專利名稱：模塊式肽基試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有穩(wěn)定骨架的肽，該穩(wěn)定骨架易于修飾以提供多個(gè)相互作用的結(jié)構(gòu)域例如抑制或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
背景技術(shù)：
基于免疫學(xué)的診斷分析的一個(gè)缺點(diǎn)是其依賴于抗體的使用。這些試劑，無論單克隆或多克隆，都是大型大分子多肽，它們制備昂貴且因常在保存期間變得不穩(wěn)定而使許多診斷產(chǎn)品的保存期很短。此外，一個(gè)典型的免疫球蛋白(例如IgG)含有大量在生理學(xué)上重要但在抗原識(shí)別中卻不起作用的物質(zhì)(Fc區(qū)域)。這樣的附加物質(zhì)對(duì)許多應(yīng)用都是非必需的，并會(huì)增加背景噪音、抑制擴(kuò)散以及引起副反應(yīng)。此外，將抗體重鏈和輕鏈結(jié)合在一起的二硫鍵是潛在不穩(wěn)定的。這樣，抗體結(jié)構(gòu)(和物質(zhì))的只有一小部分是直接涉及抗原識(shí)別的，然而抗原整體卻常常被制備并用于傳感器或診斷裝置中。
從完整抗體生產(chǎn)較小的Fab區(qū)域是可能的，但是Fab生產(chǎn)需要若干化學(xué)或酶加工步驟以及額外的蛋白純化程序。這些加工程序會(huì)增加診斷產(chǎn)品的成本。
所需要的是易于合成、穩(wěn)定的抗原識(shí)別元素，其涉及抗原識(shí)別的分子質(zhì)量比例更高。
發(fā)明概述本發(fā)明提供易于合成的、易于修飾以包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抑制劑結(jié)構(gòu)域、接頭、標(biāo)記、試劑、反應(yīng)位點(diǎn)、催化位點(diǎn)的肽骨架，或試劑以及其它化學(xué)實(shí)體。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的穩(wěn)定分離肽。這樣的穩(wěn)定分離肽可以具有聚脯氨酸螺旋、短環(huán)區(qū)以及α螺旋，其中肽發(fā)生折疊以使聚脯氨酸螺旋與α螺旋產(chǎn)生疏水相互作用。本發(fā)明的肽是衍生自鳥胰多肽的小肽，它常比具SEQ ID NO1的肽更穩(wěn)定。本發(fā)明的其它肽不如具SEQ ID NO1的肽穩(wěn)定。理想的肽包括與SEQ IDNO11或14具有至少90％同一性的氨基酸序列。具有SEQ ID NO11或14的肽如上所述發(fā)生折疊，并經(jīng)二硫鍵進(jìn)一步穩(wěn)定。
本發(fā)明還提供分離的編碼穩(wěn)定肽的核酸，該穩(wěn)定肽包含與SEQ IDNO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，該分離的核酸編碼與SEQ ID NO11或14中任一具有至少90％同一性的氨基酸序列。這樣的核酸例子包括SEQ ID NO12或13。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含肽骨架和相互作用的結(jié)構(gòu)域的肽基試劑，其中肽骨架包含與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。理想的肽基試劑具有肽骨架和相互作用的結(jié)構(gòu)域，其中肽骨架包含與SEQ ID NO11或14具有至少90％同一性的氨基酸序列。該肽骨架可以具有聚脯氨酸螺旋、短環(huán)區(qū)和α螺旋，其中肽骨架發(fā)生折疊以使聚脯氨酸螺旋與α螺旋產(chǎn)生疏水相互作用。理想的肽骨架比具有SEQ ID NO1的肽更穩(wěn)定。理想的肽基試劑比不具有相互作用的結(jié)構(gòu)域的肽骨架更穩(wěn)定。然而，某些相互作用的結(jié)構(gòu)域的插入會(huì)使得肽骨架不穩(wěn)定，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說這些去穩(wěn)定化的肽基試劑仍然是有用的。
用于附著在，或插入，肽骨架的相互作用的結(jié)構(gòu)域可以是由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的任何有用的肽或分子。相互作用的結(jié)構(gòu)域的例子包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抑制劑結(jié)構(gòu)域、抗原識(shí)別肽、接頭、標(biāo)記、固相支持物、和酶活性位點(diǎn)。本發(fā)明的一種肽基試劑具有相互作用的結(jié)構(gòu)域，此處該肽包含SEQ ID NO18。
本發(fā)明還提供一種方法，包括定義含有靶蛋白上的相互作用位點(diǎn)的搜索范圍，該肽可與靶蛋白相互作用；為該肽定義大??；為該肽的氨基酸序列中各位置定義氨基酸類別；用已定義的氨基酸類別中的各成員取代該肽序列氨基酸序列的各位置以生成包括輸出肽序列集合(plurality)的輸出文庫(kù)文檔；將輸出文庫(kù)文檔傳輸給分子對(duì)接程序以使各輸出肽序列集合成員與搜索范圍擬合并產(chǎn)生靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分(fit score)；
根據(jù)靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分將輸出肽序列集合分級(jí)；以及展示各輸出肽序列集合成員及其關(guān)聯(lián)靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分；其中一部分輸出肽序列集合能夠與靶蛋白質(zhì)穩(wěn)定相互作用。
搜索范圍可以包括靶蛋白質(zhì)中各非氫原子的x-、y-、和z-坐標(biāo)。具有較高靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分的輸出肽序列常能以較高的親和力與靶蛋白質(zhì)結(jié)合。該方法可進(jìn)一步包括接受輸入百分?jǐn)?shù)選擇以將輸出肽序列集合限制在一個(gè)確定的百分?jǐn)?shù)；其中輸入百分?jǐn)?shù)選擇可以限制輸出文庫(kù)文檔的大小和文庫(kù)的復(fù)雜性。各氨基酸類別可各自包括任一遺傳編碼的L-氨基酸、天然存在的非遺傳編碼L-氨基酸、合成的L-氨基酸、遺傳編碼氨基酸的D-對(duì)映異構(gòu)體、天然存在的非遺傳編碼氨基酸的D-對(duì)映異構(gòu)體、或合成的D-氨基酸。各氨基酸類別也可各自包括任一親水氨基酸、疏水氨基酸、類半胱氨酸氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、極性氨基酸、芳香族氨基酸、非極性氨基酸或脂肪族氨基酸。在一種實(shí)施方式中，靶蛋白質(zhì)為牛胰蛋白酶且輸出肽序列之一為YKLKY(SEQ ID NO18)。
本發(fā)明還指向產(chǎn)生肽序列的系統(tǒng)，包括處理器；與處理器相連的存儲(chǔ)器；與處理器相連的顯示器；能夠在處理器上執(zhí)行以產(chǎn)生肽序列的肽序列制備組件；能夠在處理器上執(zhí)行以顯示肽序列制備組件所用的各氨基酸殘基的類別輸出組件；和能夠在處理器上執(zhí)行以展示肽序列的肽序列輸出組件。一個(gè)顯示器的例子是打印機(jī)。輸出類別組件能顯示肽序列制備組件所用的各氨基酸殘基類別。
本發(fā)明進(jìn)一步提供帶有與能指導(dǎo)機(jī)器完成某方法相關(guān)內(nèi)容的機(jī)讀介質(zhì)，該方法包括接收包含靶位上原子坐標(biāo)集合的搜索范圍，肽集合能以不同的親和力與該靶位結(jié)合；接收包括很多氨基酸的肽長(zhǎng)度參數(shù)；接收定義的、用于沿肽長(zhǎng)各位置擬合分析的氨基酸結(jié)構(gòu)類別；生成含有輸出肽序列集合的輸出文庫(kù)文檔，該輸出肽序列集合包括定義的、沿肽長(zhǎng)各位置的氨基酸結(jié)構(gòu)類別的每個(gè)氨基酸；繼而翻譯和旋轉(zhuǎn)與搜索范圍相關(guān)的肽內(nèi)各位置上的氨基酸結(jié)構(gòu)類別中的各成員，以隨之產(chǎn)生帶有靶位-肽序列擬合得分的肽序列；根據(jù)靶位-肽序列擬合得分將肽序列分級(jí)；以及顯示具有相關(guān)肽序列的所選擇的靶位-肽序列擬合得分百分比；由機(jī)讀介質(zhì)完成的該方法可進(jìn)一步包括顯示輸出肽序列標(biāo)記和儲(chǔ)存搜索范圍。


附圖1提供SAP肽的DNA和氨基酸序列。星號(hào)表示終止密碼子。密碼子選擇偏好E.coli。如果SAP分子由重組方法產(chǎn)生則使用起始甲硫氨酸。如果肽分子由化學(xué)方法產(chǎn)生，則可省略甲硫氨酸殘基。
附圖2提供最終的SAP DNA序列。為便于克隆，為附圖1所示DNA序列添加了側(cè)翼核苷酸。5′Nde I位點(diǎn)以下劃線表示，3′Bam HI和內(nèi)部Sma I位點(diǎn)以相同方式表示。
附圖3提供SAP肽的帶狀圖。鏈從左側(cè)的末端甲硫氨酸開始，且序列延伸進(jìn)入聚脯氨酸螺旋、短環(huán)結(jié)構(gòu)域，并最終進(jìn)入右側(cè)的α螺旋區(qū)。肽以末端半胱氨酸為終點(diǎn)。
附圖4提供與附圖3相同視角的SAP肽分子結(jié)構(gòu)，但是顯示了氨基酸側(cè)鏈。
附圖5突出顯示SAP分子中三個(gè)半胱氨酸殘基的位置?？梢孕纬啥蜴I使SAP肽幾乎環(huán)化。末端半胱氨酸對(duì)將肽錨定在診斷裝置中的固體基質(zhì)上有用。
附圖6提供SAP和牛胰蛋白酶間相互作用的ITC分析。SAP溶于20mM二甲基胂酸鹽(pH 7.0)、20mM NaCl，終濃度為2mM。將胰蛋白酶透析至相同的緩沖液中，并以20μM的濃度用于量熱計(jì)中。整個(gè)滴定過程中無明顯結(jié)合。溫度保持在30℃。采用每5μL注射40次，兩次注射間重新平衡240秒。
附圖7提供SAP-1和牛胰蛋白酶間相互作用的ITC分析。SAP-1溶于20mM二甲基胂酸鹽(pH 7.0)、20mM NaCl，終濃度為1mM。將胰蛋白酶透析至相同的緩沖液中，并以20μM的濃度用于量熱計(jì)中。溫度保持在20℃。采用每5μL注射40次，兩次注射間重新平衡240秒。
附圖8提供SAP-2和牛胰蛋白酶間相互作用的ITC分析。上欄25℃下，SAP-2(1.0mM)滴定至溶于20mM、pH 7.0二甲基胂酸鹽中的胰蛋白酶(20μM)的原始ITC數(shù)據(jù)。各峰顯示注射產(chǎn)生的熱量以及隨后的結(jié)合反應(yīng)。下欄通過相對(duì)時(shí)間來整合各注射峰產(chǎn)生的結(jié)合等溫線。
附圖9圖示SAP在尿素中的解折疊。
附圖10圖示SAP-1在尿素中的解折疊。
附圖11圖示SAP-2在尿素中的解折疊。
附圖12提供牛胰蛋白酶與SAP-1(實(shí)線)和SAP-2(虛線)結(jié)合(0至500秒)與解離(500至700秒)的表面等離子結(jié)合等溫線。
附圖13是本發(fā)明方法實(shí)施方式的流程圖。
附圖14是本發(fā)明方法作為產(chǎn)肽系統(tǒng)的實(shí)施方式的板塊圖。
附圖15是本發(fā)明方法另一實(shí)施方式的流程圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供可以向其中引入一個(gè)或多個(gè)相互作用的結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定肽骨架。這樣的相互作用的結(jié)構(gòu)域可以是特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抑制劑結(jié)構(gòu)域、接頭、標(biāo)記、固相支持物、反應(yīng)位點(diǎn)、催化位點(diǎn)、有用的化學(xué)實(shí)體及試劑。相互作用的結(jié)構(gòu)域向肽骨架的附著或引入產(chǎn)生肽基試劑。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生可用作相互作用的結(jié)構(gòu)域的肽文庫(kù)的方法。這些文庫(kù)的范圍可以從完全隨機(jī)和完全指定，到靶向和部分指定，和到高度靶向和最低程度指定。
定義術(shù)語“氨基酸序列”是指肽、多肽或蛋白質(zhì)分子中的氨基酸位置排列和同一性。術(shù)語“氨基酸序列”的使用并不意味著將氨基酸序列限制為肽、多肽或蛋白質(zhì)的完整、天然氨基酸序列。
“嵌合”用于表示由多于一個(gè)核酸片段組成且至少兩個(gè)核酸片段來源不同的核酸，例如載體或基因。這樣的核酸片段是經(jīng)重組技術(shù)融合而成、天然不存在的核酸序列。
術(shù)語“編碼區(qū)”是指編碼感興趣肽、多肽或蛋白質(zhì)的核苷酸序列。蛋白質(zhì)編碼區(qū)以5′端編碼起始蛋氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”以及3′端的三個(gè)特異終止密碼子三聯(lián)體(即TAA、TAG、TGA)之一為界。
“組成型表達(dá)”是指用組成型啟動(dòng)子進(jìn)行的表達(dá)。
“組成型啟動(dòng)子”是指能夠表達(dá)控制細(xì)胞生命周期所有或幾乎所有階段的基因的啟動(dòng)子。
“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”用于定義核酸間堿基配對(duì)或雜交程度。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，腺嘌呤(A)可與胸腺嘧啶(T)形成氫鍵或堿基對(duì)，鳥嘌呤(G)可與胞嘧啶(C)形成氫鍵或堿基對(duì)。由是，A是與T互補(bǔ)的，且G是與C互補(bǔ)的?；パa(bǔ)性可能是完全的，此時(shí)雙鏈核酸中的所有堿基都是堿基配對(duì)的?；蛘撸パa(bǔ)性可能是“部分的”，此時(shí)核酸中只有某些堿基是根據(jù)堿基配對(duì)原則進(jìn)行配對(duì)的。核酸鏈間的互補(bǔ)性程度影響核酸鏈間雜交的效率和強(qiáng)度。
參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽的“衍生物”分別為具有與各自參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)但不相同的序列或化學(xué)結(jié)構(gòu)的核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽。核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽的衍生物通常是有目的地增強(qiáng)或引入一些在參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽中沒有或很弱的化學(xué)、物理或功能特性。核酸的衍生物與參比核酸的核苷酸序列不同，而蛋白質(zhì)、多肽或肽的衍生物分別與參比蛋白質(zhì)、多肽或肽的氨基酸序列不同。這種序列差異包括一個(gè)或多個(gè)取代、插入、增加、缺失、融合和截?cái)?，它們可以任一組合出現(xiàn)。差異可以是微小的(例如，一個(gè)核苷酸或氨基酸的差異)或者更實(shí)質(zhì)性的。然而，衍生物序列與參比物不會(huì)差異到使得本領(lǐng)域技術(shù)人員無法識(shí)別該衍生物與參比物是結(jié)構(gòu)和/或功能相關(guān)的程度。通常，差異是有限的以使參比物與衍生物整體上非常相似，并且在許多區(qū)域是相同的?！巴蛔凅w”與“衍生的”核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽不同，因?yàn)橥蛔凅w可以帶有不顯著改變參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽的化學(xué)、物理或功能特性的沉默結(jié)構(gòu)差異。相反，參比物與衍生的核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽之間的差異在于為改良參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽的一種或多種化學(xué)、物理或功能特性而制造的有意的改變。
