專利名稱:核苷酸磷脂分子及脂質(zhì)體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域:
本發(fā)明屬于藥物轉(zhuǎn)運載體技術領域,涉及一種用于核酸跨膜轉(zhuǎn)運的新型核苷酸磷
脂分子及其制備方法,還涉及該核苷酸磷脂分子所形成的脂質(zhì)體及其制備方法和應用。
背景技術:
基于核酸的一些藥物和生物活性分子如異核苷、寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA)及 各種RNA、 DNA單鏈和雙鏈要想發(fā)揮其生物活性,必須能有效的解決其透過細胞膜的能力。 很多技術已經(jīng)被用來提高這些化合物的細胞攝取,例如,高壓靜脈注射、脂質(zhì)體和納米聚合 物等,但是這些方法都存在各自的短板而限制其發(fā)展。 目前在核酸類分子跨膜方面應用最廣泛的是脂質(zhì)體載體,包括天然磷脂脂質(zhì)體和 陽離子脂質(zhì)體。天然磷脂含負電荷,對核酸類分子的攜帶能力差,需要繁瑣的處理和制劑設 備及工藝方能制成脂質(zhì)體,雖然有成本優(yōu)勢但是易用性差,且不可能作為轉(zhuǎn)染試劑使用。陽 離子脂質(zhì)體雖然能高效地攜帶轉(zhuǎn)運核酸類分子,但其對細胞膜也會造成嚴重損傷,雖然使 用簡便,但細胞毒性決定了其只能在低濃度下用于轉(zhuǎn)染實驗,無法大規(guī)模用于藥物制劑。而 且作為高效轉(zhuǎn)染試劑的陽離子脂質(zhì)體工藝為外國所把持,價格高昂。這一切,使得尋找高效 的電中性的脂質(zhì)體載體成為極為必要的舉措。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術中存在的問題,本發(fā)明的目的在于提供一類具有高效轉(zhuǎn)運
核酸類化合物透膜能力的磷脂脂質(zhì)體及其制備方法和應用,包括方便地大量制備核苷酸磷
脂化合物并進一步形成脂質(zhì)體的方法。 為了達到上述目的,本發(fā)明采用如下技術方案 —種核苷酸磷脂分子,其具有如式(VIII)或式(IX)所示的兩親性結(jié)構(gòu)
VIII IX
S卩,一個核苷結(jié)構(gòu)的親水基團和一個脂肪醇或甘油脂的親脂基團,兩種基團由磷 脂連接構(gòu)成一個核苷酸磷脂分子。 其中,所述核苷酸磷脂分子中所含堿基,即式(VIII)和式(IX)中的Base基團,為 各種常見的天然嘌呤和嘧啶堿基,包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶等。
磷酸部分除結(jié)合親水及親脂基團的兩個羥基之外的第三個羥基,即式(VIII)和 式(IX)中的&基團,為長度在lnm以內(nèi),含12個碳原子以下的非離子型取代基,如甲基、 乙基、腈乙基、芐基等,也可以是非取代的氫原子。 所含的脂肪醇或甘油脂的親脂基團,即式(VIII)和式(IX)中的&基團,為長度在 10到18個碳原子的脂肪烴或醚類取代基,可以是飽和的或不飽和的,例如十六烷基、十八 烯基、聚乙二醇等。 本發(fā)明還提供所述核苷酸磷脂分子的制備方法,是亞磷?;椒?,其可以但不必 須經(jīng)由一釜法策略制備。 所述一釜法策略使用能夠簡單大量獲得的試劑,在常溫條件下,8小時之內(nèi)得到目 標化合物。該策略包括下列步驟 (a)在無水無氧條件下的亞磷酰化反應;通過三價亞磷酰試劑構(gòu)建磷脂分子,尤
