專利名稱：：具有多種生物活性的螠蟶酶解液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明發(fā)明涉及一種酶解液的制備方法，特別是一種具有多種生物活性的螆蟶酶解液的制備方法，該酶解液可作為治療和預(yù)防腫瘤和疲勞疾病、滋潤營養(yǎng)毛發(fā)、促進(jìn)生長和清除體內(nèi)過氧化物的藥物、保健食品、食品的添加劑或作為洗發(fā)護(hù)發(fā)用品原料。
背景技術(shù)：
：鎰蟶(SinonovaculaconstrictaIamarck)俗名蟶子、青子、竹蚶、海蟶，隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(LameUibranchia)、真瓣鰓目(Eulamellibranchia)、蟶科(Pharellidae)，是中國和日本特有的種類，也是中國沿海養(yǎng)殖的重要貝類之一。螆蟶肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量5.5%，脂肪0.8%，糖1.8%和無機(jī)鹽1.1%。螆蟶的軟體部還有補(bǔ)虛的作用，對陰虛、血虛效果最佳，產(chǎn)后、病后多用之。近年來，海洋貝類的研究已引起人們極大重視，海洋貝類中具有多種生物活性肽、多糖、不飽和脂肪酸，是研制海洋保健食品和功能食品的重要原材料，如Bordenave等將太平洋牡蠣(Crassostreagigas)用胃蛋白酶水解得到具有抑制ACE能力的水解產(chǎn)物；文蛤(Meretrixmeretrix(Linnaeus))多糖對不同劑量的環(huán)磷酰胺(CTX)引起的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)有雙向調(diào)節(jié)功能等。但是目前關(guān)于螆蟶的研究多集中在干制品加工及營養(yǎng)成分分析方面，對其生物活性的研究甚少，產(chǎn)品品種單調(diào)，價格偏低，在一定程度上限制了螆蟶養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和螆蟶肉用組織的利用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種工藝步驟簡單、好操作、易控制、加工成本低的具有多種生物活性的螆蟶酶解液的制備方法，為治療和預(yù)防腫瘤和疲勞疾病、滋潤營養(yǎng)毛發(fā)、促進(jìn)生長和清除體內(nèi)過氧化物的藥物、保健食品、食品提供一種良好的添加劑，為洗發(fā)護(hù)發(fā)用品提供了一種好的原料。本發(fā)明的具有多種生物活性的螆蟶酶解液的制備方法，由如下步驟組成a、將新鮮的螆蟶肉用組織搗碎用勻漿機(jī)制成肉糜；b、將肉糜裝瓶加水，并加入肉糜的0.3%的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值達(dá)6，水解6小時，溫度為6(TC;肉糜與水的用量比為每30g肉糜加入50mL水；c、用加溫方式做滅酶處理，溫度為85°C，時間為10分鐘；d、對上步形成的液體以4500轉(zhuǎn)/分的速度進(jìn)行離心處理，時間控制在20分鐘，然后取上清液即為酶解液。本發(fā)明的具有多種生物活性的螆蟶酶解液的制備方法，工藝步驟簡單，操作容易，好控制，加工成本低；為治療和預(yù)防腫瘤和疲勞疾病、滋潤營養(yǎng)毛發(fā)、促進(jìn)生長和清除體內(nèi)過氧化物的藥物、保健食品、食品提供一種良好的添加劑，為洗發(fā)護(hù)發(fā)用品提供了一種好的原料。具體實施例方式本發(fā)明的方法由如下步驟組成a、將新鮮的螆蟶肉用組織搗碎勻漿機(jī)制成肉糜；b、將肉糜裝瓶加水，并加入肉糜的0.3%的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值達(dá)6，水解6小時，溫度為6(TC;肉糜與水的用量比為每30g肉糜加入50mL水；c、用加溫方式做滅酶處理，溫度為85°C，時間為10分鐘；d、對上步形成的液體以4500轉(zhuǎn)/分的速度進(jìn)行離心處理，時間控制在20分鐘，然后取上清液即為酶解液。本發(fā)明的方法制備的酶解液可做治療和預(yù)防腫瘤和疲勞疾病、滋潤營養(yǎng)毛發(fā)、促進(jìn)生長和清除體內(nèi)過氧化物的藥物、保健食品、食品的添加劑，也可做為洗發(fā)護(hù)發(fā)用品的原料。