專利名稱：基因工程改造六-甲基水楊酸合成酶并組合生物合成螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類抗生素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)工程領(lǐng)域，具體涉及基因工程改造6-MSA合成酶功能，在重 組菌株組合生物合成新化合物的發(fā)酵，分離，結(jié)構(gòu)鑒定，活性測(cè)定。
背景技術(shù)：
天然化合物是藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的主要源泉，如抗感染的青霉素和紅霉素、抗腫瘤 的博來(lái)霉素和埃托霉素、抗寄生蟲的阿維菌素和免疫抑制劑環(huán)孢菌素等，在過(guò)去幾十年里 一直是人類治療疾病的主要藥物。所以以天然化合物為基礎(chǔ)研制和開(kāi)發(fā)新藥一直是化學(xué)界 和醫(yī)藥界關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域。其中微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物占重要的部分，目前已報(bào)道的微生 物天然產(chǎn)物有數(shù)千種之多，其中聚酮類和非核糖體聚肽類占了相當(dāng)大的比例。螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯抗生素家族是聚酮類天然產(chǎn)物中非常有特色的一類，它們中的 絕大多數(shù)是由放線菌產(chǎn)生，具有良好的抗菌活性。其中代表性分子Chlorothricir^CHL，圖 1)是一個(gè)新型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，首次分離自菌株Sti^ptomyces antibioticusTu99, 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是由糖苷配基的大環(huán)骨架部分含有[6，6]并環(huán)和[6，5]螺環(huán)(圖1) (1)反式的 十氫萘環(huán)，(2)4-羥乙酰乙酸內(nèi)酯和一個(gè)環(huán)己烯環(huán)形成的螺環(huán)(螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯家族天 然產(chǎn)物由此得名)，側(cè)鏈糖基和六甲基水楊酸組成(Helv. Chim. Acta 52(1969) 127-142)。 氯絲菌素具有良好的抗感染活性，其抗菌活性歸結(jié)于對(duì)丙酮酸羧化酶催化的anaplerotic CO2固定的抑制。進(jìn)一步的研究表明，CHL與Bacillus subtilis細(xì)胞膜磷脂存在相互作 用，具有抗膽固醇的活性。最新研究還表明其具有潛在的抗腫瘤活性(J. Antibiot. 34， 1101-1106，J.Antibiot. 36，668-670了. Antibiot. 44，207-212)。氯絲菌素獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和豐富的生物活性引起了化學(xué)、生物和醫(yī)藥界的關(guān)注， 如何以之作為先導(dǎo)化合物發(fā)展更有價(jià)值的臨床藥物成為各方努力的方向。但是，其復(fù)雜 的化學(xué)結(jié)構(gòu)為化學(xué)合成和結(jié)構(gòu)衍生帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，由于過(guò)多的手性中心和集中的官能 團(tuán)，化學(xué)合成對(duì)于CHL及其類似物的生產(chǎn)前景非常有限，作為有機(jī)合成的重要補(bǔ)充，組合生 物合成技術(shù)的發(fā)展為復(fù)雜天然產(chǎn)物及其類似物的獲得提供了新方法。通過(guò)對(duì)其生物合成基 因的克隆，揭示了其包括大環(huán)骨架、側(cè)鏈糖基和六甲基水楊酸等結(jié)構(gòu)單元在內(nèi)的生物合成 機(jī)制(Chemistry&Biology 13，575-585)，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用組合生物合成的原理，合理修飾 其生物合成的代謝途徑，探索獲得所需要的新型的生物活性提高的結(jié)構(gòu)類似物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的產(chǎn)生活性提高的氯絲菌素類似物的方法，具體涉 及一種對(duì)六_甲基水楊酸合成酶的KR結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基突變，最終在氯絲菌素產(chǎn)生菌的 重組菌株中產(chǎn)生活性提高的螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類抗生素。具體如下首先用PCR的方法在Sti^ptomyces antibioticus DSM40725中得到編碼六-甲基水楊酸合成酶KR結(jié)構(gòu)域的1. QKbDNA片段，然后連入pSP72的載體中得到含有KR片段 的質(zhì)粒，下一步從PCR得到的質(zhì)粒中重切出含有突變位點(diǎn)的KR結(jié)構(gòu)域片段，替代野生型的 6-MSAS的KR結(jié)構(gòu)域一起連入表達(dá)載體pTGV2中，然后把此pTGV2衍生的質(zhì)粒導(dǎo)入到異源 表達(dá)模式菌株Str印tomyces albus中檢測(cè)產(chǎn)物。