專利名稱：斑蝥素在制備抑制腫瘤血管新生與血管新生相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及斑蝥素的新用途，具體涉及斑蝥素在制備抑制腫瘤血管新生與血管新
生相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生(Angiogenesis)是指在原有血管的基礎(chǔ)上芽生出新的毛細(xì)血管的過(guò) 程，包括五個(gè)階段①血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；②降解血管基底膜；③內(nèi)皮細(xì)胞的遷移； 內(nèi) 皮細(xì)胞形成微血管；⑤基底膜的重塑，血管成熟。 血管新生在生理和病例條件下都有發(fā)生，生理性血管新生主要發(fā)生在胚胎發(fā)育和 女性生理周期，對(duì)于正常的發(fā)育非常關(guān)鍵。而許多疾病的發(fā)生都離不開病理性血管新生的 參與，例如腫瘤、心血管疾病、糖尿病、視網(wǎng)膜黃斑病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、 牛皮癬等。目前已經(jīng)了解到，血管新生性疾病表現(xiàn)為血管新生過(guò)度和缺陷，這類疾病包括腫 瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、牛皮癬、眼內(nèi)血管新生病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、十二指腸潰瘍、月經(jīng)不調(diào)、 不孕癥等。 上述疾病中，腫瘤一直對(duì)人類健康造成極大的威脅，哈佛大學(xué)醫(yī)生JudahFolkman 提出腫瘤的生長(zhǎng)會(huì)誘導(dǎo)新生血管來(lái)給腫瘤組織提供養(yǎng)分和氧氣，帶走代謝廢物，腫瘤還可 以通過(guò)新生血管達(dá)到轉(zhuǎn)移的目的。因此，可以通過(guò)抑制血管新生來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移， 抑制血管新生是抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的有效途徑，為腫瘤的治療提供一種新方法。有效控 制血管新生已成為人們對(duì)有關(guān)疾病治療的新政策。 目前靶向腫瘤血管新生已被全球科學(xué)界列為繼放療、化療、手術(shù)治療后的第四種 腫瘤治療方法。與傳統(tǒng)的對(duì)正常細(xì)胞損傷極大的化療放療相比，抗血管新生療法靶定于腫 瘤灶的微血管內(nèi)皮細(xì)胞而不是腫瘤本身，同時(shí)血管新生抑制劑通常毒副作用小，作用明確， 因此，抗血管新生療法具有療效明顯，毒副作用小等諸多優(yōu)點(diǎn)。 中草藥是我們國(guó)家的寶貴財(cái)富，從中發(fā)現(xiàn)新的抑制血管新生的單體并研究其機(jī)制 具有重要意義。斑蝥是鞘翅目(Coleop tera)芫菁科(Meloidae)斑芫菁屬(Mylabris)的 藥用昆蟲，具有消腫破瘀、解毒、消炎、抗癌、通經(jīng)、殺蟲等功效。其中，斑蝥素(Cantharidin) 是斑蝥的有效成分，分子式是Q。H^04，分子量是196. 20，分子結(jié)構(gòu)式如式(1)如示，該化合 物為萜類物質(zhì)，斜方形鱗狀晶體。曾有報(bào)道稱斑蝥素具有抗腫瘤、升高白細(xì)胞等功效，但是 目前尚未有報(bào)道指出斑蝥素可以抑制血管新生，或通過(guò)抑制血管新生來(lái)抑制腫瘤，也沒(méi)有 關(guān)于斑蝥素作為抑制血管新生藥物的報(bào)道。本發(fā)明首次提出斑蝥素在制備抑制腫瘤血管新 生以及血管新生相關(guān)疾病的藥物中的用途。-二、J
式(1)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人把多種中草藥單體作為篩選對(duì)象，利用化學(xué)生物學(xué)、生物信息學(xué)、文獻(xiàn)查
閱等方法，通過(guò)預(yù)測(cè)并初步實(shí)驗(yàn)篩選，從多種化合物單體中檢測(cè)到斑蝥素這一種中草藥單 體具有顯著抑制血管新生并抑制腫瘤的作用。本發(fā)明的斑蝥素在結(jié)構(gòu)、來(lái)源、背景上完全 不同于其他中草藥單體，本發(fā)明人在檢測(cè)系統(tǒng)的每一單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都相應(yīng)改進(jìn)或調(diào)整了實(shí)驗(yàn)條 件，包括因不同研究對(duì)象的溶解度、作用強(qiáng)弱、穩(wěn)定性等不同性質(zhì)而不同的實(shí)驗(yàn)條件，經(jīng)過(guò) 多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)探索，本發(fā)明首次提出斑蝥素在制備抑制腫瘤血管新生以及血管新生相關(guān)疾 病的藥物中的用途。 本發(fā)明提供式(1)的斑蝥素(Cantharidin)在制備抑制腫瘤血管新生以及血管新 生相關(guān)疾病的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中所用的斑蝥素購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司。 本發(fā)明斑蝥素的技術(shù)方案是，式(1)的斑蝥素(Cantharidin)在制備抑制腫瘤血 管新生以及血管新生相關(guān)疾病的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用，尤其是在制備腫瘤血管新 生、眼科疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管瘤、銀屑病、十二指腸潰瘍等血管新生性疾病中的應(yīng) 用。