“表達(dá)”是指微生物中內(nèi)源或外源核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。表達(dá)通常是指mRNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。表達(dá)也可以指蛋白質(zhì)生產(chǎn)。
“表達(dá)盒”意指能指導(dǎo)特定核苷酸序列表達(dá)的核酸序列。表達(dá)盒通常包含與所要表達(dá)的核苷酸序列(例如，編碼區(qū))可操作性連接的啟動(dòng)子，該核苷酸序列與終止信號(hào)可操作性連接。表達(dá)盒也典型包含核苷酸序列正確翻譯所需的序列。含有感興趣核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，這意味著其至少一個(gè)成分與其剩余至少一個(gè)其它成分是異源的。表達(dá)盒中的核苷酸序列的表達(dá)可受組成型啟動(dòng)子或僅當(dāng)宿主細(xì)胞被暴露于某些特定外源刺激物時(shí)才引發(fā)轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制。對(duì)于多細(xì)胞生物，啟動(dòng)子也可以特異于特定的組織或器官或發(fā)展階段。
術(shù)語“同源性”是指核酸與參比核酸間或多肽與參比多肽間的相似程度。這樣的同源性可以是部分的或完全的。完全同源性是指核酸或氨基酸序列是相同的。部分同源的核酸或氨基酸序列是指一條與參比核酸或氨基酸序列不相同的核酸或氨基酸序列。因此，部分同源的核酸相對(duì)于其所比較的核酸來說在其序列中具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸差異。同源性程度可通過序列比較來檢測(cè)。或者，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，不同雜交條件下DNA-DNA或DNA-RNA的雜交可提供核酸間同源性程度的估計(jì)(參見，例如，Haines和Higgins(eds.)，核酸雜交，IRL Press，Oxford，U.K.)。
“雜交”是指通過在互補(bǔ)核酸鏈上的核苷酸堿基間形成氫鍵使互補(bǔ)核酸鏈退火的方法。雜交，以及核酸間的結(jié)合強(qiáng)度，受例如所雜交核酸間互補(bǔ)程度、所用條件的嚴(yán)緊性、形成的雜交體的Tm值、核酸內(nèi)的G∶C比率之類因素的影響。
“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”是指在一種或多種細(xì)胞類型中可被外源刺激物，例如化學(xué)制品、光、激素、應(yīng)力、溫度或病原體，開啟的可調(diào)型啟動(dòng)子。
“起始位點(diǎn)”是指圍繞作為所轉(zhuǎn)錄序列一部分的第一個(gè)核苷酸，其被定義為位置+1，位置的區(qū)域?；虻乃泻塑账嵛恢脜⒄瘴挥谄鹗嘉稽c(diǎn)內(nèi)的所轉(zhuǎn)錄序列的第一個(gè)核苷酸進(jìn)行編號(hào)。下游序列(即，3′方向序列)命名為正，上游序列(即，5′方向序列)命名為負(fù)。
“分離的”或“純化的”核酸或“分離的”或“純化的”多肽是指借助人的力量存在于其天然環(huán)境之外的核酸或多肽，因而其不再是天然產(chǎn)物。分離的核酸或多肽可以純化形式存在或存在于非天然環(huán)境例如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。
術(shù)語“標(biāo)記”是指可用于提供可檢測(cè)(優(yōu)選可定量的)信號(hào)、以及可附著于核酸、肽或蛋白質(zhì)的任一原子或分子。標(biāo)記可通過熒光、放射性、比色法、重量分析法、X-射線衍射或吸收、磁性、酶活力等方式提供可檢測(cè)信號(hào)。
術(shù)語“核酸”是指由含有蔗糖、磷酸和嘌呤堿或嘧啶堿的堿基的單體(核苷酸)組成的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單或雙鏈形式的聚合物。除非特別限定，該術(shù)語包括含有天然核苷酸已知類似物的核酸，它與參比核酸具有類似的結(jié)合特性并以與天然形成核苷酸類似的方式代謝。另外除非指明，特定的核酸序列還暗含其保守修飾突變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子取代)和其互補(bǔ)序列、以及明確指出的其參比序列。
術(shù)語“開放閱讀框”和“ORF”是指編碼序列的翻譯起始和終止密碼子之間所編碼的氨基酸序列。術(shù)語“起始密碼子”和“終止密碼子”是指編碼序列中的一個(gè)由三個(gè)相鄰核苷酸組成的單位(‘密碼子’)，它們分別特異指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成(mRNA翻譯)的起始和鏈終止。
“可操作性連接”意指結(jié)合成為同一核酸的分子的一部分，以使一部分的功能受另一部分的影響。通常，“可操作性連接”也指，兩個(gè)或更多個(gè)核酸適于定位或定向以使它們能夠共同發(fā)揮功能。常將核酸可操作性連接以允許從啟動(dòng)子引發(fā)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄。例如，調(diào)控序列被稱作“可操作性連接于”或“結(jié)合于”編碼RNA或多肽的核酸序列，如果這兩條序列以使調(diào)控序列影響RNA或編碼區(qū)的表達(dá)(即，編碼序列或功能RNA受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)的方式定位。
“啟動(dòng)子”是指通過為RNA聚合酶或其它正確轉(zhuǎn)錄所需因子提供識(shí)別位點(diǎn)來控制編碼區(qū)表達(dá)的核苷酸序列，通常位于編碼區(qū)上游(5′)?！皢?dòng)子”包括但不限于最小啟動(dòng)子——它是由TATA盒組成的短DNA序列。因此，啟動(dòng)子包括其它特異服務(wù)于轉(zhuǎn)錄起始以及控制或調(diào)控表達(dá)的序列，例如增強(qiáng)子。相應(yīng)地，“增強(qiáng)子”是指能夠促進(jìn)啟動(dòng)子活性的DNA片段，它可以是啟動(dòng)子的內(nèi)在元件或?yàn)樵鰪?qiáng)啟動(dòng)子水平或組織特異性而插入的異源元件。它在兩個(gè)方向都能操作(正向或反向)，并且甚至無論被移至啟動(dòng)子的上游或下游都能起作用。啟動(dòng)子可以整個(gè)源自某一天然基因，或者由源自自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或者甚至由合成的DNA片段組成。啟動(dòng)子也可以含有結(jié)合根據(jù)生理或發(fā)育條件控制轉(zhuǎn)錄起始效果的蛋白質(zhì)因子中所涉及的DNA片段。
此處術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”和“多肽”可以互換使用。
“調(diào)控序列”和“調(diào)控元件”指控制核酸序列表達(dá)的某些方面的核苷酸序列。這樣的序列或元件可以位于編碼序列的上游(5′非編碼序列)、內(nèi)部、或下游(3′非編碼序列)?！罢{(diào)控序列”和“調(diào)控元件”影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或相關(guān)編碼序列的翻譯。調(diào)控序列包括增強(qiáng)子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)序列、拼接信號(hào)、終止信號(hào)、和翻譯前導(dǎo)序列。它們包括天然的和合成的序列。
如此處所使用的，術(shù)語“選擇性標(biāo)記”是指編碼可觀察或可選擇性狀的基因，這些性狀在具有該基因的生物中得以表達(dá)并能夠被檢測(cè)。選擇性標(biāo)記常與不編碼可觀察性狀的感興趣核酸連接，以追蹤或選擇感興趣核酸的出現(xiàn)。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的選擇性標(biāo)記都可用于本發(fā)明的核酸。某些可選擇性標(biāo)記允許在不帶該標(biāo)記時(shí)會(huì)死亡的宿主存活。可選擇性標(biāo)記的例子包括抗生素抗性，例如，四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
如此處所使用的，術(shù)語“嚴(yán)緊性”用于定義核酸雜交時(shí)溫度、離子強(qiáng)度、及含有其它化合物例如有機(jī)溶劑的條件。高“嚴(yán)緊條件”下，核酸堿基配對(duì)只出現(xiàn)在具有高頻互補(bǔ)堿基序列的核酸之間。在“弱”或“低”嚴(yán)緊條件下，核酸的互補(bǔ)序列頻率通常較低，從而能夠檢測(cè)和/或分離具有不同序列的核酸。
術(shù)語“實(shí)質(zhì)上相似”和“實(shí)質(zhì)上同源”是指代表與當(dāng)前發(fā)明序列功能等價(jià)物的核苷酸和氨基酸序列。例如，單純表現(xiàn)遺傳密碼簡(jiǎn)并但編碼與本發(fā)明的氨基酸序列相同的氨基酸序列的改變核苷酸序列是與本發(fā)明序列實(shí)質(zhì)上相似的序列。此外，與當(dāng)前序列實(shí)質(zhì)上相似的氨基酸序列是那些整體氨基酸同一性足以提供穩(wěn)定肽骨架的氨基酸序列。例如，與本發(fā)明序列實(shí)質(zhì)上相似的氨基酸序列是那些與本發(fā)明的氨基酸序列相比整體氨基酸同一性為80％或更高，優(yōu)選90％或更高，例如91％，92％，93％或94％，甚至更優(yōu)選95％或更高，例如96％，97％，98％或99％。
參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽的“突變體”，分別是具有與各自的參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)但不同的序列的核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽。突變體與參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽的差異是沉默或保守差異。突變體核酸與參比核酸的核苷酸序列不同，而突變體核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽分別與參比蛋白質(zhì)、多肽或肽的氨基酸序列不同。突變體與參比核酸、蛋白質(zhì)、多肽或肽可能區(qū)別于序列中的一個(gè)或多個(gè)取代、插入、增加、缺失、融合和截?cái)?，它們可以任一組合出現(xiàn)。差異可以是微小的(例如，一個(gè)核苷酸或氨基酸的差異)或者更實(shí)質(zhì)性的。然而，突變體與參比物的結(jié)構(gòu)和功能不會(huì)差異到使得本領(lǐng)域技術(shù)人員無法識(shí)別該突變體與參比物在結(jié)構(gòu)和/或功能上是相關(guān)的。通常，差異是有限的以使參比物與突變體整體上非常相似，并且在許多區(qū)域是相同的。
術(shù)語“載體”用來指可將另一個(gè)或多個(gè)核酸片段轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的核酸。“載體”包括可以自我轉(zhuǎn)移或移動(dòng)的任一雙或單鏈、線性或環(huán)狀形式的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或核酸。它可以通過整合進(jìn)入細(xì)胞基因組或存在于染色體外(例如，具有復(fù)制原點(diǎn)的自主復(fù)制質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細(xì)胞。細(xì)菌系統(tǒng)中使用的載體常包含允許載體獨(dú)立于細(xì)菌染色體復(fù)制的復(fù)制源。術(shù)語“表達(dá)載體”是指含有表達(dá)盒的載體。
術(shù)語“野生型”是指具有自天然來源分離的該基因或基因產(chǎn)物特征的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因是指在群體中最常觀察到的基因形式，且因此其被專門定為基因的“正?！被颉耙吧汀毙问?。相反，術(shù)語“突變體”或“衍生物”是指與野生型基因或基因產(chǎn)物相比在序列和/或功能特性上呈現(xiàn)修飾的基因或基因產(chǎn)物(即，改變了的特征)?？梢苑蛛x天然產(chǎn)生的衍生物。根據(jù)與相比野生型基因或基因產(chǎn)物它們具有改變了的特征這一事實(shí)來鑒定它們。
肽骨架本發(fā)明肽骨架其序列涉及稱作鳥胰多肽(Avian PancreaticPolypeptide)的小而穩(wěn)定的肽。APP是通過其N-和C-末端與其受體結(jié)合的胰腺激素(Gehlert等人，1996；Gingerich等人，1991；Fuhlendorf等人，1990)。APP有三十六個(gè)氨基酸，形成一級(jí)結(jié)構(gòu)與眾不同的肽。(Hazelwood，1990，reviewed by Cerda-Reverter和Larhammar，2000)。通常，具三十六個(gè)氨基酸的肽會(huì)因太短而不能提供足夠穩(wěn)定特有構(gòu)象的堆積能。然而，APP肽卻由于結(jié)合二級(jí)和三級(jí)相互作用而非常穩(wěn)定(Bjornholm和Jorgensen，1993；Kruger等人，1985)。該肽起始于伸出的聚脯氨酸螺旋，接著是短環(huán)區(qū)，長(zhǎng)α螺旋，并終止于一段無序短鏈。聚脯氨酸螺旋和α螺旋平行導(dǎo)致螺旋間接觸區(qū)域內(nèi)形成顯著的范德華力和疏水相互作用(Blundell等人，1981)。該相互作用穩(wěn)定折疊的肽結(jié)構(gòu)。APP已被那些對(duì)分子動(dòng)力學(xué)模擬及蛋白質(zhì)折疊預(yù)測(cè)感興趣的研究人員用作模型系統(tǒng)(參見，例如，Alexander和MacKerell，1991)。
野生型APP序列如下列SEQ ID NO1)所示GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY與APP序列相反，本發(fā)明肽骨架經(jīng)過修飾以改造成更適于診斷應(yīng)用的分子。為形成本發(fā)明肽骨架的一個(gè)實(shí)例而改變的殘基以粗體字示于上述SEQ ID NO1中。在一種實(shí)施方式中，Tyr27被Trp取代(SEQID NO2，GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQWLNV VTRHRY)。此氨基酸取代改善疏水核心內(nèi)的堆積并提供有用的內(nèi)源光譜探針。在另一實(shí)施方式中，將Gly1變成Met-Cys(SEQ ID NO3，MCPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)。這一改變使分子能夠通過重組方法制備，其中在大腸桿菌中轉(zhuǎn)錄和翻譯需要起始Met。在另一實(shí)施方式中，在位置30添加半胱氨酸殘基(替換Val30)以與在N-末端添加的半胱氨酸形成穩(wěn)定二硫鍵(SEQ ID NO4，MCPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNC VTRHRY)。在另一實(shí)施方式中，用Pro替換Asp11以形成對(duì)螺旋間環(huán)結(jié)構(gòu)域更穩(wěn)定的紐結(jié)，并作為向肽骨架編碼的核酸中導(dǎo)入特異Sma I位點(diǎn)的途徑(SEQ ID NO5，GPSQPTYPGD PAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)。類似地，可以將Alal2改成Gly以提供肽骨架編碼的核酸內(nèi)的Sma I位點(diǎn)(SEQ ID NO6，GPSQPTYPGD DGPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRY)?？梢詫⑿蛄蠷HRY(SEQID NO7)從SEQ ID NO1中除去，因?yàn)樵撔蛄猩婕癆PP受體結(jié)合。除去RHRY(SEQ ID NO7)后，可以添加兩個(gè)丙氨酸殘基以正確間隔并定向末端半胱氨酸殘基(SEQ ID NO8，GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTAA)。可以添加C-末端Cys以使肽骨架螯合并正確定向于形成診斷儀器一部分的金或其它固相支持物或表面(SEQ ID NO9，GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYC；或(SEQ ID NO10，GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTC)。