將螆蟶肉用組織搗碎勻漿機(jī)制成肉糜并稱取30g，裝入三角瓶，加入50mL水，加入肉糜的0.3%的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值達(dá)6，恒溫水解(60°C)，高溫滅酶(85°C，10分鐘)，酶解液以4500轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液即為酶解液，定容至60mL用于測定活性。溫度、酶量、pH值和時間是直接影響螆蟶肉水解效果的重要因素，故將其作為本試驗的正交因素，并選取3個水平設(shè)計L9(34)正交試驗，并用抑菌活性和抗氧化活性來考察各組實驗水解效果。對抑菌活性和抗氧化活性均好的酶解液進(jìn)行促生長、秀毛發(fā)、抗疲勞和抑制腫瘤細(xì)胞生長活性檢測，結(jié)果表明pH6，60°C，酶加入量為底物的0.3%，水解6h的螆蟶組織酶解液可以制備成各種形式的丸齊U、散劑、片齊U、膏劑，粉齊U、水劑，顆粒齊U、膠囊等藥物；制備成保健食品可以是液體的比如像清涼飲料，口服液，乳酸飲料，調(diào)味品；作為食品添加劑，比如加入到面食類，果凍，冰淇淋，腌制品，火腿，點心中；作為滋潤營養(yǎng)毛發(fā)的洗發(fā)護(hù)發(fā)用品，可與輔料混合形成各種形式的洗發(fā)膏、洗發(fā)水、護(hù)發(fā)素等實例1:按上述步驟將螆蟶肉用組織搗碎用勻漿機(jī)制成肉糜并稱取30g，裝入三角瓶，加入50mL水，加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值，恒溫水解，高溫滅酶(85°C10min)，酶解液以4500r/min離心20min，取上清液即為水解液，定容至60mL用于測定活性。由于溫度、酶量、pH值和時間是直接影響螆蟶組織水解效果的重要因素，故將其作為本試驗的正交因素，并選取3個水平設(shè)計L9(34)正交試驗，得到9組酶解液。表l酶解正交實驗因素水平<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>濾紙片法檢測組織提取液的抑菌活性大腸桿菌Escherichiacoli(EC)、變形桿菌Proteusvulgaris(PV)、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(SA)、產(chǎn)氣桿菌Enterobacteraerogenes(EA)禾口枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis(BS)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，乳酸菌Lactobacteriumdelbruckii(LD)用MRS培養(yǎng)基。釀酒酵母菌Saccharomycescerevisiae(SC)用YPD培養(yǎng)基。以上各種菌分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)24h作指示菌。分別用移液槍取指示菌液lOOyL于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，用無菌三角涂棒涂抹均勻，然后將平板分成六個區(qū)，每個區(qū)分別放入一張濾紙片，再分別用移液槍移取酶解樣品10L滴入濾紙片中央，置于37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理做3次重復(fù)，陽性對照為75%酒精，陰性對照為無菌水。三天后觀察指示菌的生長情況，測定抑菌圈的直徑大小。結(jié)果9組酶解液對釀酒酵母菌和變形桿菌均有抑制作用，但是對乳酸菌沒有作用，而乳酸菌對人體是有益菌，因此這些螆蟶酶解液至少在體外不會減少乳酸菌的數(shù)量和作用；另外除了個別實驗組外多數(shù)酶解產(chǎn)物對大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和枯草芽孢桿菌都具有一定的抑制作用，尤其③號、④號和⑧號實驗組酶解液對除乳酸菌以外的菌株都有一定的抑制作用，③號組對各菌株抑制活性較強(qiáng)于④號組和⑧號組，④號組對釀酒酵母菌的抑菌性最強(qiáng)但是對其他菌株效果一般，因此就抑菌活性而言③號組最具有進(jìn)一步研究的意義。