專利名稱：生產(chǎn)重組α1-抗胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生產(chǎn)重組α I"抗胰蛋白酶(AAT)多肽的方法。
背景技術(shù)：
嗜中性粒細胞(Neutrophils)可以通過毛細孔不受阻礙的進入肺；他們是肺內(nèi)免疫系統(tǒng)抵抗入侵致病微生物的重要的免疫中介。發(fā)炎反映的一個結(jié)果是嗜中性粒細胞釋放出廣譜的防衛(wèi)分子，包括反應(yīng)性種類的氧分子，陽離子多肽，類二十烷酸，和蛋白酶。(Lee et al.，Am. J. Perspir. Crit. Care Med. 164 :896-904,2001.)需要注意的是，這些分子的失控釋放可以導(dǎo)至嚴重的肺損壞。人白細胞彈力蛋白酶(HLE)，亦稱為人中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)，是一個在正常炎癥反應(yīng)中從嗜中性粒細胞的嗜苯胺籃顆粒釋放出的絲氨酸蛋白酶(Siapiro，Eur. Respir. J.Suppl.44 :30s-32s，2003·)。在正常的體內(nèi)平衡的條件下，α -抗胰蛋白酶 (AAT)充當(dāng)一個對HLE蛋白水解的重要調(diào)控劑，從而防止了對肺胞細胞基質(zhì)的破壞。AAT是一個主要在肝細胞內(nèi)合成的53KD的糖蛋白，但也在嗜中性粒細胞，單核細胞，和巨噬細胞內(nèi)合成。AAT合成后分泌到血漿中，但它的主要作用部位是肺軟細胞組織(Moragaet al., J. Biol. Chem. 275 :7693-7000,2000.)。除了 HLE，AAT也抑制由嗜中性粒細胞釋放到肺中的其他兩個蛋白酶組織蛋白酶G(catG)和蛋白酶3(1^；3)。CatG和Pr3可能也通過降解彈力素和其他細胞外蛋白造成肺損壞。AAT可能防止這種損壞。然而HLE蛋白酶被認為是造成肺損壞的元兇(Korkmaz et al.，Amer. J. Resp. Cell Mol. Biol. 32 :553-559,2005.)。由于HLE和可能的其他蛋白酶的失控作用，AAT遺傳缺乏使患者易罹患早期遺傳性肺氣腫(Crystal et al. ,Hosp. Pract. (Off Ed). 26 (2) :81_4，88-9，93-4 ； 1991.)。為了恢復(fù)肺的正常功能和緩解遺傳性肺氣腫，必須進行大量的和頻繁的AAT注射?，F(xiàn)在市場上的AAT是從合并的血清分離出來(例如kmaira ，Prolastin )，但面臨著供不應(yīng)求的局面。由于市場供給的限制，AAT還沒有被適當(dāng)?shù)尿炞C在其他呼吸癥方面的應(yīng)用。AAT可能亦可用于治療因吸煙，囊腫性纖維化，肺高壓，肺纖維癥，及慢性阻塞性肺疾病(COPD)等所造成的月市氣腫(Cantin et al.，J. Aerosol. Med. 15 141—148，2002 ；Cowan etal. ,Nat. Med. 6 698-702,2000 ；Obayashi et al. Chest 112 :1338-1343,1997.) 人AAT是一個已經(jīng)被克隆并在包括大腸桿菌和真菌表達系統(tǒng)內(nèi)表達的包含394個氨基酸的蛋白(Bollen et al.，DNA 2 :255-264,1983 ；Kurachi et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 78 :6826-6830,1981 Johansen et al.，Mol. Biol. Med. 4 :291-305,1987 ；Kwon et al. ,Biochimica et Biophysica Acta 1247 :179_184，1995.)。據(jù)報道刪除人 AAT 的前 5個或者10個氨基酸導(dǎo)致在大腸桿菌中的高表達，并且所產(chǎn)生的刪除N-端的AAT衍生物表現(xiàn)出與真正的人AAT等同的抑制胰蛋白酶和彈性蛋白酶的比活力(Johansen et al. ,Mol. Biol. Med. 4 :291-305,1987.)。人AAT表達為一個418個氨基酸的前體，然后M個氨基酸前體被切除，從而產(chǎn)生394個氨基酸的最終產(chǎn)物。AAT的天然產(chǎn)物有3個糖基化位點。自然型和有些疾病類型的2. O埃的AAT的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解出并進行了深入的研究(Elliottetal.，Protein Sci. 9 :1274-1281,2000.)。因為如大腸桿菌的原核細胞缺乏將蛋白糖基化的生化機理，所以大腸桿菌生產(chǎn)的 AAT沒有糖基化。研究證明非糖基化AAT在體內(nèi)半衰期較糖基化的減少6倍，限制了它的醫(yī)療效果(Weber et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 126 (1) :630-5,1985.) 文獻報導(dǎo)， 很多生物分子的體內(nèi)半衰期可以通過聚乙二醇化(pegylation)延長，并且在Cyi^2的聚乙二醇化延長了 AAT 的半衰期(Cantin et al.，Am. J Respir. Cell Mol. Biol. 27 :659-665, 2002 ；Graddis et al. , Curr.Pharm. Biotechnol. 3(4) :285-97,2002 ；Molineux, Cancer Treat. Rev. 28 Suppl A : 13-6，2002.)。大腸桿菌表達的包涵體復(fù)性方法已經(jīng)發(fā)表。請見例證U. S. Pat. No. 6，583，268 ；U. S. Pub. Nos. US 2003/070242 ；US 2003/0199676 ；US 2004/0265298 ；和 US 2005/0227920 ；和 PCT Pub. Nos. WO 03/039491 ；WO 2004/094344 ；WO 01/55174 ；WO 2005/05830。在此引用的所有專利、專利申請和出版物均全文引入作為參考。需要指出的是，本發(fā)明背景部分中參考某一出版物并不表示承認所述出版物構(gòu)成了本發(fā)明所指的現(xiàn)有技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明提供生產(chǎn)具有生物活性的α 1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽的新的復(fù)性方法。本方法用少數(shù)步驟，即可利用變性的AAT多肽產(chǎn)生正確復(fù)性的，具有高度活性的AAT多肽。在某些實施例中，此方法利用原始的細菌生產(chǎn)的AAT多肽(從細胞糊狀物或包涵體)生產(chǎn)正確復(fù)性的，高活性的AAT多肽。在某一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)復(fù)性的重組AAT多肽的方法，包括a)用溶解緩沖液溶解變性的AAT多肽，所述溶解緩沖液包含高濃度的離液劑和還原劑，并且其具有約8. 5到約11. 0的pH，由此產(chǎn)生溶解的AAT多肽溶液；b)通過將上述溶解的AAT多肽溶液加至復(fù)性緩沖液中的方法將上述溶解的AAT多肽溶液快速稀釋，由此產(chǎn)生稀釋的溶解的AAT多肽溶液。其中的復(fù)性緩沖液包含Tris、甘油、蔗糖、或聚乙二醇(PEG)，或者上述的任何組合；及 c)將稀釋的溶解的AAT多肽溶液的pH降低至約7. 5到約8. 5，其中所述pH的降低用至少約20小時完成，由此產(chǎn)生了復(fù)性的AAT多肽。在某些實施例中，離液劑為尿素，其濃度可以為約8M。在另外的實施例中，離液劑為鹽酸胍，其濃度可以為約6M。在某些實施例中，利用復(fù)性緩沖液將溶解的AAT多肽溶液稀釋約20倍。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液中包含Tris作為緩沖液。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液包含甘油，蔗糖，或其任何組合。例如，復(fù)性緩沖液可以包含約5%至約30%的甘油， 約5%至約40%的蔗糖，或約10%的甘油和約10%的蔗糖。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液包含聚乙二醇(PEG)。在某些實施例中，PEG的分子量是約200至約20，000道爾頓。在某些實施例中，PEG的分子量是約200道爾頓。在某些實施例中，PEG的分子量是約600道爾頓。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液可以進一步包含去污劑，例如吐溫-20，吐溫-80，脫氧膽酸鈉，膽酸鈉，和氧化三甲胺(TMSO)。在某些實施例中，溶解緩沖液或復(fù)性緩沖液約為pH 8. 5至約為pH 10. 8。在某些實施例中，溶解緩沖液或復(fù)性緩沖液約為PH 10.0至約為pH 10.8。在某些實施例中，溶解緩沖液和/或復(fù)性緩沖液約為PH 8.5，約為？!1 9.0，約為？!1 10，約為pH 10. 5，或約為pH10. 8。在某些實施例中，溶解緩沖液和復(fù)性緩沖液具有等同的pH。在某些實施例中，將稀釋的溶解的AAT多肽溶液的pH降低至約8. 0。在某些實施例中，此方法進一步包含在用復(fù)性緩沖液稀釋溶解的AAT多肽溶液之前，用溶解緩沖液II調(diào)解溶解的AAT多肽溶液的A28tl到約2. 0至約10. 0 (例如約2. 0至約 5. 0)。在一個示例性的實施例中，生產(chǎn)復(fù)性的重組AAT多肽的方法包括a)用溶解緩沖液溶解變性的AAT多肽，所述溶解緩沖液包含約8M尿素，約0. IM Tris,約ImM甘氨酸，約 ImM EDTA,約IOOmM β -巰基乙醇，約pH 10. 5，由此產(chǎn)生溶解的AAT多肽溶液；b)用溶解緩沖液II調(diào)解溶解的AAT多肽溶液的A28tl到約2. 0。此溶解緩沖液II包含約8M尿素，約0. IM Tris,約ImM甘氨酸，約ImM EDTA,約IOmM β -巰基乙醇，約IOmM 二硫蘇糖醇(DTT)，約ImM 還原的谷胱甘肽(GSH)，并且其pH約為10. 5 ；c)通過將上述調(diào)解后的溶解的AAT多肽溶液加至約20倍體積的復(fù)性緩沖液中的方法將上述溶解的AAT多肽溶液快速稀釋，此復(fù)性緩沖液包含約20mM Tris, pH約10. 