統(tǒng)萎縮、多發(fā)性硬化、大腦性麻痹、癲癇、中風(fēng)、糖尿病神經(jīng)病變、肌萎縮側(cè)索硬化(盧伽雷氏病)、雙相障礙、興奮毒性損傷、肝性腦病、低血糖、錳中毒、神經(jīng)元靶標(biāo)剝奪、毒性脂肪酸如花生四烯酸、機(jī)械性神經(jīng)損傷、脊髓損傷、和腦損傷；和其中所述與細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)喪失相關(guān)的損傷任選地選自心肌梗死、中風(fēng)、急性肝毒性、膽汁淤積、和移植器官的存儲(chǔ)/再灌注損傷。
【文檔編號】C07K1/113GK103443119SQ201180067449
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月15日
【發(fā)明者】A.赫曼斯, B.W.芬斯克, D.J.特勒帕尼耶, M.D.阿貝爾, S.蘇吉亞馬, D.R.烏雷 申請人:伊索技術(shù)制藥公司