金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌分別屬于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌，而螆蟶組織酶解液對它們均有抑制作用，因此用螆蟶組織酶解液開發(fā)功能性食品或食品添加劑可因其抑菌活性而延長產(chǎn)品的保藏時間。實例3:超氧陰離子自由基(02—)清除作用的測定取鄰苯三酚O.lmL于試管中，加入pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液5mL，加入不同條件下水解得到的酶解液0.25mL，迅速混勻。在25t:反應(yīng)15min。使用lcm比色皿，以蒸餾水做空白對照，在320nm處時測吸光度A"并測定本底扣除水解液自身的干擾。酶解液對超氧陰離子自由基清除率的計算公式如下清除率S(%)=Ao-(Ai-Aj)/AoX100X。式中，Ao為試劑空白的吸光度值為樣液的吸光度值；Aj為樣液本底的吸光度值。雖然超氧陰離子自由基(02—)不能直接誘導(dǎo)生物和食品體系中的脂類氧化，但它會在金屬離子催化下發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生有高活性的0H，因此常用樣品對超氧陰離子自由基(02—)的清除能力來反映其抗氧化活性。試劑空白時的吸光度值A(chǔ)o為0.862，經(jīng)清除率公式S(X)=Ao-(Ai-Aj)/AoX100計算超氧陰離子自由基清除率。結(jié)果螆蟶酶解液的超氧陰離子自由基清除率最高為③號實驗組(提取條件pH6，6(TC，酶添加量0.3%，時間610，清除率為71.69%。因此可用作抗氧化藥物的制備或食品抗氧化添加劑。實例4:羥自由基('0H)清除作用的測定取9mmol/L的FeS04lmL、9mmol/L的水楊酸-乙醇溶液lmL、樣品酶解液lmL，最后加入8.8mmol/L的H202lmL啟動反應(yīng)。在37。C反應(yīng)30分鐘。以水為參比，用可見光分光光度計在510nm下測各個提取液吸光度值。酶解物對羥自由基的清除效果用清除率表示，按下式計算SA=[(Ac-As)/(Ac-Ao)]X100%式中，Ac為對照組0D值；As為樣品組0D值；A。為空白組0D值。羥基自由基(*0H)是一種能夠激發(fā)油脂過氧化反應(yīng)的較強(qiáng)的氧化劑，被認(rèn)為是體5內(nèi)最活躍的活性氧自由基，輻射損傷等物理、化學(xué)因子都會促進(jìn)其形成，是造成生物有機(jī)體過氧化損傷的主要因素。羥自由基可介導(dǎo)許多病理變化，如引發(fā)不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并損傷生物膜的功能和結(jié)構(gòu)，因此羥自由基的清除對于生物體具有重要意義。H202和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有很高反應(yīng)活性的*0H，能被水楊酸有效的捕捉，并生成有色物質(zhì)；但若加入具有清除作用的物質(zhì)，便會與水楊酸競爭，從而使有色產(chǎn)物生成量減少。對照組0D值A(chǔ)c為1.243，空白組0D值A(chǔ)o為0.031。經(jīng)公式SA=[(Ac-As)/(Ac-Ao)]X100X算出羥自由基清除率SX，結(jié)果酶解③號組(提取條件pH6，6(TC，酶添加量O.3%，時間6h)清除率最高，為69.72%，因此可用作抗氧化藥物的制備或食品抗氧化添加劑實例5:提取液對小鼠的促生長秀毛發(fā)實驗小鼠40只，雌雄各半分成對照組，高劑量處理組，中劑量處理組，低劑量處理組4組，每組10只。高劑量組為縊蟶的③號木瓜蛋白酶水解液原液(0.036g/mL)、中劑量處理組為1/2原液濃度、低劑量組為1/4原液濃度。每天分別給每只小鼠以每組相對應(yīng)濃度的提取液灌胃0.3mL，對照組用涼開水代替，觀察20d，每天觀察記錄生長情況，每7天秤一次體重。其中樣品處理組與對照組相比毛色光亮，體重增加明顯高于對照組，且對外界剌激反應(yīng)靈敏，其中以低劑量組尤為明顯1.4g/7d，而對照組0.2g/7d。因此可用作營養(yǎng)液或洗發(fā)護(hù)發(fā)產(chǎn)品的開發(fā)。