5，及任何的1)約10%至約30%甘油，2)約10%至約30% 蔗糖，3)約20%甘油和約20%蔗糖，4)約10%甘油和約10%蔗糖，和5)約5%至約10% 聚乙二醇(PEG)；和d)將稀釋的溶解的AAT多肽溶液的pH降低至約7. 6，其中所述pH的降低用至少約20小時至4天完成，由此產(chǎn)生了復(fù)性的AAT多肽。在某些變更中，復(fù)性緩沖液進一步包含約0. 005%至約0. 02%吐溫-20 (Tween 20)。在另一個示例性的實施例中，生產(chǎn)復(fù)性的重組AAT多肽的方法包括a)用pH 10. 5 的溶解緩沖液II溶解變性的AAT多肽，由此產(chǎn)生溶解的AAT多肽溶液；b)通過將上述溶解的AAT多肽溶液加至約20倍體積的復(fù)性緩沖液中的方法將上述溶解的AAT多肽溶液快速稀釋，此復(fù)性緩沖液包含約20mM Tris和約20%蔗糖，pH約10. 5 ；和c)將稀釋的溶解的 AAT多肽溶液的pH降低至約7. 6，其中所述pH的降低用至少約20小時完成，由此產(chǎn)生了復(fù)性的AAT多肽。在另一方面，本發(fā)明亦提供生產(chǎn)復(fù)性的重組AAT多肽的方法，包括a)用溶解緩沖液溶解變性的AAT多肽，所述溶解緩沖液包含高濃度的離液劑和還原劑，并具有pH約8. 5 至約10. 5，由此產(chǎn)生溶解的AAT多肽溶液；b)用pH約8. 5至約10. 5的復(fù)性緩沖液稀釋溶解的AAT多肽溶液，由此產(chǎn)生稀釋的溶解的AAT多肽溶液，其中的復(fù)性緩沖液包含甘油，蔗糖，或聚乙二醇(PEG)，或任何組合；c)將稀釋的溶解的AAT多肽溶液在約16°C至約20°C孵育至少約16小時；d)將稀釋的溶解的AAT多肽溶液在約4°C進一步孵育約M至約72小時；和e)將稀釋的溶解的AAT多肽溶液交換成具有pH約7. 5至約8. 5的緩沖液，由此產(chǎn)生復(fù)性的AAT多肽。在某些變通中，在步驟e)中的緩沖液具有與復(fù)性緩沖液相同的配方。在某些實施例中，本方法進一步包括在步驟e)之前濃縮稀釋的溶解的AAT多肽溶液的方法。例如，可以用超濾濃縮方法將AAT多肽溶液濃縮10-200倍。在某些變通中，步驟e)可以通過透析或分子排阻色譜法實現(xiàn)。在某些實施例中，離液劑是約8M濃度的尿素。在其他實施例中，離液劑是約6M濃度的鹽酸胍。在某些實施例中，以約20倍的比例將溶解的AAT多肽溶液稀釋到復(fù)性緩沖液中。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液包含Tris作為緩沖。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液包含甘油，蔗糖，或其任何組合。例如，復(fù)性緩沖液可以包含約5%至約20%甘油，約10%至約20%蔗糖，或約10%甘油和約10%蔗糖。在某些變通中，復(fù)性緩沖液包含聚乙二醇 (PEG)。在某些變通中，PEG的分子量為約200至約20，000道爾頓。在某些變通中PEG的分子量為約200道爾頓。在某些實施例中，PEG的分子量為約200至約20，000道爾頓。在某些實施例中PEG的分子量為約600道爾頓。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液可以進一步包含一種或幾種去污劑，如吐溫-20 (Tween 20)，吐溫-80 (Tween80)，脫氧膽酸鈉，膽酸鈉，和氧化三甲胺(TMSO)。在某些實施例中，溶解緩沖液或復(fù)性緩沖液的pH約為8. 5。在某些實施例中，溶解緩沖液或復(fù)性緩沖液的PH約為9. 0。在某些實施例中，溶解緩沖液或復(fù)性緩沖液的pH約為9. 5。在某些實施例中，溶解緩沖液或復(fù)性緩沖液的pH約為10.0。在某些實施例中，溶解緩沖液和復(fù)性緩沖液的PH等同。在某些實施例中，此方法進一步包含在用復(fù)性緩沖液稀釋溶解的AAT多肽溶液之前用溶解緩沖液II將溶解的AAT多肽溶液的A28tl調(diào)節(jié)為約2. 0至約10. 0 (例如約2. 0至約 5. 0)。在一個例證性的實施例中，生產(chǎn)復(fù)性的重組AAT多肽的方法包括a)用溶解緩沖液溶解變性的AAT多肽，所述溶解緩沖液包含約8M尿素，約0. IM Tris,約ImM甘氨酸，約 ImM EDTA,約ΙΟΟπιΜβ -巰基乙醇，約pH 10. 5，由此產(chǎn)生溶解的AAT多肽溶液；b)用溶解緩沖液II調(diào)解溶解的AAT多肽溶液的A28tl到約2. 0。此溶解緩沖液II包含約8M尿素，約 0. IM Tris,約ImM甘氨酸，約ImM EDTA,約IOmM β -巰基乙醇，約IOmM 二硫蘇糖醇(DTT)， 約ImM還原的谷胱甘肽(GSH)，并且其pH約為10. 5 ；c)通過將上述溶解的AAT多肽溶液加至約20倍體積的復(fù)性緩沖液中的方法將上述溶解的AAT多肽溶液快速稀釋，此復(fù)性緩沖液包含約20mM Tris, pH約10. 5，及任何的1)約10%至約30%甘油，2)約10%至約30%蔗糖，3)約20%甘油和約20%蔗糖，4)約10%甘油和約10%蔗糖，和5)約5%至約10%聚乙二醇(PEG) ；d)在20°C將稀釋的溶解的AAT多肽溶液孵育至少16小時；e)進一步在4°C 將稀釋的溶解的AAT多肽溶液孵育約M至約72小時；f)用超濾法將稀釋的溶解的AAT多肽溶液濃縮；和g)用分子篩色譜法將稀釋的溶解的AAT多肽溶液交換為具有約20mM Tris, 約0. 2MNaCl，約10%甘油或約15%蔗糖，約ImM DTT，約pH 7. 6的緩沖液，由此產(chǎn)生復(fù)性的 AAT多肽。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液和在步驟g)中的緩沖液進一步包含約0.005%的吐溫-20 (Tween 20)。下面的實施例可以應(yīng)用于此處所描述的任何方法。在某些實施例中，AAT多肽是人的AAT多肽(SEQ ID NO 1)。在某些實施例中，在 SEQ ID NO :1中的氨基酸1-15的氨基酸殘基被刪除。對于N-端刪除的AAT多肽，為了在大腸桿菌內(nèi)表達，將蛋氨酸加在N-端作為第一個氨基酸。在某些實施例中，AAT多肽包含 SEQ ID NO 1 中的氨基酸 2-394，3-394，4-394，5-394，6-394，7-394，8-394，9-394，10-394， 或11-394。在某些實施例中，AAT多肽包含SEQ ID NO 3中的序列。在某些實施例中，此方法進一步包括用化學(xué)修飾法將聚乙二醇(PEG)連接到AAT 多肽上的方法。在某些實施例中，將聚乙二醇(PEG)分子連接到AAT多肽的Cyf2氨基酸上，其中的氨基酸CyP2是基于SEQ ID N0:1的氨基酸序列。在某些實施例中，聚乙二醇 (PEG)分子具有分子量約為20kD至約為40kD。本發(fā)明方法在起始的過程中可以包含附加的步驟。因此在某些實施例中本方法包括在初始步驟中溶解包含變性的AAT多肽細菌宿主細胞并收集變性的AAT多肽。某些附加的實施例也包括洗滌變性的AAT多肽。本發(fā)明方法在結(jié)束的過程中亦可以包含附加的步驟。因此在某些實施例中本方法亦包括純化復(fù)性的AAT多肽，例如用分子排阻色譜(SEC)，陰離子交換色譜，疏水交換色譜， 或任何這些步驟的組合。比如SEC后進行陰離子交換，及進一步進行疏水交換色譜，及根據(jù)需要交換這些步驟的任何次序。本發(fā)明亦提供將正確復(fù)性的AAT多肽從不正確復(fù)性的或非復(fù)性的AAT多肽中純化出來的方法，此方法包括a)在鹽的作用下將不正確復(fù)性的或非復(fù)性的AAT多肽與疏水作用層析樹脂結(jié)合；和b)收集沒有同樹脂結(jié)合的正確復(fù)性的AAT多肽。在某些實施例中，其中所述的鹽是硫酸銨[(NH4)2SO4],氯化鈉(NaCl)，或氯化鉀(KCl)。在某些實施例中，其中所用硫酸銨的濃度約為0. 25M至約為1. 2M。在某些實施例中，其中所用氯化鈉的濃度約為 1. OM至約為3. 5M。在某些實施例中，其中所用氯化鉀的濃度約為1. OM至約為3. 5M。在某些實施例中，正確復(fù)性的AAT多肽來源于細菌包涵體。本發(fā)明亦提供由本方法生產(chǎn)的AAT多肽。在某些實施例中，此AAT多肽是非糖基化的AAT多肽。在某些實施例中，由本方法生產(chǎn)的AAT多肽具有約至少任何80%，85%，90%， 95%,96%,97%,98%,^P 99%的純度。本發(fā)明還提供藥物組合物，其中包含所述AAT多肽和可接受的藥用賦形劑。本發(fā)明還提供包含所描述的AAT多肽的藥劑盒。這些通常在合適的包裝中和提供適當(dāng)說明的藥劑盒可以被用于治療AAT缺乏癥(包括遺傳和非遺傳的)的患者。附圖簡述

圖1顯示成熟型天然的人AAT的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)和成熟型天然的人 AAT 的 cDNA 序歹Ij (SEQ ID NO :2)。圖2顯示合成cDNA序列(SEQ ID NO 4)和翻譯的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO 3)此序列是優(yōu)化的在大腸桿菌中表達的截短的AAT多肽(Δ5-ΑΑΤ)序列。此截短的AAT多肽是從成熟的AAT多肽派生出來，其序列缺乏1-5氨基酸殘基但是另加一個蛋氨酸作為蛋白表達的起始氨基酸。圖3顯示非還原SDS-PAGE，證明大腸桿菌生產(chǎn)的非聚乙二醇修飾的 (unpegylated)和聚乙二醇修飾的(pegylated) Δ 10-ΑΑΤ多肽(分別為線道2和3)和 Δ 5-ΑΑΤ多肽(分別為線道4和5)可以被純化到幾乎同質(zhì)性。每一個SDS-PAGE都顯示了標(biāo)準(zhǔn)分子量(線道1和6)。圖4表示不同來源的AAT對HLE或PPE活性抑制的比較。顯示復(fù)性和純化的聚乙二醇修飾的和非修飾的Δ5-ΑΑΤ多肽與商業(yè)的全長人AAT(糖基化的)的活性抑制的比較，此抑制為阻礙人中性粒細胞彈性蛋白酶(HLE)和豬胰彈性蛋白酶(porcine pancreaticelastase, PPE)白勺ΒΙ 舌t生。Series 1 =非聚乙二醇化 Δ 5AAT 多Jft對 HLE ；Series 2 =聚乙二醇化 Δ 5ΑΑΤ 多肽對 HLE ；Series 3 =(糖基化)商業(yè)全長AAT對PPE ；Series 4 =非聚乙二醇化 Δ 5AAT 多Jft對 ΡΡΕ。