結(jié)果1540位的Y突變成F的重組菌株中 產(chǎn)生0SA。上述方法簡(jiǎn)單易行，只需常規(guī)的分子生物學(xué)手段，就可以很快得到功能改變的蛋 白，并在異源宿主中檢測(cè)突變的產(chǎn)物。本發(fā)明提供的點(diǎn)突變蛋白的方法，完全不依賴于任何 商業(yè)化的突變?cè)噭┖?，而是一種簡(jiǎn)單，廉價(jià)，高效的點(diǎn)突變蛋白的方法。本發(fā)明還提供了一種在 Str印tomyces antibioticus DSM40725 chlBl 基因 敲除的突變菌株中產(chǎn)生兩個(gè)的新的氯絲菌素類似物的策略和應(yīng)用。具體方法是我們 把上述在Str印tomyces albus中異源表達(dá)產(chǎn)生OSA的表 達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到Str印tomyces antibiOtiCusDSM40725ChlBl基因敲除的突變菌株的中，發(fā)酵檢測(cè)，分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定，初 步的生物活性測(cè)定得到了兩個(gè)活性提高一倍的綠絲菌素的類似物7和8。


圖1表示Chlorothricin(CHL)，deschloro-CHL,以及本發(fā)明所產(chǎn)生的新化合物7 和8的結(jié)構(gòu)。圖2表示幾種含有一型重復(fù)PKS合成的芳香單元的天然產(chǎn)物，Cholorothricin, Maduroprptin, polyketomycin, Avilamycin, Calicheamicin0圖3表示真菌和細(xì)菌6-MSAS的結(jié)構(gòu)域組成以及其結(jié)構(gòu)域選擇性失活產(chǎn)生的產(chǎn)物 的推測(cè)，(A)6-MSAS的功能結(jié)構(gòu)域的組成。(B)真菌和細(xì)菌6-MSAS的合成路線以及DH突變 (H947F)的 ChlBl 產(chǎn)生 6-MSA ；KR 突變(Y1450F)的 ChlBl 產(chǎn)生 OSA ；真菌 KR 突變(G1387A, G1389P, G1392A)的 6-MSAS 產(chǎn)生 TAL。圖4表示HPLC分析DH和KR突變后的ChlBl在Str印tomyces albus中異源 表達(dá)的產(chǎn)物。(I) Str印tomyces albus含有pTGV2空質(zhì)粒；(II)6_MSA標(biāo)準(zhǔn)品；(III) Streptomyces albus含有野生型6-MSAS(ChlBl)表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生6-MSA，產(chǎn)量約為2mg/ ml ； (IV) Streptomyces albus 含有 DH 突變(H947A)的 ChlBl 表達(dá)質(zhì)粒不產(chǎn)生 6-MSA ； (V) Streptomyces albus含有DH突變(H947F)的ChlBl表達(dá)質(zhì)粒繼續(xù)產(chǎn)生6-MSA，產(chǎn)量約為 0. 3mg/ml ； (VI) TAL 標(biāo)準(zhǔn)品；(VII) OSA 標(biāo)準(zhǔn)品；(VIII) Streptomycesalbus 含有 KR 突變 (G1389A)的 ChlBl 表達(dá)質(zhì)粒不產(chǎn)生 6-MSA，TAL, OSA ； (IV) Streptomyces albus 含有 KR 突 變(G1387A, G1389P, G1392A)的 ChlBl 表達(dá)質(zhì)粒不產(chǎn)生 6-MSA，TAL, OSA ； (X) Streptomyces albus含有KR突變(Y1540F)的ChlBl表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生0SA，產(chǎn)量約為0. 3mg/ml。圖5表示6-MSA和OSA的?；鶈卧暮笮揎椧约稗D(zhuǎn)移到DMCHL糖基上形成 deschloro-CHL ；CHL ；7 和 8 的示意圖。圖 6 表示 HPLC 分析 Str印tomyces antibioticus DSM40725 ( Δ chlBl)中新的 螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯的產(chǎn)生(I)野生菌株Str印tomyces antibioticus DSM40725產(chǎn)生 deschloro-CHL, CHL ； (II) ^ ^ ^ tt Streptomyces antibioticus DSM40725 ( ΔchlBl) 產(chǎn)生DMCHL ； (III)KR突變(Y1540F)的ChlBl表達(dá)質(zhì)粒互補(bǔ)Str印tomyces antibioticusDSM40725 (AchlBl)菌株產(chǎn)生 7，8 和 DMCHL。a，deschloro-CHL ；b, CHL ；C, DM-CHL ；d，7 ；and e，8。