其中，所述抑制血管新生藥物可抑制腫瘤血管新生，可抑制病變組織血管新生。其中， 所述腫瘤血管新生包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌癥的血管新生，K即osi's肉瘤病變組 織血管新生，Paget' s疾病血管新生，血管瘤，血管瘤病變組織血管新生，實(shí)體瘤病變組織血 管新生，多發(fā)性血管瘤，血管母細(xì)胞瘤，良性血管增生疾病。所述病變組織血管新生包括關(guān) 節(jié)炎病變組織血管新生，血管新生性眼病，銀屑病病變組織血管新生。 本發(fā)明還提供含有有效量的式(I)斑蝥素以及藥學(xué)可接受成分的組合物在制備 抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明可以將治療有效量的斑蝥素和藥學(xué)上允許的任 意一種輔料制成藥物組合物，也可以添加其他與斑蝥素沒(méi)有拮抗作用的其他抗血管新生藥 物?？梢栽诒景l(fā)明的抑制血管新生的藥物中可以加入一種或多種藥學(xué)上可以接受的載體。
其制劑可以是藥學(xué)上的任意一種劑型，包括但不限于末齊U、散劑、片齊U、丸齊iJ、滴齊iJ、顆粒齊iJ、
懸浮劑、溶液劑、膠囊劑、糖衣劑、口服液、注射劑、脂質(zhì)體、舌下含片等。 經(jīng)研究表明，本發(fā)明提供的斑蝥素在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖實(shí)驗(yàn)、體外
劃痕遷移實(shí)驗(yàn)、Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn)、微管形成實(shí)驗(yàn)以及小鼠角膜血管新生等均有明顯的
抑制作用，可以明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，明顯抑制內(nèi)
皮細(xì)胞有阻力的遷移，明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞微管的形成，明顯抑制由血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子
4誘導(dǎo)的新生血管形成。并且，本發(fā)明提供的斑蝥素還可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。


以下各附圖中，均以p < 0. 05表示有顯著差異，其中，*表示p < 0. 05 ;**表示
0. 001 < p < 0. 01 ;***表示p < 0. 001。
圖1 :斑蝥素抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
圖2 :斑蝥素抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外劃痕遷移；其中A.對(duì)照；B. 10微摩爾/升
斑蝥素，右圖為統(tǒng)計(jì)圖。 圖3 :斑蝥素抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞修飾的Boyden小室遷移，箭頭所指為遷移到小室
膜下的細(xì)胞，其中A.對(duì)照；B. IO微摩爾/升斑蝥素，右圖為統(tǒng)計(jì)圖。
圖4 :斑蝥素抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管，其中A.對(duì)照；B. 10微摩爾/升斑蝥素，右
圖為統(tǒng)計(jì)圖。
圖5 :斑蝥素抑制角膜新生血管新生，黑色箭頭所指為植入顆粒，白色箭頭所指為 新生血管，其中A.對(duì)照；B.斑蝥素，柱狀圖為血管長(zhǎng)度、鐘點(diǎn)數(shù)與血管面積的統(tǒng)計(jì)圖。
圖6 :斑蝥素抑制腫瘤生長(zhǎng)，治療過(guò)程中腫瘤體積與小鼠體重的統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)例1 :斑蝥素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein EndothelialCells， HUVEC)增殖 原理在活細(xì)胞中，線粒體中的NADra脫氫酶將MTS四唑鹽化合物轉(zhuǎn)變成一種溶 于細(xì)胞培養(yǎng)液的有色物質(zhì)。因此，活細(xì)胞數(shù)越多，就可以更多地轉(zhuǎn)變四唑鹽成為這種有色物 質(zhì)，所以其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)目在一定范圍內(nèi)，通過(guò)測(cè)定該物質(zhì)在490nm處的光吸收值 可以間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)該方法可評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
方法在96孔板中接入HUVEC細(xì)胞懸液，5000個(gè)/孔，設(shè)置對(duì)照組和加樣組，對(duì)照 組不加斑蝥素，加樣組分別加入含有不同濃度斑蝥素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，作用48小時(shí)后，加入 20微升CellTiter 96 Aqueous細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，孵育1_3小時(shí)，用酶標(biāo)儀在490納米處 檢測(cè)每孔的光吸收值。 結(jié)果與評(píng)價(jià)與對(duì)照組相比，加入斑蝥素的實(shí)驗(yàn)組，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力受到抑
