專利名稱：：C₆₀-苯甲酸氮芥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及C6o-苯甲酸氮芥的應(yīng)用，尤其涉及C60-苯甲酸氮芥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景目前，抗腫瘤藥(或稱化療藥)的給入多是血行途徑如動(dòng)脈灌注、靜脈注射等，藥代動(dòng)力學(xué)的研究也是基于血循環(huán)進(jìn)行的，這些給藥方法對經(jīng)血行途徑的轉(zhuǎn)移灶是有效的。然而血行途徑化療時(shí)，化療藥在淋巴系統(tǒng)中的藥物濃度極低，既不能有效防止癌細(xì)胞向淋巴轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移，同時(shí)對淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移灶幾乎也不起作用。另一方面，淋巴轉(zhuǎn)移與惡性腫瘤的預(yù)后及術(shù)后復(fù)發(fā)有很大關(guān)系，如胃癌，其是最常見的惡性腫瘤之一，在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中占第一位，在全身惡性腫瘤中占第三位。胃癌的治療，手術(shù)為首選，術(shù)后再輔以化療、免疫治療等。由于胃癌轉(zhuǎn)移途徑主要還是淋巴途徑，雖然在行胃癌根治性手術(shù)時(shí)連同區(qū)域淋巴結(jié)一并切除，但手術(shù)時(shí)不可避免地會(huì)遺漏細(xì)小陽性的淋巴結(jié)或清掃不到跳躍性轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，還可能在切斷淋巴管或擠壓腫瘤時(shí)造成癌細(xì)胞的外逸等等。因此，盡管多年來化療藥物的品種在不斷更新，然而，胃癌總生成率至今并無突破性進(jìn)展。進(jìn)一步尋找新的藥物和劑型，并探索出更有效的用藥途徑，達(dá)到有效的治療惡性腫瘤如胃癌和防止癌細(xì)胞通過淋巴道轉(zhuǎn)移是非常緊迫的。目前有很3多嘗試，利用大分子載體如葡聚糖、乳劑、脂質(zhì)體、活性炭和微球等載帶腫瘤藥物，起到靶向治療的效果，其中研究得最多的是活性炭，日本學(xué)者將氨甲蝶呤吸附于活性炭，皮下注射于模型小鼠，荷瘤鼠生存期顯著延長。在臨床實(shí)驗(yàn)中胰腺癌患者口服和胃癌術(shù)前和術(shù)后化療，結(jié)果復(fù)發(fā)率顯著降低。作為碳的同分異構(gòu)體C6o代替活性炭載帶藥物具有很大的優(yōu)越性，主要表現(xiàn)在:(1)與活性碳不同，水溶性C6o衍生物在體內(nèi)能代謝，排泄，體內(nèi)無積累，實(shí)驗(yàn)證明無急性毒性，因此能避免使用活性炭導(dǎo)致較多的并發(fā)癥，長期預(yù)后較差的弊病；(2)C^有30個(gè)雙鍵，可以通過多種方式和各種抗癌化療藥物聯(lián)結(jié)，因而藥物品種和研制方法有較大選擇和優(yōu)化的空間；(3)富勒烯衍生物分子組成和結(jié)構(gòu)明確，粒徑較小，大小均勻，能載帶足夠的荷藥量，且比活性炭更容易進(jìn)入病變組織甚至癌細(xì)胞。氮芥類藥物屬烷化劑類抗腫瘤藥物，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，雖然氮芥是一個(gè)用于惡性淋巴腫瘤、肺癌、頭頸部癌、慢性白血病、乳腺癌、卵巢癌及絨癌等惡性腫瘤治療的藥物，但是由于氮芥類藥物毒副作用比較大，在臨床應(yīng)用上有一定的限制性。文獻(xiàn)(V.P.Gubskaya，N.RKonovalovaetal.Synthesisofnewfunctionallysubstitutedfullereopyrrolidines.iws57.awC7ze附/ca/5w〃e/Z"，/wter"a&o"a/Vol.51,No.9,pp.1723-1726)已報(bào)到了C^-苯甲酸氮芥及其制備方法，其結(jié)構(gòu)如式I所示，但是還沒有報(bào)道該化合物在抗腫瘤方面的應(yīng)用。式I
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種基于氮芥以C6Q為載體藥物的應(yīng)用，進(jìn)一步開創(chuàng)Qo在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，并開發(fā)氮芥類藥物在消化道腫瘤治療中的新用途。因此，本發(fā)明是提供式I所示的C6o-苯甲酸氮芥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的腫瘤包括胃癌、肺癌、頭頸部癌、慢性粒細(xì)胞白血病、肝癌、乳腺癌或前列腺癌等，優(yōu)選胃癌。該腫瘤還可為淋巴原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤，淋巴系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤如惡性淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白細(xì)胞，而轉(zhuǎn)移性腫瘤則通常由上述胃癌、肺癌等腫瘤經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移至淋巴管道或淋巴結(jié)中的腫瘤。