專利名稱：生產(chǎn)α1抗胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)α 1抗胰蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
α 1抗胰蛋白酶是一種大約分子量為52000-55000道爾頓(Da)的糖蛋白。此蛋白是由幾個(gè)寡核苷酸共價(jià)連接的單鏈蛋白，它是一種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰彈性蛋白酶、血管緊張肽原酶、皮膚膠原蛋白酶、脲激酶和分葉核淋巴細(xì)胞蛋白酶。近來(lái)應(yīng)用α 1抗胰蛋白酶治療由于α 1抗胰蛋白酶缺陷引起的遺傳性疾病和后天獲得性α 1抗胰蛋白酶缺陷性疾病。給予α 1抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴細(xì)胞彈性蛋白酶。淋巴細(xì)胞彈性蛋白酶能破壞肺的外源蛋白。當(dāng)α 抗胰蛋白酶缺失時(shí)，不能很好地調(diào)節(jié)彈性蛋白酶的活性，使彈性蛋白酶就破壞肺組織導(dǎo)致肺組織損傷引起肺氣腫，α 1抗胰蛋白酶能成功的用于治療肺氣腫、慢性氣管炎和氣管炎等。由于用于治療的α 抗胰蛋白酶基本上是來(lái)源人血漿，原料來(lái)源有限，為了最大地滿足臨床病人的需求，應(yīng)最大可能地提高血漿來(lái)源的α 1抗胰蛋白酶產(chǎn)率，同時(shí)也要嚴(yán)格要求純度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種α 1抗胰蛋白酶產(chǎn)率高、純度高的生產(chǎn)α 1抗胰蛋白酶的方法。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)α 1抗胰蛋白酶的方法，包括如下步驟血漿加入生理鹽水進(jìn)行稀釋，調(diào)整ρΗ7.0 7. 5，加入乙醇至乙醇濃度為8% 10%，維持溫度-1 -3 V，離子強(qiáng)度0. 10 0. 14，攪拌，離心，得到上清I和沉淀I ；上清I調(diào)整ρΗ6.4 7.0，加入乙醇至乙醇濃度為18% 25%，維持溫度為-3 _5°C，離子強(qiáng)度0. 08 0. 10，攪拌，離心，得到上清II+III和沉淀II+III ；上清II+III調(diào)整pH5. 0 5. 4，調(diào)整乙醇濃度為16 % 19 %，維持溫度為-3 -5°C，離子強(qiáng)度0. 06 0. 09，攪拌，離心，得到上清IV-I和沉淀IV-I ；沉淀IV-I用緩沖液溶解，溫度-2 3°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為8% 12%，攪拌，離心，過(guò)濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯濃度為0. 3%，吐溫-80濃度為 1 %，24 ，孵育；然后加入PEG4000至其濃度為10 % 15 %，調(diào)整pH5. 0 5. 5離心， 取上清B ；上清B加入PEG4000至其濃度為25% 30%，調(diào)整pH6. 2 6. 8，離心，取沉淀；沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析， 用0. 01 0. 04M pH6. 2 6. 8磷酸鹽緩沖液洗滌，再用0. 1 0. 3M pH6. 2 6. 8磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過(guò)濾，凍干，干熱滅活，得到α 1抗胰蛋白酶粉末。本發(fā)明的生產(chǎn)α 1抗胰蛋白酶的方法，其中所述緩沖液為ρΗ8.0 8.6Tris緩沖液。本發(fā)明的生產(chǎn)α 1抗胰蛋白酶的方法生產(chǎn)的α 1抗胰蛋白酶平均收率達(dá)到27%、 純度達(dá)到90%。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的百分含量如無(wú)特殊說(shuō)明均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、血漿加入1倍生理鹽水進(jìn)行稀釋，用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整ρΗ7. 2，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為8%，維持溫度為-10C，離子強(qiáng)度0. 14，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清I和沉淀I;上清I用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整ρΗ6. 7，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為25%維持溫度為-5°C，離子強(qiáng)度0. 09，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清II+III和沉淀 II+III ；上清II+III用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH5. 2，攪拌條件下加入生理鹽水調(diào)整乙醇濃度為18%，維持溫度為_(kāi)4°C，離子強(qiáng)度0. 