這樣的序列變化已被用于產(chǎn)生具氨基酸序列SEQ IDNO11(MCPSQPTYPGD PGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)所示的35氨基酸肽骨架。在另一本發(fā)明實(shí)施方式中，肽骨架不帶起始蛋氨酸。相反，該肽具有SEQ ID NO14(CPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC)。
核苷酸序列SEQ ID NO12是可編碼SEQ ID NO11的核酸的一個(gè)例子。
M C P S Q P T Y P G D P G PATG TGC CCG AGC CAG CCG ACC TAT CCG GGC GAT CCC GGG CCGV E D L I R F Y D N L Q Q WGTG GAA GAT CTG ATC CGC TTT TAT GAT AAC CTG CAG CAG TGGL N C V T A A C *CTG AAC TGC GTG ACC GCC GCC TGC TAG核苷酸序列SEQ ID NO13是可編碼SEQ ID NO11的核酸的另一個(gè)例子。
1 11 21 31 41ACACACCATATGTGCCCGAG CCAGCCGACC TATCCGGGCG ATCCCGGGCCTGTGTGGTAT ACACGGGCTC GGTCGGCTGG ATAGGCCCGC TAGGGCCCGG51 61 71 81 91GGTGGAAGAT CTGATCCGCT TTTATGATAA CCTGCAGCAG TGGCTGAACTCCACCTTCTA GACTAGGCGA AAATACTATT GGACGTCGTC ACCGACTTGA101111121131GCGTGACCGC CGCCTGCTAGGGATCCACAC ACCGCACTGGCG GCGGACGATC CCTAGGTGTG TG以下給出野生型APP(SEQ ID NO1)與本發(fā)明肽骨架SEQ IDNO14的比較。
SEQ ID NO1 GPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYSEQ ID NO14CPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC可在具有SEQ ID NO2～6或SEQ ID NO8～11或SEQ ID NO14之任一序列的肽骨架上進(jìn)行插入。這種插入的一個(gè)常規(guī)位置是在環(huán)區(qū)中心附近的脯氨酸-11殘基和甘氨酸-12殘基之間。若用具SEQ IDNO12的核酸產(chǎn)生具脯氨酸-11殘基和甘氨酸-12殘基間插入的肽基試劑，則插入應(yīng)當(dāng)在SEQ ID NO12的核苷酸36和37之間。
許多由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2～6、8～11或14共有的氨基酸在肽內(nèi)形成重要的分子內(nèi)接觸并在保持肽中的穩(wěn)定及構(gòu)象中起作用。然而，骨架序列的某些可變性并不對(duì)肽骨架穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。因此，本發(fā)明還指向本發(fā)明肽骨架的突變體和衍生物，例如，SEQ IDNO2～6、8～11或14的突變體和衍生物。
本發(fā)明肽骨架的衍生物和突變體經(jīng)在參比肽骨架的N-末端和/或C-末端缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；在參比肽骨架內(nèi)在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或在參比肽骨架內(nèi)在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自參比肽骨架。因此，本發(fā)明肽骨架可經(jīng)包括氨基酸取代、缺失、截?cái)嗪筒迦氲牟煌緩竭M(jìn)行改變。
這樣的突變體和衍生物肽可經(jīng)，例如人工操作，產(chǎn)生。這樣的操作方法是本領(lǐng)域公知的。例如，肽的氨基酸序列突變體可由DNA中突變制備。誘變方法和核苷酸序列改變也是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)；Kunkel等人，Methods in Enzymol.，154，367(1987)；美國(guó)專利No.4,873,192；Walker和Gaastra，eds.，Techniques in Molecular Biology，MacMillanPublishing Company，New York(1983)以及其中所引用文獻(xiàn).有關(guān)不會(huì)不利影響感興趣肽的結(jié)構(gòu)完整性和/或生物活性的適宜氨基酸取代的指導(dǎo)可獲自Dayhoff等人的模型，Atlas of Protein Sequence and Structure，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，C.D(1978)，在此引作參考。
本發(fā)明肽骨架衍生物和突變體其部分與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列的氨基酸位置具有至少約90％、91％、92％、93％或94％的同一性，且這樣的部分通常具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩(wěn)定性和整體三維結(jié)構(gòu)。在一個(gè)理想的實(shí)施方式中，肽骨架衍生物和突變體其部分與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列的氨基酸位置具有至少約95％或96％的同一性，且這樣的部分通常具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩(wěn)定性和整體三維結(jié)構(gòu)。在一個(gè)更理想的實(shí)施方式中，肽骨架衍生物和突變體其部分與SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列的氨基酸位置具有至少約97％或98％的同一性，且這樣的部分通常具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩(wěn)定性和整體三維結(jié)構(gòu)。
肽骨架及肽骨架衍生物和突變體的氨基酸殘基可以是遺傳編碼L-氨基酸、天然存在的非遺傳編碼L-氨基酸、合成的L-氨基酸或上述任一的D-對(duì)映異構(gòu)體。此處所用的二十個(gè)遺傳編碼L-氨基酸和常見非編碼氨基酸的氨基酸符號(hào)是依據(jù)慣例的，示于表1。
表1


包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的肽突變體可以帶有由具有相似化學(xué)和/或物理特性的氨基酸取代的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，只要這些突變體肽的骨架部分保持與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩(wěn)定性和整體三維結(jié)構(gòu)。肽骨架衍生物可以帶有附加的肽或化學(xué)成分以及由具有不同的化學(xué)和/或物理特性的氨基酸取代的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，只要這些肽骨架衍生物具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩(wěn)定性和整體三維結(jié)構(gòu)。
可相互取代以形成本發(fā)明突變體肽的氨基酸通常屬于相似的類或亞類。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可主要依據(jù)氨基酸側(cè)鏈特征將氨基酸分為三個(gè)主要類別親水氨基酸、疏水氨基酸和類半胱氨酸氨基酸。這些主要類別可進(jìn)一步分作亞類。親水氨基酸包括帶有酸性、堿性或極性側(cè)鏈的氨基酸，疏水氨基酸包括帶有芳香或非極性側(cè)鏈的氨基酸。非極性氨基酸可進(jìn)一步細(xì)分為包括，在其中，脂肪族氨基酸。此處所使用的氨基酸類別定義如下“疏水氨基酸”是指帶有在生理pH下不帶電荷并被水溶液排斥側(cè)鏈的氨基酸。遺傳編碼的疏水氨基酸例子包括Ile、Leu和Val。非遺傳編碼的疏水氨基酸例子包括t-BuA。
“芳香族氨基酸”是指帶有包含至少一個(gè)帶共軛π-電子系統(tǒng)環(huán)(芳香基團(tuán))側(cè)鏈的疏水氨基酸。芳香基團(tuán)可進(jìn)一步用取代基例如烷基、鏈烯基、炔基、羥基、磺?；⑾趸虬被鶊F(tuán)以及其它基團(tuán)取代。遺傳編碼的芳香族氨基酸例子包括苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常見的非遺傳編碼芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。
“非極性氨基酸”是指帶有在生理pH下通常不帶電荷的側(cè)鏈且為非極性的疏水氨基酸。遺傳編碼的非極性氨基酸例子包括甘氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。非遺傳編碼的非極性氨基酸例子包括Cha。
“脂肪族氨基酸”是指帶有飽和或不飽和直鏈、支鏈或環(huán)烴側(cè)鏈的非極性氨基酸。遺傳編碼的脂肪族氨基酸例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括Nle。
“親水氨基酸”是指帶有被水溶液吸引的側(cè)鏈的氨基酸。遺傳編碼的親水氨基酸例子包括Ser和Lys。非遺傳編碼的親水氨基酸例子包括Cit和hCys。
“酸性氨基酸”是指帶有pK值小于7的側(cè)鍵的親水氨基酸。生理pH下由于氫離子的丟失酸性氨基酸通常帶有負(fù)電荷側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸例子包括天冬氨酸(aspartate)和谷氨酸(glutamate)。
“堿性氨基酸”是指帶有pK值大于7的側(cè)鏈的親水氨基酸。生理pH下由于結(jié)合水合氫離子堿性氨基酸通常帶有正電荷側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸例子包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。非遺傳編碼的堿性氨基酸的例子包括非環(huán)狀氨基酸鳥氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“極性氨基酸”是指帶有在生理pH下不帶電荷的具有側(cè)鏈的親水氨基酸，但該側(cè)鏈帶有一個(gè)其兩個(gè)原子的共用電子對(duì)離一個(gè)原子更近的鍵。遺傳編碼的極性氨基酸例子包括天冬酰胺和谷氨酰胺。非遺傳編碼的極性氨基酸例子包括瓜氨酸、N-乙?；嚢彼岷图琢虬彼醽嗧?。
“類半胱氨酸氨基酸”是指帶有能與另一氨基酸殘基側(cè)鏈形成共價(jià)鍵，例如二硫鍵，的側(cè)鏈的氨基酸。典型地，類半胱氨酸氨基酸通常帶有包含至少一個(gè)巰基(SH)基團(tuán)的側(cè)鏈。遺傳編的類半胱氨酸氨基酸例子包括半胱氨酸。非遺傳編碼的類半胱氨酸氨基酸例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，上述分類并不是絕對(duì)的。有幾種氨基酸表現(xiàn)多于一種特性，因而可被包括在多于一種類別中。例如，酪氨酸同時(shí)具有芳香環(huán)和極性羥基基團(tuán)。因此，酪氨酸具有雙重特性，可以被同時(shí)包括在芳香和極性類別中。類似地，半胱氨酸能形成二硫鍵外還具有非極性特征。因此，盡管半胱氨酸并不是嚴(yán)格地被分為疏水或非極性氨基酸，它在許多物質(zhì)中可被用來賦予多肽以疏水性。
幾個(gè)常見的非遺傳編碼可存在于本發(fā)明多肽突變體中、或可取代本發(fā)明多肽突變體中的氨基酸的氨基酸包括但不限于，β-丙氨酸(b-Ala)和其它ω-氨基酸例如3-氨基丙酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸，等等；α-氨基異丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸(MeGly)；鳥氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；t-丁基丙氨酸(t-BuA)；t-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩基丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亞砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙?；嚢彼?AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，4-二氨基丁酸(Dbu)；p-氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)和高絲氨酸(hSer)。這些氨基酸也落入上述定義的類別。
上述遺傳編碼和非編碼氨基酸的分類概括于下表2中。應(yīng)當(dāng)理解，表2的目的僅僅是列舉而不是一個(gè)對(duì)此處所述突變體和衍生物多肽中可能含有的氨基酸的窮舉?？捎糜诋a(chǎn)生此處所述突變體和衍生物多肽的其它氨基酸殘基可得自，例如，F(xiàn)asman，1989，CRC PracticalHandbook of Biochemistry and Molecular Biology，CRC Press，Inc..，以及其中所引用的文獻(xiàn)。此處未明確提及的氨基酸可依據(jù)已知性狀和/或它們與已明確鑒定氨基酸相比的特征性化學(xué)和/或物理特性方便地歸類于上述類別中。
表2


本發(fā)明肽骨架可具有由任一類似分類氨基酸取代的氨基酸來產(chǎn)生突變體肽，只要肽突變體具有與具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一的肽骨架相似的穩(wěn)定性和整體三維結(jié)構(gòu)。
盡管本發(fā)明的肽骨架可具有可變區(qū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍可以根據(jù)既定目的選擇不變的骨架結(jié)構(gòu)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用不變的骨架結(jié)構(gòu)形成肽基試劑庫(kù)或肽文庫(kù)。不變骨架結(jié)構(gòu)的化學(xué)和物理特性將保持不變，且任何結(jié)合、溶解度、穩(wěn)定性或其它生物學(xué)、化學(xué)或物理特性的變化都是由附著于肽骨架的化學(xué)或肽部分引起的。
本發(fā)明的肽骨架是比較小的。這意味著為預(yù)期目的使用了引入肽骨架的肽基試劑的高比率的分子物質(zhì)。因此，例如，當(dāng)抗原識(shí)別位點(diǎn)附著于或引入肽骨架時(shí)，就產(chǎn)生一個(gè)很小的肽基試劑，它模擬大很多的抗體的結(jié)合特性。
這樣的肽基“抗體”試劑比抗體更穩(wěn)定，具有較少的抗原表位且易于人工制備和生產(chǎn)。
相互作用的結(jié)構(gòu)域根據(jù)本發(fā)明，相互作用的結(jié)構(gòu)域可被附著于或引入本發(fā)明的肽骨架，例如，SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一。這樣的相互作用的結(jié)構(gòu)域可以是任何由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的分子或部分。有用的相互作用的結(jié)構(gòu)域包括，例如，特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抑制劑結(jié)構(gòu)域、接頭、標(biāo)記、固相支持物、酶活性位點(diǎn)、催化位點(diǎn)、有用的化學(xué)實(shí)體和試劑等。