圖7表示新化合物7的1H-1H COSY以及7和8的OSA單元的HMBC示意圖。圖8表示化合物T1H-NMR圖譜圖9表示化合物S1H-NMR圖譜圖10表示新化合物7的H-H COSY圖11表示新化合物7的HSQC圖12表示新化合物7的HMBC圖13表示新化合物7R0ESY圖14表示新化合物8的OSA單元的HMBC圖譜。表明化合物8的結(jié)構(gòu)是CHL的結(jié) 構(gòu)且在6-MSA單元苯環(huán)的對(duì)位增加了氧原子。圖 15 表示將 MSS4. 3 導(dǎo)入到 Streptomyces antibioticus DSM40725 ( Δ chlBl) 中發(fā)酵產(chǎn)物的 HPLC 分析(I)MSS4. 3 質(zhì)粒互補(bǔ) Sti^ptomyces antibioticus DSM40725 (AchlBl)菌株產(chǎn)生OSA以及痕量的7和8 ； (II)OSA標(biāo)準(zhǔn)品。圖16化合物7的LC-MS圖17化合物8的LC-MS圖 18表示新化合物的抗Bacillus subtilis 活性測(cè)定1，deschloro-CHL ；2, CHL ； 3，7 ;4，8。(I)各化合物5yg溶于200μ 1甲醇后加入牛筋杯；(II)各化合物10 μ g溶于 200 μ 1甲醇后加入牛筋杯，37度，12小時(shí)。7和8的抗菌活性分別比deschloro-CHL和CHL 提高了 1倍左右。符號(hào)說(shuō)明附圖1 中，Chlorothricin(CHL)氯絲菌素；deschloro-CHL 脫氯氯絲菌素；7 和 8 氯絲菌素的類似物。附圖2中，PKS:聚酮。附圖3中，6-MSAS，六-甲基水楊酸；AT ?；D(zhuǎn)移酶；KS 酮基合成酶；DH:脫氫 酶；KR 酮基還原酶；ACP ?；d體蛋白。附圖4中，Str印tomyces albus 異源表達(dá)的模式菌株，屬于鏈霉菌屬；ChlBl 氯 絲菌素生物合成基因簇中六_甲基水楊酸合成酶；HPLC 高效液相色譜；OSA 苔色酸；TAL 2羥基4-甲基-2-吡喃酮。附圖5中，CHL 氯絲菌素；deschloro-CHL 脫氯氯絲菌素；DM-CHL 脫六-甲基水
楊酸氯絲菌素。附圖6中，Str印tomyces antibioticus DSM40725氯絲菌素產(chǎn)生菌，屬于鏈霉菌 屬。7和8:新化合物。附圖7中，1H-1H COSY 氫-氫二維相關(guān)譜；HMBC 多鍵碳?xì)潢P(guān)系。附圖S1H-NMR 核磁共振氫譜。附圖11中，HSQC 異核單量子相干譜附圖13中，NOESY 二維核奧弗豪澤增強(qiáng)譜。附圖15中，MSS4. 3 苔色酸合成酶的基因(aviM)克隆到表達(dá)載體pWHM3中。附圖17中，LC-MS 高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用。附圖I8中，Bacillus subtilis 枯草芽孢桿菌。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)知道，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員 而言是顯而易見(jiàn)的，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn) 中所述的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本方面的內(nèi)容。實(shí)施例1 ChlBl的DH和KR結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變和異源表達(dá)1. DH和KR結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變的ChlBl的獲得1) DH結(jié)構(gòu)域的突變失活ChlBl的DH結(jié)構(gòu)域，選擇突變其947的組氨酸殘基，將其突變成甘氨酸或者 苯丙氨酸。首先取兩對(duì)設(shè)計(jì)好的引物，引物序列如下947位H突變成A上游5，-CTAC CCC GGC AGC GCC ACC ATC AAC GGC ACG-3，下游5，-CGTGCC GTT GAT GGT GGC GCT GCC GGG GTA G-3，947位H突變成F上游5’-C TAC CCC GGC AGC TTC ACC ATC AAC GGC ACG—3’下游:5，-CGTGCC GTT GAT GGT GAA GCT GCC GGG GTA G-3，以pAL1084 (野生型DH結(jié)構(gòu)域的片段克隆到pSP72中)為模板模板，dNTP, DMS0， 無(wú)酶水，高保真的primestar酶及其緩沖液組成PCR反應(yīng)體系按照設(shè)計(jì)好的程序進(jìn)行PCR。 PCR產(chǎn)物為含有突變的DH結(jié)構(gòu)域片段的質(zhì)粒，將其進(jìn)行凝膠電泳分離，切膠回收純化，加入 限制性內(nèi)切酶Dpn I切碎作為模板的質(zhì)粒pAL1084。然后吸取5 μ 1酶切體系轉(zhuǎn)化E. coli DH5，挑取單克隆菌落于LB培養(yǎng)液(含有Amp抗生素)中培養(yǎng)過(guò)夜，至菌液較濃。提取質(zhì)粒 送測(cè)序，檢測(cè)947位的H是否突變成的相應(yīng)的氨基酸。然后從測(cè)序突變的質(zhì)粒中用BglII/ AvrII切出1. Okb的片段連入pAL1087(chlBl克隆到pTGV2中)的相同的酶切位點(diǎn)中，得到 DH的突變的pTGV2衍生質(zhì)粒pAL1088，pAL1089。2) KR 的突變失活ChlBl的KR結(jié)構(gòu)域，選擇三種策略①1389位的G突變成A，②1387的G突變 成A，1389的G突變成P，1392位的G突變成A，③1540位的Y突變成F。取三對(duì)設(shè)計(jì)好的引物，引物序列如下①1389位的G突變成A上游5，-CACC GGC GGA CTG GCC ACC CTC GGC CTG G-3，下游5，-CCAG GCC GAG GGT GGC CAG TCC GCC GGT G-3，②1387的G突變成A，1389的G突變成P，1392位的G突變成A上游5，-CACC GGC GCA CTG CCC ACC CTC GCC CTG G—3，下游5，-CCAG GGC GAG GGT GGG CAG TGC GCC GGT G-3， ③1540位的Y突變成F上游5，-GGCCAG GCC GCC TTC GGC TCC GCC AAC G-3，