圖5Α和圖5Β顯示聚乙二醇修飾的Δ 5-ΑΑΤ多肽的SDS-PAGE和MALDI-T0F質(zhì)譜圖。圖5A顯示聚乙二醇非修飾的和修飾的Δ 5-ΑΑΤ多肽的SDS-PAGE。線道1 非聚乙二醇修飾的Δ 5-ΑΑΤ多肽；線道2 聚乙二醇修飾的Δ 5-ΑΑΤ多肽；及線道3 標(biāo)準(zhǔn)分子量。圖5Β顯示聚乙二醇修飾反應(yīng)后的Δ 5-ΑΑΤ多肽的MALDI-T0F質(zhì)譜圖。每一個所標(biāo)志峰的分子量皆描述于峰的上方。例如，Δ5-ΑΑΤ多肽(非聚乙二醇修飾的)的分子量為43996. 34道爾頓，而聚乙二醇反應(yīng)試劑Mal-PEG 20的分子量為22063. 92道爾頓。所以成功反應(yīng)的聚乙二醇修飾的Δ 5-ΑΑΤ的分子量為65324. 02道爾頓，與質(zhì)譜圖所得到的分子量非常接近。此數(shù)據(jù)證明Δ5-ΑΑΤ已經(jīng)被聚乙二醇成功修飾。圖6顯示從疏水作用層析柱所收集的AAT多肽餾分的SDS-PAGE。線道1_6顯示非還原SDS-PAGE ；而線道7顯示還原的SDS-PAGE。線道1顯示標(biāo)準(zhǔn)分子量。線道2顯示在 IM(NH4)2SO4存在下從疏水作用層析柱流出液所收集的含AAT多肽的餾分。線道3_6顯示在將IM(NH4)2SO4從緩沖液中去除后洗脫液中含AAT多肽的餾分。線道7顯示與線道2相同的餾分但還原的SDS-PAGE。圖7顯示復(fù)性和純化的Δ 5-ΑΑΤ多肽與kmaria 抑制PPE的活性抑制比較。圖8為圖7的圖解表。發(fā)明詳述本發(fā)明提供生產(chǎn)重組的，具有生物活性的AAT多肽的方法。除非另外指明，本發(fā)明的實施將采用免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細胞生物學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。以上所述均在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。參見，例如分子克隆實驗室 ^jJJ :Molecular Cloning -.a laboratory manual, 3nd edition Sambrook, et al. (2001)； Current Protocols In Molecular Biology F. M. Ausubel, et al.eds. , (1987) ；the series MethodsIn Enzymology, Academic Press, Inc. ；PCR 2 :A Practical Approach, M. J. MacPherson,B. D. Hames and G. R. Taylor, eds. (1995), and Antibodies,A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds. (1988)。需要指出的是，文中使用的單數(shù)形式除非特別指明均包括復(fù)數(shù)形式。當(dāng)用“大約”或“約”描述一個范圍，此術(shù)語同時應(yīng)用于值域的低限和高限。例如， “約X到Y(jié)”的意思是“從約X到約Y”。引用的“大約”或“約” 一個值或所指參數(shù)包括(所描述的)實施例中的值或參數(shù)。例如，在描述中所指“大約X”或“約X”包括對“X”的描述。需要理解的是這里描述的發(fā)明的方面和實施例包含對其他方面和實施例的“包括”和/或“基本包括”。A. AAT 多肽AAT多肽(與AAT，AAT蛋白互換應(yīng)用)包含任何天然存在的品種(例如來源于任何哺乳動物，包括人，侍養(yǎng)動物，體育動物，寵物，靈長目動物，馬，狗，貓，小鼠和大鼠等的全長蛋白)，具有生物活性的多肽片斷(例如蛋白N-端一個或多個氨基酸切除的人AAT片斷)，和突變體(包括天然存在和非天然存在的)，包括不明顯影響生物特性的功能等同的變異體和具有增加或減少活性的變異體(例如對人白細胞彈力蛋白酶活性的抑制)。變異體的例子包括替換一個或多個氨基酸的AAT (例如保守的替換)，不明顯的改變復(fù)性和/或蛋白活性功能的一個或多個氨基酸的切除或增加。AAT多肽，包括變異體，多肽片斷，AAT多肽的修飾形式(包括天然存在的AAT)，融合蛋白和本發(fā)明的連接體，可以用下列的一種或多種特性鑒別(a)抑制白細胞彈力蛋白酶(例如人白細胞彈力蛋白酶(HLE))活性的能力；(b)抑制豬胰彈力蛋白酶活性的能力； (c)抑制組織蛋白酶(cath印sin G(catG)(例如人catG))活性的能力；(d)抑制蛋白酶 3 (proteinase 3(例如人活性的能力；和(e)防止HLE造成的肺傷害。從而所有的 AAT多肽(包括變異體，片斷，和修飾的形式)皆具有以上所描述的功能。抑制可以是完全的或部分的，例如，至少抑制酶活性的約50%，至少約60%，至少約70%，至少約80%，至少約90%，至少約95%，或100%。在某些實施例中，AAT多肽包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列。在某些實施例中，AAT 多肽包含在SEQ ID NO :1中1-15氨基酸中的一個或多個氨基酸殘基被刪除。在某些實施例中，AAT多肽包含不同的N-端截除的AAT片斷。例如AAT多肽包含SEQ IDNO :1中的氨基酸 2-394，3-394，4-394，5-394，6-394，7-394，8-394，9-394，10-394，或 11-394。對 N-端截除的AAT多肽，為了多肽表達，如在大腸桿菌內(nèi)表達，可以把蛋氨酸加在N-端作為第一個氨基酸。在某些實施例中，AAT多肽包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列或被SEQ ID NO :4中核酸序列編碼的氨基酸序列。AAT多肽實施例中包括融合蛋白(N-端融合或C-端融合)。本發(fā)明的AAT變異體可以包括不會明顯改變蛋白活性的一個或多個氨基酸的取代，刪除或增加。變異體可以從自然突變或人工操作獲得。變化可以是次要性的，例如對復(fù)性和活性沒有顯著影響的保守的氨基酸取代。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的重組DNA技術(shù)可以被用來創(chuàng)造新奇的突變蛋白或包括單個或多個氨基酸取代，刪除，或增加的突變體。如此修改過的多肽可以顯示，例如，增強的活性，增加的穩(wěn)定性，或降低的活性。此外，與自然多肽相比，它們可能以更高的產(chǎn)量和更好的溶解性被純化，至少在一定的純化和保存條件下。異變體亦包括那些在有一個或多個氨基酸殘基被刪除，增加，或取代后能產(chǎn)生出在所選擇的宿主細胞中更適合于表達，放大，等等的多肽。所以AAT亦包括單個或多個氨基酸取代，刪除，或增加的AAT衍生物和類似物，此類AAT衍生物和類似物在宿主細胞中可能更適合于表達，放大，等等。在某些實施例中，AAT異變體的氨基酸序列至少大約70%，75%， 80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%與AAT (例如從哺乳動物的，及人的AAT)等同。AAT異變體的例證描述于美國專利Nos. 4，732，973，5，134，119，和4，711，848 這些專利全部以引用的方式并入本文中。如果兩個氨基酸序列在如下列描述的最大相符比對時相同，則兩個多肽序列可以說是“等同的”。兩個序列之間的比較通常用通過確定局部序列的相似性的比較視窗的方法進行。這里所用的“比較視窗”是參考一個至少20個鄰近位置的片斷，通常大約30到75， 大約40到50，其中的序列最佳比對后可以與具有相同數(shù)目的鄰近位置的參考序列比較?？梢杂孟铝熊浖M行為了比較序列的最佳比對應(yīng)用缺省參數(shù)用Lasergene生物信息軟件套餐中的Megalign程序(DNASTAR，Inc.，Madison, WI)。此程序的實施已描述于下列參考文獻中的幾個比對方案Dayhoff，Μ. 0. (1978)A model of evolutionary change inproteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff, M. 0. (ed. ) Atlas of ProteinSequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol.5, Suppl.3, pp. 345-358 ；Hein J. ,1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626—645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA ；Higgins, D. G. andSharp, P. Μ. ,1989, CABIOS 5 151-153 ；Myers, Ε. W. and Muller W.，1988，CABIOS 4 :11-17 ；Robinson,Ε.D.，1971，Comb. Theor. 11 :105 ；Santou, N.，Nes, Μ.，1987，Mol. Biol. Evo 1. 4 :406-425 ；Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. ,1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice ofNumerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco, CA ；Wilbur,W.J. and Lipman,D. J. ,1983,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :726_730。理想的是，“序列等同百分比”的決定方法可以用在一個至少20位點的比較窗比較兩個最佳比對的序列。當(dāng)與對比序列(不包含增加或刪除)進行兩個序列的最佳比對時， 其中在比較窗內(nèi)的多肽序列部分可以包含增加或刪除(例如缺口)百分之20或更少，通常百分之5到15，或百分之10到12。此百分比的計算方法是決定兩個序列中在同位點等同氨基酸的數(shù)目以得到相配位置數(shù)，用此相配位置數(shù)除以在對比序列中總的位點數(shù)，所得結(jié)果再乘以100以得到序列等同百分比。AAT多肽異變體亦包括包含AAT多肽的融合蛋白。