09，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清 IV-I和沉淀IV-I ；沉淀IV-I用pH8. OTris緩沖液溶解，溫度_2°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為12%， 離心，過(guò)濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯的終濃度為0. 3%，吐溫-80的終濃度為1%，M ^°C，孵育6小時(shí)；然后加入PEG4000至其濃度為12%，調(diào)整pH5. 1，離心， 取上清B ；上清B加入PEG4000至其濃度為，調(diào)整pH6. 5，離心，取沉淀；沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析， 用0. 02MpH6. 2磷酸鹽緩沖液洗滌，再用0. IM pH62磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過(guò)濾，凍干，干熱滅活，得到α 1抗胰蛋白酶粉末。純化路線各步驟收集物經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，用AlphaEaseFC軟件對(duì)其進(jìn)行純度分析，純度可達(dá)到90%。蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定含有目的蛋白的蛋白濃度，并計(jì)算蛋白回收率，結(jié)果如下表批次Cohn FIV-I沉淀QSFF層析樣品回收率(mg)(mg)
150. 113. 025.9%
250. 213. 226.3%
350. 113. 426.7%實(shí)施例2、血漿加入1倍生理鹽水進(jìn)行稀釋，用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH7. 0，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為9%，維持溫度為_(kāi)2°C，離子強(qiáng)度0. 14，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清I和沉淀I ；上清I用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH6. 5，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為21 %維持溫度為-3°C，離子強(qiáng)度0. 08，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清II+III和沉淀 II+III ；上清II+III用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH5. 0，攪拌條件下加入生理鹽水調(diào)整乙醇濃度為16%，維持溫度為_(kāi)3°C，離子強(qiáng)度0. 08，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清 IV-I和沉淀IV-I ；沉淀IV-I用pH8. 2Tris緩沖液溶解，溫度_1°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為10%， 離心，過(guò)濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯的終濃度為0. 3%，吐溫-80的終濃度為1 %，M ，孵育6小時(shí)；然后加入PEG4000至其濃度為11 %，調(diào)整pH5. 3，離心， 取上清B ；上清B加入PEG4000至其濃度為，調(diào)整pH6. 2離心，取沉淀；沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析， 用0. 03MpH6. 5磷酸鹽緩沖液洗滌，再用0. 2M pH6. 5磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過(guò)濾，凍干，干熱滅活，得到α 1抗胰蛋白酶粉末。純化路線各步驟收集物經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，用AlphaEaseFC軟件對(duì)其進(jìn)行純度分析，純度可達(dá)到91%。蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定含有目的蛋白的蛋白濃度，并計(jì)算蛋白回收率，結(jié)果如下表批次 Cohn FIV-I沉淀 QSFF層析樣品回收率(mg)(mg)160. 317. 028. 2%260. 516. 827. 8%360. 117. 128. 5%實(shí)施例3、血漿加入1倍生理鹽水進(jìn)行稀釋，用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH7. 4，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為10%，維持溫度為-3°c，離子強(qiáng)度0. 12，持續(xù)攪拌2小時(shí)， 離心，得到上清I和沉淀I;上清I用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH6. 