本發(fā)明提供的相互作用的結(jié)構(gòu)域的例子還包括編碼牛胰蛋白酶抑制劑部分識(shí)別序列的肽(PYRIRF，分子中殘基561至566，SEQ IDNO15)和用此處所述文庫(kù)搜索程序以牛胰蛋白酶作為靶蛋白質(zhì)鑒定的肽(YKLKY，SEQ ID NO18)。一種將SEQ ID NO15的相互作用的結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO11的肽骨架結(jié)合的肽基試劑具有SEQ ID NO21(CPSQPTYPGDPPYRIRFGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)。一種將SEQ ID NO18的相互作用的結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO11的肽骨架結(jié)合的肽基試劑具有SEQ ID NO22(CPSQPTYPGDPYKLKYGPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)。
可產(chǎn)生肽文庫(kù)以提供大量的相互作用的結(jié)構(gòu)域。例如，可產(chǎn)生肽文庫(kù)以用作受體的抑制劑、結(jié)合劑、配體和抗原識(shí)別位點(diǎn)。在一種實(shí)施方式中，肽被設(shè)計(jì)用于與靶蛋白質(zhì)、核酸或抗原相互作用。靶蛋白質(zhì)、核酸或抗原內(nèi)的特異位點(diǎn)或序列可用于靶向與文庫(kù)所提供肽的相互作用。被鑒定具適宜特性的肽之后可用于引入或附著于本發(fā)明的肽骨架。
通常，選擇輸入或靶蛋白質(zhì)或核酸與文庫(kù)肽相互作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇任何感興趣的靶蛋白質(zhì)或核酸。例如，靶蛋白質(zhì)可以是抗原、抗體、酶、激素、受體、配體、DNA-結(jié)合蛋白、膜關(guān)聯(lián)蛋白、或任何結(jié)構(gòu)蛋白。輸入或文庫(kù)肽可以結(jié)合靶核酸位點(diǎn)的例子包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)、內(nèi)含子、拼接信號(hào)、終止信號(hào)、和翻譯前導(dǎo)序列。
定義了輸入或靶蛋白質(zhì)或核酸的搜索范圍。這一搜索范圍定義肽將與之相互作用或結(jié)合的位點(diǎn)的物理和化學(xué)特性。例如，搜索范圍可以包含蛋白質(zhì)或核酸上肽相互作用位點(diǎn)中所有非氫原子的x、y和z坐標(biāo)。定義該搜索范圍可能考慮的其它參數(shù)包括電荷、親水性、疏水性、距離和輸入或靶蛋白質(zhì)或核酸內(nèi)原子的方向。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇文庫(kù)肽的長(zhǎng)度。例如，理想的文庫(kù)中肽可以是約1至約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。更理想的文庫(kù)中肽可以是約1至約25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。甚至更理想的文庫(kù)中肽可以是約1至約20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。甚至更理想的文庫(kù)中肽可以是約2至約15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。甚至更理想的文庫(kù)中肽可以是約2至約10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。特別理想的文庫(kù)中肽可以是約2至約8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。
在一種實(shí)施方式中，肽長(zhǎng)度約為一至六個(gè)氨基酸長(zhǎng)。最初的建模研究，包括長(zhǎng)程分子動(dòng)力學(xué)模擬，表明可將多達(dá)六個(gè)氨基酸殘基插入環(huán)部分的中心而不會(huì)對(duì)分子穩(wěn)定性產(chǎn)生消極影響。這六個(gè)氨基酸可能編碼對(duì)靶蛋白質(zhì)或核酸具有結(jié)合親和力和特異性的相互作用的結(jié)構(gòu)域。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇在文庫(kù)內(nèi)的肽中各位置上發(fā)生多少氨基酸取代。類似地，使用者可以選擇任一氨基酸組合將其置于文庫(kù)肽中的給定位置。例如，熟練技術(shù)人員可以選擇將任何類別或類型的氨基酸置于給定位置。這樣的一類氨基酸可以，例如，是一類遺傳編碼的L-氨基酸、天然存在的非遺傳編碼L-氨基酸、合成的L-氨基酸、遺傳編碼氨基酸的D-對(duì)映異構(gòu)體、天然存在的非遺傳編碼氨基酸的D-對(duì)映異構(gòu)體、或合成的D-氨基酸。其它的氨基酸類別包括親水氨基酸、疏水氨基酸、類半胱氨酸氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、極性氨基酸、芳香族氨基酸、非極性氨基酸或脂肪族氨基酸。上文給出了氨基酸類別及類型的進(jìn)一步例子。
之后將所選擇的肽文庫(kù)文檔用作向?qū)映绦虻妮斎?，該?duì)接程序(docking program)將各肽與靶蛋白質(zhì)或核酸上的搜索范圍擬合?？捎靡恍┓肿訉?duì)接程序，例如，Molecular Simulations Inc(MSI)的程序LigandFitTM。該對(duì)接程序提供為各種肽類型提供擬合得分。輸出文檔可以根據(jù)肽擬合得分分級(jí)排序。最高得分肽是潛在最適于與輸入靶蛋白質(zhì)或核酸相互作用的。
在一種實(shí)施方式中，該方法包括附圖13中所概括的幾個(gè)步驟。一個(gè)步驟是定義一個(gè)搜索范圍1302。這一搜索范圍是所選擇的位于靶蛋白質(zhì)上肽可與之相互作用的相互作用位點(diǎn)。本發(fā)明的相互作用肽結(jié)構(gòu)域可與搜索范圍相互作用。搜索范圍可以是，例如，結(jié)合位點(diǎn)、抗原識(shí)別位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、抑制劑結(jié)合位點(diǎn)等。
該方法中可以包括的另一個(gè)步驟是定義肽的大小1304。如此處所述，肽可以具有各種長(zhǎng)度。例如，肽可以是約1至約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
該方法中可以包括的附加步驟是為肽的氨基酸序列中各位置定義氨基酸類別1306。如此處所提供的，本領(lǐng)域技術(shù)人員肽的氨基酸序列各位置可以具有獨(dú)特的化學(xué)和物理特性。因此，具有相關(guān)物理結(jié)構(gòu)、或具有特定化學(xué)特性、或具有特定溶解特性的氨基酸可形成該類別。
在另一步驟中，氨基酸的每個(gè)成員可以被重復(fù)取代或置于肽中指定位置以產(chǎn)生一個(gè)輸出文庫(kù)文檔1308。這一輸出文庫(kù)文檔包含輸出肽序列集合，每個(gè)都具有一個(gè)獨(dú)特肽序列。
該方法中可以包括的附加步驟是將輸出文庫(kù)文檔傳輸給分子對(duì)接程序1310。該分子對(duì)接程序能將輸出肽序列集合各成員與搜索范圍擬合并隨之產(chǎn)生靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分。這樣的靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分是對(duì)給定肽將與該搜索范圍內(nèi)發(fā)生多好的相互作用、結(jié)合或擬合的一個(gè)度量。具有高靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分的肽通常將很好地與靶蛋白質(zhì)或靶核酸中所選擇位點(diǎn)發(fā)生相互作用、結(jié)合或擬合。
在該方法的另一步驟中，輸出肽序列集合可根據(jù)靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分進(jìn)行分級(jí)1312。這一分級(jí)允許對(duì)哪個(gè)肽將最有效地與靶蛋白質(zhì)或靶核酸上的所選擇位點(diǎn)發(fā)生相互作用、結(jié)合或擬合作出即時(shí)的評(píng)估。
該方法中可以包括的附加步驟是展示輸出肽序列集合各成員及其關(guān)聯(lián)靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分1314。輸出肽序列集合中至少一部分能夠與靶蛋白質(zhì)穩(wěn)定相互作用。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇列出所有輸出肽序列。
或者，除了列出所有可能的肽序列及其關(guān)聯(lián)擬合得分，當(dāng)輸入百分比時(shí)可以只顯示高端得分值肽的百分?jǐn)?shù)?；蛘撸绦蚩梢噪S機(jī)選擇所有可能肽的某個(gè)特定百分比以寫出最終的結(jié)構(gòu)文檔。這一百分?jǐn)?shù)的選擇可以限制輸出文庫(kù)文檔的大小和/或文庫(kù)復(fù)雜性。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生肽序列的系統(tǒng)(參見附圖14)。這一系統(tǒng)可以包括處理器1402。處理器可以連接存儲(chǔ)器1404和/或顯示器1406。該系統(tǒng)還可包括能夠在處理器上執(zhí)行以產(chǎn)生肽序列的肽序列制備組件1408。輸出標(biāo)簽或類別組件1410能在處理器上執(zhí)行以顯示肽序列制備組件所用的各氨基酸殘基類別。該系統(tǒng)還可包括能夠在處理器上執(zhí)行以展示肽序列的輸出肽序列組件1412。
個(gè)人計(jì)算機(jī)(PC)中的處理器，例如微處理器是響應(yīng)并處理驅(qū)動(dòng)計(jì)算裝置基本指令的邏輯電路。計(jì)算裝置包括個(gè)人計(jì)算機(jī)、膝上型電腦、通常用途的計(jì)算機(jī)等。存儲(chǔ)器電子儲(chǔ)存計(jì)算裝置可理解的指令和數(shù)據(jù)的地方。常規(guī)操作中，存儲(chǔ)器通常包含操作系統(tǒng)、應(yīng)用程序和數(shù)據(jù)。存儲(chǔ)器的種類包括隨機(jī)存儲(chǔ)器(RAM)、只讀存儲(chǔ)器(ROM)、可編程存儲(chǔ)器(PROM)和可擦可編程ROM(EPROM)以及儲(chǔ)存設(shè)備例如硬盤驅(qū)動(dòng)器和軟盤。顯示器是計(jì)算機(jī)向計(jì)算機(jī)使用者顯示文本以及常顯示圖形的輸出裝置。顯示器的例子包括打印機(jī)、顯示器等。
在一種實(shí)施方式中，類別輸出組件能顯示肽序列制備組件所用的各氨基酸類別殘基。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種帶有與能指導(dǎo)機(jī)械完成某方法相關(guān)內(nèi)容的機(jī)讀介質(zhì)。該方法可以是上述方法之一。
在機(jī)讀介質(zhì)上完成的方法也可以是附圖15中闡明的包括下述步驟的方法。在該方法的一個(gè)步驟中包括接收搜索范圍1502。如上所速，搜索范圍可以為靶位上的原于提供坐標(biāo)集合，肽集合能以不同親和力與該靶位結(jié)合。
在另一步驟中，該方法可以包括接收肽長(zhǎng)度參數(shù)的步驟1504。這一肽長(zhǎng)度參數(shù)可以是對(duì)肽中所含氨基酸數(shù)量的定義。
一個(gè)可被包括的附加步驟涉及接收定義的、用于沿肽長(zhǎng)各位置擬合分析的氨基酸結(jié)構(gòu)類別1506。該步驟中，使用者可以定義將何種氨基酸類型和類別置于肽序列的預(yù)期位置。
在另一步驟中，該方法可以包括生成包括輸出肽序列集合的輸出文庫(kù)文檔1508。該輸出肽序列是含有來自各定義的沿肽長(zhǎng)各位置氨基酸結(jié)構(gòu)類別的的肽序列集合。
可包括在該方法中的一個(gè)附加步驟包括隨后的翻譯和旋轉(zhuǎn)肽內(nèi)各位置氨基酸結(jié)構(gòu)類別1510的各成員。該翻譯和旋轉(zhuǎn)的完成與搜索范圍有關(guān)以隨之產(chǎn)生帶有靶位-肽序列擬合得分的肽序列。
在另一步驟中，該方法可以包括根據(jù)靶位-肽序列擬合得分將肽序列分級(jí)1512。如上所述，這一分級(jí)允許對(duì)哪個(gè)肽將最有效地與靶蛋白質(zhì)或靶核酸上的所選擇位點(diǎn)發(fā)生相互作用、結(jié)合或擬合作出即時(shí)的評(píng)估。
可包括在該方法中的一個(gè)附加步驟包括顯示一個(gè)選擇的靶位-肽序列擬合得分百分比和關(guān)聯(lián)肽序列1514。
該方法還可包括用靶位-肽序列擬合得分和關(guān)聯(lián)肽序列構(gòu)建理想的肽結(jié)構(gòu)1516。
可包括在該方法中的一個(gè)附加步驟包括顯示用于輸出肽序列的標(biāo)記和/或儲(chǔ)存搜索范圍。
一個(gè)用此處所述的篩選程序以牛胰蛋白酶作為靶蛋白質(zhì)而選擇出的肽相互作用的結(jié)構(gòu)域例子是YKLKY(SEQ ID NO18)。該相互作用的結(jié)構(gòu)域肽被置于SEQ ID NO11肽骨架中以產(chǎn)生一個(gè)具有SEQ IDNO22(CPSQPTYPGDPYKLKY GPVEDLIRFYDNLQQWLNCVTAAC)的肽(也叫做SAP-2)。該文庫(kù)程序選擇出的肽與牛胰蛋白酶結(jié)合良好。作為比較，將來自牛胰蛋白酶抑制劑的天然肽(PYRIRF，分子中殘基561至566，SEQ ID NO15)插入SEQ ID NO11肽骨架以產(chǎn)生SEQ IDNO21(CPSQPTYPGDPPYRIRFGPVEDLIRFYDNLQQWLN CVTAAC)(也叫做SAP-1)。該具有SEQ ID NO22的文庫(kù)選擇肽與具有SEQ ID NO21的天然選擇肽相比具有略低的牛胰蛋白酶結(jié)合親和力。然而，將肽SEQ IDNO15或18插入SEQ ID NO11肽骨架產(chǎn)生比不帶插入的肽骨架更穩(wěn)定的肽基試劑。因此，本發(fā)明的方法也可用于產(chǎn)生非常穩(wěn)定的肽基試劑。
在一種實(shí)施方式中，肽相互作用的結(jié)構(gòu)域具有抗原識(shí)別特異性。這一抗原識(shí)別肽相互作用的結(jié)構(gòu)域可被構(gòu)建進(jìn)或附著于肽骨架上以產(chǎn)生具抗原識(shí)別能力的肽基試劑。含有肽相互作用的結(jié)構(gòu)域的抗原識(shí)別元素是插入肽骨架中選擇性插入位點(diǎn)的短肽。以肽骨架不會(huì)喪失穩(wěn)定性來選擇該插入位點(diǎn)。由于這樣的肽相互作用的結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定插入使抗原識(shí)別肽的構(gòu)型熵相對(duì)于自由肽來說降低了，從而對(duì)抗原識(shí)別肽的結(jié)合特異性和親和力產(chǎn)生積極影響。肽骨架內(nèi)的一個(gè)適宜插入位點(diǎn)的例子是具SEQ ID NO2～6、8～11或14之中任一序列肽的環(huán)部分中。一個(gè)理想的插入位點(diǎn)位于脯氨酸-11殘基和甘氨酸-12殘基之間。
本發(fā)明的抗原識(shí)別肽相互作用的結(jié)構(gòu)域可用本發(fā)明的肽文庫(kù)搜索程序或通過鑒定現(xiàn)有抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定。也可通過常規(guī)方法制備抗體以鑒定有用的抗原結(jié)合肽相互作用的結(jié)構(gòu)域。
