專利名稱：一種人腫瘤標(biāo)志物-Tim17多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體涉及一種新的人腫瘤標(biāo)志物_Timl7多肽(translocase of inner mitochondrial membrane 17)，編碼Timl7的多核苷酸序列和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生該蛋白的方法。本發(fā)明還涉及Tim17蛋白及其編碼序列的用途，如用于腫瘤的預(yù)防，早期檢測(cè)，預(yù)后的判斷，以及含Timl7蛋白拮抗劑(如抗體和反義核酸，RNAi等)的藥物組合物。
背景技術(shù)：
生物標(biāo)志物(biomarker)是指能被客觀測(cè)量的，指示正常生理或病理過程，或是機(jī)體對(duì)于藥物反應(yīng)的物理、化學(xué)、生物指標(biāo)。腫瘤研究的最關(guān)鍵的問題之一，就是尋找早期檢測(cè)，診斷分型，治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后，以及作為藥物靶標(biāo)的標(biāo)志物。細(xì)胞從正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤的過程中，細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)譜會(huì)發(fā)生一系列變化。腫瘤標(biāo)志物就是在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，由腫瘤細(xì)胞合成釋放或宿主對(duì)腫瘤反應(yīng)性釋放的一類物質(zhì)。它們具有一定的特異性與靈敏度，可以用作診斷與治療中的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。 目前，已被用于臨床的腫瘤標(biāo)志物還相當(dāng)缺乏。各國(guó)的標(biāo)志物審核標(biāo)準(zhǔn)略有不同。我國(guó)在腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用方面主要還是參照美國(guó)等西方發(fā)達(dá)國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)。以美國(guó)為例，每年ASC0(American Society of Clinical Oncology)都會(huì)對(duì)腫瘤臨床所用的生物標(biāo)志物提出指導(dǎo)性建議。如2007年能用于乳腺癌的標(biāo)志物包括ER/PR，HER2，uPA/PAIl，和多參數(shù)基因表達(dá)分析方法(0ncotype DM， MammaPrint等)，并提供了詳細(xì)的建議使用條件和范圍。其余的如Ki67， Cyclin D， Cyclin E， p27， p21，蛋白質(zhì)組分析等因證據(jù)不充分，不被建議使用(參見ASC0網(wǎng)頁(yè))?？梢钥吹?，在承認(rèn)這些標(biāo)志物在改善病人診斷，治療中的作用同時(shí)，目前腫瘤病人的發(fā)病率和致死率仍總體上呈上升趨勢(shì)。這一現(xiàn)象要求更多更好的腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人腫瘤標(biāo)志物Tim17的多肽SEQ ID N0:1，核酸(RNA)SEQ ID NO :5，及其片斷，類似物，衍生物。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼上述RNA，多肽的脫氧核酸序列(DNA)SEQ ID NO :6。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述RNA和多肽的制備方法，以及該RNA，多肽和其編碼序列的用途。 所述的RNA可以通過PCR的方式產(chǎn)生。具體的說，可以用SEQ ID NO :3中的引物對(duì)，通過聚合酶鏈反映，獲得序列為SEQ ID NO :5的RNA產(chǎn)物。所述多肽可以通過化學(xué)合成的方式生產(chǎn)。該RNA和多肽均可幫助檢測(cè)腫瘤的存在。 本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了新的可作為腫瘤標(biāo)志物的基因。該基因的表達(dá)產(chǎn)物，包括RNA SEQ ID N0:4和蛋白SEQ ID NO :2，在正常細(xì)胞和組織中幾乎檢測(cè)不到，在腫瘤細(xì)胞和組織中卻有很高的表達(dá)。并且表達(dá)量與腫瘤的級(jí)別，分化程度，以及病人的預(yù) 后都呈明顯正相關(guān)。研究結(jié)果表明Timl7是一特異的腫瘤標(biāo)志物。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā) 明。 