具有生物活性的AAT多肽可以融合于其他序列，這些序列可以促進將多肽結(jié)合于支撐或載體，或促進復(fù)性和/或純化(例如，抗原決定部位(印itopes)如Myc，從流感病毒紅血球凝聚素衍生的HA，His-6, FLAG,或 His-Tag)。這些序列可以融合于AAT多肽的N-端或C-端。另外，蛋白或多肽可以融合于其他增加功能的多肽，或確定在細胞中的定位，例如分泌序列。以上所述的生產(chǎn)重組融合蛋白的方法在所屬領(lǐng)域是熟知的。這些重組融合蛋白可以用所述的或其他所屬領(lǐng)域是熟知的方法生產(chǎn)，復(fù)性，和提純。AAT多肽的變異體也包括任何在這里所描述的融合蛋白實施物的連接物，例如， AAT多肽連接或融合于一個延長半衰期的部分，比如一個PEG或多肽。AAT異變體亦包括功能等同異變體。功能等同異變體可以用下列的一種或多種標(biāo)準(zhǔn)鑒別(a)抑制白細胞彈力蛋白酶(例如人白細胞彈力蛋白酶(HLE))活性的能力；(b)抑制豬胰彈力蛋白酶活性的能力；(c)抑制組織蛋白酶(cath印sin G(catG)(例如人catG)) 活性的能力；(d)抑制蛋白酶3 (proteinase 3(例如人活性的能力；和(e)防止HLE 造成的肺傷害。AAT多肽異變體的生物活性可以用本領(lǐng)域熟知的和下面所述的方法測驗。 在某些實施例中，功能等同異變體具有至少約任何的50 %，60 %，70 %，75 %，80 %，85 %， 90 %，或95 %的活性，此活性是通過與全長天然AAT比較，應(yīng)用一種或多種以上所描述的活性分析方法(或本領(lǐng)域熟知的方法)。B. AAT多肽復(fù)性方法本發(fā)明的方法是常規(guī)的應(yīng)用含有AAT多肽的包涵體生產(chǎn)AAT多肽的方法，所述包涵體是用經(jīng)改造用于生產(chǎn)AAT多肽的細菌(如大腸桿菌)細胞中形成的，但任何來源的變性的AAT多肽都可以應(yīng)用。此處所描述的方法亦可以用于生產(chǎn)任何所述的AAT異變體。所述AAT多肽可以依據(jù)實施者的期望，來源于任何合適的物種，來源于任何天然的或非天然的序列。圖1顯示成熟型人AAT基因的全長編碼序列。另外，改變的AAT基因，例如為提高在宿主細胞中表達而做出的“沉默”變化的基因(“最佳化”序列)，或具有一個或多個氨基酸序列變化的編碼突變體AAT多肽基因亦可以應(yīng)用。重組宿主細菌(如大腸桿菌)可以用任何方便的技術(shù)經(jīng)改造用來生產(chǎn)任何蛋白 (包括AAT蛋白和AAT異變體蛋白)。盡管也可使用基于噬菌體基因組DNA的表達載體，但最常見的是將編碼所需融合蛋白的DNA序列插入到提供合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的質(zhì)粒表達載體的適當(dāng)位點。盡管也可使用組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，但通常優(yōu)選可被宿主細胞周圍環(huán)境的改變(例如添加可引起轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列應(yīng)答的底物或假底物)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。另外作為本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，還優(yōu)選在表達載體中包含正篩選標(biāo)記(例如乳糖酶基因，其可引起氨芐西林抗性)，以便從不含表達載體的細菌宿主細胞中篩選出含表達載體的宿主細胞。本發(fā)明提供包含任何所述AAT蛋白和AAT異變體蛋白核苷酸編碼的多(聚) 核苷酸和籽粒。細菌宿主細胞一般在適合于宿主細胞和表達載體的條件下，在液體生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)以生產(chǎn)AAT多肽。理想的是，將宿主細胞在細菌發(fā)酵罐中培養(yǎng)以獲得最大產(chǎn)量，但其他任何簡便的培養(yǎng)方法也可接受(例如搖瓶，尤其是用于少于1升的培養(yǎng)物)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，精確的生長條件、培養(yǎng)基補料的時間和速度以及誘導(dǎo)劑的添加 (如果需要的話)應(yīng)根據(jù)宿主細胞和表達構(gòu)建體而改變。將細菌宿主細胞培養(yǎng)至所需要的密度(以及經(jīng)任何必須的表達誘導(dǎo))后，收集所培養(yǎng)的細胞。盡管可以采用任何其他方便的技術(shù)，但收集一般通過將生長培養(yǎng)基離心而方便的實現(xiàn)。所收集的宿主細胞可以在這一階段進行洗滌以除去痕量的生長培養(yǎng)基，最常用的方法是在一種簡單的緩沖液中重懸然后離心(或其他方便的細胞收集方法)。此后，所收集的細菌宿主細胞(“細胞糊狀物”)可以立即按照本發(fā)明進行處理，亦可以冰凍儲存至以后處理。將細胞糊狀物中的細胞裂解，使之釋放出含AAT多肽的包涵體。理想的是，在一定的條件下裂解，在所述條件下細胞殘片可以被充分破碎，以至于在低速離心時不會在沉淀中出現(xiàn)。通常情況下，將細胞在約PH 5到9(優(yōu)選約6到8)的緩沖液中懸浮，并使用約0.01 到2Μ(優(yōu)選約0. 1到0. 2Μ)離子強度(使用基本上為0的離子強度顯然是不合適的)?？捎萌魏魏线m的鹽(包括NaCl)來維持適當(dāng)?shù)碾x子強度水平。懸浮于上述緩沖液后，將細胞利用常規(guī)技術(shù)裂解，例如機械方法如凍/融循環(huán)，使用Manton-Gaulin壓碎機、弗氏壓碎機或超聲震蕩器，或者通過化學(xué)或酶學(xué)方法諸如用溶菌酶處理。通常期望在低溫條件下(即低于20°C )進行細胞裂解和細菌細胞收集?？梢岳萌魏畏奖愕募夹g(shù)(例如離心)從裂解的細胞糊狀物中收集包涵體，然后洗滌。如果需要，可以洗滌收集的包涵體。包涵體的洗滌一般是通過在洗滌緩沖液中重懸， 然后再將包涵體重新收集來進行，其中所述的緩沖液一般為裂解緩沖液，優(yōu)選其中加有去污劑(例如TRITON X-100 )。其后，將洗滌過的包涵體在溶解緩沖液中溶解。溶解緩沖液含有高濃度的離液劑、將溶液緩沖至高PH的pH緩沖劑以及一種或多種還原劑。溶解緩沖液還可以任選含有其他試劑，如氧化還原劑、陽離子螯合劑以及用于中和可破壞蛋白質(zhì)的自由基的清除劑。本發(fā)明的溶解緩沖液使用尿素作為示例性的離液劑，但也可以使用鹽酸胍。溶解緩沖液中尿素的實用濃度包括約5M到約8. 5M、約6M到約8. 5M、約7M、或約8M。當(dāng)離液劑為鹽酸胍時，實用濃度包括約4M到8M，或約5. 5M到約6. 5M，或約6M。溶解緩沖液的pH可以較高，即高于pH 8. 0，例如pH 9. 0。溶解緩沖液的實用pH水平為約8. 0到約11. 0，約9. 0到約11. 0，約9. 5到約10. 5，約10. 0到約10. 5，約10，約10. 5， 或約10.8。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，盡管可以在約pH 8到約pH 9或10之間起緩沖作用的PH緩沖劑尤其有用，但任何在高pH下能有效起緩沖作用的pH緩沖劑(或緩沖劑的組合)都是有用的。有用的PH緩沖劑包括Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)、BiCine(N， N-雙(2-羥乙基)甘氨酸)、HEPBS (N- (2-羥乙基)哌嗪-N' (4- 丁磺酸)、TAPS ([ (2-羥基-1，1-雙[羥甲基]乙基)氨基]-1-丙氨酸)，AMPD (2-氨基-2-甲基_1，3_丙二醇) 等等。加入的PH緩沖劑的濃度應(yīng)提供有效的pH緩沖作用，例如從約50到約150mM，約75 到約125mM，或約lOOmM。溶解緩沖液中包含還原劑以還原二硫鍵并維持半胱氨酸殘基的還原形式?？梢允褂玫倪€原劑包括巰基乙醇、二硫蘇糖醇，或類似的還原劑等。溶解緩沖液還可以包括其他成分。例如，溶解緩沖液可以包含陽離子螯合劑如雙價陽離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)。EDTA 或EGTA可以加入到溶解緩沖液中，其濃度為約0. 5到約5mM，通常為約ImM。另外，溶解緩沖液中亦可以含有自由基清除劑以減少或消除自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)破壞，尤其當(dāng)使用尿素作為離液劑且預(yù)期將含有尿素的蛋白質(zhì)溶液儲存相當(dāng)長的時間時。適宜的自由基清除劑包括甘氨酸(例如濃度約為0. 5至約2mM，或約ImM)以及其他氨基酸和氨類化合物。溶解緩沖液II的示例之一由下列濃度的化合物組成約8M尿素，約0. IM Tris, 約ImM甘氨酸，約IOmM β -巰基乙醇，約IOmM 二硫蘇糖醇(DTT)，和約ImM還原型谷胱甘肽 (GSH)，約 ImM EDTA，pH 約 10. 5。另一個溶解緩沖液II的示例由下列濃度的化合物組成約8Μ尿素，約0. IMTris, 約ImM甘氨酸，約IOmM β -巰基乙醇，約IOmM 二硫蘇糖醇(DTT)，和約ImM還原型谷胱甘肽 (GSH)，約 ImM EDTA, pH 約 8. 5 到約 10. 0.將包涵體/溶解緩沖液混合物孵育以使其完全溶解。孵育時間通常從約6小時到約M小時，且更慣常的從約8小時到約14小時或約12小時。包涵體/溶解緩沖液混合物的孵育可以在低溫下進行，通常在約4°C到約10°C下進行。待孵育完成后，將包涵體/溶解緩沖液混合物澄清以除去不溶性殘渣?；旌衔锏某吻蹇梢酝ㄟ^任意一項便利的方法完成，例如過濾(如通過使用深芯濾器)或離心。澄清應(yīng)在低溫下進行，例如在約4°C到約10°C下進行。隨后將澄清的混合物稀釋至合適的蛋白質(zhì)濃度以利于復(fù)性。蛋白濃度可以利用任意一項方便的技術(shù)確定，例如Bradford測定法、280nm光吸收(A28tl)等等。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的方法中使用A28tl為約2. 0到約10. 0(例如，下列任何的大約濃度2. 0,3. 0,4. 0， 5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0，和10. 0)的溶液都是合適的。例如，蛋白的最終濃度在2mg/ml是合適的。盡管混合物一般不會保存超過4周，但如果需要，該混合物可以冷藏(例如在4°C下) 保存等待以后處理。一個示例性的溶解緩沖液II由下列濃度的化合物組成約8M尿素，約 0. IM TrisJ々ImM甘氨酸，約IOmM β -巰基乙醇，約IOmM 二硫蘇糖醇(DTT)，和約ImM還原型谷胱甘肽(GSH)，約ImM EDTA。為調(diào)節(jié)用的溶解緩沖液II的pH可以與溶解包涵體的溶解緩沖液相同。將調(diào)整濃度后的包涵體溶液首先快速稀釋于復(fù)性緩沖液中。稀釋的過程可以用將包涵體溶液加入到復(fù)性緩沖液中的方法進行?？蓪w溶液用復(fù)性緩沖液稀釋約10倍到約100倍，約10倍到約50倍，約10倍到約25倍，約15倍到約25倍，或約20倍。稀釋包涵體溶液的過程降低了尿素和蛋白質(zhì)濃度，在此過程中失活的蛋白質(zhì)(包涵體)被復(fù)性。 稀釋后的蛋白質(zhì)終濃度可以從約0. 01mg/ml到約lmg/ml，約0. lmg/ml到約0. 5mg/ml。