多克隆抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見，例如，Green等人在ImmunochemicalProtocols(Manson，ed.)中第1～5頁(HumanaPress)的Production of Polyclonal Antisera；Coligan等人在CurrentProtocols in Immunology，2.4.1部分中的Production of PolyclonalAntisera in Rabbits，Rats Mice and Hamsters，它們?cè)诖艘鰠⒖肌?br> 同樣地，單克隆抗體的制備也是常規(guī)的。參見，例如，Kohler &Milstein，Nature，256495(1975)；Coligan等人，sections 2.5.1～2.6.7；和Harlow等人，AtibodiesA Laboratory Manual中第726頁(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，它們?cè)诖艘鰠⒖?。單克隆抗體可通過多種已經(jīng)良好建立的技術(shù)自雜交瘤中分離和純化.這樣的分離技術(shù)包括蛋白質(zhì)-A瓊脂糖親和層析、大小排阻層析、和離子交換層析。參見，例如，Coligan等人，2.7.1～2.7.12部分和2.9.1～2.9.3部分；Barnes等人，在Methods in Molecular Biology，第10卷第79～104頁(Humana Press(1992)的Purification of Immunoglobulin G(IgG)。
編碼肽基試劑的重組表達(dá)編碼本發(fā)明的肽骨架、肽基試劑和抗原識(shí)別肽的核酸可用于這些肽的重組表達(dá)。一般，可通過將核酸導(dǎo)入適宜在特定類型宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體中進(jìn)行本發(fā)明肽編碼核酸的重組表達(dá)。
可將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入并在任一宿主生物中表達(dá)，例如，在原核或真核宿主細(xì)胞中都可以。宿主細(xì)胞的例子包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞系、以及培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。優(yōu)選，選擇以本領(lǐng)域技術(shù)人員想要的方式加工和翻譯后修飾初生肽的重組宿主細(xì)胞系統(tǒng)。如果翻譯后處理不挑剔的話，則可以選擇任一便利的宿主生物。為了表達(dá)并分離大量的本發(fā)明肽骨架、肽基試劑和抗原識(shí)別肽，理想的是使用原核生物，例如，大腸桿菌。因此，本發(fā)明提供含有本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
可將要導(dǎo)入的核酸置于表達(dá)盒內(nèi)在感興趣生物體中表達(dá)。該表達(dá)盒含有與本發(fā)明核酸連接的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。表達(dá)盒優(yōu)選還帶有多個(gè)用于將核酸插入使其在不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件控制下的限制位點(diǎn)。該表達(dá)盒此外還包含選擇性標(biāo)記基因。若需要正確起始轉(zhuǎn)錄和/或?qū)Τ跫?jí)RNA轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行正確加工可將合適的控制元件例如增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、拼接點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)等放在基因編碼附近?；蛘?，本發(fā)明表達(dá)載體中所用編碼區(qū)可包含內(nèi)源性增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、拼接點(diǎn)、插入序列、多腺苷酸化信號(hào)等、或內(nèi)源與外源控制元件的組合。
優(yōu)選載體中的核酸受適宜啟動(dòng)子或宿主細(xì)胞中用于轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件的控制并與之可操作性連接。載體可以是在多個(gè)宿主中有功能的雙功能表達(dá)載體。轉(zhuǎn)錄盒通常包括在生物體中有功能的5′-3′轉(zhuǎn)錄方向、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)、感興趣的DNA序列、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。終止區(qū)可以是天然對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的、可以是天然對(duì)應(yīng)感興趣DNA序列的、或可以是衍生自其它來源的。
重組核酸在原核和真核細(xì)胞中的有效表達(dá)通常需要指導(dǎo)得到的轉(zhuǎn)錄物的有效終止和多聚酰苷酸化的調(diào)控元件。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)通常位于多腺苷酸化信號(hào)下游且長(zhǎng)數(shù)百個(gè)核苷酸。此處所用術(shù)語“多聚A位點(diǎn)”或“多聚A序列”表示指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止和初始RNA轉(zhuǎn)錄物多聚酰苷酸化的核酸序列。由于不帶多聚A尾巴的轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定并迅速被降解，重組轉(zhuǎn)錄物需要進(jìn)行有效的多聚酰苷酸化。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將編碼本發(fā)明肽骨架、肽基試劑和抗原識(shí)別肽的核酸導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞中。例如，可通過常用的轉(zhuǎn)化方法，例如用氯化鈣或電擊處理，將這樣的核酸導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。如果要在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的肽骨架、肽基試劑和抗原識(shí)別肽，則可通過許多方法將編碼這些肽的核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞，包括磷酸鈣共沉淀、原生質(zhì)體融合、電擊法等方法。當(dāng)真核宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞時(shí)，可通過醋酸鋰或電擊處理宿主細(xì)胞來影響轉(zhuǎn)化。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供含有編碼本發(fā)明肽骨架、肽基試劑和抗原識(shí)別肽的核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域可獲得的表達(dá)載體范圍廣泛。可以在其它地方找到有關(guān)不同表達(dá)載體及其使用方法的說明，美國(guó)專利No.5,604,118、5,583,023、5,432,082、5,266,490、5,063,158、4,966,841、4,806,472、4,801,537和Goedel等人，GeneExpression Technology，Methods of Enzymology，第185卷，AcademicPress，San Diego(1989)?？奢o助用于本發(fā)明制備及用途方面的重組DNA和分子克隆技術(shù)描述于Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual Vol.1-3，Cold Spring Harbor laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.(2001)；Ausubel(ed.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley和Sons，Inc..(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和by T.J.Silhavy，M.L.Berman，and L.W.Enquist的Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.(1984)。
診斷和治療方法本發(fā)明的肽基試劑可用作治療方法或診斷方法或儀器的基礎(chǔ)。該具有抗原識(shí)別相互作用的結(jié)構(gòu)域的肽基試劑可替代抗體。具有酶催化位點(diǎn)或酶活性位點(diǎn)為相互作用的結(jié)構(gòu)域的肽基試劑可替代酶。具有抑制劑為相互作用的結(jié)構(gòu)域的肽基試劑可替代抑制劑使用。因此，本發(fā)明所提供的肽基試劑其利用是非常廣泛的。
尤其可將這樣的肽基試劑用于任一本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的檢測(cè)感興趣核酸或蛋白質(zhì)的步驟。例如，本發(fā)明的肽基試劑可用于任意分子生物學(xué)檢測(cè)步驟，包括任何酶檢測(cè)、抑制檢測(cè)或免疫檢測(cè)。生物物理檢測(cè)步驟可與這些步驟結(jié)合使用，或根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的指示分別使用。這樣的步驟包括，例如，表明等離子共振技術(shù)、熒光、側(cè)流技術(shù)。這些步驟形成檢測(cè)和鑒定測(cè)試樣品中靶蛋白質(zhì)和核酸的強(qiáng)勁有效方法。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)測(cè)試樣品中靶蛋白質(zhì)或核酸的方法，包括將肽基試劑與測(cè)試樣品接觸并檢測(cè)肽基試劑是否與測(cè)試樣品中的靶蛋白質(zhì)或核酸結(jié)合。當(dāng)肽基試劑具有抗原識(shí)別肽為其相互作用的結(jié)構(gòu)域時(shí)，在某溫度及足以發(fā)生抗原-抗體相互反應(yīng)的條件下實(shí)施檢測(cè)方法一段時(shí)間。這樣的溫度、時(shí)間和條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易的決定。例如，可在約4℃至42℃下將肽基試劑與含有蛋白質(zhì)或核酸提取物的樣品在適宜的緩沖液中溫育約5分鐘至24小時(shí)。之后測(cè)定或檢測(cè)肽基試劑與蛋白質(zhì)或核酸之間所形成的復(fù)合物的存在及量，例如，通過測(cè)定或檢測(cè)與肽基試劑附著的標(biāo)記。
本發(fā)明的肽基試劑可適應(yīng)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫檢測(cè)。例如，可將肽基試劑用于例如那些涉及放射免疫檢測(cè)、ELISA、或免疫熒光檢測(cè)的方法。因此，例如，適于使用本發(fā)明肽基試劑的免疫檢測(cè)包括那些在美國(guó)專利No.3,791,932；3,817837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876中所述的。
在肽基試劑與蛋白質(zhì)或核酸之間的復(fù)合物形成的檢測(cè)或測(cè)定包括檢測(cè)標(biāo)記、報(bào)告分子或其它可檢測(cè)部分。這樣的標(biāo)記、報(bào)告分子或可檢測(cè)部分可與肽基試劑或靶蛋白質(zhì)或核酸的池結(jié)合。
可用于當(dāng)前方法的測(cè)試樣品包括，例如，來人體或動(dòng)物的生理液體和樣品、食物樣、水、土壤、以及采自工作區(qū)、工作臺(tái)、架、食品儲(chǔ)存區(qū)、動(dòng)物或禽類圍欄、或采自皮膚、毛發(fā)或動(dòng)物體表面的樣品。這樣的應(yīng)用包括人體疾病狀態(tài)檢測(cè)。
本發(fā)明的檢測(cè)儀器包括與固相支持物穩(wěn)定結(jié)合或連接的肽基試劑。該固體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何應(yīng)用支持物。例如，該固相支持物可以是珠粒、過濾器、微量滴定盤、或生物感應(yīng)芯片。
本發(fā)明還包括含有帶有一種本肽基試劑的裝置或容器的試劑和試劑盒。試劑或試劑盒可以包括帶有肽基試劑的生物傳感器、或試管、微量滴定板或其它用于實(shí)施檢測(cè)方法的物體。為便于測(cè)試或使方法或裝置更加便利，試劑盒可設(shè)計(jì)包含與測(cè)試、方法或裝置相關(guān)的對(duì)照樣品。試劑盒還可包含實(shí)施本發(fā)明方法的溶液，例如，稀釋測(cè)試樣品的溶液、溫育測(cè)試樣品與生物傳感器或檢測(cè)裝置的溶液、以及將未結(jié)合的測(cè)試樣品洗滌除去的溶液。試劑盒還可含有在與樣品接觸前或接觸中用于與生物傳感器或檢測(cè)裝置接觸的阻斷劑。理想的對(duì)照物和其它溶液是無菌的，且不含對(duì)與肽基試劑結(jié)合產(chǎn)生干擾的物質(zhì)。
本發(fā)明試劑盒中還可提供檢測(cè)形成于肽基試劑與靶蛋白質(zhì)或核酸之間的復(fù)合物的標(biāo)記或報(bào)告分子。這樣的標(biāo)記或報(bào)告分子可與生物傳感器、檢測(cè)裝置或肽基試劑分開包裝。
標(biāo)記的肽基試劑本發(fā)明還提供標(biāo)記的肽基試劑?？墒褂玫臉?biāo)記包括放射性核、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、比色染料、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、酶亞單位、金屬離子、顆粒等。常用作報(bào)告分子或標(biāo)記的放射性同位素包括32P、125I及131I。常用作報(bào)告分子或標(biāo)記的酶包括，例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶和葡糖氧化酶。常用的熒光報(bào)告分子或標(biāo)記包括，例如，染料例如異硫氰酸熒光素(FITC)、熒光素、羅丹明、異硫氰酸羅丹明B(RITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、4，4′-二異硫氰基茋-2，2′-二磺酸(DIDS)。參見，例如，美國(guó)專利No.3,766,162、3,791,932、3,817,837、和4,233,402。其它的常用標(biāo)記或報(bào)告分子類型包括德克薩斯紅(Texas red)、藻紅素、7-羥基香豆素、魯米諾、NADPH等。
可用于檢測(cè)和定量標(biāo)記存在的各種的技術(shù)依賴于標(biāo)記的性質(zhì)。對(duì)于熒光標(biāo)記，可以得到大量不同的熒光計(jì)和熒光顯微鏡。對(duì)于化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，可以得到發(fā)光計(jì)或薄膜。產(chǎn)生熒光、化學(xué)發(fā)光或有色產(chǎn)物的酶可用于熒光、發(fā)光、分光光度或可視化檢測(cè)。這樣的標(biāo)記可用于此處所述的免疫檢測(cè)和雜交檢測(cè)。
將標(biāo)記附著于肽和/或核酸的許多方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。已報(bào)道的將標(biāo)記附著于核酸的方法的例子，例如，Leary等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1983)804045；Renz和Kurz，Nucl.AcidRes.(1984)123435；Richardson和Gumport，Nucl.Acid Res.(1983)116167；Smith等人，Nucl.Acid Res.(1985)132399；和Meinkoth和Wahl，Anal，Biochem.(1984)138267。可經(jīng)羧基、巰基、氨基、或肼其它官能度將標(biāo)記結(jié)合于肽基試劑而不會(huì)對(duì)肽的功能或肽與靶的結(jié)合產(chǎn)生有害影響。