其是存在含有三價磷的亞磷脂化合物中間體; (b)反應完成后蒸干溶劑,無需轉(zhuǎn)移的氧化反應; (c)氧化之后無需轉(zhuǎn)移、條件溫和的脫保護基反應。 進一步,所得化合物還可經(jīng)由正相硅膠色譜方法純化。 本發(fā)明進一步提供所述核苷酸磷脂分子的應用,可將其用于制備脂質(zhì)體,但不僅 僅局限于此一用途。 所述脂質(zhì)體可以由本發(fā)明公開的核苷酸磷脂分子構(gòu)成,或由本發(fā)明公開的核苷酸 磷脂分子和其他化合物混合構(gòu)成。這些化合物可以是膽固醇、含陽離子的磷脂、大豆磷脂 等,但不僅僅局限于這一范圍。 上述由本發(fā)明公開的核苷酸磷脂分子構(gòu)成,或由本發(fā)明公開的核苷酸磷脂分子和 其他化合物混合構(gòu)成的空白脂質(zhì)體可以攜帶核苷分子、核苷酸鏈、siRNA分子透過細胞膜。 所述的核苷分子是指天然核苷、經(jīng)由化學修飾的核苷、異核苷;所述的核苷酸鏈是指各種天 然核苷酸鏈和經(jīng)由化學修飾的核苷酸鏈,包括但不局限于單/雙鏈寡核苷酸、直鏈/環(huán)狀核 苷酸鏈、脫氧/非脫氧核苷酸形成的鏈;所述的siRNA分子是指化學合成的siRNA分子、經(jīng) 由Dicer酶降解生產(chǎn)的siRNA分子和化學修飾的siRNA分子。 本發(fā)明進一步提供一種制備上述脂質(zhì)體的方法,可以是通過制劑手段使核苷分 子、核苷酸鏈或siRNA分子包裹在脂質(zhì)體內(nèi),也可以是將空白脂質(zhì)體和上述分子簡單混合 后孵育形成可以透過細胞膜的結(jié)合物。 本發(fā)明還提供所述脂質(zhì)體的用途,可以作為轉(zhuǎn)染試劑,攜帶基因分子透過細胞膜; 所述的基因分子指攜帶遺傳性息的DNA單鏈、RNA單鏈、DNA雙鏈、RNA雙鏈及其他可以用作 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DNA分子。 本發(fā)明可以實現(xiàn)以下優(yōu)點提供了一類核苷和各種核酸的高效透膜載體,低細胞 毒性,體內(nèi)可降解為內(nèi)源性物質(zhì),且使用簡便;且該類載體經(jīng)由一釜法完成的合成路線及簡
單的純化方法制備得到,具有相對低廉的制造成本。本發(fā)明涉及的磷脂脂質(zhì)體,具有制備簡 單、效用良好、應用范圍廣泛等特點,是一類膜透性好的載體分子,可用于介導核苷酸類化 合物如siRNA、質(zhì)粒的透膜。該種脂質(zhì)體可以作為研究反義寡核苷酸與小干擾RNA(siRNA) 機理的分子生物學工具,或一種通用的轉(zhuǎn)染試劑,同時也具有潛在的藥物開發(fā)前景。
圖1為代表性化合物B的合成路線; 圖2為代表性化合物B的核磁共振氫譜譜圖; 圖3為代表性化合物F的合成路線; 圖4為毛細管電泳評價脂質(zhì)體對核酸鏈的親和力; 圖5為熒光法觀測脂質(zhì)體內(nèi)包合siRNA的情況及使用其進行細胞轉(zhuǎn)染的結(jié)果,其 中A表示HEK293細胞系轉(zhuǎn)染實驗;B表示BT474細胞系轉(zhuǎn)染實驗;C和D表示激光共聚焦顯 微觀測脂質(zhì)體_核酸復合物顆粒。
具體實施例方式
— 、核苷酸磷脂化合物的合成 根據(jù)本發(fā)明,制備核苷酸磷脂化合物的合成方法,主要包括以下步驟 A.使用式(I)的結(jié)構(gòu)與式(II)或式(III)通過亞磷?;椒?gòu)建式(IV)化合物
或式(V)化合物,即在無水無氧條件下進行亞磷?;磻?,亞磷酰試劑式(I)Ri基團為一短
的親脂基團,可以是但不局限于甲基、腈乙氧基、芐基;
B.對式(IV)、式(V)的亞磷酰進行氧化,氧化劑可以是但不局限于雙氧水、過氧叔
丁醇,得到式(VI)和式(VII);
6VI VII