下游5，-CGTT GGC GGA GCC GAA GGC GGC CTG GCC-3，以pAL1085 (野生型KR結(jié)構(gòu)域的片段克隆到pSP72中)為模板模板，dNTP, DMS0，無(wú)酶水，高保真的primestar酶及其緩沖液組成PCR反應(yīng)體系按照設(shè)計(jì)好的程序進(jìn)行PCR。 PCR產(chǎn)物為含有突變的KR結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒，將其進(jìn)行凝膠電泳分離，切膠回收純化，加入限制 性內(nèi)切酶Dpn I切碎作為模板質(zhì)粒PAL1085。然后吸取5ul酶切體系轉(zhuǎn)化E. coli DH5，挑取 單克隆菌落入LB培養(yǎng)液(含有Amp抗生素)中培養(yǎng)過(guò)夜，至菌液較濃。提取質(zhì)粒送測(cè)序， 檢測(cè)1387G，1389G，1392G是否突變成的相應(yīng)的氨基酸。然后從測(cè)序突變的質(zhì)粒中用AvrII/ HindIII切出1. 9kb的片段連入pAL1087的相同的酶切位點(diǎn)中，分別得到KR的突變的pTGV2 衍生質(zhì)粒 pAL1090，pAL1091, pAL1092。2. DH和KR結(jié)構(gòu)域突變的ChlBl的在異源表達(dá)1)菌株 ETl2567 與菌株 Sti^ptomyces albus JlOM 的屬間接合轉(zhuǎn)移。將上述質(zhì)粒pAL1088, pAL1089, pAL1090, pAL1091, pAL1092 轉(zhuǎn)化 ET12567,培 養(yǎng)含有適當(dāng)質(zhì)粒的ET12567至OD6tltl = 0. 4-0. 6, 25ml培養(yǎng)液中的細(xì)菌離心收集，用等 體積的LB洗兩次，重懸于Iml LB中，作為大腸桿菌供體細(xì)胞。取適量?jī)龃嬗赺80°C的 Streptomycesalbus J1074的20%甘油孢子懸液500 μ L，用500 μ 1的TES緩沖液洗兩次， 重懸于等體積的TES緩沖液，50°C熱激10分鐘使孢子萌發(fā)。再加等體積的TSB，37°C溫育 2-5小時(shí)，離心重懸于1.5ml LB培養(yǎng)基中作為鏈霉菌受體細(xì)胞。將不同濃度的受體細(xì)胞 100 μ L與等體積的供體細(xì)胞混合直接涂布在含有IOmM氯化鎂的MS (2. Og甘露糖醇，2. Og 黃豆餅粉，2. Og瓊脂，自來(lái)水定容至100ml)平板上，30°C培養(yǎng)20小時(shí)后，用無(wú)菌水輕輕洗 滌平板表面以洗去大部分大腸桿菌，在每一平板的表面覆蓋Iml含萘啶酮酸(終濃度為 50 μ g/ml)和相應(yīng)抗生素(Tsr 50yg/ml))的無(wú)菌水。30°C培養(yǎng)5天以上挑取接合子。2)接合子的篩選·挑單菌落于TSB(Tsr 50 μ g/ml)培養(yǎng)，用菌液PCR驗(yàn)證導(dǎo)入質(zhì)粒的正確性。3)發(fā)酵和處理將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌(約48hr)轉(zhuǎn)接0. 5%的菌液于R5A(蔗糖100g/l ；硫 酸鎂0. 25g/l ；六水氯化鎂10. 12g/l ；葡萄糖10g/l ；Hy-case amino 0. lg/1 ；酵母提取物 5g/l ；Mops 21g/l ；2ml R5微量元素；調(diào)pH = 6. 85，高壓滅菌)的液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng) 120hr，把所有的發(fā)酵物(包括菌體和菌液)的PH調(diào)至2-3，超聲15min(10S/50S)；用濾紙 濾去大部分菌體，用等體積的乙酸乙酯萃取兩次，旋干，重旋于甲醇中。HPLC分析發(fā)酵產(chǎn)物。HPLC分析檢測(cè)條件儀器48116壯1100昍冗系統(tǒng)柱子Phenomenex C18 column (4. 63250nm, part number 00F-3300-E0, S/ N115575-1檢測(cè)波長(zhǎng)UV= 220nm流動(dòng)相條件=V= lmL/min ；A = H2O (1% TFA) ；B = CH3CN (1% TFA)Min A% /B%0，90% A/10% B5，80% A/20% B25,30% A/70% B
