專(zhuān)利名稱(chēng)：一種規(guī)?；a(chǎn)人α1-抗胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種規(guī)?；a(chǎn)人α I"抗胰蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
人α 1-抗胰蛋白酶是一種大約分子量為52000-55000道爾頓(Da)的糖蛋白。此蛋白是由幾個(gè)寡核苷酸共價(jià)連接的單鏈蛋白，它是一種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰彈性蛋白酶、血管緊張肽原酶、皮膚膠原蛋白酶、脲激酶和分葉核淋巴細(xì)胞蛋白酶。與α 1-抗胰蛋白酶缺乏直接相關(guān)的疾病主要是肺和肝臟疾病，慢性阻塞性肺病 (COPD)是一種常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病人數(shù)多，病死率高。其主要特征是慢性氣流阻塞，并呈進(jìn)行性發(fā)展，嚴(yán)重影響患者的勞動(dòng)能力及生活質(zhì)量。近來(lái)開(kāi)始應(yīng)用人α 1-抗胰蛋白酶治療由于α 1_抗胰蛋白酶缺陷引起的遺傳性疾病和后天獲得性α -抗胰蛋白酶缺陷性疾病，獲得了較好的治療效果。給予α -抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴細(xì)胞彈性蛋白酶。淋巴細(xì)胞彈性蛋白酶能破壞肺的外源蛋白。 當(dāng)α 1-抗胰蛋白酶缺失時(shí)，不能很好地調(diào)節(jié)彈性蛋白酶的活性，使彈性蛋白酶就破壞肺組織導(dǎo)致肺組織損傷引起肺氣腫，α 1-抗胰蛋白酶能成功的用于治療肺氣腫、慢性氣管炎和氣管炎等。由于用于治療的α 1-抗胰蛋白酶基本上是來(lái)源人血漿，原料來(lái)源有限，為了滿(mǎn)足臨床病人的需求，應(yīng)最大可能地提高血漿來(lái)源的α 1-抗胰蛋白酶收獲率，同時(shí)也要嚴(yán)格控制其純度?，F(xiàn)已公開(kāi)的人α -抗胰蛋白酶的生產(chǎn)方法，均提出收率高，但未公開(kāi)其每噸血漿的回收率，因此無(wú)法獲知規(guī)模化生產(chǎn)后制品的產(chǎn)量，而且實(shí)施例顯示均為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)，無(wú)法驗(yàn)證其能否實(shí)施規(guī)?；a(chǎn)。我公司經(jīng)過(guò)研究發(fā)明了一種規(guī)?；a(chǎn)人α 1-抗胰蛋白酶的方法，該方法以血液制品生產(chǎn)中的廢料組分IV-I沉淀為原料，用酒精和PEG先沉淀大部分雜蛋白，使α 1-抗胰蛋白酶的純度達(dá)到60% 70%，再采用兩步層析工藝，生產(chǎn)出高純度的α 1-抗胰蛋白酶，該生產(chǎn)工藝操作相對(duì)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本較低，制品的回收率高， 純度高，比活也比較高，適合工業(yè)化規(guī)?；a(chǎn)。而且制品的病毒滅活采用S/D滅活和巴氏滅活，對(duì)脂包膜病毒和非脂包膜病毒均有效，保證了產(chǎn)品的病毒安全性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種規(guī)?；a(chǎn)人α 1-抗胰蛋白酶的方法，產(chǎn)品的回收率高、純度高、比活高，可以工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)α 1-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步驟血漿加入生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān){(diào)整溶液的ρΗ值為7. 0 7. 4，加入乙醇至乙醇濃度為8% 10%，維持溫度-3 -1°C，離子強(qiáng)度0. 12 0. 14，攪拌，離心，得到上清I和沉淀 I ；上清I調(diào)整ρΗ值為6. 5 6. 9，加入乙醇至乙醇濃度為20% 25%，維持溫度為-5 -3V，離子強(qiáng)度0. 08 0. 10，攪拌，離心，得到上清II+III和沉淀II+III ；上清II+III調(diào)整pH值為5.0 5. 4，調(diào)整乙醇濃度為16 % 19%，維持溫度為-5 -3°C，離子強(qiáng)度0. 07 0. 09，攪拌，離心，得到上清IV-I和沉淀IV-1 ；沉淀IV-I用5 8倍緩沖液溶解，溫度-3 -l°c，加入冷乙醇至乙醇濃度為 8%~ 12%,pH5. 2 5. 6，攪拌，離心，離心液用0. 45 μ m的濾器過(guò)濾，取上清A ；上清A按10 1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐溫-80溶液(磷酸三丁酯的濃度為3. 3%和吐溫-80的濃度為11% )，使磷酸三丁酯的最終濃度為0. 3% (g/ml)，吐溫-80 的最終濃度為(g/ml)，在M 條件下，孵育6小時(shí)；然后加入PEG4000至其濃度為10% 15% (g/ml)，調(diào)整溶液的pH值為5. 0 5. 5，溫度為-1 1°C，離心，取上清B ；上清B用0. 45 μ m的濾器過(guò)濾，過(guò)濾液用DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析，層析柱先用pH為6. 