C.將式(VI)和式(VII)脫除匿Tr保護,從而形成核苷酸磷脂分子式(VIII)和式 (IX)。
VIII IX
以上所示Base為各種常見的天然嘌呤和嘧啶堿基,包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌 呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶等; 以上所示&為長度在lnm以內(nèi),含12個碳原子以下的不含電荷的取代基,如甲基、 乙基、月青乙基、節(jié)基等; 以上所示R2為長度在10到18個碳原子內(nèi)的脂肪烴取代基,為長度在10到18個 碳原子的脂肪烴或醚類取代基,可以是飽和的或不飽和的,例如十六烷基、十八烯基、聚乙
二醇等。
(1) —釜法策略 根據(jù)本發(fā)明,核苷酸磷脂化合物的制備應通過包括下列步驟的方法實現(xiàn)(a)在 無水無氧條件下的亞磷?;磻?;(b)反應完成后蒸干溶劑,無需轉(zhuǎn)移的氧化反應;(c)氧 化之后無需轉(zhuǎn)移條件溫和的脫保護基反應; 根據(jù)本發(fā)明,用于亞磷?;脑噭┛梢允?H-四氮唑。 根據(jù)本發(fā)明,用于脫除匿Tr保護基的試劑可以是三氟乙酸(TFA)。 根據(jù)本發(fā)明,用于反應的溶劑包括,但不限于吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈
(MeCN)、甲醇(MeOH)禾P N, N_ 二甲基甲酰胺(DMF)。 (2)純化方法 —釜法合成核苷酸磷脂之后的產(chǎn)物可進一步經(jīng)由正相硅膠色譜方法純化,以二氯
甲烷甲醇=50 : i io : i(體積比)的洗脫條件可分離純化上述系列核苷酸磷脂產(chǎn)物。 以下通過具體合成的實施例進一步說明本發(fā)明,但不代表對本發(fā)明有任何限制。
根據(jù)上述的方法,我們得到了一系列核苷酸磷脂化合物,代表性的例舉其中六個
7化合物A-F :
<formula>formula see original document page 8</formula> 實施例1化合物B的合成
反應路線如圖l所示。 取化合物Bl (亞磷?;塑諉误w均購自國藥集團,為DNA合成常用化合物,市場來 源廣泛)(740mg) , 1H-四唑(70mg),無水無氧條件下混合,溶于雙蒸無水CH3CN 15ml中,攪 拌。取化合物正十六醇(棕櫚醇)(360mg),溶于10ml雙蒸無水CH3CN中,緩緩注入前述攪 拌反應中。室溫繼續(xù)攪拌反應2小時,TLC鑒定反應基本完全后冰浴降溫。
冰浴攪拌下逐滴滴加過氧叔丁醇(0. 3ml, 4eq.),觀察無劇烈放熱后撤去冰浴,繼 續(xù)反應30分鐘。然后向反應體系中加入30ml 5% CHC12C00H的CH2C12溶液,室溫攪拌反應 15分鐘,TLC鑒定反應完全后,硅膠柱層析(環(huán)己烷乙酸乙酯=3 : l)分離,產(chǎn)物為白色 小膠珠狀固體,完全抽干后為貼壁白色間帶紅色固體,共計390mg,總收率66% .
產(chǎn)物核磁氫譜檢驗如圖2所示。 4 NMR(CD30D) :67. 73 (s, 1H) ,6. 24(t, 1H, J = 6. 0Hz, 1H) , 5. 01 (m, 1H), 4. 78-4. 08 (m, 5H) , 3. 73 (d, J = 2. 8, 2H) , 2. 83 (m, 2H) , 2. 48 (m, 1H) , 2. 34 (m, 1H) , 1. 81 (s, 3H) , 1. 62-1. 67(m,2H) , 1. 33(s,26H) ,0. 82(t, J = 7. 2Hz,3H).