具體的說，本發(fā)明通過系統(tǒng)地比較來自同一個(gè)病人的，不同惡性程度的乳腺癌細(xì) 胞系，獲得了一系列的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。Timml7A是其中的一個(gè)新的腫瘤特異表達(dá)的蛋白。 其一個(gè)多肽，SEQ ID N0:1，被穩(wěn)定同位素標(biāo)記的質(zhì)譜法特異檢出在腫瘤中具有高于正常細(xì) 胞4. 8倍的表達(dá)水平。通過定量RT-PCR的方法，結(jié)果顯示腫瘤中Timml7A的RNA表達(dá)也明 顯高于正常對(duì)照的水平。同時(shí)，通過抗體驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，Timl7(包括A，B兩個(gè)亞型，抗體不區(qū)分 這兩個(gè)亞型)的蛋白也在腫瘤中呈上升趨勢(shì)(圖1A，B)。更進(jìn)一步，通過免疫組化的方法， 本發(fā)明對(duì)43例正常和乳腺癌腫瘤病人的組織進(jìn)行試驗(yàn)(圖1C，表l)，結(jié)果顯示，正常乳腺 組織中未見有Timl7蛋白的表達(dá)，而早期乳腺疾病(Hyperplasia,乳腺增生)中則顯示有 Timl7的表達(dá)；在早期乳腺癌病人中(DCIS，原位導(dǎo)管瘤)達(dá)到表達(dá)高峰。上述實(shí)驗(yàn)證據(jù)表 明Timl7具有作為早期檢測(cè)乳腺癌標(biāo)志物的潛在作用。 為了驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)發(fā)掘的工作。在0ncomine (麗w. on固ine. org)數(shù)據(jù)庫(kù)中，存放著大量腫瘤病例的RNA微陣列芯片數(shù)據(jù)。本發(fā)明對(duì)Timml7A 基因進(jìn)行搜索和數(shù)據(jù)整理，其中，乳腺癌和正常組織的比較結(jié)果顯示，乳腺癌中Timml7A的 表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照(圖2);在乳腺癌的級(jí)別，分化程度和Timml7A的表達(dá)相關(guān)分 析中，顯示了明顯正相關(guān)(圖3)。更有意義的是，在病人預(yù)后和Timml7A的表達(dá)相關(guān)分析 中，也顯示了明顯正相關(guān)(圖4);同時(shí)Timl7的另一個(gè)亞型，Timml7B基因，也顯示了上述 這些結(jié)果。上述結(jié)果表明，Timl7的兩個(gè)亞型均能成為潛在的腫瘤發(fā)現(xiàn)(早期檢測(cè))，診斷 (分級(jí)別)，預(yù)后的標(biāo)志物。 為了觀察Tim17的腫瘤高表達(dá)現(xiàn)象是否僅僅局限于乳腺癌，本發(fā)明對(duì)Oncomine數(shù) 據(jù)庫(kù)里的其他腫瘤也進(jìn)行了類似的數(shù)據(jù)挖掘分析。結(jié)果顯示，在肺癌，肝癌，腸癌，膀胱癌， 前列腺癌，淋巴癌中，均存在該種腫瘤中高表達(dá)的現(xiàn)象(圖5)。分析結(jié)果證實(shí)，Timl7是一 個(gè)廣譜的腫瘤標(biāo)志物。 本發(fā)明根據(jù)Timl7在腫瘤中的過表達(dá)，進(jìn)行抑制它的表達(dá)是否能抑制腫瘤的生長(zhǎng) 檢驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了針對(duì)Tim17的shRNA，并將它克隆到可誘導(dǎo)表達(dá)的慢病毒(lenti-viral) 載體中。結(jié)果顯示，抑制Timl7的表達(dá)可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。所述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Tim17 能作為腫瘤治療的靶標(biāo)。


圖1Timl7在乳腺癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)， 其中，A :用Timl7A的特異引物進(jìn)行的定量反轉(zhuǎn)錄-PCR，結(jié)果以對(duì)照基因GAPDH進(jìn) 行標(biāo)準(zhǔn)化表示，圖中16N，HME為正常乳腺上皮細(xì)胞，其余為乳腺癌細(xì)胞；B :乳腺細(xì)胞中用免 疫印記法檢測(cè)Timl7蛋白，細(xì)胞標(biāo)識(shí)如A ;C :組織中用免疫組化檢測(cè)Timl7蛋白，圖為正常， 原位癌，和侵襲性癌的示例；上正常；中原位導(dǎo)管癌；下侵襲性癌。 圖2TI匪17A RNA在正常對(duì)照和乳腺癌腫瘤病人組織中的表達(dá)差異(數(shù)據(jù)挖掘結(jié)
果)，其中，Class l:Normal(7例)；Class 2 :Breast Carcinoma(45例)。 圖3TI匪17A表達(dá)水平與乳腺癌病人預(yù)后呈顯著正相關(guān)(數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果)，
4