復(fù)性緩沖液中可含有能夠緩沖pH的緩沖液及0種、1種、或多種助復(fù)性化合物。復(fù)性緩沖液中亦含有甘油，糖(如蔗糖和麥芽糖)，或聚乙二醇(PEG)，或這些化合物的任何組合。包含在復(fù)性緩沖液中的甘油的濃度可以為約5%到約30^34 5^^1^4 20 ^在某些實施例中，在復(fù)性緩沖液內(nèi)甘油的濃度為約10%或30%。復(fù)性緩沖液可以包含約10%到約30%的蔗糖，例如約25%。在某些實施例中，復(fù)性緩沖液含有約15%的蔗糖，約10%的甘油和約10%的蔗糖，或約20%的甘油和約20%的蔗糖。為了幫助復(fù)性和保持復(fù)性蛋白的穩(wěn)定，復(fù)性緩沖液亦可以包含聚乙二醇(PEG)，例如，分子量為從約200到約20，000道爾頓，約5%到約10%的PEG可以包含于復(fù)性緩沖液中。在某些實施例中，PEG的分子量為約 200道爾頓，約300道爾頓，約400道爾頓，約600道爾頓，約10000道爾頓，或約20，000道爾頓。復(fù)性緩沖液中亦可以包含低濃度的離液劑，還原劑，和雙價陽離子螯合劑。復(fù)性緩沖液中亦可以進一步包含附加的試劑，如自由基清除劑。在某些實施例中，將包涵體溶液快速的稀釋到復(fù)性緩沖液中。文中所述的“快速” 稀釋是指稀釋過程在短于約25分鐘內(nèi)進行，并且稀釋過程通常是在約2分鐘到約25分鐘， 或約5分鐘到約20分鐘。在快速稀釋過程完成后，通常將稀釋的溶解的AAT多肽溶液保持 1-2小時。復(fù)性緩沖液的pH可以與溶解緩沖液的相同或不同。復(fù)性緩沖液中的pH緩沖劑可以是任何在PH約為8至約為9或約為10或約為10. 5的水平下有效的緩沖劑或緩沖劑的組合。有用的PH緩沖劑包括Tris (三(羥甲基)氨基甲烷)，BiCine(N，N-雙(2-羥乙基) 甘氨酸)，HEPBS (N-(2-羥乙基)哌嗪-N' (4-丁磺酸)，TAPS ([ (2-羥基-1，1-雙[羥甲基]乙基)氨基]-1-丙氨酸)，或々1^)(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)等等。加入的pH 緩沖劑的濃度應(yīng)提供有效的PH緩沖作用，例如從約10到約150mM，約50到約125mM，或約 IOOmM0雙價陽離子螯合劑可以是任何可以有效螯合Ca++和其他雙價陽離子的分子。示例性的用于復(fù)性緩沖液中的陽離子螯合劑包括乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)。當(dāng)用EDTA或EDTA為雙價陽離子螯合劑時，它們在復(fù)性緩沖液中的濃度為約0. 5至約5mM，通常為約ImM。復(fù)性緩沖液中也可以包含一種或多種去污劑，例如吐溫-20，吐溫-80，脫氧膽酸鈉，膽酸鈉，和氧化三甲胺(TMAO)。例如復(fù)性緩沖液可以包含從約0. 001%到約0. 02% (如約0. 005%到約0. 02% )濃度范圍的吐溫-20或吐溫-80。在另一個例證中，復(fù)性緩沖液可以包含約0. 1 %的脫氧膽酸鈉，約0. 1 %的膽酸鈉，或0. 025%的ΤΜΑ0?？捎糜趶?fù)性緩沖液中的其他成分包括自由基清除劑?？梢约尤胱杂苫宄齽┮詼p少或消除自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)損壞，尤其當(dāng)使用尿素作為離液劑且預(yù)期將含有尿素的蛋白質(zhì)溶液儲存相當(dāng)長的時間時，合適的自由基清除劑包括甘氨酸(例如大約0. 5至約2mM，或約 ImM)。一個示例性的復(fù)性緩沖液包含約20mM Tris，約10%甘油或約15%蔗糖，pH約 10. 5或約8. 5。另一個示例性的復(fù)性緩沖液包含約20mM Tris,^ 5%到約10% PEG，pH約 10. 5 或約 8. 5。在某些實施例中，利用適當(dāng)?shù)乃釋⑾♂尩娜芙獾腁AT多肽溶液的pH從高pH緩慢降低至約中性pH。在某些變更中，pH被降低至約7. 5到約8. 5 (例如，到約pH 8)。降低pH所用時間為約20-24小時到約10天，約20到約50小時，約20到約40小時，約20到約30 小時，約M到約40小時。降低pH所用時間至少為約20小時，至少為約M小時，至少為約 30小時，至少為約40小時，至少為約48小時，至少為約50小時，至少約4天，至少約5天， 至少約6天，至少約8天，至少約10天。在某些實施例中，降低pH所用時間為約2-5天。 在某些實施例中，降低PH所用時間為約6-10天。在某些實施例中，降低pH所用時間為約 10-15天。用于調(diào)節(jié)pH的合適的酸取決于復(fù)性緩沖液中使用的pH緩沖劑。例如，當(dāng)緩沖劑為Tris時，應(yīng)使用鹽酸(HCl)調(diào)節(jié)pH。pH調(diào)節(jié)完成后，將復(fù)性反應(yīng)孵育約1至2個小時到約18至M個小時。根據(jù)操作者的選擇和可利用的條件，復(fù)性反應(yīng)及孵育可以在室溫(例如約18-20°C )或稍微降低的溫度(例如約14-16°C )下進行。在另外的實施例中，在所用復(fù)性緩沖液的pH為約8. 5到約10的情況下，在約16°C 到約20°C孵育稀釋的溶解的AAT多肽溶液至少約16小時，然后再在4°C孵育約M小時到約72小時。下一步將AAT多肽溶液交換到pH約7. 5到約8. 5的緩沖液中。此緩沖液可以與復(fù)性緩沖液的劑型相同。緩沖液交換可以用透析或分子排阻層析法進行。在緩沖液交換前，可以將樣品濃縮(例如用超濾法)。在某些實施例中，所用復(fù)性緩沖液的PH為約8. 5， 溶液在約16°C到約20°C孵育16小時。在進行純化之前，復(fù)性的AAT多肽可以在4°C保存 2-7 天。復(fù)性反應(yīng)后，將正確復(fù)性的AAT多肽濃縮和進一步純化。復(fù)性蛋白質(zhì)的濃縮可以利用任何方便的技術(shù)完成，例如超濾、透析、層析(如離子交換層析、疏水相互作用或親和層析)等等。在可行的情況下，濃縮步驟優(yōu)選在低溫(例如約4-10°C)下進行。如果需要， 濃縮步驟亦可以包括緩沖液交換，以在蛋白純化前交換成期望的一定濃度的緩沖液及鹽， 或者調(diào)節(jié)，交換，及去除復(fù)性緩沖液中的去污劑。通常任何方便的蛋白純化方案都可以在此應(yīng)用。在某些實施例中，兩種層析方法可以用于純化。例如分子排阻層析(SEC)和/或離子交換層析可以在此應(yīng)用。在某些變更中，復(fù)性的AAT多肽可以從雜質(zhì)中純化出來。例如，AAT多肽可以從可能干擾其治療應(yīng)用的雜質(zhì)中純化出來。雜質(zhì)可以包括酶，激素，或其他細菌細胞或細胞培養(yǎng)液來源的蛋白或非蛋白物。在某些變更中，復(fù)性的AAT多肽可以純化至高于任何的由重量測量的約70 %，約75 %，約80 %，約85 %，約90 %，約95 %，和約99 %。蛋白組合物的純度可以用任何本領(lǐng)域熟知的方法確定，例如Lowry方法，氨基酸序列分析法，及用考馬斯藍或銀染的還原或非還原的SDS-PAGE。在某些變更中，可用切向流過濾法濃縮復(fù)性的蛋白和分子排阻層析(SEC)純化濃縮的蛋白?？梢杂萌魏畏奖愕目梢詫⒄_復(fù)性的AAT多肽與非正確復(fù)性的或非復(fù)性的AAT多肽分開的層析介質(zhì)進行分子排阻層析(SEC)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)具有分離蛋白分子量約IO4到約6X105道爾頓的介質(zhì)皆可以應(yīng)用于此步驟。示例性的SEC介質(zhì)包括kphacryl-300和Superdex-75。如果需要，此步驟亦可用于進行緩沖液交換。確切的SEC條件依賴于所選擇的層析介質(zhì)，是否進行緩沖液交換，下步純化步驟的需求，和其他本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的因素。正確復(fù)性的AAT多肽可以進一步用離子交換層析純化，例如用示例3中顯示的 HiTrapQ XL陰離子交換柱。正確復(fù)性的AAT多肽可以進一步在高鹽下用疏水交換層析與非正確復(fù)性的AAT多肽分離，所述疏水交換層析包括，例如苯基瓊脂糖凝膠(phenyl-s印harose)層析，丁基瓊脂糖凝膠(butyl-s印harose)層析，及辛基瓊脂糖凝膠(octyl-s印harose)層析等。在一定的鹽濃度下(例如約0. 25到約1. 2M的(NH4)2SO4,或約1. 5到約3. 5M的NaCl)，不正常復(fù)性的或非正確復(fù)性的AAT多肽與樹脂結(jié)合，但正確復(fù)性的AAT多肽從樹脂流過。例如， (NH4)2SO4和NaCl等鹽可以在此應(yīng)用。在一個實施例中，將在20mM Tris, IM(NH4)2SO4, 7. 5% 蔗糖，0.005%吐溫-20，ImM DTT，pH 7. 6中的AAT多肽上樣于苯基瓊脂糖凝膠柱，然后在流出液餾分中收集到含有正確復(fù)性的AAT多肽。可以對復(fù)性的AAT多肽進行修飾以增加其在個體(如人)體內(nèi)的半衰期。例如， 可以對AAT多肽聚乙二醇化(pegylation)以最低限度的減少失活及降低體內(nèi)清除。任何已知的聚乙二醇化方法都可以應(yīng)用。例如請見Cantin et al.，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27 :659-665,2002 ；Travis et al. ,Methods Enzymml· 80 :754-766,1981 ；Reberts et al. ,Advanced Drug Delivery Reviews 54 :459-476, 2002o 4