8 7. 2的磷酸鹽緩沖液平衡，上樣，收集流出蛋白峰；層析柱再生用0. 5M的NaCl溶液沖洗。收集的蛋白液再經(jīng)DEAE Sepharose CL 6B層析，先用0.01M ρΗ6· 2 6. 8磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，用0. OlM 0. 03Μ ρΗ6. 2 6. 8磷酸鹽緩沖液洗滌，再用0. 04Μ 0. 06ΜρΗ6. 2 6. 8磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液用截留分子量為IOKD的超濾器超濾，透析，加入3% 5% (g/ml)甘氨酸和3% 5% (g/ml)葡萄糖做保護(hù)劑，巴氏滅活，除菌過(guò)濾，分裝，凍干，得到人α 1-抗胰蛋白酶粉末。本發(fā)明一種規(guī)?；a(chǎn)人α 1-抗胰蛋白酶的方法，其中所述緩沖液是PH值為 8. 0 8. 6的Tris緩沖液。本發(fā)明一種規(guī)?；a(chǎn)人α 1-抗胰蛋白酶的方法，每1000L血漿可回收人 α 1-抗胰蛋白酶300 400克，制品的純度達(dá)到96 % 99 %，制品的比活達(dá)到0. 7 1.0PEU/mg 蛋白。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1是本發(fā)明的工藝流程方框示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、血漿1000L，加入1倍生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)胮H4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整 PH7. 2，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為8%，維持溫度為_(kāi)1°C，離子強(qiáng)度0. 14，持續(xù)攪拌 2小時(shí)，離心，得到上清I和沉淀I ；上清I用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH6. 7，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為25%維持溫度為-5°C，離子強(qiáng)度0. 09，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清II+III和沉淀 II+III ；上清II+III用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH5. 2，攪拌條件下加入生理鹽水調(diào)整乙醇濃度為18%，維持溫度為_(kāi)4°C，離子強(qiáng)度0. 09，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清 IV-I和沉淀IV-I ；沉淀IV-I用6倍pH值為8. 0的Tris緩沖液溶解，溫度-2V，調(diào)節(jié)溶液的pH值為5. 4，加入冷乙醇至乙醇濃度為12%，離心，離心液用0. 45 μ m的濾器過(guò)濾，取上清A ；上清A按10 1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐溫-80溶液(磷酸三丁酯的濃度為3. 3%和吐溫-80的濃度為11% )，使磷酸三丁酯的最終濃度為0. 3% (g/ml)，吐溫-80 的最終濃度為(g/ml)，在M 條件下，孵育6小時(shí)；然后加入PEG4000至其濃度為12% (g/ml)，調(diào)整溶液的pH值為5. 1，溫度為0°C，離心，取上清B;上清B用0. 45 μ m的濾器過(guò)濾，過(guò)濾液用DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析，收集流出蛋白峰。收集的蛋白液再經(jīng)DEAE Sepharose CL 6B層析，用0. 02M pH值為6. 4的磷酸鹽緩沖液洗滌，再用0. 05M pH值為6. 4的磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液用截留分子量為IOKD的超濾器超濾，透析，加入4% (g/ml)甘氨酸和4% (g/ml)葡萄糖做保護(hù)劑，進(jìn)行巴氏滅活， 滅活后除菌過(guò)濾，分裝，凍干，得到人α -抗胰蛋白酶粉末。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1.表1:結(jié)果分析
權(quán)利要求
