專(zhuān)利名稱(chēng)：蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從蛋清蛋白酶解產(chǎn)物中分離純化血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其
制備方法，特別涉及一種生物酶解方法制備得到一種新的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，屬于 生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高血壓病是一種常見(jiàn)的心血管疾病，它發(fā)病率高，常伴有心臟、血管、肺以及腎臟 等器官功能性或器質(zhì)性改變，是引發(fā)心、腦、腎和眼血管等各種并發(fā)癥和導(dǎo)致中風(fēng)、促進(jìn)動(dòng) 脈粥樣硬化、冠心病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因子。高血壓病是中國(guó)目前首要的心血管疾病，我國(guó)約 有1.6億高血壓患者，高血壓的治療迫在眉睫。人工合成的降壓藥物具有明顯的降壓效果， 但是副作用較大，人們將目光轉(zhuǎn)向了安全無(wú)副作用的源于食品的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽 的研究。 食物來(lái)源的活性肽不僅能提供人體生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)，還可降低血壓、抗凝血、 抗菌、免疫、抗氧化、降膽固醇，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、降血脂、護(hù)肝等功能。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制 肽是一類(lèi)具有抑制ACE活性的物質(zhì)，隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的高度關(guān)注，食源性血管緊 張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。 自1965年首次在南美茅頭蝮蛇毒液中發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽以來(lái)，國(guó)內(nèi) 外研究人員已從不同來(lái)源的蛋白質(zhì)中制備出各種具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的肽類(lèi) 物質(zhì)。蛋清中含有豐富的蛋白質(zhì)資源，且與人體的蛋白模式相似，可以很好的被人體全面吸 收。但蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究報(bào)道較少，本發(fā)明以蛋清蛋白為原料開(kāi)發(fā) 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。檢索中國(guó)專(zhuān)利，未見(jiàn)相同相似記載。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其制 備方法。 蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，其特征在于，氨基酸序列為RVPSL，本發(fā)明所 述的蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽具有較高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性，半抑制濃 度(IC5。)為0.020mM，形態(tài)為白色粉末狀。 本發(fā)明所述的蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽制備方法，包括酶解蛋清蛋白酶 解物制備、純化、結(jié)構(gòu)鑒定和化學(xué)合成，具體步驟如下
(1)酶解蛋清蛋白制備酶解物 取一定量蛋清蛋白質(zhì)配制成濃度為5%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中9(TC熱變性 10min。冷卻至酶解溫度40 60°C ，用0. 5moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至8 11，加入占 蛋清蛋白質(zhì)質(zhì)量1% 5X的堿性蛋白酶Alcalase 2. 4L進(jìn)行水解，水解過(guò)程中不斷攪拌， 并不斷加入適當(dāng)濃度的氫氧化鈉溶液以維持pH值在8 11范圍內(nèi)(±0. 05)，水解2 20 小時(shí)后經(jīng)8(TC滅酶10min，離心1000 9000g 10min，噴霧干燥或冷凍干燥，保存?zhèn)溆茫?br> (2)蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的純化 酶解物配制成水溶液，經(jīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠進(jìn)行柱層析純化，用蛋白核酸檢測(cè)儀在 220nm處進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)色譜柱純化得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱(chēng)重后，測(cè) 定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性； (3)蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定 分離純化得到的具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶高抑制活性的組分，采用液相色譜_四極 桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(4000QTRAP)測(cè)定其結(jié)構(gòu)，液相色譜分離流動(dòng)相為70%乙腈(A)和 含O. 1%甲酸水(B)，線性梯度洗脫A:10X 100% (0 10min)，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，質(zhì)譜掃 描模式為EMS/ER/EPI/EPI，掃描范圍為M/Z :275-1000。
(4)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的合成及活性驗(yàn)證 采用Fmoc固相合成法合成活性肽RVPSL，純度達(dá)到95 % 。利用高效液相色譜純化 合成肽，并通過(guò)DIONEX MSQ質(zhì)譜測(cè)定其分子量，質(zhì)譜參數(shù)為源ESI，錐孔電壓+75v，上樣量 5ul，掃描范圍m/zl00-2000。 本發(fā)明所采用的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性測(cè)定方法為高效液相色譜法，具體步 驟為 取30iiL馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)底物液，加入10 y L抑制劑混合均勻，在 37°C 士0.5t:恒溫水浴中預(yù)熱3-5min，然后加人20iiL血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)液充分混 合，37。C保溫30min后，再加入60iiL的lmoL/LHCl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。同時(shí)用10 y L pH 為8. 3的硼酸緩沖液替代抑制劑溶液作為空白對(duì)照組。該反應(yīng)液用0. 45 ii m濾膜過(guò)濾后直 接用HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。色譜條件柱溫25°C ，流速0. 5mL/min，流動(dòng)相乙腈/水(0. 05% TFA)比例為25/75等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)228nm.