通過以下實(shí)施例得以進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例該實(shí)施例描述肽骨架自一個(gè)稱作鳥胰多肽的小而穩(wěn)定肽的產(chǎn)生，以及設(shè)計(jì)和構(gòu)建DNA序列以制備該新肽。還描述了用于發(fā)現(xiàn)可插入親體肽骨架以產(chǎn)生特異抗原結(jié)合元件的肽序列的計(jì)算機(jī)程序。提供了一個(gè)實(shí)施例顯示可以制備與牛胰蛋白酶結(jié)合的重組模塊式抗原識(shí)別分子。
材料和方法細(xì)菌生長(zhǎng)條件及培養(yǎng)根據(jù)Miller(1972)所述完成。除非另外指明，本研究中完成的所有方法都根據(jù)Maniatis等人(1982)或Sambrook等人(1989)所述進(jìn)行；包瓊脂糖凝膠電泳和限制性內(nèi)切酶消化。所有PCR反應(yīng)中所用的VentTMDNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs，并與所提供的緩沖液使用。由Genosys，Inc.用Applied Biosystems，Inc.的自動(dòng)測(cè)序儀完成DNA測(cè)序(Sanger等人，1977)。由Genosys，Inc.合成DNA寡核苷酸。根據(jù)Bradford的方法(1976)用牛血清清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)Siegel和Monty(1966)用BioRad，Inc.的7×250mm BioSelect SEC-125柱完成分析凝膠過濾試驗(yàn)。所有細(xì)菌菌株均購(gòu)自New England Biolabs，Inc.。蛋白質(zhì)SDS PAGE凝膠根據(jù)Laemmli(1970)進(jìn)行制備、運(yùn)行和處理。除特別指明外，化學(xué)試劑和層析樹脂來自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。
分子建模分子建模用了兩個(gè)可視化程序，Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997)和Rasmol(Sayle和Milner-White，1995)。用CompaqPC，Windows 2000以及Silicon Graphics，Inc.的Octane UNIX工作站完成模型工作。此外，在Octane上使用Molecular Simulations，Inc.的Cerius2分子堆積。用于起始建模研究的三維結(jié)構(gòu)文檔下載自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Databank)(文檔1PPT.ENT)。進(jìn)行幾輪連續(xù)的氨基酸缺失和取代以將野生型APP分子轉(zhuǎn)化為適合診斷應(yīng)用的模塊肽。
之后用GROMOS 96力場(chǎng)將最終模型能量最低化，以及用SYBYL力場(chǎng)進(jìn)行幾輪分子力學(xué)幾何優(yōu)化(Clark等人，1989)。之后對(duì)最終最低化/優(yōu)化的模型進(jìn)行不良相互作用和扭力幾何學(xué)分析。最終定下來的蛋白質(zhì)以及三維模型命名為SAP。對(duì)于合成的(基于同源性建模)抗體肽來說這是短的。SAP是可向其中插入特異性的6-mer結(jié)合序列的親體分子。
基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建及克隆用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼反向翻譯最終的SAP氨基酸序列。根據(jù)大腸桿菌偏好選擇密碼子，這意味著為某一特定氨基酸所選擇的最終密碼于是大腸桿菌中該氨基酸最常、或第二常用的密碼子。全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因?yàn)?11bp(包括終止密碼子)。為建立該基因序列，合成了10個(gè)跨越編碼區(qū)的單鏈寡核苷酸。寡核苷酸長(zhǎng)度范圍是18至28個(gè)核苷酸。每個(gè)寡核苷酸相互互補(bǔ)，這樣當(dāng)與結(jié)合伴侶雜交時(shí)，所獲得的片段含有中央雙鏈區(qū)，其各末端為一段單鏈8核苷酸區(qū)。寡核苷酸序列示于表3。
基因構(gòu)建包括三個(gè)獨(dú)立步驟。首先，將5μg各寡核苷酸及其互補(bǔ)結(jié)合伴侶(對(duì)于5個(gè)獨(dú)立的反應(yīng))混合于10mM Tris-HCl(pH 7.2)、10mM NaCl中，終體積為10μL。特異寡核苷酸雜交是(參見表3)(1a和1b)、(2a和2b)、(3a和3b)、(4a和4b)、和(5a和5b)。95℃水浴加熱混合物10分鐘。關(guān)閉熱源，讓整個(gè)水浴經(jīng)5小時(shí)冷卻至室溫。其次，混合這五個(gè)“慢速冷卻”反應(yīng)各自的等分量(10μL)(終體積50μL)。將試管于45℃加熱10分鐘，之后置于冰浴中。將T4 DNA連接酶和緩沖液(New England Biolabs)加入試管，于16℃溫育反應(yīng)(終體積60μL)20小時(shí)。第三，用兩個(gè)與結(jié)構(gòu)基因5′和3′最末端互補(bǔ)的PCR引物(表3、6a和6b)從片段混合物中選擇全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因。這確保只有全長(zhǎng)基因產(chǎn)物能被擴(kuò)增。用1μL連接混合物完成如下PCR反應(yīng)95℃1分鐘；49℃1分鐘；72℃30秒。于Techne Progene PCR儀中完成30個(gè)該程序循環(huán)。最后一個(gè)PCR循環(huán)之后再于72℃溫育10分鐘。用DNA瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)Promega的DNA Wizard PCR純化試劑盒純化制備用于克隆。首先，在ATP存在下用T4 DNA聚合酶處理DNA片段以確保形成完全雙鏈末端。根據(jù)New England Biolabs，Inc.的用法說明書完成該反應(yīng)。用Promega的DNA Wizard PCR純化試劑盒再次純化DNA。其次，DNA用Nde I和Bam HI消化并經(jīng)乙醇沉淀純化。將最終的DNA重懸于少量10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA中。
克隆載體，pET11a(Novagen)，經(jīng)Nde I和Bam HI消化并用Promega的DNA純化試劑盒純化。該消化產(chǎn)生包含與DNA片段適合的末端的線性載體。該組合確保片段定向、符合讀框的克隆。將載體與插入物以大約1∶15的摩爾比混合并于16℃在T4 DNA連接酶存在下連接20小時(shí)(總反應(yīng)體積為20μL)。用5μL連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細(xì)菌。在LB/60μg/mL氨芐青霉素瓊脂平板上生長(zhǎng)后，選擇單個(gè)克隆，用Promega的小量制備DNA分離試劑盒經(jīng)小量制備方法從克隆純化質(zhì)粒DNA。經(jīng)DNA凝膠電泳、限制性內(nèi)切酶消化、以及最后的DNA測(cè)序評(píng)估分離的質(zhì)粒。質(zhì)粒結(jié)構(gòu)命名為pSAPe。
純化SAP表達(dá)策略在整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中使用Novagen的T7 RNA聚合酶。包含表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的BL21(DE3)細(xì)胞37℃下于補(bǔ)加有0.5％葡萄糖和自1％接種物的60μg/mL氨芐青霉素的Luria液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。細(xì)胞A595值達(dá)0.8時(shí)(接種后大約3小時(shí)內(nèi))加入IPTG至終濃度為0.5mM。細(xì)胞在收獲前再生長(zhǎng)5個(gè)小時(shí)。典型地，每升得到5g細(xì)胞。
細(xì)胞于10,000×g下離心10分鐘成塊并重懸于一體積的10mMTris-HCl，pH8.0。將細(xì)胞如上述再次離心并于-70℃冷凍至少2小時(shí)。將冷凍塊重懸于二倍體積的10mM Tris-HCI，pH8.0。于French Press(一次，20,000psi)中裂解混合物。獲得的抽提物經(jīng)12,000×g下離心20分鐘而澄清，于20mM Tris-HCl(pH7.4)、100mM NaCl、1mM EDTA(緩沖液I)中透析上清液。透析物用緩沖液I稀釋至終濃度2.5mg/mL，稱作級(jí)分I。隨后的所有層析步驟于室溫下10mMTris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA中完成。
將級(jí)分I加于5cm×1.8cc2Mono-Q離子交換柱。結(jié)合材料使用如下梯度僅緩沖液，40mLs；接著是100mM NaCl，40mLs；和由100mM至500mM NaCl的線性梯度，200mLs。約50％APP肽(及突變體)經(jīng)梯度從柱中洗脫出來。級(jí)分中的蛋白質(zhì)含量用SDS PAGE可視化，并集中含APP的級(jí)分，于10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA中透析，并經(jīng)半透膜(Amicon)壓力過濾濃縮至10mg/mL。最終的濃縮收集物稱作級(jí)分II。
將級(jí)分II加于Sephadex G-75柱(110cm×7.6cc2)。收集經(jīng)SDSPAGE可視化鑒定的峰級(jí)分。G75收集物稱作級(jí)分III。該級(jí)分包含同源APP肽并被用于下述試驗(yàn)。
生產(chǎn)SAP-2
以大腸桿菌密碼子用法將牛胰蛋白酶抑制劑識(shí)別序列的一部分(PYRIRF，分子中殘基561至566，SEQ ID NO15)轉(zhuǎn)換成DNA序列5′-CCGTATCGCATCCGCTTT(SEQ ID NO16)。用上述方法產(chǎn)生帶有Sma I位點(diǎn)側(cè)翼的雙鏈序列5′-CCCGGGCCGTATCGCATCCGCTTTCCCGGGSEQ ID NO17GGGCCCGGCATAGCGTAGGCGAAAGGGCCC-5′SEQ ID NO17雙鏈DNA用Sma I消化并克隆進(jìn)經(jīng)Sma I消化的去磷酸化pSAPe。DNA測(cè)序驗(yàn)證重組克隆。如上所述表達(dá)純化SAP-2(SEQ ID NO21)肽。
新肽發(fā)現(xiàn)編寫FORTRAN 90程序以產(chǎn)生退化肽文庫(kù)。該編碼允許使用者選擇肽長(zhǎng)度(1～6氨基酸)、各位置可發(fā)生多少氨基酸取代(0至20)、以及使用者是否想隨機(jī)選擇所有可能肽的某個(gè)確定百分?jǐn)?shù)以寫出最終的結(jié)構(gòu)文檔。這一最終特征用于限制文檔大小和文庫(kù)復(fù)雜性。程序，稱作MKPEPS，輸出的是單一文檔，它包含蛋白質(zhì)中所有非氫原子的XYZ坐標(biāo)。之后將肽文庫(kù)文檔作為向?qū)映绦虻妮斎?使用MSI程序LigandFit，盡管任何可獲得的分子對(duì)接程序都可以)。對(duì)接程序?qū)⒏麟呐c基于靶蛋白質(zhì)的搜索范圍進(jìn)行擬合并輸出擬合得分。輸出文檔是分級(jí)排序的，且最高得分肽潛在為最強(qiáng)的結(jié)合物。對(duì)牛胰蛋白酶運(yùn)行一個(gè)這樣的肽文庫(kù)。將最高得分肽，YKLKY(SEQ ID NO18)，轉(zhuǎn)換成DNA序列TATAAACTGAAGTAT(SEQ ID NO19)。添加Sma I側(cè)翼序列，并如上所述制備得到具下述結(jié)構(gòu)的雙鏈。
5′-CCCGGGTATAAACTGAAGTATCCCGGGSEQ ID NO20GGGCCCATATTTGACTTCATAGGGCCC-5′將插入物經(jīng)Sma I消化后克隆進(jìn)經(jīng)Sma I消化的去磷酸化pSAPe。DNA測(cè)序證實(shí)克隆。如上所述表達(dá)純化SAP-3。
熱量測(cè)定用MicroCal，Inc.的VP-ITC儀器完成等溫滴定量熱(ITC)。向1.4mL攪拌反應(yīng)細(xì)胞注射5μL抑制劑溶液(在濃度范圍0.5mM至2.0mM下)實(shí)施滴定。APP和APP衍生物在細(xì)胞中的濃度范圍是50至80μM。抑制劑和酶都溶于20mM二甲基胂酸鈉(pH5.5-7.0)、40mMNaCl，或20mM Tris-HCl(pH7.0-7.5)、40mM NaCl。滴定在20℃和40℃下進(jìn)行。滴定的典型試驗(yàn)條件是持續(xù)注射10秒、注射間歇240秒，共注射40次。為校準(zhǔn)稀釋熱和混合熱，進(jìn)行抑制劑向緩沖液的空白滴定。
獨(dú)立的一套多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是最常見的結(jié)合試驗(yàn)評(píng)估模型。根據(jù)(Freire等人，1990)檢測(cè)總熱量分析液Q=VΔH[[L]+1+[M]nK-(1+[M]nK-[L]K)2+4K[L]2K]]]>其中Q為總熱量，V為細(xì)胞體積，ΔH為焓，M為大分子濃度(細(xì)胞中的結(jié)合伴侶)，n為結(jié)合化學(xué)計(jì)量，L為配體濃度(注射器中的結(jié)合伴侶)，以及K為結(jié)合常數(shù)。用Origin version 5(MicroCal，Inc.)將數(shù)據(jù)與該模型擬合。
結(jié)合常數(shù)以下列關(guān)系式與van′t Hoff焓相關(guān)(∂lnK∂T)p=ΔHVHRT2]]>其中定義，K=e-ΔGRT]]>結(jié)合自由能以下式與結(jié)合焓相關(guān)ΔG＝ΔH-TΔS或根據(jù)Gibbs-Helmholtz方程引入熱容數(shù)據(jù)
ΔGblnd(T0)=ΔH(T0)-T0[ΔH(T)-ΔG(T)T+ΔCPln(T0T)]]]>其中ΔG為Gibbs結(jié)合自由能，T0為參比溫度，以及ΔCp為熱容。根據(jù)兩個(gè)不同穩(wěn)定下的量熱測(cè)定焓算出ΔCp值ΔCp=ΔHT2-ΔHT1T2-T1=ΔST2-ΔST1ln(T2T1)]]>通過測(cè)定兩種已知電離焓的不同緩沖液中的結(jié)合表觀焓，可以測(cè)定結(jié)合事件中轉(zhuǎn)化的凈質(zhì)子數(shù)ΔHopp＝ΔHoor+nΔHlouts其中ΔHcor是所測(cè)pH下的實(shí)際結(jié)合熱。其符號(hào)表示質(zhì)子的轉(zhuǎn)移方向。
表面等離子共振用BiaCore，Inc.的BiaCore-X表面等離子共振(SPR)儀測(cè)定牛胰蛋白酶和SAP-1或SAP-2間相互作用。以10μl每分鐘的流速用50mM N-羥基琥珀酰亞胺、0.2M N-乙基-N ′-(二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺激活羧甲基葡聚糖傳感器芯片(CM-5)10分鐘。巰基偶聯(lián)劑PDEA(2-(2-pyridinyldithio)ethaneamine hydrochloride)以80mM濃度、10μl每分鐘的流速通過激活表面5分鐘。濃度為50ng/μL的SAP-1或SAP-2以10μl每分鐘的流速與激活表面偶聯(lián)10分鐘。50mM 1-半胱氨酸、1M NaCl以10μl每分鐘的流速流過傳感器表面5分鐘使最終表面失活。緩沖液改為磷酸緩沖鹽溶液(PBS)且濃度范圍為1至100nM的牛胰蛋白酶以20μl每分鐘的流速流過傳感器表面。
對(duì)于這一類型的反應(yīng)，A+B←→AB，其中A為自由流動(dòng)的配體以及B為固定配體，SPR信號(hào)(R)的改變是與復(fù)合物AB的形成(結(jié)合相)或解離(解離相)成比例的。因此對(duì)于結(jié)合相傳感器反應(yīng)為(Morton等人，1995)
R(t)=ckacka+kdRmax(1-e-(cka+kd)')+Rd]]>如果結(jié)合物質(zhì)中的所有結(jié)合位點(diǎn)被占用，Rmax是測(cè)量的應(yīng)答，c為配體濃度，Rb為配體注射的基線信號(hào)的改變。解離相可根據(jù)下式計(jì)算R(t)=R0e-kdt]]>其中R0為解離開始時(shí)的SPR信號(hào)。FFT慣例分別使結(jié)合等溫線中的結(jié)合與解離部分變得平滑。用Microcal，Inc.的Origin完成最終的動(dòng)力學(xué)分析(O′Shannessy等人，1993)。