實例6:螆蟶組織酶解液的抗疲勞活性檢測小鼠40只，灌胃20d存活的小鼠(灌胃處理同實施例5)，末次灌胃30min后，鼠身體負(fù)荷5%體重的鐵絲，置小鼠在游泳箱中游泳(水深30cm)，水溫25+1°C，在實驗過程中需使每只小鼠的四肢保持運動，如果小鼠漂浮在水面四肢不動，可用木棒在其附近攪動。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，作為小鼠負(fù)重游泳時間。小鼠用不同濃度提取液灌胃20d后，進(jìn)行負(fù)重游泳試驗，結(jié)果劑量組負(fù)重游泳時間比對照組延長。與對照組相比(211.0+8.9)，高劑量組負(fù)重游泳時間稍有延長(252.6+7.5)，中劑量組組負(fù)重游泳時間延長并比高劑量組顯著(271.7+5.0)，說明，酶解液的處理能夠在一定程度上提高小鼠的抗疲勞能力。可用作抗疲勞藥物或保健品的開發(fā)。實例7:將小鼠腹水型腫癌株HcaF16A復(fù)蘇，在小鼠腹腔內(nèi)傳代，57d傳代1次。傳代3次后，抽取腹水.生理鹽水洗滌離心(800r/minX5min)3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至5.OX106個/mL.臺盼藍(lán)拒染法檢測存活率>95%，備用。整個操作在無菌條件下進(jìn)行。用無菌注射器抽取腹水瘤細(xì)胞懸液注射至昆明小鼠右前腋皮下，每鼠0.2mL，接種瘤株H后將小鼠隨機(jī)分組并稱重。每組IO只，雌雄各半，分別為空白組.模型組，陽性對照組，螆蟶組織酶解物高、中、低劑量(320mg/kg、160mg/kg、80mg/kg)組，每日給小鼠灌胃給藥1次，每次0.2ml/20g體重；空白組和模型組灌胃等量蒸餾水；陽性對照組按劑量20mg/(kg.d)腹腔注射給藥氟尿嘧啶每日1次。各組均連續(xù)給藥10d，第lld時稱重并脫頸椎處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，摘取脾臟和胸腺，稱重，并計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。抑瘤率(％)=(模型組平均腫瘤重量-給藥組平均腫瘤重)/模型組平均腫瘤重X100%:胸腺(脾臟)指數(shù)(mg/10g)=胸腺(脾臟)重量/小鼠體重。數(shù)據(jù)以(x士s)表示.采用SPSSIO.O軟件中的單因素方差分析進(jìn)行處理。結(jié)果表明.螆蟶組織酶解物具有很好的抑制小鼠移植性腫瘤HcaF16A活性的作用.其中以中劑量組活性最好抑瘤率達(dá)61.2%，因此可開發(fā)為新的抗癌藥物。權(quán)利要求一種具有多種生物活性的螠蟶酶解液的制備方法，其特征在于由如下步驟組成a、將新鮮的螠蟶肉用組織搗碎用勻漿機(jī)制成肉糜；b、將肉糜裝瓶加水，并加入肉糜的0.3％的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值達(dá)6，水解6小時，溫度為60℃；肉糜與水的用量比為每30g肉糜加入50mL水；c、用加溫方式做滅酶處理，溫度為85℃，時間為10分鐘；d、對上步形成的液體以4500轉(zhuǎn)/分的速度進(jìn)行離心處理，時間控制在20分鐘，然后取上清液即為酶解液。全文摘要一種具有多種生物活性的螠蟶酶解液的制備方法，其特征在于由如下步驟組成將新鮮的螠蟶肉用組織搗碎勻漿機(jī)制成肉糜；將肉糜裝瓶加水，并加入肉糜的0.3％的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值達(dá)6，水解6小時，溫度為60℃；肉糜與水的用量比為每30g肉糜加入50ml水；用加溫方式做滅酶處理，溫度為85℃，時間為10分鐘；對上步形成的液體以4500轉(zhuǎn)/分的速度進(jìn)行離心處理，時間控制在20分鐘，然后取上清液即為酶解液。工藝步驟簡單，操作容易，好控制，加工成本低；為治療和預(yù)防腫瘤和疲勞疾病、滋潤營養(yǎng)毛發(fā)、促進(jìn)生長和清除體內(nèi)過氧化物的藥物、保健食品、食品提供一種良好的添加劑，為洗發(fā)護(hù)發(fā)用品提供了一種好的原料。文檔編號A61P43/00GK101744837SQ20091024896公開日2010年6月23日申請日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者張付云申請人:大連水產(chǎn)學(xué)院