26,5% A/95% B29,5% A/95% B30,90% A/10% B經(jīng)過(guò)LC-MS的分析，分別檢測(cè)到947位H突變成A的重組菌株中，不產(chǎn)生6-MSA ； 947位H突變成F的重組菌株中，產(chǎn)生6-MSA ；1389位的G突變成A的重組菌株中，不產(chǎn)生 OSA, TAL (2羥基4-甲基-2-吡喃酮)，6-MSA ；1387的G突變成A，1389的G突變成P，1392 位的G突變成A的重組菌株中，不產(chǎn)生OSA，TAL，6-MSA ； 1540位的Y突變成F的重組菌株 中，產(chǎn)生0SA。實(shí)施例2，KR突變的ChlBl互補(bǔ)ChlBl突變株產(chǎn)生新的CHL的類似物1, E. coli ET12567 和 Sti^ptomyces antibioticus DSM40725 ( Δ chlBl)和之間 的屬間接合轉(zhuǎn)移從經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的E. coli ET12567培養(yǎng)平板上挑取單菌落接到試管當(dāng)中培養(yǎng)過(guò)夜，吸 取0. 5ml的菌液接到25ml LB，置于37°C搖床中培養(yǎng)至OD600為0. 3-0. 4，或者0. 4-0. 6。離 心收集菌體，用等體積的LB培養(yǎng)基洗滌兩次，離心收集菌體并懸浮于Iml LB培養(yǎng)基中。作 為DNA供體。取出-80°C，20%甘油保存的 Sti^ptomyces antibioticus DSM40725 ( Δ chlBl) 的孢子懸液(3 X IO9個(gè)/mL)，8，OOOrpm離心3分鐘去除上清，然后用0. 5ml TES buffer (0. 05M,pH 8. 0)洗滌兩次，500 μ 1 TES buffer (0. 05M,pH 8. 0)重懸，50°C熱休克 10 分鐘以激發(fā)孢子萌發(fā)，然后加入500μ 1 TSB，混勻，37°C溫育4-5hr，離心收集孢子并懸浮于 1.5ml LB broth中。作為受體菌。取100 μ 1受體菌和100 μ 1供體菌混合，然后涂在兩塊AS_1或者M(jìn)S平板上(含 有IOmM的MgCl2)，另外將同樣處理過(guò)的孢子涂在兩塊AS-I或者M(jìn)S平板上(含有IOmM的 MgCl2)，分別做為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。接合轉(zhuǎn)移的平板在30°C培養(yǎng)16-20小時(shí)以后采用 無(wú)菌水輕輕洗滌平板表面以除去絕大部分大腸桿菌，在每一平板的表面加蓋Iml ddH20(含 有Tsr終濃度為50μ g/ml，Nalidixic acid終濃度威50 μ g/ml)，30°C培養(yǎng)3-5天后挑取 接合子。將獲得的接合子接種到液體培養(yǎng)基TSB (Tsr = 50 μ g/ml)中，30°C振蕩約28hr。取 出200 μ 1涂布在R2YE (不含蔗糖)(Tsr = 50 μ g/ml)，30 V培養(yǎng)5天，收孢子，保存于-80 V。2，KR 突變的 ChlBl 互補(bǔ) Sti^ptomyces antibioticus DSM40725 ( Δ chlBl)的重 組菌株的發(fā)酵在MS (20ml，Tsr = 50 μ g/ml)平板上涂鏈霉菌孢子 100-200 μ 1 ( 109/ml)，30°C 培養(yǎng)10天；將培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基冷凍抽干，搗碎后加50ml無(wú)水甲醇，超聲破菌10分鐘 (超聲10秒，間隔50秒)，攪拌器攪拌1小時(shí)；過(guò)濾(或離心)收集有機(jī)相，培養(yǎng)基用50ml 無(wú)水甲醇再萃取一次，攪拌1小時(shí)，收集并合并兩次的有機(jī)相；旋蒸除去甲醇，得到深褐色 殘余物，用Iml無(wú)水甲醇溶解，離心后HPLC分析。分析突變菌株產(chǎn)生了兩個(gè)全新的峰，LC-MS檢測(cè)兩個(gè)化合很可能是CHL的類似物， 命名為7和8。實(shí)施例3，突變菌株的新化合物的發(fā)酵分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定以及生物活性的測(cè)定小量發(fā)酵突變株時(shí)，HPLC和LC-MS檢測(cè)到可能的兩個(gè)新化合物7和8，為了鑒定這兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，我們對(duì)突變株進(jìn)行了大量發(fā)酵，發(fā)酵方法見(jiàn)實(shí)例2，發(fā)酵完培養(yǎng)基冷凍 抽干后，搗碎加等體積無(wú)水甲醇，超聲破菌10分鐘(超聲10秒，間隔50秒)，攪拌器攪拌 1小時(shí)，過(guò)濾(或離心)收集甲醇，；旋蒸除去甲醇，用1/5體積水分散，調(diào)pH到2. 0-3.0， 用等體積乙酸乙酯萃取三次，減壓抽干得到深褐色膏狀物。膏狀物第一步先進(jìn)行粗分，用 100-200目粗硅膠拌樣膏狀物，油泵抽干，上300-400目硅膠預(yù)裝的正相柱，梯度洗脫條件 為洗脫劑 配比乙酸乙酯石油醚80% /20%60% /40%40% /60%20% /80%純乙酸乙酯100%二氯甲烷甲醇95% /5%90% /10%純丙酮100%發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新化合物出現(xiàn)在40%乙酸乙酯/60%石油醚；20%乙酸乙酯/80%石油 醚和100%乙酸乙酯的洗脫部分中，把上述三部分的洗脫液減壓抽干溶于3ml甲醇，上C18 材料的高壓反相柱，洗脫順序?yàn)樗状?配比95% /5%90% /10%85% /15%80% /20%60% /40%50% /50%40% /60%100% 兩個(gè)新化合物出現(xiàn)在80%水/20%甲醇，60%水/40%甲醇這兩部分，收集這兩部分，減壓抽干，容易于3ml甲醇，然后HPLC半制備，按上述的HPLC的洗脫條件，收集兩個(gè)新 峰，最后把HPLC制備完的樣品溶于3ml甲醇，上樣superdex凝膠柱，用100%的甲醇洗脫， 最終得到純的兩個(gè)新化合物7和8。新化合物7，8和CHL的ESI-MS/MS圖譜表明7的加鈉 分子離子峰為959. 