高分辨質(zhì)譜得MS :m/z 600. 3409 [M+H] +
實施例2化合物F的合成
反應路線如圖3所示。 取化合物Fl (購自國藥集團)(400mg) , 1H_四唑(40mg),無水無氧條件下混合,溶 于雙蒸無水CH3CN 10ml中,攪拌。取化合物正十二醇(180mg),溶于10ml雙蒸無水CH3CN 中,緩緩注入前述攪拌反應中。室溫繼續(xù)攪拌反應2小時,TLC鑒定反應基本完全后冰浴降溫。 冰浴攪拌下逐滴滴加過氧叔丁醇(0. 2ml),觀察無劇烈放熱后撤去冰浴,繼續(xù)反應 30分鐘。然后向反應體系中加入25ml 5% CHC12C00H的CH2C12溶液,室溫攪拌反應15分 鐘,TLC鑒定反應完全后,注入飽和濃氨水lOml,攪拌反應30分鐘,TLC鑒定反應完全后,以硅膠柱層析(二氯甲烷甲醇=30 : 1)分離,產(chǎn)物為白色小膠珠狀固體,共計183mg,總收 率73% . 高分辨質(zhì)譜得MS:m/z 514. 3233 [M+H]+. 本發(fā)明要求權(quán)利的系列化合物都可以用和產(chǎn)物相對應的原料,以上述方法合成,
故不再一一贅述。 二、核苷酸磷脂脂質(zhì)體的制備
(1)空白脂質(zhì)體的制備 經(jīng)過純化后的上述核苷酸磷脂化合物可用于制備空白脂質(zhì)體,通過以下方法實 施 (a)將核苷酸磷脂的乙醇溶液通過薄膜分散法制為空白脂質(zhì)體;
(b)透析去小分子雜質(zhì);
(c)凍干。 該空白脂質(zhì)體可按照中華人民共和國藥典中關于脂質(zhì)體藥物載體的使用方法,用 做各種藥物的載體。
(2)脂質(zhì)體_核酸復合物的制備 除預制空白脂質(zhì)體用于包載藥物之外,本發(fā)明公開的系列核苷酸磷脂化合物還可 以通過溶液狀態(tài)與核酸分子相互作用,形成脂質(zhì)體_核酸復合物,從而發(fā)揮轉(zhuǎn)染試劑的作 用。具體通過以下方法實施 (a)將核苷酸磷脂分散在乙醇水=100 : 0 50 : 50的溶液中;
(b)將上述溶液同核酸(如siRNA、反義寡核苷酸、質(zhì)粒)溶液混合;
(c)將上述混合液25攝氏度下振搖孵育30分鐘; (d)上述孵育后混合液即為脂質(zhì)體-核酸復合物,可以直接用于細胞轉(zhuǎn)染,也可以 通過薄膜法、凍融法等方法修飾粒徑或進一步提高包封率。 根據(jù)本發(fā)明,用于制備脂質(zhì)體和透析的主要溶劑包括,但不限于,去離子水(H20)、
吡啶(Py)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(MeCN)、甲醇(MeOH)和N, N-二甲基甲酰胺(DMF)。其中
具體操作方法為相關專業(yè)人員所熟知,故不再贅述。三、根據(jù)本發(fā)明,核苷酸磷脂脂質(zhì)體可
以用于以下用途 A. siRNA透膜轉(zhuǎn)運 核苷酸磷脂脂質(zhì)體可以用于協(xié)助siRNA的透膜轉(zhuǎn)運。通過制備脂質(zhì)體包裹的 siRNA或者將siRNA和核苷酸磷脂簡單共孵育制得的復合物,可以有效的將siRNA轉(zhuǎn)運進細 胞膜。 B.寡核苷酸透膜轉(zhuǎn)運 寡核苷酸也可以用和A所述同樣的方式進行轉(zhuǎn)運。
C.基因轉(zhuǎn)染 本發(fā)明也可以用作基因轉(zhuǎn)染試劑,通過將核苷酸磷脂和質(zhì)粒進行大約30分鐘的 簡單共孵育,g卩能形成轉(zhuǎn)染復合物,完成有效轉(zhuǎn)染。
應用實例1 :對寡核苷酸雙鏈的結(jié)合能力; 使用21個堿基對長度的雙鏈DNA和化合物合成方法舉例中的核苷酸磷脂化合物 C,對比在有無脂質(zhì)體參與情況下DNA雙鏈的毛細管電泳行為,說明該類脂質(zhì)體對寡核苷酸的結(jié)合能力,如圖4所示。