本發(fā)明成功地用放射性核素1251對Qo-苯甲酸氮芥進(jìn)行了標(biāo)記，利用放射性核素的示蹤作用，得到了C6o-苯甲酸氮芥在SD大鼠體內(nèi)的攝取、分布和代謝數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，大鼠胃中的放射性攝取率高達(dá)60%ID/g以上。而且，在腫瘤細(xì)胞及原位胃癌模型的療效實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與其他幾個(gè)對照組(苯甲醛氮芥、活性炭-苯甲醛氮芥相比)，本發(fā)明涉及的C60-苯甲酸氮芥對胃癌的抑制率最高，其高的胃癌抑制率與C60-苯甲酸氮芥的高的胃攝取有一定的關(guān)系。總之，本發(fā)明的C60-苯甲酸氮芥可以提高對機(jī)體腫瘤組織的殺傷作用，抑瘤率高于氮芥。圖i為1251-(:6。-苯甲酸氮芥在大鼠體內(nèi)的分布示意圖。具體實(shí)施例方式C6o-苯甲酸氮芥的制備(具體見文獻(xiàn)V.P.Gubskaya，N.P.Konovalovaetal.Synthesisofnewfunctionallysubstitutedfiillereopyrrolidines./m肌'"wC/iew/ca/Bm//^'/"ez-"加'owa/五c/"/o"，Vol.51，No.9,pp.1723-1726)將216mg(0.6mmo1)(:60(富勒烯)溶于200mL甲苯，加入53mg(0.6mmo1)肌氨酸和74mg(0.3mmol)苯甲醛氮芥，在ll(TC油浴中加熱回流10h，溶液由紫紅色變?yōu)榧t色。將所得溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得一棕黑色固體，柱層析(硅膠H300400目，正己垸裝柱)分離，先用正己烷洗去未反應(yīng)的富勒烯，然后用體積比為1:1的正己烷和甲苯的洗脫液淋洗，洗下C6o單加成物，揮干溶劑，得到96mg棕褐色固體，產(chǎn)率42%。實(shí)施例l1251《6()-苯甲酸氮芥在大鼠體內(nèi)的分布C,苯甲酸氮芥的放射性標(biāo)記a.C,苯甲酸氮芥的碘化稱取llmgC6o-苯甲酸氮芥溶于含30mLCH2Cl2及5mLCHCl3的混合溶劑中，加入ICl溶液約2mL，避光下室溫反應(yīng)5天；用50mL10。/。Na2S2O3分兩次洗去過量的ICl，濃縮有機(jī)相，過硅膠柱收集深褐色產(chǎn)品帶。b.1251的同位素交換法標(biāo)記將5mg碘化后的C6o-苯甲酸氮芥溶于10mL0.5mM的甲苯中，取0.5mL裝在安瓿管中，再加20|iiLNa1251溶液(10微居里)，將安瓿管封好后置13(TC油浴中反應(yīng)1小時(shí)進(jìn)行同位素交換；油浴完畢，以體積比為8:2的乙酸乙酯和甲苯為展開劑在新華一號濾紙上展開，碘標(biāo)的C6o-苯甲酸氮芥的Rf二0.9，125廠在原點(diǎn)位置，標(biāo)記率達(dá)94.5%。1251《6()-苯甲酸氮芥在大鼠體內(nèi)的分布取30只SD大鼠，隨機(jī)分成5組，每組6只，取已標(biāo)記好的1251-<:6()-苯甲酸氮芥按200^/只的劑量通過大鼠足下皮墊注入體內(nèi)，各組在給藥后不同時(shí)間段(0.5h、lh、2h、6h、24h)處死并解剖，取重要的臟器和組織(血液、心臟、肺、肝、脾、腎、胃、肌肉、淋巴、腦)，分別稱重，并用Y射線探測器測量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克臟器的放射性計(jì)數(shù)占注射量的百分比(％ID/g)。結(jié)果標(biāo)記化合物在大鼠內(nèi)的分布見圖1，從圖l中可以看出標(biāo)記化合物能直接很快進(jìn)入血液或通過淋巴道進(jìn)入血液，其中胃的攝取最高，在l小時(shí)時(shí)高達(dá)70%以上，各時(shí)相的淋巴藥物濃度大體與同時(shí)相的血藥濃度相當(dāng)，說明Q。-苯甲酸氮芥有一定的淋巴靶向性。實(shí)施例2C6n-苯甲酸氮芥在體外對腫瘤細(xì)胞的抑制作用C6o水溶液的制備將2.88mgC6Q(富勒烯)溶于100mL甲苯，90mg聚乙烯基吡咯烷酮溶于100mL氯仿，再將兩者混勻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將除去溶劑后的殘余物用10mL純水溶解得淺黃色Q。PVP溶液。苯甲醛氮芥水溶液的制備將0.98mg苯甲醛氮芥溶于100mL無水乙醇，90mg聚乙烯基吡咯烷酮溶于100mL氯仿，再將兩者混勻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將除去溶劑后的殘余物用10ml純水溶解得無色苯甲醛氮芥PVP溶液。C6o-苯甲酸氮芥水溶液的制備將3.976mg<:6()-苯甲酸氮芥溶于100mL體積比為1:1甲苯和二硫化碳的混合溶劑中，將90mg聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)溶于100mL氯仿，再將兩者混勻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將除去溶劑后的殘余物用10mL純水溶解得棕黃色C6。