化學(xué)變性通過在尿素存在下在Shimadzu RF5301熒光計(jì)中經(jīng)內(nèi)源色氨酸熒光(Lakowicz，1983)測(cè)定蛋白質(zhì)的解折疊完成對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的測(cè)定。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為295nm和340nm。激發(fā)和發(fā)射單色計(jì)縫隙都設(shè)為1.5nm。將持續(xù)增加量的尿素(濃度范圍為0至6.8M)與蛋白質(zhì)(20μM)混合，將樣品于室溫下溫育10小時(shí)以確保達(dá)到解折疊平衡。根據(jù)下述關(guān)系式(Pace等人，1989)將相對(duì)熒光轉(zhuǎn)換為自由能值ΔG=-RTln[(yf-y1y1-yu)]]]>其中yf和yu分別為完全折疊和完全解折疊DST的相對(duì)熒光值，y1為解折疊中間產(chǎn)物的相對(duì)熒光值，T為絕對(duì)溫度，以及R為氣體常數(shù)。將關(guān)系式ΔG對(duì)[尿素]的線性回歸和外推用于檢測(cè)無變性劑存在下的自由能值(ΔGH20)。類似地，解折疊蛋白質(zhì)(Fu)級(jí)分可以根據(jù)以下關(guān)系式從熒光數(shù)據(jù)算出(Pace等人，1989)FU=(yf-y1yf-yu)]]>結(jié)果為以人工改造(engineer)可用于診斷應(yīng)用的分子，SAP建模產(chǎn)生若干個(gè)氨基酸改變。產(chǎn)生的第一個(gè)改變是用Trp取代Tyr27。這可以幫助重新堆積疏水核心并提供一個(gè)有用的內(nèi)源光譜探針。將Gly1變成Met-Cys。這一變化使分子得以經(jīng)重組方法產(chǎn)生，其中必需一個(gè)起始Met以在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄/翻譯。人工產(chǎn)生Cys殘基以與添加于位置30的第二個(gè)Cys(替換Val30)形成一個(gè)穩(wěn)定的二硫鍵。用Pro替換Asp11以形成一個(gè)對(duì)螺旋間環(huán)結(jié)構(gòu)域更穩(wěn)定的紐結(jié)，并作為向DNA序列中導(dǎo)入特異Sma I位點(diǎn)的一個(gè)途徑。類似地，可以將Alal2改成Gly以使DNA序列內(nèi)的Sma I位點(diǎn)完整。刪除序列RHRY，因?yàn)樵撔蛄猩婕癆PP受體結(jié)合。在序列末端添加兩個(gè)丙氨酸以正確間隔并定向末端半胱氨酸殘基。這一最后的Cys用于將SAP肽螯合并正確定向于作為診斷儀器一部分的金或其它固相支持物或表面。
原來的野生型APP序列和最終的SAP氨基酸序列如下所示。改變的殘基以粗體字顯示。SAP長(zhǎng)為35個(gè)殘基。
SEQ ID NO1-Wt APPGPSQPTYPGD DAPVEDLIRF YDNLQQYLNV VTRHRYSEQ ID NO14-SAPCPSQPTYPGD PGPVEDLIRF YDNLQQWLNC VTAAC保留的氨基酸中有許多形成與肽的關(guān)鍵接觸并在保持肽的穩(wěn)定性和構(gòu)象中起作用。附圖1示出SAP氨基酸序列以及大腸桿菌密碼子偏好的DNA序列。在位于環(huán)區(qū)中心的殘基P11和G12間產(chǎn)生所有插入。這與在核苷酸36和37間的插入對(duì)應(yīng)。
為合成該結(jié)構(gòu)基因，制備一雙鏈DNA序列。為便于克隆進(jìn)表達(dá)載體，將側(cè)翼限制性酶切位點(diǎn)引入到DNA序列中。最終的SAP結(jié)構(gòu)基因雙鏈DNA序列示于附圖2。表3所示的寡核苷酸1～6用于構(gòu)建附圖2所示的DNA序列，其中各寡核苷酸對(duì)各有一個(gè)A和B成員。
表3用于基因構(gòu)建和PCR反應(yīng)的寡核苷酸對(duì)1～6

SAP的最終GROMOS能量最低化結(jié)構(gòu)示于附圖3～5。氨基酸變化未導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，增加的色氨酸加強(qiáng)了螺旋界面核心的疏水性。附圖5以空間填充形式示出三個(gè)半胱氨酸。Cys2和Cys31之間形成一個(gè)二硫鍵。如將在以下顯示的，該二硫鍵大大提高SAP相對(duì)于野生型APP的穩(wěn)定性。SAP肽，以及SAP-1和SAP-2突變體有效表達(dá)并純化自大腸桿菌。典型的產(chǎn)量(未優(yōu)化)約為15～25mg/L。
用等溫滴定量熱法(ITC)測(cè)定了SAP、SAP-1、和SAP-2結(jié)合牛胰蛋白酶的能力。附圖6清楚表明，SAP不具備對(duì)胰蛋白酶的天然結(jié)合親和力。在所有試驗(yàn)條件下，未檢測(cè)到結(jié)合。而另一方面如附圖7所示，SAP-1顯示出對(duì)胰蛋白酶的顯著結(jié)合特異性。
分析附圖7的結(jié)合等溫線得到以下熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)化學(xué)計(jì)量 0.975+/-0.02ΔH(kcal/mol) -26.1+/-1.45ΔS(cal mol-1K-1)-11.6+/-2.2Ka(M-1)1.65×106+/-4.5×104溫度(K) 293
該結(jié)果表明，SAP-1和胰蛋白酶間的相互作用是由焓驅(qū)動(dòng)的，也即，ΔH為負(fù)。正如ΔS為負(fù)值所證明的，該反應(yīng)不是由熵促成的。然而，由于焓項(xiàng)的數(shù)量級(jí)大于熵項(xiàng)，TΔS，因此整體自由能(ΔG)為負(fù)。在更高的溫度下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)得到以下熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)化學(xué)計(jì)量 0.99+/-0.03ΔH(kcal/mol)-15.4+/-2.05ΔS(cal mol-1K-1) -21.1+/-1.8Ka(M-1) 2.40×106+/-3.7×104溫度(K)303該結(jié)合反應(yīng)由焓促成，不由熵促成，以及由總體能量促成。這使ΔCp為-0.51kcal/mol K，表明結(jié)合反應(yīng)燃燒少量的可靠近表面區(qū)域(ΔASA)。這些結(jié)果顯示，可單純通過在環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)域中央插入六個(gè)氨基酸來使SAP分子成為有功能的結(jié)合試劑。從任意肽組合都可用于改變或變更結(jié)合特異性這一意義上來說，SAP試劑是模塊式的。試劑的整體結(jié)構(gòu)不改變(親體骨架)，這使它成為廣泛診斷檢測(cè)中的一個(gè)相當(dāng)有用的組分。SAP結(jié)構(gòu)的保守性對(duì)于純化也是一個(gè)幫助，它將保存期、以及與在側(cè)流診斷檢測(cè)中將材料與支持物和珠粒表面相連有關(guān)的化學(xué)特性標(biāo)準(zhǔn)化。
牛胰蛋白酶和SAP-2間的相互作用示于附圖8。插入肽，YKLKYSEQ ID NO18)，顯示與胰蛋白酶的結(jié)合，盡管其親和力略低于衍生自牛胰蛋白酶抑制劑的肽。仍可用MKPEPS計(jì)算機(jī)程序(生成由使用者定義的肽文庫(kù)結(jié)構(gòu)文檔)和自動(dòng)分子對(duì)接重新設(shè)計(jì)結(jié)合序列。因此可結(jié)合SAP肽與建模軟件得到無限數(shù)量的新穎抗原(或分析物)結(jié)合試劑。圖8所示的ITC等溫線可用于得到以下SAP-2和胰蛋白酶結(jié)合的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
化學(xué)計(jì)量 0.995+/-0.06ΔH(kcal/mol) -31.2+/-2.30ΔS(cal mol-1K-1) -16.2+/-1.22Ka(M-1) 6.4×105+/-5.3×103
概念的驗(yàn)證是用MKPEPS-SAP系統(tǒng)、以適度高的親和常數(shù)、不經(jīng)任何對(duì)插入肽序列的任何優(yōu)化就可以產(chǎn)生焓驅(qū)動(dòng)的結(jié)合反應(yīng)。通過用MKPEPS產(chǎn)生的簇集于YKLKY(SEQ ID NO18)(或其它前導(dǎo)肽插入序列)周圍的序列完成靶向?qū)臃磻?yīng)有可能提高平衡親和常數(shù)。也可能利用對(duì)于出自科技或?qū)＠墨I(xiàn)的肽的SAP系統(tǒng)，或使用象噬菌體展示這樣的分子技術(shù)。
不同緩沖液中SAP-1和SAP-2與牛胰蛋白酶抑制劑結(jié)合的量熱分析表明，對(duì)于SAP-1未發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致結(jié)合(n＝0.01)，對(duì)于SAP-2結(jié)合從蛋白質(zhì)向肽轉(zhuǎn)移了一個(gè)質(zhì)子(n＝1.12)。
在含尿素的情況下檢測(cè)SAP的穩(wěn)定性，如附圖9所示。解折疊曲線對(duì)應(yīng)-3.1kcal/mol的天然自由能以及2.5M尿素的m1/2值。這些數(shù)字將用作與SAP環(huán)插入突變體的比較依據(jù)。解折疊曲線顯示，未發(fā)生如許多胰多肽所證實(shí)的二聚化現(xiàn)象(例如-Kanazawa和Hamaguchi，1986；Chang等人，1980；Noelken等人，1980)。因此，有可能野生型肽中的一個(gè)或若干個(gè)突變導(dǎo)致產(chǎn)生完全單體的肽。對(duì)有用的類抗體診斷試劑來說，這是一個(gè)重要的觀測(cè)現(xiàn)象和必需要求。類抗體試劑與聚笨乙烯或金珠或側(cè)流檢測(cè)中的捕捉帶偶聯(lián)是單體的并不是傾向于多聚化的，這很重要。
令人驚奇的是，SAP-1比SAP穩(wěn)定2.0kcal/mol。建模不立即顯示自由能變化的結(jié)構(gòu)原因。為了完全理解這一現(xiàn)象，現(xiàn)在正在對(duì)該肽進(jìn)行結(jié)晶嘗試(Wood等人，1977)。但是，由環(huán)插入提供的穩(wěn)定性使SAP-1更適宜作診斷工作。如附圖10所示，SAP-1具有-5.1kcal/mol的天然自由能和和4.0M尿素中相應(yīng)的m1/2值。
當(dāng)尿素存在時(shí)SAP-2發(fā)生解折疊這證明了類似的穩(wěn)定化現(xiàn)象。附圖11示出受尿素濃度影響產(chǎn)生的解折疊級(jí)分。等溫線分析再次表明SAP-2以相對(duì)SAP(0.1kcal/mol相對(duì)SAP-1)為2.1kcal/mol的天然狀態(tài)穩(wěn)定的。SAP-2解折疊反應(yīng)的m1/2是4.05M尿素。試驗(yàn)參照的自由能關(guān)系式在SAP、SAP-1和SAP-2建模中僅得到定性反映。插入序列中的六個(gè)氨基酸出現(xiàn)在上限。分子建模中不明顯的短期效應(yīng)例如溶解反應(yīng)或許促進(jìn)肽的穩(wěn)定性。這樣的穩(wěn)定性在如此大小的肽中是不常見。
SAP-1和SAP-2與結(jié)合牛胰蛋白酶的結(jié)合動(dòng)力學(xué)反映出ITC試驗(yàn)所闡述的熱動(dòng)力學(xué)關(guān)系。附圖12示出牛胰蛋白酶結(jié)合于SAP-1或SAP-2表面的結(jié)合等溫線。SAP-1/胰蛋白酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)為1.3×105(ka)和1.7×10-2(kd)。SAP-2和胰蛋白酶相互作用的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)為8.2×104(ka)和6.9×10-2(kd)。結(jié)合等溫線清楚的顯示，SAP-1和SAP-2可經(jīng)C-末端半胱氨酸巰基以仍可影響結(jié)合的方式被正確導(dǎo)向于某個(gè)表面。
肽文庫(kù)MKPEPS程序在生成用作分子對(duì)接程序輸入的肽文庫(kù)方面是非常多樣的。該文庫(kù)的范圍可以從完全隨機(jī)和完全指定，到靶向和部分指定。該隨機(jī)因素允許試驗(yàn)人員對(duì)所有或選定的肽序列空間區(qū)域進(jìn)行采樣。該指定因素通過從全部生成的文庫(kù)(選擇因素)中取每個(gè)第i個(gè)(ith)肽來減少最終文庫(kù)中的肽總數(shù)挑選因素。這減少了對(duì)接計(jì)算時(shí)間。對(duì)MKPEPS文庫(kù)的仔細(xì)篩選和對(duì)自動(dòng)對(duì)接搜索范圍標(biāo)準(zhǔn)的選擇是有利的i)縮減整體計(jì)算時(shí)間，ii)提高得到有意義目標(biāo)的可能性(也就是，提高對(duì)接得分與試驗(yàn)平衡親和常數(shù)的相關(guān)性)，以及iii)降低對(duì)象噬菌體展示這樣的大量勞動(dòng)的依賴性。
MKPEPS程序的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)和流程示于表4。
表4。
MKPEPS程序流程圖。
1)主程序是一個(gè)稱作mkpeps的shell腳本。它可以用幾個(gè)分類符(specifiers)運(yùn)行。它們都和以下4個(gè)版本匹配i)mkpeps ::Runs @mkpepsii)mkpeps class::Runs @outtagsiii)mkpeps peps::Runs @outpepsiv)mkpeps help ::輸出幫助信息2)有三個(gè)用Fortran代碼程序編譯的主程序@mkpeps 根據(jù)使用者說明生成一個(gè)csd肽文檔@outtags 輸出@mkpeps所用殘基的可能標(biāo)簽/類別@outpeps 輸出所有20個(gè)氨基酸的簡(jiǎn)寫
3)代碼目錄包含以下文檔(第一欄列出各程序行數(shù))59 classtags.f233 initaa.f101 initpeps.f101 libpeps.f23 mkpeps.f42 outaa.f229 outpep.f12 outpeps.f12 outtags.f46 ran3.f403 setup.f24 aa.h9 peps.h4 tags.h1298＝＝TOTAL4)@mkpeps流程圖表


5)@outtags流程圖表

6)@outpeps流程圖表

7)所有程序的共用模塊為aaI(在aa.h中) ::包括aa殘基的所有整數(shù)變量aaC(在aa.h中) ::包括aa殘基的所有特征變量aaR(在aa.h中) ::包括aa原子的三維位置pepback(在aa.h中) ::包括aa殘基的骨架信息peps(在peps.h中)::包括所有aa’s的單字母名稱、三字母名稱及全稱8)在tags.h中發(fā)布與類別/標(biāo)簽相關(guān)的變量，盡管為了確保陣列大小一致而將變量通過子程序。
結(jié)論該項(xiàng)工作已經(jīng)表明，有可能人工重造鳥胰多肽以生產(chǎn)可作為潛在的抗體替代物而用于免疫組織化學(xué)診斷檢測(cè)的模塊式結(jié)合試劑。向結(jié)構(gòu)中引入氨基酸改變以提高分子穩(wěn)定性并提供附加功能。設(shè)計(jì)、合成了該新肽的基因序列，并將其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中使用以生產(chǎn)肽。產(chǎn)生了SAP系統(tǒng)的兩個(gè)突變體。第一個(gè)突變體包含衍生自牛胰蛋白酶抑制劑的六個(gè)氨基酸插入。該分子與牛胰蛋白酶結(jié)合。第二個(gè)突變體包含用自動(dòng)肽文庫(kù)結(jié)構(gòu)形成和分子對(duì)接的重新發(fā)現(xiàn)的五氨基酸序列。該分子也與牛胰蛋白酶結(jié)合。SAP分子非常穩(wěn)定，這是部分因?yàn)橹囟逊e的疏水核心和增加的二硫鍵。因此，由于可將多至六個(gè)氨基酸插入親體分子的柔性環(huán)部分，可用SAP系統(tǒng)生成無限數(shù)量的結(jié)合試劑。
參考文獻(xiàn)Blundell，TL.，Pitts，JE.，Tickle，U.，Wood，SP.，和Wu，CW.，(1981)，X-ray analysis(1.4 A resolution)of avian pancreatic polypeptideSmall globular protein hormone.