17 ；8的加鈉分子離子峰為993. 05 ；CHL的加鈉分子離子峰為977. 36。7， 8和CHL都含有特征碎片峰535，665，777 ；7有碎片峰447 ；8有碎片峰481 ；CHL有碎片峰 465 ；說(shuō)明新化合物7和8的結(jié)構(gòu)是在6-甲基水楊酸單元增加了個(gè)氧原子。新化合物油泵 抽干溶于500 μ 1氘代甲醇或者氘代氯仿中，進(jìn)行1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC, CONSY, NOESY數(shù)據(jù)采集，分析新化合物7，8和CHL的1H-NMR圖譜顯示7結(jié)構(gòu)中兩個(gè)單峰化學(xué)位移分別 為6. 24and 6. 29，說(shuō)明含有兩個(gè)芳香氫；8結(jié)構(gòu)中一個(gè)單峰化學(xué)位移為6. 53，說(shuō)明含有一個(gè) 芳香氫；CHL結(jié)構(gòu)中一個(gè)單峰化學(xué)位移6. 76，一個(gè)雙峰化學(xué)位移7. 37 (耦合常數(shù)為8. 9赫 茲)，說(shuō)明含有三個(gè)芳香氫。三個(gè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比得出7和8的結(jié)構(gòu)和CHL的差別是6-MSA單 元苯環(huán)上增加了個(gè)氧原子。13C-NMR圖譜。圖譜表明7和CHL具有相同的碳骨架。7的H-H COSY (圖 10)，HSQC (圖 11)，HMBC (圖 12)，和 ROESY (圖 13)，表明 7 的結(jié)構(gòu)是 deschloro-CHL 的結(jié)構(gòu)且在6-MSA單元苯環(huán)的對(duì)位增加了氧原子。8的OSA單元的HMBC(圖14)圖譜，表明 化合物8的結(jié)構(gòu)是CHL的結(jié)構(gòu)且在6-MSA單元苯環(huán)的對(duì)位增加了氧原子，綜上所述，確定了 化合物的結(jié)構(gòu)。對(duì)7和8化合物進(jìn)行了抗菌活性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)新化合物7和8抗革蘭氏陽(yáng) 性菌Bacillussubtilis的活性分別比deschloro-CHL和CHL的活性提高一倍左右。說(shuō)明 7和8在6-MSA單元的對(duì)位引入的羥基，增加了化合物的水溶性，提高了其生物活性。以下根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容提供的基因和蛋白序列氨基酸/核苷酸序列表SEQUENCE LISTING<110>上海有機(jī)化學(xué)研究所<120>基因工程改造6-甲基水楊酸合成酶并組合生物合成螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類 抗生素<130>說(shuō)明書，權(quán)利要求書<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>5271<212>DNA<213>Streptomyces antibioticus DSM40725<220><221>CDS<222>(1). . (5271)<400>1gtg cag agt cac gac gtt gcc cgt gcg ggc ggc agg gaa gtc gtc gag 48Val Gln Ser His Asp Val Ala Arg Ala Gly Gly Arg Glu Val Val Glu151015gag ccg ate gcc gtg ctc ggg atg gcg tgc egg ttc gca ggt ggt gcc 96Glu Pro lie Ala Val Leu Gly Met Ala Cys Arg Phe Ala Gly Gly Ala202530gac acc ctg gag gcg ttc tgg gag ttg ctg ctg gag ggc egg gac ggc 144Asp Thr Leu Glu Ala Phe Trp Glu Leu Leu Leu Glu Gly Arg Asp Gly354045ate ggt gag gtg cct gag aag egg tgg cgc gcc tac gag gag gcc ggc 192lie Gly Glu Val Pro Glu Lys Arg Trp Arg Ala Tyr Glu Glu Ala Gly
505560ccc gat cat gcggcg gcg gtg egg agg gcg acg egg tgg ggt ggg ttc 240Pro Asp His Ala Ala Ala Val Arg Arg Ala Thr Arg Trp Gly Gly Phe65707580ctc gat gac ategag ggg ttc gac gcg gag ttc ttc ggg ttg tcg ccg 288Leu Asp Asp lieGlu Gly Phe Asp Ala Glu Phe Phe Gly Leu Ser Pro859095cgt gag gcg gagttg atg gat ccg cag cag egg ttg ctg ctg gag gtg 336Arg Glu Ala GluLeu Met Asp Pro Gln Gln Arg Leu Leu Leu Glu Val100105110gcg tgg gag gcgttg gag cac gcg ggt att gcg ccg egg gag ttg gcg 384Ala Trp Glu Ala Leu Glu His Ala Gly