-苯甲酸氮芥PVP溶液。C60-苯甲酸氮芥在體外對腫瘤細(xì)胞的抑制作用取指數(shù)生長期的S，腫瘤細(xì)胞、Lewis腫瘤細(xì)胞，制成0.5Xl(^個(gè)/mL細(xì)胞懸液，然后按2mL/孔加入6孔培養(yǎng)板中，每組6孔，每孔各加入2mL相應(yīng)下列制劑并分組A生理鹽水組、BC6o組、C苯甲醛氮芥組、DC6o-苯甲酸氮芥。置37。C5%的C02孵箱中孵育24小時(shí)，然后收集細(xì)胞，進(jìn)行PI染色，分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外，在A、B、C、D四種不同物質(zhì)作用下，S咖細(xì)胞的凋亡率分別為20.0%、28.6%、38.5%、41.5%，Lewis細(xì)胞細(xì)胞凋亡率則分別為22.5%、29.4%、39.1%、42.0%。該數(shù)據(jù)表明060-氮芥組、氮芥組S180細(xì)胞、Lewis細(xì)胞凋亡率高于Q。組、生理鹽水組，但C6。-氮芥組、氮芥組組間細(xì)胞凋亡率無明顯差異。實(shí)施例3C6o-苯甲酸氮芥對原位胃癌腫瘤的抑制作用活性炭-苯甲酸氮芥水溶液的制備將0.98mg苯甲醛氮芥溶于100mL無水乙醇，加入3mg活性炭，將兩者混勻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將除去溶劑后的殘余物用10ml純水超聲分散得黑色活性炭-苯甲酸氮芥水溶液。苯甲醛氮芥水溶液、苯甲醛氮芥水溶液、Q(r苯甲酸氮芥水溶液的制備同實(shí)施例2。C6o-苯甲酸氮芥對原位胃癌腫瘤的抑制作用取雄性體重為20g左右的BABL/cnu/nu裸小鼠，原位種植胃癌，荷瘤鼠隨機(jī)分成五組，其中生理鹽水組15只，其他組每組10只，分別給予相應(yīng)下列制劑0.025mmol/kg:1)生理鹽水組、2)C6o組、3)苯甲醛氮芥組、4)活性炭-苯甲酸氮芥組、5)C6(r苯甲酸氮芥組。腹腔給藥，隔天給藥第9周處死動(dòng)物，測量原位腫瘤最大徑a和最小徑b，用公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積，計(jì)算各組的抑瘤率，抑瘤率=(v對照組一V實(shí)驗(yàn)組)/V對照組X100%。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注1為生理鹽水組，2為C6o組，3為苯甲醛氮芥組，4為活性炭-苯甲酸氮芥，5為C6o-苯甲酸氮芥。結(jié)果對原位胃癌模型的藥效分析中(見表l)，發(fā)現(xiàn)與其他幾組相比，C,苯甲酸氮芥的抑瘤效果最好，抑瘤率可到69.7%，C6o的抑瘤率為21.1%，苯甲醛氮芥的抑瘤率為33.6%，并且C6o-苯甲酸氮芥能有效抑制腫瘤細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)論在體外與苯甲醛氮芥相比，C6Q的引入并沒有提高氮芥對細(xì)胞的抑制率。但是從體內(nèi)結(jié)果來看，C6。的引入能提高氮芥對機(jī)體腫瘤組織的殺傷作用，是因?yàn)槠洳粌H對原位腫瘤及經(jīng)血行播散腫瘤進(jìn)行殺傷，并且還明顯抑制腹膜、淋巴結(jié)等經(jīng)淋巴道的轉(zhuǎn)移。這與其在胃及淋巴中的高的攝取率及較長的滯留時(shí)間有關(guān)，因此本發(fā)明的C60-苯甲酸氮芥除對現(xiàn)有氮芥有效的各種腫瘤及其淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤有更佳的防治作用外，還對胃癌的防治具有較佳的效果。權(quán)利要求1、式I所示的C60-苯甲酸氮芥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，id="icf0001"file="A2009101709390002C1.tif"wi="59"he="55"top="39"left="56"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>式I其特征在于該腫瘤為淋巴原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于氮芥以C₆₀為載體的藥物C₆₀-苯甲酸氮芥在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其結(jié)構(gòu)如式I所示，本發(fā)明利用放射性標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)C₆₀-苯甲酸氮芥在胃中有高的攝取率和較長的滯留時(shí)間，C₆₀-苯甲酸氮芥可以提高對機(jī)體腫瘤組織的殺傷作用，特別是其淋巴轉(zhuǎn)移灶，抑瘤率高于氮芥。文檔編號A61K31/403GK101653439SQ200910170939公開日2010年2月24日申請日期2006年4月21日優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日發(fā)明者冉鐵成,徐晶瑩,李文新,李晴暖申請人:中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所