實驗條件 所用雙鏈DNA序列(購買自北京奧科生物技術有限公司)如下 5, -TCGGGAAATTTCTCTATTATT-3, 3' -TTAGCCCTTTAAAGAGATAAT-5' 所用核苷酸磷脂化合物C為其乙醇的真溶液。 毛細管電泳實驗溫度25°C ,檢測波長254nm,電泳電壓25kV,流動相緩沖液為25mM
TBE,pH = 8. 0。圖中所示峰為溶液中游離的雙鏈DNA的檢出峰。所用DNA為0. 2od/ y L的
21堿基dsDNA在25mM的TBE中的溶液。 圖4中所示三條曲線,自上而下分別為 (l)DNA :僅以DNA雙鏈溶液單獨進行毛細管電泳; (2)0':以DNA雙鏈和50倍質(zhì)量當量的核苷酸磷脂混合振搖后立刻進行毛細管電泳; (3) 30':以DNA雙鏈和50倍質(zhì)量當量的核苷酸磷脂混合后振搖30分鐘再進行毛細管電泳。 電泳結(jié)果顯示,加入該種磷脂后,溶液中游離的雙鏈DNA片段大幅減少,說明該磷脂可以迅速捕捉結(jié)合雙鏈DNA寡核苷酸片段。
應用實例2 :轉(zhuǎn)染和透膜能力,如圖5所示。 轉(zhuǎn)染實驗使用化合物合成方法舉例中的核苷酸磷脂B和羧基熒光素(FAM)熒光標記的siRNA(序列如下,購買自北京奧科生物技術有限公司)混合孵育,即將核苷酸磷脂B的乙醇真溶液加入到siRNA中孵育,在激光共聚焦顯微下能夠觀察到脂質(zhì)體-siRNA復合物(圖5C、D,脂質(zhì)體中可見明顯綠色熒光聚集);以粒度儀檢測該復合物的平均粒徑為350nm。將該復合物和細胞共孵育后,觀察到細胞內(nèi)熒光(圖5A、B),證明siRNA已被轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)。
實驗所用siRNA序列
5' -UCGGGAAAUUUCUCUAUUAdTdT-3'
3' -dTdTAGCCCUUUAAAGAGAUAAU-5' 本文顯示并詳細描述的信息足以實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的,因此本發(fā)明的優(yōu)選實施方案代表本發(fā)明的主題,該主題為本發(fā)明所廣泛涵蓋。本發(fā)明的范圍完全涵蓋其它對本領域技術人員來說顯而易見的實施方案,因此,本發(fā)明的范圍不被除所附權(quán)利要求之外的任何內(nèi)容所限制,其中除了明確說明外,所用元素的單數(shù)形式并不是指"一個和唯一",而是指"一個或更多"。對本領域一般技術人員來說,所有公知的上述優(yōu)選的實施方案和附加實施方案部分的結(jié)構(gòu)、組成和功能上的等價物因此引入本文作參考,而且試圖被本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。 此外,不需要某種設備或方法來表達本發(fā)明所解決的每個問題,因為它們都已包括在本發(fā)明的權(quán)利要求之內(nèi)。另外,無論本發(fā)明公開事實中的所有部分、成分,或者方法步驟是否在權(quán)利要求中被明確敘述,它們都沒有貢獻給公眾。但是,對本領域普通技術人員來說,很明顯在不背離如所附權(quán)利要求中所闡明的本發(fā)明的實質(zhì)和范圍的前提下,可以在形式、試劑和合成細節(jié)上做出各種改變和修飾。
10
權(quán)利要求
一種核苷酸磷脂分子,其具有如式(VIII)或式(IX)所示的兩親性結(jié)構(gòu)即,一個核苷結(jié)構(gòu)的親水基團和一個脂肪醇或甘油脂的親脂基團,兩種基團由磷脂連接構(gòu)成一個核苷酸磷脂分子。F2009102387376C0000011.tif