個聚乙二醇化方法。在某些實施例中，應(yīng)用分子量約20到約40kD的PEG對AAT多肽進行聚乙二醇化。在某些實施例中，PEG具有分子量約21kD。在某些實施例中，PEG分子被連接到AAT多肽的CyP2上，其中CyP2的氨基酸序列值是根據(jù)SEQ ID NO :1的序列系統(tǒng)。與沒有修飾的AAT多肽相比，修飾的AAT多肽的半衰期可以增加至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約50%，至少約100%，至少約2倍，至少約5倍，至少約10倍。由按照本發(fā)明方法生產(chǎn)的復(fù)性的AAT多肽的生物活性可以利用任何可接受的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的活性測定方法進行測定。例如見=Cantin et al. , Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27 :659-665, 2002 ；Travis et al.，Methods Enzymml. 80 :754_766，1981。示例 3描述了一個測定AAT多肽活性的示例性的方法此例用合成底物測量了抑制人白細胞彈力蛋白酶(HLE)和豬胰彈力蛋白酶的體外活性。其他活性測定方法包括將AAT多肽和HLE 應(yīng)用于動物，然后測量由AAT多肽的抗-HLE活性所產(chǎn)生的對肺的保護=Cantin et al.， Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27 :659_665，2002。例如，可以將AAT多肽對小鼠進行鼻腔滴注，然后滴注HLE。用血紅蛋白含量作為指數(shù)來確定HLE-居間的肺傷害=Cantin et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157 :464-469,1998。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以充分理解的是，所有濃度和pH值均無需精確，并且對某一給定值的參考反應(yīng)了本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，但并不意味著該數(shù)值不能改變。C.藥物組合物、治療應(yīng)用和藥劑盒本發(fā)明也提供所述的包含有生物活性的AAT多肽組合物(包括藥品組合物)。此組合物亦可以包含藥用賦形劑。AAT多肽可以是凍干制劑或液體制劑的形式。藥用賦形劑是在所用的藥量和濃度下對使用方無毒，可以包含緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽；鹽如氯化鈉； 糖如鹿糖；及 / 或聚乙二醇(PEG)。見 Remington :The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed. (2000)Lippincott Williams and ffilkins, Ed. K. E. Hoover0 可以制備出不同給藥途徑的AAT多肽制劑，如為靜脈注射(IV)的液體或凍干制劑，及為深肺給藥的干粉制劑或氣化制劑。這些試劑對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。見，例如，“DrugDelivery to the Lung, Bisgaard H. , 0' Callaghan C and Smaldone GC, editors, New York ；Marcel Dekker,2002”。本發(fā)明所述AAT多肽可以用此處所描述的任何方法制備。在某些實施例中，AAT多肽從細菌(如大腸桿菌)包涵體產(chǎn)生。在某些實施例中，AAT多肽是非糖基化的。在某些實施例中，AAT多肽具有至少約任何80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，和99%的純度。 在某些實施例中，AAT多肽的比活力(例如用豬胰彈力蛋白酶抑制測定)每毫克總蛋白不少于約任何 0. 3,0. 35，0. 4，0. 45，0. 5，0. 55，0. 6，0. 65，0. 7，0. 75，0. 8，0. 85，0. 9，和 0. 95 毫克的活性AAT多肽。本發(fā)明也提供包含所述AAT多肽的治療應(yīng)用藥劑盒。本發(fā)明的藥劑盒包含一個或多個含有AAT多肽的容器。此容器可以是小藥水瓶，瓶子，廣口瓶，或靈活的包裝。例如，AAT 多肽可以用一次性應(yīng)用的小藥水瓶包裝，每瓶含有500毫克或1，000毫克的活性AAT多肽。 此藥瓶可以有一個無菌通入口(例如一個可以被皮下注射針頭刺穿的瓶塞)。另外可預(yù)期的是用特殊裝置組合起來的包裝，例如吸入器，鼻給藥裝置(例如噴霧器)或輸入裝置如微泵。至少一種活性藥劑是AAT多肽。此藥劑盒也可以進一步包括第二個藥物的有效成分。 包裝容器中亦可以包含根據(jù)本發(fā)明所描述方法的應(yīng)用說明書。一般地，這些說明書包括根據(jù)本發(fā)明所描述方法的用AAT多肽治療疾病的應(yīng)用方法說明。此說明書可以進一步包括應(yīng)用AAT多肽治療疾病的說明，例如，治療與AAT缺乏有關(guān)的疾病。說明一般包括使用劑量， 使用時間，和治療所述疾病的應(yīng)用途徑。本發(fā)明藥劑盒提供的使用說明一般在標(biāo)簽上或說明書上(例如包含于試劑盒中的紙張上)書寫說明，但機器可讀的說明(例如裝載于磁片上或光盤上的說明)亦可以接受。此藥劑盒也可以包括干粉或噴霧器肺部給藥的裝置。下列實施例提供例證，但不限制本發(fā)明。
實施例實施例1用降低pH方法復(fù)性重組AAT多肽質(zhì)粒構(gòu)造和表達。用PCR擴增法得到編碼Δ 5-ΑΑΤ多肽(SEQ ID NO 3)的DNA片斷(SEQ ID NO 4)。Δ 5-ΑΑΤ多肽缺乏圖1顯示的SEQ ID NO :1所示的1_5氨基酸序列，并在起始位置人工附加了蛋氨酸以促進在大腸桿菌中表達。編碼Δ5-ΑΑΤ多肽的DNA多(聚) 核苷酸序列為了在大腸桿菌中最佳表達已經(jīng)進行了優(yōu)化。為了蛋白表達，將上述PCR產(chǎn)物克隆于包括多克隆位點的修飾的PETlla籽粒。在PCR，連接，和轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)菌株后， 選擇單克隆菌落擴增，并最終對所選擇的載體進行DNA序列測定，以保證得到正確的DNA序列。所得載體為PETl 1- Δ 5-ΑΑΤ。用DNA片斷(SEQ ID NO :2)構(gòu)建表達全長人AAT或缺乏SEQ ID N0:1中1-10， 但在起始位置附加蛋氨酸的△ 10-AAT多肽載體的方法與以上所描述的相同。所得載體為 pETIl-AAT 禾口 pETll-Δ 10-MT。將ρΕΤ11-Δ5_ΑΑΤ，pETll-AAT，和 ρΕΤ11-Δ 10-ΑΑΤ 表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)菌株內(nèi)，表達和包涵體純化基本按發(fā)表的程序進行(Kim，YT et al. 2002 Eur JBiochem 269 :5668-5677 ；Lin, XL et al. 1994 Methods Enzymol 241 :195-224 ；Lin, X U. S. Pat. No. 6，583，268)，并簡要描述如下。將轉(zhuǎn)化的細菌鋪在含有氨芐西林的觀平板上。 選擇單個菌落并用其接種含有氨芐西林的IOOml觀培養(yǎng)基(10g/L NZ-胺-A (SIGMA)和5g/ L NaCl)，并在37°C生長過夜(約16小時)。將IOOml起始培養(yǎng)物中的20ml再接種至IL 含氨芐西林的LB培養(yǎng)基，并將其在37 °C震搖溫育至600-nm的光密度(0D_)達到0. 4-0. 6。然后加入異丙基硫代- β -D-半乳糖苷(IPTG)至0. 5mM以誘導(dǎo)AAT表達，并將培養(yǎng)基繼續(xù)搖動3個小時。用多個IL培養(yǎng)瓶及高密度發(fā)酵罐法可進行大量表達。pETIl-AAT的表達水平非常低，但ρΕΤΙΙ-Δ 5-AAT和ρΕΤΙΙ-Δ 10-ΑΑΤ的表達水平達到了可以接受的水平。復(fù)性之前的包涵體處理從細菌收集包涵體。通過離心收集細胞，然后在含有 Triton-X-100 的 20ml TN(150mM NaCl,50mM Tris,pH 8.0)中懸浮。向其中加入 IOmg溶菌酶，并將細胞懸浮在_20°C冰凍過夜。然后將裂解物溶化并加入20 μ 1 IM硫酸鎂和100 μ 1 0. 01mg/ml DNAase0攪動細胞，并將其溫育至釋放的DNA完全溶解。其后用250ml含有1 % Triton-X- 100 的TN稀釋裂解物并攪動混合2_4小時。通過離心收集包涵體，并將其繼續(xù)洗滌3次(通過重懸浮和離心)。不言而喻，所收集的包涵體中含有AAT多肽。AAT多肽的復(fù)性。將洗滌的包涵體溶于含高濃度尿素的溶解緩沖液(8M尿素， 0. IM Tris，lmM 甘氨酸，ImM EDTA, IOOmM β -巰基乙醇(β-ME)，pH 10. 5)中，溶解于高 OD280(20-40)，并在4°C緩慢的攪動12小時。溶解的樣品超速離心(30分鐘x66，OOOg)澄清以去除不溶解的雜質(zhì)，然后用溶解緩沖液II (8M尿素，0. IM 1^8，11111甘氨酸，11111^014，101111 β -巰基乙醇(β -ME)，IOmM 二硫蘇糖醇(DTT)，ImM還原的谷胱甘肽(GSH)，pH 10. 5)將溶解的包涵體的OD28tl調(diào)至2. O。將上述溶解的包涵體快速沖稀至20倍體積的復(fù)性緩沖液OOmM Tris, 10%甘油， PH 10. 5)中，其稀釋后的最后OD28tl為0. 1。稀釋后，用IM HCl將溶液的pH在2_4天內(nèi)，逐步的調(diào)到7. 6。其他試驗過的復(fù)性方法包括在復(fù)性緩沖液中用高濃度的甘油(20% )，或用20% 蔗糖取代甘油，或同時用10%蔗糖和10%甘油。在某些實驗中，吐溫-20(0. 005%-0. 01%) 也被包含在復(fù)性緩沖液中。所有這些條件都產(chǎn)生了正確復(fù)性的(有活性的)AAT多肽。實施例2用固定pH方法復(fù)性重組AAT多肽用固定pH法對表達的AAT多肽包涵體的復(fù)性。