其中，A :數(shù)據(jù)集l，Class 1 :生存(121例)，Class 2 :死亡(38例)；B :數(shù)據(jù)集2， Class 1 :無疾病(180例)，Class 2 :復(fù)發(fā)(93例)。 圖4TI匪17A表達(dá)水平與乳腺癌級(jí)別和分化程度呈顯著正相關(guān)(數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果)，
其中，A :數(shù)據(jù)集1， Class 1 :grade 1 (68例)，Class 2 :grade 2 (126例)，Class 3 :grade 3 (55例)；B :數(shù)據(jù)集2， Class 1 :grade 1 (67例)，Class 2 :grade 2 (128例)， Class 3 :grade 3 (54例);C :數(shù)據(jù)集3， Class 1 :高分化(30例)，Class 2 :中分化(83 例)，Class 3 :低分化(83例)。 圖5TI匪17A許多腫瘤中都有過表達(dá)，是一個(gè)廣譜的標(biāo)志物(0ncomine數(shù)據(jù)分析結(jié)
果)。其中，A :膀胱癌;B :腸癌;C :肝癌;D :肺癌;E :前列腺癌。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的第一方面，提供了新穎的分離出的差異表達(dá)的Timl7多肽，它包含具 有SEQ ID N0:1氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物。
實(shí)施例1 :獲得差異表達(dá)的Timl7多肽 從一個(gè)病人分離得到的乳腺癌細(xì)胞系，包括正常(16N)，腫瘤(NT)，和轉(zhuǎn)移瘤 (MT2)，用D3_Leu (Cambridge Isotope公司)穩(wěn)定同位素培養(yǎng)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞。正常和轉(zhuǎn)移瘤 細(xì)胞用含D。-Leu的培養(yǎng)液培養(yǎng)。將三個(gè)細(xì)胞系的蛋白質(zhì)用裂解液(8M urea，2. 5Mthiourea， 65mM DTT，4% (w/v)CHAPS,0. 5% (v/v)Biolytes pH 3-10，proteaseinhibitor cocktail) 抽提，定量(RC DC Protein Assay Kit,Biorad公司)。等量的蛋白質(zhì)混合成正常腫瘤組 和腫瘤轉(zhuǎn)移瘤組，然后以一維SDS凝膠電泳分離。凝膠經(jīng)染色后，每一凝膠條切割成大小 相似的8個(gè)條帶。每一條帶經(jīng)脫色，干膠，膠內(nèi)酶切，提肽等步驟，再用液相色譜分離多肽。 分離的多肽由LTQ-Orbitrap(ThermoElectron公司)質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。鑒定獲得1200多 個(gè)蛋白的定量信息。其中70多個(gè)被確定為顯著差異表達(dá)的蛋白。除去已知的腫瘤標(biāo)志物， 在余下的新標(biāo)志物中，確定差異表達(dá)顯著的TI匪17A(Tim17蛋白兩個(gè)亞型中的一個(gè))，其為 具有重要線粒體功能的蛋白。所獲得的定量信息的多肽為GKEDPWNSITSGALTGAILAAR。在腫 瘤中，它的表達(dá)比正常細(xì)胞高4. 8倍。經(jīng)多次的質(zhì)譜鑒定均得到相同的結(jié)果。
在本發(fā)明的第二方面，提供了編碼分離的所述多肽的多核苷酸。SEQ ID NO :4。實(shí) 施例2 :從乳腺癌細(xì)胞系中獲得編碼TI匪17A的全長(zhǎng)基因 用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取21T乳腺癌細(xì)胞系(來源于NT或MT2兩 禾中細(xì)胞)中的總RNA，用PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa公司)將 總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以合成的cDNA為模板，設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的TI匪17A克隆基因正向引 物(已經(jīng)除去原TI匪17A的起始密碼子ATG)5'-CA GAA TTC TGG AGG AGT ACGCGC GAG-3' 和反向引物5' -GACCTCGAGCTACTGATATTGTCGATA-3'，用熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶(TaKaRa公 司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為98度預(yù)變性2分鐘，然后95度10秒，55度退火15秒，72 度40秒進(jìn)行延伸反應(yīng)，反映30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物和pcDNA3. 0-HA-FLAG空載體分別進(jìn)行 EcoRI和Xhol雙酶切、連接以及DH5 a細(xì)菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，得到TI匪17A基因轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克 隆，待DNA測(cè)序確定基因序列無誤后得到pcDNA3. 0-HA-FLAG-TI匪-17A載體。