ACE抑制活性計(jì)算公式如下
ACE抑制活性(% ) = 100(M-N)/M
式中M為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積。
N為添加抑制劑組中馬尿酸的峰面積。 本發(fā)明的優(yōu)良效果在于將生物酶工程技術(shù)及蛋白質(zhì)組技術(shù)應(yīng)用于雞蛋的深層次 開(kāi)發(fā)利用。本發(fā)明以蛋清蛋白為酶解原料，酶解產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化色譜質(zhì)譜鑒定血管緊張 素轉(zhuǎn)化酶抑制肽氨基酸序列為RVPSL， IC5。為0. 020mM。


圖1是實(shí)施例1步驟(1)中蛋清蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠S印hadex G-25柱層析的色譜圖。 圖2，圖3分別是實(shí)施例1步驟(3)中交聯(lián)葡聚糖凝膠S印hadex G_25柱層析分離 的高活性組分的一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖。 圖4，圖5分別是實(shí)施例1步驟(4)中固相合成法合成RVPSL的色譜圖及質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但不限于此。
實(shí)施例1從蛋清蛋白酶解產(chǎn)物中純化得到血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽RVPSL
(1)酶解蛋清蛋白制備酶解物 取一定量蛋清蛋白質(zhì)配制成濃度為5%的水溶液，置于恒溫水浴鍋中9(TC熱變性 10min。冷卻至酶解溫度4(TC，用0. 5moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至11，加入占蛋清蛋白質(zhì) 質(zhì)量5X的堿性蛋白酶Alcalase2. 4L進(jìn)行水解，水解過(guò)程中不斷攪拌，并不斷加入適當(dāng)濃 度的氫氧化鈉溶液以維持pH值在11范圍內(nèi)(士0.05)，水解20小時(shí)后經(jīng)8(TC滅酶10min， 離心1000g 10min，噴霧干燥，保存?zhèn)溆茫?
(2)蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的純化 酶解物配制成水溶液，經(jīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠進(jìn)行柱層析純化(1. 6*100cm)，去離子水 作為洗脫液，流速為60mL/min，用蛋白核酸檢測(cè)儀，在220nm處進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)色譜柱純化 得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱(chēng)重后，測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性；
(3)蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定 分離純化得到的具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶高抑制活性的組分，采用液相色譜_四極 桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(4000Q TRAP)測(cè)定其結(jié)構(gòu)，液相色譜分離流動(dòng)相為70%乙腈(A)和 含O. 1%甲酸水(B)，線性梯度洗脫A:10X 100% (0 10min)，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，質(zhì)譜掃 描模式為EMS/ER/EPI/EPI，掃描波長(zhǎng)范圍為275-1000amu。
(4)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的合成及活性驗(yàn)證 采用Fmoc固相合成法合成活性肽TPSPR，純度達(dá)到95 % 。利用高效液相色譜純化 合成肽，并通過(guò)DIONEX MSQ質(zhì)譜測(cè)定其分子量，質(zhì)譜參數(shù)為源ESI，錐孔電壓+75v，上樣量 5ul，掃描范圍m/zl00-2000。 實(shí)施例2如實(shí)施例1所述，所不同的是蛋清蛋白制備酶解物的Alcalase 2. 4L用 量為蛋清蛋白的1X，酶解pH值為8，酶解時(shí)間為2h，滅酶后9000g離心10min，冷凍干燥，
保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
一種蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，其特征在于，所述的蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽具有較高的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性，其氨基酸序列為RVPSL，為白色粉末狀，半抑制濃度(IC50)為0.020mM。
2. 如權(quán)利要求1所述的蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，制備方法的具體步驟如下(1) 酶解蛋清蛋白制備酶解物取一定量蛋清蛋白質(zhì)配制成一定濃度的水溶液，置于恒溫水浴鍋中9(TC熱變性 10min。冷卻至酶解溫度40 60°C ，用0. 5moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)解pH至8 11，加入占 蛋清蛋白質(zhì)質(zhì)量1% 5%的堿性蛋白酶進(jìn)行水解，水解過(guò)程中不斷攪拌，并不斷加入適當(dāng) 濃度的氫氧化鈉溶液以維持pH值在8 11范圍內(nèi)(士0.05)，水解2 20小時(shí)后經(jīng)8(TC 滅酶10min，離心1000 9000g 10min，噴霧干燥或冷凍干燥，保存?zhèn)溆茫?2) 蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的純化酶解物配制成水溶液，經(jīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠進(jìn)行柱層析純化，用蛋白核酸檢測(cè)儀，在 220nm處進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)色譜柱純化得到的色譜峰分別收集，收集的洗脫液凍干稱(chēng)重后，測(cè) 定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性；(3) 蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定分離純化得到的具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶高抑制活性的組分，采用液相色譜_四極桿線 性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(4000Q TRAP)測(cè)定其結(jié)構(gòu)，液相色譜分離流動(dòng)相為70%乙腈(A)和含 0. 1%甲酸水(B)，線性梯度洗脫A:10X 100% (0 10min)，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，質(zhì)譜掃描 模式為EMS/ER/EPI/EPI，掃描范圍為M/Z 275-1000 ;(4) 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的合成及活性驗(yàn)證采用Fmoc固相合成法合成權(quán)利要求1中所述序列的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽。禾U用 高效液相色譜純化合成肽，并通過(guò)DIONEX MSQ質(zhì)譜測(cè)定其分子量，質(zhì)譜參數(shù)為源ESI，錐 孔電壓+75v，上樣量5uL，掃描范圍m/z 100-2000。
3. 如權(quán)利要求2所述的蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備方法，其特征在于， 步驟(2)中所采用的色譜層析填料為S印hadex G_25，流速為60mL/h。
4. 如權(quán)利要求2所述的蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備方法，其特征在于， 步驟(4)中所述的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的合成采用FM0C固相合成法，純度達(dá)到95X。
5. 如權(quán)利要求2所述的蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的制備方法，其特征在于， 步驟(2)中測(cè)定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的方法為高效液相色譜法。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。從蛋清蛋白酶解物中分離純化出新的具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制作用的活性肽，序列為RVPSL。制備步驟包括酶解蛋清蛋白制備酶解物、蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的純化、蛋清蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的合成及活性驗(yàn)證。本發(fā)明可用于制備降壓藥物和輔助降血壓功能食品。
文檔編號(hào)A61P9/00GK101696233SQ20091021778
公開(kāi)日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者于一丁, 于志鵬, 劉靜波, 趙文竹 申請(qǐng)人:吉林大學(xué);