Proc.Nat.Acad.Sci.USA.784175-79.
Bjornholm，B.，和Jorgensen，F(xiàn)S.，(1993)，Conservation of a helix stabilizing dipolemoment in the PP-fold family of regulatory peptides.Biochem.322954-59.
Bradford，M.M.(1976).A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of dye binding.
Anal.Biochem. 72，248-254.
Cerda-Reverter，J.M.，和Larhammar，D.，2000，Neuropeptide Y family of peptides；structure，anatomical expression，function，and moleculat evolution，Biochem CellBiol 78(3)371-92.
ClarK，M.，Cramer，R.D.，和van Opdensch，N.(1989).J.Computational Chem.10，982-986.
Chang，PJ.，Noelken，ME.，和Kimmel，JR.，(1980)，Reversible dimerization of avian
pancreatic polypeptide.Biochem.191844-49.
Freire，E.，van Osdol，WW.，Mayorga，OL，和Sanchez-Ruiz，JM.(1990).
Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions inproteins.Annu Rev Biophys Biophys Chem.19，159-88.
Fuhlendorff，J.，Johansen，NL.，Melberg，SG.，Thogersen，H.，和Schwartz，TW.(1990)，The antiparallel pancreatic polypeptide fold in the binding ofneuropeptide Y to Y1 and Y2 receptors.J.Biol.Chem.26511706-11712.
Gehlert，DR.，Schober，DA.，Beavers，L.，Gadski，R.，Hoffman，JA.，Smiley，DL.，Chance，RE.，Lundell，I.，Larhammar，D.(1996)，Characterization of the peptidebinding requirements for the cloned human pancreatic polypeptide-preferringreceptor.Molec.Pharmacol.50112-118.
Gingerich，RL.，AKpan，JO.，Gilbert，WR.，Leith，KM.，Hoffman，JA.，和Chance，RE.(1991)，Structural requirements of pancreatic polypeptide receptorbinding.Am J Physiol.261(3 Pt 1)E319-24.
Glover，I.，Haneef，I.，Pitts，J.，Wood，S.，Moss，D.，Tickle，I.，和Blundell，T.，1983，Conformational flexibility in a small globular hormonex-ray analysis of avianpancreatic polypeptide at 0.98-A resolution，Biopolymers 22(1)293-304.
Griko，YV，和Kapanadze，MD.(1995)，Purification and characterization of humanpancreatic polypeptide expressed in E.coli.Biochem.And Biophys.Res.Commun.213239-248.
Guex，N.和peitsch，M.C.(1997).Swiss Model and the Swiss-PdbViewerAnenvironment for comparative protein modeling.Electrophoresis 18，2714-2723.
Hazelwood，RL.，(1990)，Pancreatic polypeptide(pp) and its relevant relatives，inProg.Comparat.Endocrinol.Wiley and Sons，p.250-56.
Kanazawa，I.，和Hamaguchi，K.，(1986)，Unfolding by temperature and guanidinehydrochloride of chicken pancreatic polypeptide.J.Biochem.100207-212.
Karlsson，R.，和Falt，A.(1997).Experimental design for kinetic analysis of protein-protein interactions with surface plasmon resonance biosensors.J.Immunol.Meths.200，121-33.
Kruger，P.，Strassburger，W.，Wollmer，A.，和van Gunsteren，W.F.，1985，Acomparison of the structure and dynamics of avian pancreatic polypeptide hormonein solution and in the crystal，Eur Biophys J 13(2)77-88.
Laemmli，U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during the assemnbly of thehead of bacteriophage T4.Nature(London)227，680-685.
MacKerell，AD，(1991)，Molecular Modeling and dynamics of biologically activepeptidesApplication to Neuropeptide Y.Methods in Enzymol. 202449-470.Maniatis，T.，F(xiàn)ritch，E.F.，和Sambrook，J.(1981).Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.
Miller，J.H.(1972).Experiments in Molecular Genetics.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.
Noelken，ME.，Chang，PJ.，和Kimmel，JR.，(1980)，Conformation and association ofpancreatic polypeptide from three species.Biochem.191838-1843.
O’Shannessy，D.J.，Brigham-Burke，M.，Soneson，K.K，Hensley，P.，和Brooks，I.(1993).Determination of rate and equilibrium binding constants formacromolecular interactions using surface plasmon resonanceuse of nonlinear least squares analysis methods.Anal. Biochem.212，457-468.
Pace，C.N.，Shirley，B.A.，和Thomson，J.A.(1989).In Protein Structure a practicalapproach(T.E.Creighton，Ed.)，pp.311-330.IRL Press，Oxford，UK.
Sambrook，J.，F(xiàn)ritch，EF.，和Maniatis，T.(1989).Molecular CloningA LaboratoryManual，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.
Sanger，F(xiàn).，Nicklen，S.，和Coulson，A.R.(1977).DNA sequencing with chainterminating inhibitors.Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.74，5643-5647.
Sayle，R.A.和Milner-White，E.J.(1995).RasMolBiomolecular graphics for all.
Trends in Biochemical Sciences 20，374-376.
Siegel，LM.，和Monty，KJ.(1966).Determination of molecular weights andfrictional ratios of proteins in impure systems by the use of gel filtration anddensity gradient centrifugation.Application to crude preparations of sulfiteand hydroxylamine reductases.Biochim.Biophys.Acta 112，346-362.
Wood，SP.，Pitts，JE.，Blundell，TL.，Tickle，IJ.，和Jenkins，JA.，(1977)，Purification，crystallization and preliminary X-ray studies on avian pancreatic polypeptide.Eur.J.Biochem.78119-26.
Zondlo，NJ，和Schepartz，A.(1999)，Highly specific DNA recognition by adesigned miniature protein.J.Am.Chem.Soc.1216938-39.
權(quán)利要求
1.一種方法，包括a)定義含有靶蛋白上的相互作用位點(diǎn)的搜索范圍，該肽可與靶蛋白相互作用；b)為該肽定義大??；c)為該肽的氨基酸序列中各位置定義氨基酸類別；d)用已定義的氨基酸類別中的各成員取代該肽序列氨基酸序列的各位置以生成包括輸出肽序列集合的輸出文庫(kù)文檔；e)將輸出文庫(kù)文檔傳輸給分子對(duì)接程序以使各輸出肽序列集合成員與搜索范圍擬合并產(chǎn)生靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分；f)根據(jù)靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分將輸出肽序列集合分級(jí)；和g)展示各輸出肽序列集合成員及其關(guān)聯(lián)靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分；其中，當(dāng)附著于含有SEQ ID NO11或14的肽骨架時(shí)，部分輸出肽序列集合能夠與靶蛋白質(zhì)穩(wěn)定地相互作用。
2.權(quán)利要求1的方法，其中搜索范圍含有靶蛋白質(zhì)中各非氫原子的x-、y-、和z-坐標(biāo)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中具有較高靶蛋白質(zhì)-肽序列擬合得分的輸出肽序列能潛在地以較高的親和力與靶蛋白質(zhì)結(jié)合。
4.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括接受輸入百分?jǐn)?shù)選擇以將輸出肽序列集合限制在一個(gè)確定的百分?jǐn)?shù)；其中輸入百分?jǐn)?shù)選擇可以限制輸出文庫(kù)文檔的大小和文庫(kù)的復(fù)雜性。
5.權(quán)利要求1的方法，其中各氨基酸類別各自包括任一遺傳編碼的L-氨基酸、天然存在的非遺傳編碼L-氨基酸、合成的L-氨基酸、遺傳編碼氨基酸的D-對(duì)映異構(gòu)體、天然存在的非遺傳編碼氨基酸的D-對(duì)映異構(gòu)體、或合成的D-氨基酸。
6.權(quán)利要求1的方法，其中各氨基酸類別各自包括任一親水氨基酸、疏水氨基酸、類半胱氨酸氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸、極性氨基酸、芳香族氨基酸、非極性氨基酸或脂肪族氨基酸。
7.權(quán)利要求1的方法，其中靶蛋白質(zhì)為牛胰蛋白酶且輸出肽序列之一為YKLKY(SEQ ID NO18)。
8.產(chǎn)生肽序列的系統(tǒng)，包括(a)處理器；(b)與處理器相連的存儲(chǔ)器；(c)與處理器相連的顯示器；(d)能夠在處理器上執(zhí)行以產(chǎn)生肽序列的肽序列制備組件；(e)能夠在處理器上執(zhí)行以展示肽序列制備組件所用的各氨基酸殘基類別的類別輸出組件；和(f)能夠在處理器上執(zhí)行以展示肽序列的肽序列輸出組件。
9.如權(quán)利要求8中所述的系統(tǒng)，其中顯示器是打印機(jī)。
10.如權(quán)利要求8中所述的系統(tǒng)，其中類別輸出組件能顯示肽序列制備組件所用的各氨基酸殘基類別。
11.一種系統(tǒng)，它具有與能夠指導(dǎo)機(jī)器完成方法的相關(guān)的內(nèi)容，該方法包括a)接收包含靶位上原子的坐標(biāo)集合的搜索范圍，肽集合能以不同的親和力與該靶位結(jié)合；b)接收包括許多氨基酸的肽長(zhǎng)度參數(shù)；c)接收定義的、用于沿肽長(zhǎng)各位置的擬合的待分析的氨基酸結(jié)構(gòu)類別；d)生成含有輸出肽序列集合的輸出文庫(kù)文檔，該輸出肽序列集合，其包括定義的、沿肽長(zhǎng)各位置的氨基酸結(jié)構(gòu)類別的各氨基酸；e)繼而翻譯和旋轉(zhuǎn)與搜索范圍相關(guān)的肽內(nèi)各位置上的氨基酸結(jié)構(gòu)類別中的各成員，以隨之產(chǎn)生帶有靶位-肽序列擬合得分的肽序列；f)根據(jù)靶位-肽序列擬合得分將肽序列分級(jí)；和g)顯示所選擇的具有相關(guān)肽序列的靶位-肽序列擬合得分百分比；其中，當(dāng)附著于含有SEQ ID NO11或14的肽骨架時(shí)，一部分具有良好擬合得分的肽序列能夠與靶蛋白質(zhì)穩(wěn)定相互作用。
12.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括顯示輸出肽序列的標(biāo)記。
13.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，進(jìn)一步包括儲(chǔ)存搜索范圍。
全文摘要
本發(fā)明提供可以向其中引入一個(gè)或若干個(gè)相互作用的結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定肽骨架。這樣的相互作用的結(jié)構(gòu)域可以是特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域、抑制劑結(jié)構(gòu)域、接頭、標(biāo)記、固相支持物、反應(yīng)位點(diǎn)、催化位點(diǎn)、有用的化學(xué)實(shí)體、及試劑。相互作用的結(jié)構(gòu)域向肽骨架的附著或整合產(chǎn)生肽基試劑。本發(fā)明還提供產(chǎn)生可用作相互作用的結(jié)構(gòu)域的肽文庫(kù)的方法。
文檔編號(hào)C07K14/465GK1978454SQ20061016847
公開日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月20日
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