在本發(fā)明的第三方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人Timl7活性的化合物，以及抑制 人Timl7的表達(dá)的化合物。較佳地，該化合物是人Timl7編碼序列或其片斷的小分子干擾RNA。將所述的小分子shRNA克隆到pLVTHM載體中成pLVTHM-sTimml7A.將該載體同包裝 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞293T以產(chǎn)生病毒。用病毒感染待測(cè)腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)待測(cè)腫瘤細(xì)胞的生 長(zhǎng)明顯減慢。 實(shí)施例3 :TI匪17A小分子干擾RNA抑制腫瘤的生長(zhǎng) 按照shRNA的設(shè)計(jì)規(guī)則，設(shè)計(jì)三個(gè)序列的23堿基shRNA。將其中具有較好的抑制基 因表達(dá)效果的序列克隆到pLVTHM(Trono實(shí)驗(yàn)室，Switzerland)載體的Mlul和Clal位點(diǎn)。 產(chǎn)生的載體命名為pLVTHM-sTimml7A。為了產(chǎn)生可誘導(dǎo)的shRNA表達(dá)細(xì)胞系，pLVPT-tTR/ KRAB-Red載體(Trono實(shí)驗(yàn)室，Switzerland)轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。同時(shí)，兩個(gè)包裝載體PMD. G(VSV. G) ， CMV-DR891被共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)48小時(shí)后，收集細(xì) 胞的上清。過濾去除細(xì)胞，將上清感染MDA-231乳腺癌細(xì)胞。被感染的MDA-231細(xì)胞經(jīng)48 小時(shí)培養(yǎng)后，用流式細(xì)胞儀分選獲得帶紅色熒光的表達(dá)KRAB抑制因子的細(xì)胞。獲得穩(wěn)定 表達(dá)KRAB的MDA-231-KRAB細(xì)胞株。將構(gòu)建的pLVTHM-sTimml7A載體與PMD. G(VSV. G)， CMV-DR891包裝載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞以產(chǎn)生shRNA的表達(dá)載體病毒顆粒。用上述產(chǎn)生穩(wěn) 定細(xì)胞株同樣的方法，以病毒感染MDA-231-KRAB細(xì)胞株，從而產(chǎn)生可被D0X(Sigma公司) 誘導(dǎo)表達(dá)shRNA的MDA-231-KRAB-sTimml7A細(xì)胞株。所述細(xì)胞在1 P g/ml的D0X下，表達(dá) shRNA，抑制TI匪17A基因的表達(dá)。 在這一基礎(chǔ)上，將MDA-231-KRAB-sTimml7A細(xì)胞株以50000/孔的密度，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中的10個(gè)孔。其中5個(gè)孔培養(yǎng)在有D0X培養(yǎng)液中，另5個(gè)孔培養(yǎng)在無D0X的 培養(yǎng)液中。72小時(shí)后，用MTT (Sigma公司)法測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。結(jié)果顯示，有DOX的培養(yǎng) 液培養(yǎng)的MDA-231-KRAB-sTimml7A細(xì)胞與無D0X的細(xì)胞相比有50%的生長(zhǎng)抑制。
在本發(fā)明的第四方面，提供了含有上述小分子干擾RNA的載體和病毒。載體和病 毒的產(chǎn)生過程已在實(shí)施例3中詳述。 在本發(fā)明的第五方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在Tim17的方法。它包括抽提組 織中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用設(shè)計(jì)合成的引物序列(SEQ ID NO :3)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。 另一檢測(cè)蛋白質(zhì)水平的方法是抽提組織中的蛋白質(zhì)，用特異抗體進(jìn)行免疫印記反應(yīng)?；颍?br> 對(duì)石蠟包埋的組織，用特異抗體進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)。還提供了檢測(cè)腫瘤的方法，包括對(duì)樣