制，說(shuō)明斑蝥素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，結(jié)果見圖1。 實(shí)施例2 :斑蝥素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外劃痕遷移實(shí)驗(yàn) 目的和原理細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)又叫體外劃痕實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通在培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿的單層
細(xì)胞上制造劃痕，觀察劃痕邊緣細(xì)胞朝劃痕部位遷移的情況，統(tǒng)計(jì)在藥物作用下，劃痕處新
遷入的內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量是否有變化，來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。
方法將細(xì)胞接入6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上的密度時(shí)，用微量移液器的1
毫升吸頭在每孔的中間劃十字線。用磷酸緩沖液(PBS)洗凈劃下的細(xì)胞，加入含不同藥物
濃度及8納克/毫升VEGF165的培養(yǎng)基，于5% C02培養(yǎng)箱中37t:培養(yǎng)12 16小時(shí)，直至
VEGF165組劃線兩側(cè)的細(xì)胞遷移至劃線區(qū)域中央。 結(jié)果與評(píng)價(jià)在顯微鏡下觀察并拍照，結(jié)果見圖2(其中A為對(duì)照組；B為含斑蝥素 組，劑量為10微摩爾/升)。與對(duì)照組相比，加入斑蝥素后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的
5遷移受到抑制，說(shuō)明斑蝥素可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。 實(shí)施例3 :斑蝥素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞修飾的Boyden小室遷移實(shí)驗(yàn) 目的和原理內(nèi)皮細(xì)胞修飾的Boyben小室最初是Boyden發(fā)明的，用于研究白細(xì)
胞的趨化性，這種研究基于小室被微孔分離成上下兩個(gè)部分，本實(shí)驗(yàn)室采用的是Millopore
公司購(gòu)買的小室。修飾的Boyden小室是一類可插入細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)皿，底層有孔徑為8
微米的多聚碳酸鹽濾膜，在生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)下細(xì)胞可以透過(guò)膜的一側(cè)粘附于含有高濃度生
長(zhǎng)因子的另一側(cè)。此實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有阻力遷移能力的影響。 方法用0. 1%的明膠將24孔板和放入其中的小室包被，于5% C02培養(yǎng)箱中37°C
孵育30分鐘，棄去明膠，用PBS洗三遍。小室外24孔板中加入含有10%血清和VEGF165的
內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。小室中接入細(xì)胞，之后再加入50 P L不同濃度的藥物，細(xì)胞在37°C 5% C02
培養(yǎng)箱中孵育四小時(shí)。 結(jié)果與評(píng)價(jià)四小時(shí)后，將小室內(nèi)外的細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，用棉棒拭去上層細(xì)胞，將 小室浸泡在4%多聚甲醛中固定20分鐘，用PBS洗三遍吸干，然后用蘇木精染色20分鐘，再 用PBS將背景多余染料洗去，室溫晾干。OLYMPUS顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果見圖 3(其中A為對(duì)照組；B為含斑蝥素組，10微摩爾/升)，與對(duì)照組比，給予斑蝥素后，人臍靜 脈內(nèi)皮細(xì)胞穿過(guò)Boyden小室的能力受到抑制，說(shuō)明斑蝥素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞有阻力的遷 移的能力。 實(shí)施例4 :斑蝥素抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn) 目的和原理Matrigel (基質(zhì)膠)是從小鼠肉瘤EHS中抽提得到的可容性基底膜 抽提物。在室溫下，此Matrigel可聚合成一種具有生物活性的基質(zhì)材料，作用與哺乳動(dòng)物 細(xì)胞基底膜類似，對(duì)于細(xì)胞的粘附和分化有效應(yīng)作用。內(nèi)皮細(xì)胞可以在Matrigel上融和成 微管，可以利用內(nèi)皮細(xì)胞的這種成管特性來(lái)研究藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響。