將實施例1中得到的洗滌的包涵體溶于含高濃度尿素的溶解緩沖液(8M尿素，0. IM 1TrisamM甘氨酸，ImM EDTA, IOOmM β-巰基乙醇(β_ΜΕ)，ρΗ 10. 5)中，溶解于高OD28tl 00-40)，并在4°C緩慢的攪動12小時。溶解的樣品超速離心(30分鐘x66，OOOg)澄清以去除不溶解的雜質(zhì)。然后用溶解緩沖液II (8M尿素，0. IM Tris, ImM甘氨酸，ImM EDTA, IOmM β -巰基乙醇(β -ΜΕ)，IOmM二硫蘇糖醇(DTT)， ImM還原的谷胱甘肽(GSH)，pH 10.5)將溶解的包涵體的OD28tl調(diào)至2. O。將上述溶解的包涵體快速沖稀至20倍體積的復(fù)性緩沖液QOmM 1^化，10%甘油，？!1 8. 5)中，其稀釋后的最后OD28tl為0. 1。將稀釋的溶液于20°C保存16小時，然后在進行實施例3所描述的濃縮，緩沖液交換和純化前，于4°C保存2-7天。實施例3復(fù)性的重組AAT多肽的純化和生物功能測定將按照實施例1所述生產(chǎn)的Δ 5-AAT多肽和Δ IO-AAT多肽通過超濾 (MilliporePellicon，30, OOO 截流膜)濃縮并通過超速離心(Beckman LE-80K，Type 70 Ti rotor，30，000rpm，30分鐘)以去除多余的不可溶殘駭。將得到的上清液上樣于用緩沖液(含 20mMTris，0. 2M NaCl，15 %蔗糖，0. 005 % Tween 20, ImM DTT，pH 7.6)平衡的5. 0x90-cm Superdex 75 (Amersham) SEC 柱。通過此柱將單體 Δ 5-AAT 多肽和 Δ IO-AATgJft 從錯誤復(fù)性的多聚多肽中分離出來。從分離柱中收集IOml的餾分，然后用A28tl和SDS-PAGE 分析。下一步將單體的部分純化的餾分合并，上樣于一個用Wiarmacia AKTAFPLC HiTrap Q XL陰離子交換柱(GE Healthcare)，在20mM MES pH 6. 2含有ImMDTT的緩沖液中用 O-IOOOmM NaCl鹽梯度洗脫。用非還原SDS-PAGE分析所述陰離子色層析餾分，然后將高度純化的餾分合并。合并樣品的濃度用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的光度法(A28tl)確定。如圖3所示，此方法生產(chǎn)和純化了幾乎同質(zhì)的Δ5-ΑΑΤ多肽和Δ 10-ΑΑΤ多肽(在 10%甘油復(fù)性緩沖液中復(fù)性)。復(fù)性和純化的Δ5-ΑΑΤ多肽和Δ 10-ΑΑΤ多肽的對蛋白酶抑制的性質(zhì)通過對人白細胞彈力蛋白酶(HLE)和豬胰彈力蛋白酶(PPE)的抑制作用進行了鑒定，并與從市場得到的從人血漿分離的全長糖基化的ΑΑΤ(購買于Calbiochem，San Diego, Calif. Cat. #178251)進行了比較。從豬胰中純化的 PPE 從 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.， cat. #E7885)購買；而從人唾液中純化的 HLE 從 Molecular Innovations (Southfield, Mich. Cat#HNE)購買。將濃度為0. 3nM至14nM范圍的人Δ 5-AAT多肽或市場購買的從人血漿分離的全長糖基化的AAT與固定于1. 4nM濃度的HLE或PPE在37°C孵育15分鐘，然后取出部分孵育液與ImM的彈力酶底物混合，所述底物為N-succinyl-ala-ala-ala-p-ni troanilide (PPE ^ fe / ^lJ ) N-methoxy-succinyl-ala-ala-pro-val-p-nitroanilide (HLE 發(fā)色底物)。用 MolecularDevices Spectrophotometer (Spectramax Plus)監(jiān)測底物水解動力學(xué)。確定每一個反應(yīng)的起始速度，然后再計算相對于對比樣品(no AAT or AAT polypeptides)的活性百分比。繪出所述彈力酶的活性百分比對應(yīng)于在相應(yīng)反應(yīng)中AAT多肽彈力蛋白酶濃度的化學(xué)當(dāng)量分子比的反應(yīng)圖。實驗所用的每一個形式的AAT多肽，PPE， 和HLE的精確濃度皆在實驗之前確定，確定方法是用從ExPASY蛋白組服務(wù)器(http://www. expasy. ch)內(nèi)ProtParam軟件程序所提供的每一個蛋白或多肽的已知消光系數(shù)。如圖4所示，實施例1所述復(fù)性的Δ 5-AAT多肽顯示了對HLE和PPE活性的抑制， 而且此抑制可以與市場獲得的人血清AAT相比。實施例2所述復(fù)性的Δ5-ΑΑΤ多肽，及實施例1和2所述復(fù)性的Δ 10-ΑΑΤ多肽亦顯示了阻礙HLE和PPE活性的功能。實施例4復(fù)性的重組AAT多肽的聚乙二醇化(pegylation)首先將在緩沖液20mM MES,200mM NaCl, ImM DTT，pH 6. 2中的實施例1和3所述復(fù)性及純化的Δ 5-AAT多肽進行緩沖液交換，其目的是除去還原劑DTT及交換成Pegylation 反應(yīng)所需緩沖液。緩沖液交換通過PD-10 (BioRad)去鹽柱層析進行，此柱先用50mM NaPi, 200mM NaCl, pH 7. 5緩沖液平衡，然后按制造商的說明書上樣和純化。因為還原劑DTT干擾pegylation反應(yīng)，所述緩沖液交換通常進行兩次以確保樣品中沒有微量的DTT存在。用摩爾消光法定量Δ5-ΑΑΤ多肽。將在氬氣下儲存于_20°C的固體PEG-mal20(大約分子量 21KDa 白勺 polyethylene glycol maleimide 20, ^ftiHT Nektar, Huntsville, Ala.)以 @ 5 : 1至10 : 1的分子比加入到緩沖液交換后的Δ 5-AAT多肽的溶液中，并在37°C孵育30 分鐘。用加入20mM DTT并繼續(xù)在37°C孵育5分鐘的方法終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物用水稀釋至少4倍，以將反應(yīng)液的鹽度降至50mM NaCl以下，然后上樣于HiTrap Q陰離子交換柱， 以將聚乙二醇化和非聚乙二醇化的AAT多肽分開。聚乙二醇化的AAT多肽對HiTrap Q陰離子交換柱的親和力低于非聚乙二醇化的AAT多肽。這兩種形式的AAT在洗脫過程中，于不同的鹽梯度餾分中被選擇性的分開。聚乙二醇化反應(yīng)的成功用SDS-PAGE (圖5A)和MALDI-T0F質(zhì)譜分析(圖5B)確定。 圖4顯示所述聚乙二醇化的Δ 5-ΑΑΤ多肽對HLE和PPE酶活性的抑制。圖4和圖5Α和圖5Β 顯示Δ 5-ΑΑΤ多肽已經(jīng)被成功的聚乙二醇化，并且所述聚乙二醇化的Δ5-ΑΑΤ多肽在抑制 HLE和PPE酶活性方面的體外功能特性與非-聚乙二醇化的Δ 5-ΑΑΤ多肽等同。Δ 10-ΑΑΤ 多肽也已經(jīng)被成功的聚乙二醇化(圖3)，并且顯示保存了抑制彈力酶的活性。實施例5用苯基瓊脂糖凝膠(phenyl-s印harose)層析將正確復(fù)性的和不正確復(fù)性的及非復(fù)性的AAT多肽分離的方法進一步用疏水作用層析(HIC)，如苯基瓊脂糖凝膠層析，純化用如上所述方法純化的復(fù)性的 AAT 多肽。用含 20mM Tris，IM(NH4)2SO4,10%蔗糖，0. 005% Tween 20, ImM DTT, PH 7. 6的緩沖液平衡苯基瓊脂糖凝膠柱(GE Healthcare)。進一步用苯基瓊脂糖凝膠柱純化在實施例3中所述用分子排阻(SEC)柱和陰離子交換柱純化的復(fù)性的Δ5-ΑΑΤ多肽。將在平衡苯基瓊脂糖凝膠柱同樣的緩沖液中的復(fù)性的Δ5-ΑΑΤ多肽上樣到所述柱中。不正確復(fù)性的或非復(fù)性的Δ 5-ΑΑΤ多肽結(jié)合在柱中，而正確復(fù)性的Δ 5-ΑΑΤ多肽從柱中穿過并被收集和濃縮。所述柱然后用含20mM Tris，7. 5%蔗糖，0. 005%Tween20，lmM DDT，pH 7. 6的緩沖液洗脫，以收集不正確復(fù)性的或非復(fù)性的Δ5-ΑΑΤ多肽。用SDS-PAGE (圖6)分析從疏水作用層析柱中所收集的Δ5-ΑΑΤ多肽餾分。對用苯基瓊脂糖凝膠柱純化的Δ5-ΑΑΤ多肽進行活性測定，并將所測活性與kmaira α -蛋白酶抑制劑(人，來源Aventis Behring L. L. C)活性相比較。用反應(yīng)緩沖液(含20mM Tris, 38mM NaCl，0. 01 % Tween 20，pH 8. 8)將純化的八5^41~多肽沖稀至25(^8/^1。將PPE (豬胰彈力蛋白酶)溶于反應(yīng)緩沖液中，然后與不同濃度的Δ 5-AAT多肽或Zemaira α 1_蛋白酶抑制劑在37°C孵育15分鐘。將反應(yīng)混和液進一步用H2O沖稀，然后將底物P-ala-ala-ala (Sigma)加入以啟動PPE水解反應(yīng)。在96-孔板中反應(yīng)，用405nm光波監(jiān)測。圖7顯示不同濃度的復(fù)性的Δ 5-AAT多肽和kmaira對PPE 活性的抑制(繪制成AAT:PPE的化學(xué)計量學(xué))。圖8的數(shù)據(jù)表明復(fù)性和純化的Δ 5-ΑΑΤ多肽與Zemaira 具有相似的比活。實施例6用含有PEG，蔗糖或去污劑的復(fù)性緩沖液對重組AAT多肽復(fù)性試驗了含有PEG，蔗糖或去污劑的復(fù)性緩沖液。用實施例1所述的方法對 Δ5-ΑΑΤ多肽復(fù)性，除了所述復(fù)性緩沖液含有20mM Tris, pH 10.5，和下列任何一種 1) 1-10 % PEG(PEG200, PEG300, PEG400, PEG600, PEG1000,或 PEG3000，皆來源于 Sigma, U.S.A.) ；2) 10-20%蔗糖；和3) —種去污劑[如月桂酰肌氨酸鈉(源于Arresco)，脫氧膽酸鈉(NaDeCholate，源于Sigma)，膽酸鈉(NaCholate，源于Sigma)，十六烷基三甲基溴(cetyltrimethylammonium bromide,源于 Sigrna),環(huán)式糊精(β-cyclodextrin,源于Sigma)，嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68，源于Sigma)，和氧化三甲胺(TMS0，源于 Sigma)]。從測試復(fù)性的Δ5-ΑΑΤ多肽阻斷人白細胞彈力蛋白酶(HLE)或豬胰彈力蛋白酶的活性，在所有測試的PEk中，在復(fù)性緩沖液中包含10% PEG200或5% PEG600得到了最高的Δ5-ΑΑΤ多肽活性。在所測試的去污劑中，脫氧膽酸鈉(0. )，膽酸鈉(0. )，或