品進(jìn)行上述的定量PCR試驗(yàn)，免疫印記試驗(yàn)或免疫組化試驗(yàn)，結(jié)果高于本底水平的個(gè)體患
有腫瘤或腫瘤易感性高于正常人群。 實(shí)施例4 :定量PCR檢測(cè)TI匪17A的RNA 按照質(zhì)譜鑒別出的蛋白相應(yīng)序列和NCBI網(wǎng)站上的基因序列信息(accession number :NM 006335. 1)，用primer3軟件(http://frodo.wi.mit. edu/primer3/input. htm) 設(shè)計(jì)TI匪17A引物。獲得的上游引物序列，從5'到3'為atccctggaactccatcaca，下游引 物序列為tgcagaggcaaatcttgtca。引物設(shè)計(jì)時(shí)使擴(kuò)增產(chǎn)物跨過基因組序列的2號(hào)內(nèi)含子， 從而降低基因組DNA影響結(jié)果的可能性。定量PCR的內(nèi)參為GAPDH基因。所用的GAPDH基 因的上游弓l物為cgagatccctccaaaatcaa，下游弓l物為ttcacacccatgacgaacat。 用Trizol 提取總RNA，經(jīng)分光光度計(jì)(260nm/280nm)測(cè)RNA的濃度和純度。用3 y g總RNA和oligo dT弓l物經(jīng)PrimeScript 1st strand cDNASynthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(TaKaRa)。在25 ii 1 定量PCR反應(yīng)體系中，加入75ng cDNA模板，lXSY服Premix Ex Taq(Perfect Real Time; TaKaRa)和各200nM的引物。用iQ5定量PCR儀(Bio-rad公司)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?5t:初始變性10秒，兩步法進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95°C ， 5秒變性，6(TC退火，延伸20秒。用 iQ5 (Bio-Rad) v2. 0版本軟件在相對(duì)定量模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析。圖1A是定量PCR實(shí)驗(yàn) 的一個(gè)結(jié)果。用細(xì)胞系RNA，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞16N，HME表達(dá)很低的TI匪17A RNA，而腫瘤細(xì)胞， 如NT， MT2， T47D表達(dá)量顯著高于正常細(xì)胞。
實(shí)施例5 :免疫印跡和免疫組化檢測(cè)Timl7蛋白 應(yīng)用Timl7的抗體(兔抗人TI匪17A/TI匪17B抗體，PTGLAB公司)，在細(xì)胞和組織 中進(jìn)行免疫印跡和免疫組化實(shí)驗(yàn)。在免疫印跡中，用6-15%梯度SDS-PAGE凝膠分離大約 30ii g總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Amersham Bioscience公司)上。用含5XBSA的TBST 緩沖液(137mM NaCl，20mM Tris-HCl pH7. 6，0. 1% Tween 20)封閉PVDF膜，與Timl7抗體 室溫孵育一小時(shí)或者4度孵育過夜，洗滌，HRP偶聯(lián)的二抗孵育。洗好的膜加上超敏化學(xué)發(fā) 光液(Amersham Bioscience)顯影，經(jīng)LAS-3000成像系統(tǒng)成像(Fuji, Japan)。經(jīng)Multi Gauge V3.0(Fuji公司，Japan)軟件對(duì)免疫印跡的條帶定量。圖IB為免疫印跡實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞 系中的結(jié)果。Actin B抗體(鼠抗人Actin B抗體，PTGLAB公司)作文上樣的對(duì)照。實(shí)驗(yàn) 表明，在正常乳腺上皮細(xì)胞，16N和HME中，Timl7處于很低的表達(dá)水平，而在乳腺癌細(xì)胞，NT 和MT2中，Timl7的表達(dá)水平顯著增高。 在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋的組織芯片購(gòu)自US Biomax公司 (CA， U. S. A. Catalog :TMA_BR480)。切片經(jīng)脫蠟和水化后，經(jīng)0. 01M檸檬酸鹽緩沖液(pH = 6.0)水煮復(fù)原抗原。與l : 100稀釋的抗Timl7的一抗4度過夜孵育。再由抗兔的HRP聚 合體檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，Olympus BX51顯微鏡系統(tǒng)成像。