lie Ala Pro Arg Glu Leu Ala115120125ggg acg gac gcgggt gtg ttc gtg ggg ate ggt tcg gat gat tac ggc 432Gly Thr Asp Ala Gly Val Phe Val Gly lie Gly Ser Asp Asp Tyr Gly130135140egg egg ttg ttggag gat ctg ccg ggg ate gag gcg tgg acg ggg ate 480Arg Arg Leu LeuGlu Asp Leu Pro Gly lie Glu Ala Trp Thr Gly lie145150155160ggc agt gcg atgtgt gcg gcg gcg aac egg ate tcg tat gcg ctg gat 528Gly Ser Ala MetCys Ala Ala Ala Asn Arg lie Ser Tyr Ala Leu Asp165170175ctg aag ggg ccgagt ctg gcg gtg gac acg gcg tgt tcg gcg tcg ttg 576Leu Lys Gly ProSer Leu Ala Val Asp Thr Ala Cys Ser Ala Ser Leu180185190gtg gcg gtg catctg gcg tgt cag agt ctg egg gcg ggt gag agt gag 624Val Ala Val HisLeu Ala Cys Gln Ser Leu Arg Ala Gly Glu Ser Glu195200205gtg tcg ctc gcggcg ggt gtg aat ctg atg ate tea ccg ggg ttg acg 672Val Ser Leu Ala Ala Gly Val Asn Leu Met lie Ser Pro Gly Leu Thr210215220ctg acg ctg gatgcg gcg ggt gcg acg gcg ccg gac ggg egg tcg aag 720Leu Thr Leu AspAla Ala Gly Ala Thr Ala Pro Asp Gly Arg Ser Lys225230235240tcc ttc gat gcctcc gcg gac ggt tat ggc egg ggc gag ggg tgt ggg 768Ser Phe Asp Ala Ser Ala Asp Gly Tyr Gly Arg Gly Glu Gly Cys Gly245250255ctg ctc gtg ctgaag egg ttg tcg gac gcg gtg egg gac ggg gat ccg 816Leu Leu Val LeuLys Arg Leu Ser Asp Ala Val Arg Asp Gly Asp Pro
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Pro Thr GlyThr Pro Leu Glu Cys Arg AlaAsp Gly Thr Tyr Leu137013751380lie Thr GlyGly Leu Gly Thr Leu Gly LeuGlu Val Ala Gly Arg138513901395Leu Ala GluArg Gly Ala Arg Arg Leu ValLeu Ala Gly Arg Thr140014051410Gly Leu ProPro Arg Ser Thr Trp Gly GluThr Thr Asp Thr His141514201425Thr Arg GlnArg lie Glu Ala Val Lys AlaLeu Glu Asp Gln Gly143014351440Val Thr ValArg Val lie Pro Leu Asp lieThr Asp Thr Ala Lys144514501455Ala Ala GluGln Leu Thr Pro Asp Ala LeuGly Leu Pro Pro lie146014651470Arg Gly lieVal His Leu Ala Gly Val LeuAsp Asn Arg Met Val147514801485Thr Ala ValAsp Glu Thr Ser Leu Arg ThrVal Leu Arg Pro Lys149014951500Ala Asp GlyAla Trp Thr Leu His Thr LeuPhe Pro Pro Gly Thr150515101515lie Asp PheLeu lie Leu Phe Ser Ser CysGly Gln Leu Leu Gly152015251530Leu Pro GlyGln Ala Ala Tyr Gly Ser AlaAsn Ala Phe Leu Asp153515401545Ala Leu Ala Val His Arg Asn Thr Thr ThrPro Thr Ala Ala Asp155015551560Thr Thr SerPhe Gly Trp Thr Ser Trp ArgGly Gln Gly Met Ala156515701575Val Asn AspVal Val Asp Ala Glu Leu ArgAla Arg Gly Val Thr158015851590Asp lie ThrThr Gln Glu Ala Phe Ala AlaTrp Asp Phe Ala Ala159516001605Gln His GlyPro Gly Asn Tyr Pro Val LeuArg Arg Leu Pro His161016151620Glu Pro AspMet Asp Gln Leu Pro Leu LeuSer Glu lie His His162516301635Thr Gln ProThr Ala Pro Thr Ser Gly AlaAla Thr Asp Ser Tyr164016451650Ala Gly LeuAla Pro Asp Glu Leu Arg AlaArg Leu lie Asp Glu