1.一種規(guī)模化生產(chǎn)人α ι-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步驟(a)采用低溫乙醇法制得血漿沉淀IV-I；(b)沉淀IV-I用緩沖液溶解；(c)加入冷乙醇沉淀，攪拌，離心，離心液用濾器過(guò)濾，取上清A；(d)上清A溶液進(jìn)行S/D病毒滅活，然后用PEG沉淀，取上清B；(e)上清B用濾器過(guò)濾，過(guò)濾液用DEAESepharose Fast Flow弱陰離子交換層析；(f)收集的蛋白液再經(jīng)DEAESepharose CL 6B離子交換層析；(g)收集洗脫液，超濾，透析，巴氏滅活，除菌過(guò)濾，分裝，凍干，得到α -抗胰蛋白酶粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種規(guī)?；a(chǎn)人α -抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟(a)中，所述的沉淀IV-I是通過(guò)以下步驟得來(lái)的血漿加入生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān){(diào)整 pH 7. O 7. 4，加入乙醇至乙醇濃度為8% 10%，維持溫度-3 -11，離子強(qiáng)度0. 12 0. 14，攪拌，離心，得到上清I和沉淀I ；上清I調(diào)整pH6. 5 6. 9，加入乙醇至乙醇濃度為 20% 25%，維持溫度為-5 _3°C，離子強(qiáng)度0. 08 0. 10，攪拌，離心，得到上清II+III 和沉淀II+III ；上清II+III調(diào)整pH5.0 5. 4，調(diào)整乙醇濃度為16% 19%，維持溫度為-5 -3V，離子強(qiáng)度0. 07 0. 09，攪拌，離心，得到上清IV-I和沉淀IV-I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種規(guī)?；a(chǎn)人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟(b)中所述的緩沖液是pH值為8. 0 8. 6的Tris緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種規(guī)模化生產(chǎn)人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于所述的濾器，其孔徑大小為0. 45 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種規(guī)模化生產(chǎn)人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟(c)中所述的冷乙醇沉淀是在溶液中加入冷乙醇至乙醇濃度為8% 12%，ρΗ5. 2 5. 6ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種規(guī)?；a(chǎn)人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟 (d)中所述的PEG分子量為4000，濃度為10% 15% (g/ml)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種規(guī)模化生產(chǎn)人α -抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟⑷中所述的PEG沉淀是在溶液中加入PEG濃度至10% 15% (g/ml)，溶液的pH值為 5. 0 5. 5，溫度為-1 1°C進(jìn)行沉淀。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種規(guī)?；a(chǎn)人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟(d)中所述的S/D病毒滅活是在上清A中按10 1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐溫-80溶液，使磷酸三丁酯的最終濃度為0.3% (g/ml)，吐溫-80的最終濃度為(g/ ml)，在M 條件下，孵育6小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種規(guī)?；a(chǎn)人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟(g)中所述的超濾器其截留分子量為10KD。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種規(guī)模化生產(chǎn)人α -抗胰蛋白酶的方法，其特征在于步驟(g)中所述的巴氏滅活時(shí)，在洗脫液中加入3% 5%甘氨酸和3% 5%葡萄糖做保護(hù)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種規(guī)?；a(chǎn)人α1-抗胰蛋白酶的方法，具體涉及從人血漿分離的組分IV-1中純化α1-抗胰蛋白酶。本發(fā)明包括以下步驟采用低溫乙醇法制得血漿沉淀IV-1；將沉淀IV-1溶解于緩沖液中，加入冷乙醇沉淀，過(guò)濾，取上清A；上清A進(jìn)行S/D病毒滅活；然后加入PEG沉淀，得到上清B，過(guò)濾，分別進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow離子交換層析，DEAE Sepharose CL 6B層析，洗滌，洗脫，收集洗脫液，超濾透析，巴氏滅活，除菌過(guò)濾，分裝，凍干，得到α1-抗胰蛋白酶粉末。本發(fā)明所生產(chǎn)的人α1-抗胰蛋白酶不僅產(chǎn)率高、純度高，制品的比活也比較高，而且還可以進(jìn)行工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102180966SQ20111003079
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者于洋, 孫曉東, 李常祿, 楊金平, 郭晶, 陳鳳珠, 魏舒 申請(qǐng)人:哈爾濱派斯菲科生物制藥股份有限公司