氧化三甲胺(0. 025% )促進Δ5-ΑΑΤ多肽復(fù)性，但效果較PEG略低。 盡管為了清除和易于理解的目的已通過圖解和實施例的方式對前述發(fā)明進行了
詳細描述，但是，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，該發(fā)明可以進行某些改變和修飾。因此，
上述描述和實施例不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書定義。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)復(fù)性的重組AAT多肽的方法，其特征在于包括a)用溶解緩沖液溶解變性的 AAT多肽，所述溶解緩沖液包含高濃度的離液劑和還原劑，并且其具有8. 5到11. 0的pH，由此產(chǎn)生溶解的AAT多肽溶液；b)通過將上述溶解的AAT多肽溶液加至復(fù)性緩沖液中的方法將上述溶解的AAT多肽溶液快速稀釋，由此產(chǎn)生稀釋的溶解的AAT多肽溶液，其中的復(fù)性緩沖液包含Tris、甘油、蔗糖、或聚乙二醇，或者上述的任何組合；及c)將稀釋的溶解的AAT 多肽溶液的PH降低至7. 5到8. 5，其中所述pH的降低用至少20小時完成，由此產(chǎn)生了復(fù)性的AAT多肽。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的AAT多肽包含SEQID NO :1的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的AAT多肽在SEQID NO=I的氨基酸序列殘基1-15中有一個或多個氨基酸殘基被刪除。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的AAT多肽包含從下組序列中所選出的氨基酸序列:SEQ ID NO 1 的氨基酸序列的 2-394，3-394，4-394，5-394，6-394，7-394， 8-394,9-394,10-394，和 11-394。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的AAT多肽包含SEQID NO :3的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的離液劑是尿素或鹽酸胍。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液包含5%至30%的甘油。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液包含5%至40%的蔗糖。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液包含分子量為200至 20, 000道爾頓的聚乙二醇。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述復(fù)性緩沖液還包含從下一組化合物中所選的去污劑吐溫-20，吐溫-80，脫氧膽酸鈉，膽酸鈉，和氧化三甲胺。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述溶解緩沖液和復(fù)性緩沖液的PH相同。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的溶解緩沖液包含8M尿素，0.IMTris, ImM甘氨酸，ImM EDTA, IOOmM β -巰基乙醇，并且其pH為9到10. 8。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于還包括在步驟b)之前用溶解緩沖液II調(diào)解溶解的AAT多肽溶液的A280到2. 0至10. 0。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述的溶解緩沖液II包含8M尿素，0.IM Tris，lmM甘氨酸，ImM EDTA, IOmM β -巰基乙醇，IOmM二硫蘇糖醇，和ImM還原的谷胱甘肽， 并且其PH為9到10.8。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將其中所述的溶解的AAT多肽溶液沖稀到二十倍體積的復(fù)性緩沖液中。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液包含20mMTris, ρΗΙΟ. 5， 和任何的下列成分1) 5 %至30 %甘油，2) 5 %至40 %蔗糖，3) 20 %甘油和20 %蔗糖，4) 10 % 甘油和10%蔗糖，和幻5%至10%聚乙二醇。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液還包含0.001%至0. 02% 的吐溫-20。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的變性的AAT多肽來源于細菌包涵體。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于還包括純化所述復(fù)性的AAT多肽。
20.生產(chǎn)復(fù)性的重組AAT多肽的方法，其特征在于包括a)用溶解緩沖液溶解變性的 AAT多肽，所述溶解緩沖液包含高濃度的離液劑和還原劑，并且其具有8. 5到11. 0的pH，由此產(chǎn)生溶解的AAT多肽溶液；b)通過將上述溶解的AAT多肽溶液加至復(fù)性緩沖液中的方法將上述溶解的AAT多肽溶液快速稀釋，由此產(chǎn)生稀釋的溶解的AAT多肽溶液，其中的復(fù)性緩沖液包含Tris、甘油、蔗糖、或聚乙二醇，或者上述的任何組合；c)將稀釋的溶解的AAT多肽溶液在16°C至20°C孵育至少16小時；d)進一步將稀釋的溶解的AAT多肽溶液在4°C孵育 24至72小時；及e)將稀釋的溶解的AAT多肽溶液交換成具有pH7. 5至8. 5的緩沖液，由此產(chǎn)生復(fù)性的AAT多肽。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的溶解緩沖液和復(fù)性緩沖液具有相同的pH。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于進一步包含在步驟e)之前將稀釋的溶解的 AAT多肽溶液濃縮的步驟。
23.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于用透析或分子排阻層析法執(zhí)行所述步驟e)。
24.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的溶解緩沖液包含8M尿素，0.IMTris, ImM甘氨酸，ImMEDTA，IOOmM β -巰基乙醇，并且其pH為8. 5至10. 5。
25.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于進一步包括在用復(fù)性緩沖液稀釋溶解的AAT 多肽溶液前用溶解緩沖液Π調(diào)節(jié)溶解的AAT多肽溶液的A28tl到2. 0至5. 0。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于所述的溶解緩沖液II包含8Μ尿素，0.IM Tris，lmM甘氨酸，ImM EDTA, IOmM β -巰基乙醇，IOmM二硫蘇糖醇，和ImM還原的谷胱甘肽， 并且其pH為8. 5到10. 5。
27.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于將其中所述的溶解的AAT多肽溶液沖稀到二十倍體積的復(fù)性緩沖液中。
28.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液包含20mMTris,pH10.5, 和任何的下列成分1) 5 %至30 %甘油，2) 5 %至40 %蔗糖，3) 20 %甘油和20 %蔗糖，4) 10 % 甘油和10%蔗糖，和幻5%至10%聚乙二醇。
29.權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的復(fù)性緩沖液還包含0.005 %至 0. 02%的吐溫-20。
30.將正確復(fù)性的AAT多肽從不正確復(fù)性的或非復(fù)性的AAT多肽中純化出來的方法，其特征在于此方法包括a)在鹽溶液中將不正確復(fù)性的或非復(fù)性的AAT多肽與疏水作用層析樹脂結(jié)合；和b)收集沒有同樹脂結(jié)合的正確復(fù)性的AAT多肽。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于其中所述的鹽是下列的任何一種硫酸銨， 氯化鉀，或氯化鈉。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于其中所述的鹽濃度是0.25M至1. 2M的硫酸銨，或1. OM至3. 5M的氯化鉀，或1. OM至3. 5M的氯化鈉。
33.包括權(quán)利要求1或權(quán)利要求18所述方法生產(chǎn)的復(fù)性的AAT多肽的組合物。
34.權(quán)利要求33所述的組合物，其特征在于其中還進一步包括藥用賦形劑。
35.權(quán)利要求33所述的組合物，其特征在于其中所述AAT多肽與聚乙二醇分子以化學(xué)修飾的方法結(jié)合。
36.包含利用權(quán)利要求1或權(quán)利要求18中所生產(chǎn)的復(fù)性的AAT多肽的治療AAT缺乏癥的藥劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供生產(chǎn)復(fù)性的α1-抗胰蛋白酶(AAT)的方法。復(fù)性方法包括首先將變性的重組AAT多肽在高pH的離液劑中溶解，接著是在所設(shè)定的條件下復(fù)性，復(fù)性過程包括在低濃度的離液劑和聚乙二醇(PEG)，甘油或蔗糖，或去污劑中緩慢的降低pH或者保持一定的pH。
文檔編號A61K38/55GK102206272SQ20091025820
公開日2011年10月5日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者藺新力 申請人:普羅特奧姆技術(shù)公司