1655 16601665Val Ala AlaHis lie Ser Ala Glu MetLys Leu Ala Ala Ser Gln1670 16751680Leu Asp HisArg Lys Ser Leu Val GluGln Gly Leu Asp Ser Val1685 16901695Met Thr lieVal lie Arg Arg Arg LeuGlu Lys Trp Phe Gly His
1700 17051710Lys Leu ProAla Thr Leu Leu Trp HisGln Pro Thr Val Thr Ala1715 17201725lie Ser GluHis Leu Ala Glu Leu LeuAla Pro Thr Thr Ser Gln1730 17351740Pro Asp AsnThr Ala Pro Ala Glu ProAla Ala Thr Ala1745 1750175權(quán)利要求
一種螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類抗生素，其特征是結(jié)構(gòu)式如下式中R1＝OH，R2＝H；或者R1＝OH，R2＝Cl。F2009102475678C00011.tif
2.一種基因工程改造6-MSAS并組合生物合成螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類抗生素的方法，其 特征是該方法包括1)在PCR引物中引入了6-MSAS的KR結(jié)構(gòu)域的催化活性位點(diǎn)的Y突變成F的突變位 點(diǎn)，以含有KR片段的質(zhì)粒為模板，PCR得到相應(yīng)的KR片段，通過(guò)酶切連接替代原來(lái)的KR結(jié) 構(gòu)域，并最終克隆到表達(dá)載體PTGV2中，構(gòu)建成KR點(diǎn)突變的6-MSAS的表達(dá)質(zhì)粒；2)將KR結(jié)構(gòu)域定點(diǎn)突變的6-MSAS的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到Str印tomycesalbus中異源表 達(dá)，在得到的重組菌株中產(chǎn)生OSA ；3)將6-MSAKR結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變后產(chǎn)生OSA的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到六-甲基水楊酸合成酶基 因中斷的氯絲菌素產(chǎn)生菌Str印tomyces antibioticus DSM40725中，得到的重組菌株發(fā) 酵，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分離純化得到權(quán)利要求1所述的螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類抗生素；其中6-MSAS代表六-甲基水楊酸合成酶，OSA代表苔色酸。
3.—種6-MSAS改成OSAS的核苷酸和蛋白序列，其特征是6-MSAS的KR結(jié)構(gòu)域催化活 性位點(diǎn)1540位的Y突變成F相應(yīng)的突變位點(diǎn)的序列；其中OSAS代表苔色酸合成酶。
4.一種如權(quán)利要求3所述的6-MSAS改成OSAS的核苷酸和蛋白序列，其特征是 所述的6-MSAS的KR結(jié)構(gòu)域催化活性位點(diǎn)1540位的Y突變成F相應(yīng)的突變位點(diǎn)的序 列為PCR引物構(gòu)建成的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到Str印tomyces albus和chlBl基因敲除的 Streptomycesantibioticus DSM40725 得到的突變菌株。
5.如權(quán)利要求1螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類抗生素用于制備抗菌或抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于基因工程的方法組合生物合成新的具有較高活性的螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯類抗生素的新方法。通過(guò)位點(diǎn)特異性突變六-甲基水楊酸(6-MSA)合成酶的酮基還原(KR)保守活性位點(diǎn)，遺傳改造氯絲菌素(chlorothricin，CHL)產(chǎn)生菌Streptomyces antibioticus DSM40725發(fā)酵產(chǎn)生新的生物活性提高的氯絲菌素類似物7和8。7和8良好的生物活性有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成藥物的價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P31/04GK101812103SQ20091024756
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者丁偉, 劉 文 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所