由兩個(gè)研究員對(duì)染好的組織芯片進(jìn)行 評(píng)分，至少10%的乳房上皮細(xì)胞被染上色的芯片算作陽(yáng)性芯片。數(shù)據(jù)用Fisher Exact方法 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)P〈0.05。圖1C示例了正常，原位導(dǎo)管癌，和侵襲性癌的免疫組化 染色。結(jié)果顯示，所有5個(gè)正常組織中都不表達(dá)Timl7蛋白，而Timl7蛋白最早在早期乳腺 疾病，乳腺增生中有部分表達(dá)；到早期腫瘤原位導(dǎo)管癌時(shí)達(dá)到了表達(dá)高峰(檢測(cè)的腫瘤中 100%表達(dá)，6/6)。結(jié)果顯示，Timl7能作為乳腺癌預(yù)防和早期檢測(cè)的標(biāo)志物。
在本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。用途包括用多肽免 疫動(dòng)物獲得針對(duì)多肽的抗體，再通過抗體檢測(cè)蛋白的表達(dá)。可以通過血液，組織，及其他體 液(如乳腺吸液，nipple aspirate)進(jìn)行檢測(cè)。編碼序列的作用包括通過其設(shè)計(jì)引物，探 針，及siRNA， shRNA等用于檢測(cè)DNA， RNA的表達(dá)，突變，和由于抑制基因表達(dá)達(dá)到抑制腫瘤 生長(zhǎng)的治療效果。所述用途在實(shí)施例3、4、5中有所描述。 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合，它含有安全有效量的本發(fā)明的人 Timl7拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選的拮抗劑是小分子干擾RNA序列。這些藥物 組合物可治療腫瘤。具體的是，用pLVTHM載體構(gòu)建成的pLVTHM-sTimml7A，以及用其產(chǎn)生的 缺陷病毒。這些結(jié)果在實(shí)施例3中有所描述。 在本發(fā)明的其他方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易 見的。 表1是Timl7在人正常和腫瘤組織中的表達(dá)。
表l
7Aged (range)Tim 17 Staining (pos/total)P V3lU6 e
Normal15-260/5-
Hyperplasia22-725/90.062937
LCISa40-622/40.166666
DCISb30-496/60.002164
ICC31-6710/190.047101 其中，'，小口十原位癌Lobular carcinoma in situ ;b導(dǎo)管原位癌Ductal carcinoma
in site ; c浸潤(rùn)性癌Infiltrating carcinoma ;d年齡；P值以Fisher Exact統(tǒng)計(jì)計(jì)算。 —種人腫瘤標(biāo)志物_Timl7多肽及其用途序列表 SEQUENCE LISTING 〈110>復(fù)旦大學(xué) <120> —種人腫瘤標(biāo)志物_Timl7多肽及其用途 〈130〉11 〈160>6 〈170>Patentln version 3. 1 〈210>1 〈211>22 〈212>PRT <213>人體 〈400〉 1 Gly Lys Glu Asp
1 Ala lie Leu Ala
20 〈210>2 <211>171 〈212〉PRT 〈213〉人體 〈400>2 Met Glu Glu Tyr 1 5 Cys Gly Gly Ala
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Val Gly Ser Ala Ala Met Gly Gly lie Leu LeuAla Leu lie Glu Gly115 120 125Ala Gly lie Leu Leu Thr Arg Phe Ala Ser AlaGin Phe Pro Asn Gly130 135 140Pro Gin Phe Ala Glu Asp Pro Ser Gin Leu ProSer Thr Gin Leu Pro145 150 155160Ser Ser Pro Phe Gly Asp Tyr Arg Gin Tyr Gin165 170〈210>3〈211>40〈212>DNA〈213〉人體〈400>3atccctggaa ctccatcacatgc3gaggca朋tcttgtca〈210>4〈211>1644〈212>DNA〈213〉人體〈400>4agtcaagatg gaggagtacg cgcgagagcc ttgcccatggcgaattgtgg atgactgtgg60tggggccttt acgatgggta ccattggtgg tggtatctttc朋gc朋tca朋ggttttcgc朋ttctcca gtgggagt朋3cc3C3gact 3cgagggagtttgacagcte tt朋朋cc3g180ggctccacag