方法將Matrigel均勻鋪到24孔板中，37°〇，5% C02培養(yǎng)箱中放置30分鐘待其 凝固。每孔加入相同體積的細(xì)胞和含有不同濃度斑蝥素的培養(yǎng)基各500微升，混勻。于 37°C 5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h在顯微鏡下觀察微管形成情況，計(jì)算微管形成數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析。 結(jié)果與評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel中生長(zhǎng)8_12小時(shí)后，細(xì)胞在Matrigel中延伸 生長(zhǎng)，由原來(lái)的單個(gè)細(xì)胞巻成管狀相互連接，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果見圖4(其中A :對(duì)照 組；B :給予10微摩爾斑蝥素)，與對(duì)照組相比，內(nèi)皮細(xì)胞的成管過(guò)程受到影響，三維網(wǎng)絡(luò)結(jié) 構(gòu)形成受阻，說(shuō)明斑蝥素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞微管形成。
實(shí)施例5 :斑蝥素抑制小鼠角膜新生血管形成 目的與原理小鼠角膜是一個(gè)無(wú)血管區(qū)域，在小鼠角膜上做一個(gè)小袋，植入含有血 管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的緩釋顆粒，可以誘導(dǎo)存在于角鞏緣處的血管向緩釋顆粒的 小袋生長(zhǎng)。加藥組通過(guò)在緩釋顆粒上加上VEGF和O. l微克的斑蝥素，觀察這些誘導(dǎo)的血管 面積是否有改變。 方法將C57/BL6小鼠麻醉，固定，在角膜上開一小口 ，對(duì)照組植入含有血管內(nèi)皮 細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的緩釋顆粒，加藥組植入含有VEGF和藥物的緩釋顆粒。術(shù)后復(fù)蘇，飼 養(yǎng)一周后，顯微鏡下觀察拍照。 結(jié)果與評(píng)價(jià)結(jié)果見圖5示，與對(duì)照組相比，加藥組新生血管明顯受到抑制，說(shuō)明
6斑蝥素可以抑制由血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)誘導(dǎo)的新生血管形成。
實(shí)施例6 :斑蝥素抑制腫瘤生長(zhǎng) 目的和原理在小鼠身上荷瘤，通過(guò)對(duì)腫瘤的不同處理，觀察處理組和對(duì)照組腫瘤 體積的變化，并且觀察小鼠體重是否有明顯變化。 方法將一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞注射到小鼠皮下，等實(shí)體腫瘤長(zhǎng)到一定體積的時(shí)候， 分別對(duì)對(duì)照組和處理組注射不同濃度的斑蝥素，同時(shí)每天測(cè)量其體重和腫瘤體積，36天后 將腫瘤剝離。 結(jié)果與評(píng)價(jià)結(jié)果見圖6所示，36天后，將經(jīng)過(guò)斑蝥素處理的加藥組和對(duì)照組的小 鼠腫瘤剝離，加藥組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組。
權(quán)利要求
式(1)的斑蝥素在制備抑制血管新生的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用。式(1)F2009101994598C0000011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制血管新生藥物可抑制腫瘤血管 新生。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制血管新生藥物可抑制病變組織 血管新生。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤血管新生包括白血病、淋巴瘤、 骨髓瘤血液癌癥的血管新生，K即osi' s肉瘤病變組織血管新生，Paget' s疾病血管新生，血 管瘤，血管瘤病變組織血管新生，實(shí)體瘤病變組織血管新生，多發(fā)性血管瘤，血管母細(xì)胞瘤， 良性血管增生疾病。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病變組織血管新生包括關(guān)節(jié)炎病變 組織血管新生，血管新生性眼病，銀屑病病變組織血管新生。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于，含有有效量的式(I)斑蝥素以及藥學(xué)可接 受成分的組合物在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了斑蝥素在制備抑制腫瘤血管新生與血管新生相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了含有有效量的式(I)斑蝥素以及藥學(xué)可接受成分的組合物在制備抑制血管新生藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/02GK101703498SQ200910199459
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者劉明耀, 盧彬彬, 吳媛媛, 宋雅娟, 張曉麗, 易正芳, 李成海, 楊正峰 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)