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述核苷酸磷脂分子,其中所含堿基,即式(VIII)和式(IX)中的 Base基團,為各種常見的天然嘌呤和嘧啶堿基,包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、胸 腺嘧啶及尿嘧啶等。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述核苷酸磷脂分子,其中磷酸部分除結(jié)合親水及親脂基團的兩個 羥基之外的第三個羥基,即式(VIII)和式(IX)中的R1基團,為長度在lnm以內(nèi),含12個 碳原子以下的非離子型取代基,如甲基、乙基、腈乙基、芐基等,也可以是非取代的氫原子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述核苷酸磷脂分子,其中所含的脂肪醇或甘油脂的親脂基團,即 式(VIII)和式(IX)中的&基團,為長度在10到18個碳原子的脂肪烴取代基,可以是飽 和的或不飽和的,例如十六烷基、十八烯基等。
5. —種制備權(quán)利要求1所述核苷酸磷脂分子的方法,是亞磷?;椒?,其可以但不必 須經(jīng)由一釜法策略制備。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,所述一釜法策略應通過包括下列步驟的方法實現(xiàn)(a) 在無水無氧條件下的亞磷?;磻煌ㄟ^三價亞磷酰試劑構(gòu)建磷脂分子,尤其是 存在含有三價磷的亞磷脂化合物中間體;(b) 反應完成后蒸干溶劑,無需轉(zhuǎn)移的氧化反應;(c) 氧化之后無需轉(zhuǎn)移、條件溫和的脫保護基反應; 進一步,優(yōu)選脫除保護基完成后經(jīng)由正相硅膠色譜方法進行純化。
7. —種脂質(zhì)體,其是由權(quán)利要求1所述的核苷酸磷脂分子構(gòu)建;該脂質(zhì)體可以單獨由 權(quán)利要求1所述的核苷酸磷脂分子構(gòu)成,也可以由權(quán)利要求1所述的核苷酸磷脂分子和其 他化合物混合構(gòu)成,混合的其他化合物可以是但不局限于膽固醇、含陽離子的磷脂、大豆磷 脂。
8. 權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)體,可以攜帶核苷分子、核苷酸鏈或siRNA分子;所述的核苷 分子是指天然核苷、經(jīng)由化學修飾的核苷、異核苷;所述的核苷酸鏈是指各種天然核苷酸鏈 和經(jīng)由化學修飾的核苷酸鏈,包括但不局限于單/雙鏈寡核苷酸、直鏈/環(huán)狀核苷酸鏈、脫 氧/非脫氧核苷酸形成的鏈;所述的siRNA分子是指化學合成的siRNA分子、經(jīng)由Dicer酶 降解生產(chǎn)的siRNA分子和化學修飾的siRNA分子。
9. 一種制備權(quán)利要求7或8所述脂質(zhì)體的方法,可以是通過制劑手段使核苷分子、寡核 苷酸鏈或siRNA分子包裹在脂質(zhì)體內(nèi),也可以是將空白脂質(zhì)體和上述分子簡單混合后孵育形成可以透過細胞膜的結(jié)合物。
10.權(quán)利要求7或8所述脂質(zhì)體的用途,可作為轉(zhuǎn)染試劑,攜帶基因分子透過細胞膜; 所述的基因分子指攜帶遺傳性息的DNA單鏈、RNA單鏈、DNA雙鏈、RNA雙鏈及其他可以用作 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DNA分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類核苷酸磷脂化合物及其制備方法,具有通式(VIII)或(IX)的結(jié)構(gòu),基于“一釜法”策略大量簡便制取得到。本發(fā)明進一步提供一類新型脂質(zhì)體以及其制備方法,本發(fā)明涉及的磷脂脂質(zhì)體,具有制備簡單、效用良好、應用范圍廣泛等特點。該種脂質(zhì)體可以作為研究反義寡核苷酸與小干擾RNA(siRNA)機理的分子生物學工具,也具有潛在的藥物開發(fā)前景。
文檔編號A61K47/26GK101709073SQ20091023873
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月1日
發(fā)明者唐晨, 張禮和, 楊振軍, 潘德林 申請人:北京大學