ttaggaggta gctttgcagt ttggggagggctgttttcca tgattgactgtegtetggtt c朋gtc3gag g朋3gg朋g3 tccctgg朋ctccatcacaa gtggtgcctt300朋cgggagcc 3tectggcag c朋g3朋tgg accagtggccatggttgggt cagccgcaat360gggtggcatt ctcctagctt teattgaagg agctggtatcttgttgacaa gatttgcctctgcacagttt cccaatggtc ctcagtttgc agaagacccctcccagttgc cttcaactcagttaccttcc tcaccttttg gagactetcg acaatetcagtaggacttct ttcctaggat
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一種人腫瘤標(biāo)志物Tim17多肽，其特征在于，該多肽包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性多肽、或其活性衍生物；其編碼核酸具有SEQ ID NO5的序列。
2. —種Timl7蛋白，其特征在于，該蛋白具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。
3. —種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ ID N0:4的序列，其編碼權(quán)利要求2的蛋白。
4. 一種DNA，其特征在于，具有SEQ ID NO :6的結(jié)構(gòu)，其編碼權(quán)利要求1的RNA及多肽。
5. —種化合物，其特征在于，該化合物為拮抗人Timl7活性拮抗劑，它含有權(quán)利要求1的人Timl7編碼序列或其片斷的小分子干擾RNA。
6. —種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求5的化合物及藥學(xué)上可接受的載體。
7. —種能與權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的Timl7蛋白特異性結(jié)合的抗體。
8. —種檢測(cè)樣品中Timl7的方法，其特征在于，它包括抽提組織中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SEQ ID NO :3的引物序列定量PCR擴(kuò)增；或，抽提組織中的蛋白質(zhì)，用特異抗體進(jìn)行免疫印記反應(yīng)，檢測(cè)蛋白質(zhì)水平；或，對(duì)石蠟包埋的組織，用特異抗體進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)。
9. 權(quán)利要求l的Timl7多肽及其編碼序列在制備檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物或腫瘤治療靶標(biāo)中的用途。
10. 權(quán)利要求2的蛋白及其編碼序列在制備檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物或腫瘤治療靶標(biāo)中的用途。
11. 按權(quán)利要求9或10的用途，其中所述的腫瘤是乳腺癌、肺癌、肝癌、腸癌、膀胱癌、前列腺癌或淋巴癌。
12. 按權(quán)利要求9或10的用途，其中所述的腫瘤是乳腺癌。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及新的人腫瘤標(biāo)志物-Tim17多肽，編碼Tim17的多核苷酸序列和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生該蛋白的方法。本發(fā)明還涉及Tim17蛋白及其編碼序列的用途，以及含Tim17蛋白拮抗劑的藥物組合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)顯示，所述的Tim17多肽及其編碼序列及該基因的表達(dá)產(chǎn)物，在正常細(xì)胞和組織中幾乎檢測(cè)不到，在腫瘤細(xì)胞和組織中卻有很高的表達(dá)，并且表達(dá)量與腫瘤的級(jí)別，分化程度以及預(yù)后均呈明顯正相關(guān)。結(jié)果表明Tim17為一特異的腫瘤標(biāo)志物。能作為乳腺癌、肺癌、肝癌、腸癌、膀胱癌、前列腺癌或淋巴癌的預(yù)防和早期檢測(cè)的標(biāo)志物或腫瘤治療的靶標(biāo)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101768214SQ200910174168
公開日2010年7月7日 申請(qǐng)日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月6日
發(fā)明者喬萌, 張揚(yáng), 徐曉恩, 施前 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)