9，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為20%維持溫度為-4°C，離子強(qiáng)度0. 10，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清II+III和沉淀 II+III ；上清II+III用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)整pH5. 4，攪拌條件下加入生理鹽水調(diào)整乙醇濃度為19%，維持溫度為_(kāi)5°C，離子強(qiáng)度0. 07，持續(xù)攪拌2小時(shí)，離心，得到上清 IV—-1 和沉淀 IV-I ；沉淀IV-I用pH8. 4Tris緩沖液溶解，溫度0°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為8%，離心，過(guò)濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯的終濃度為0. 3%，吐溫-80的終濃度為1%，M ^°C，孵育6小時(shí)；然后加入PEG4000至其濃度為10%，調(diào)整pH5. 4，離心， 取上清B ；上清B加入PEG4000至其濃度為25%，調(diào)整pH6. 7，離心，取沉淀；
沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，進(jìn)行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析， 用0. 01MpH6. 7磷酸鹽緩沖液洗滌，再用0. 3M pH6. 6磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過(guò)濾，凍干，干熱滅活，得到α 1抗胰蛋白酶粉末。純化路線各步驟收集物經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，用AlphaEaseFC軟件對(duì)其進(jìn)行純度分析，純度達(dá)89%。蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定含有目的蛋白的蛋白濃度，并計(jì)算蛋白回收率，結(jié)果如下表批次 Cohn FIV-I沉淀 QSFF層析樣品回收率(mg)(mg)
15213. 826.5%
25314. 226.8%
352. 614. 427.3% 以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)α 抗胰蛋白酶的方法，包括如下步驟血漿加入生理鹽水進(jìn)行稀釋，調(diào)整PH 7.0 7. 5，加入乙醇至乙醇濃度為8% 10%， 維持溫度-1 -3 V，離子強(qiáng)度0. 10 0. 14，攪拌，離心，得到上清I和沉淀I ；上清I調(diào)整ΡΗ6. 4 7. 0，加入乙醇至乙醇濃度為18% 25%，維持溫度為_(kāi)3 _5°C， 離子強(qiáng)度0. 08 0. 10，攪拌，離心，得到上清II+III和沉淀II+III ；上清II+III調(diào)整pH5. 0 5. 4，調(diào)整乙醇濃度為16% 19%，維持溫度為-3 _5°C， 離子強(qiáng)度0. 06 0. 09，攪拌，離心，得到上清IV-I和沉淀IV-I ；沉淀IV-I用緩沖液溶解，溫度-2 3°C，加入冷乙醇至乙醇濃度為8% 12%，攪拌， 離心，過(guò)濾取上清A ；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，磷酸三丁酯濃度為0. 3%，吐溫-80濃度為1 %， M ^°C，孵育；然后加入PEG4000至其濃度為10% 15%，調(diào)整pH5. 0 5. 5離心，取上清B;上清B加入PEG4000至其濃度為25% 30%，調(diào)整pH6. 2 6. 8，離心，取沉淀； 沉淀用磷酸鹽緩沖液溶解，進(jìn)行弱陰離子交換層析，用0. 01 0. 04M pH6. 2 6. 8磷酸鹽緩沖液洗滌，再用0. 1 0. 3M pH6. 2 6. 8磷酸鹽緩沖液洗脫，洗脫液超濾，巴氏滅活， 除菌過(guò)濾，凍干，干熱滅活，得到α 抗胰蛋白酶粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述緩沖液為pH8.0 8. 6Tris緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)α1抗胰蛋白酶的方法，包括血漿稀釋，pH7.0～7.5，加入乙醇，溫度-1～-3℃，離子強(qiáng)度0.10～0.14，攪拌，離心，得到上清I和沉淀I；上清I pH6.4～7.0，加入乙醇18％～25％，溫度為-3～-5℃℃，離子強(qiáng)度0.08～0.10，攪拌，離心，得到上清II+III和沉淀II+III；上清II+III pH5.0～5.4，調(diào)節(jié)乙醇濃度為16％～19％，溫度為-3～-5℃，離子強(qiáng)度0.06～0.09，攪拌，離心，得到上清IV-1和沉淀IV-1；沉淀IV-1溶解，溫度-2～3℃，調(diào)整乙醇濃度至8％～12％，攪拌，離心，過(guò)濾取上清A；上清A加入磷酸三丁酯和吐溫-80，24～26℃，孵育；然后加入PEG4000，pH5.0～5.5離心，取上清B；上清B加入PEG4000，pH6.2～6.8，離心，取沉淀；沉淀溶解，進(jìn)行弱陰離子交換層析，洗脫液超濾，巴氏滅活，除菌過(guò)濾，凍干，干熱滅活，得到α1抗胰蛋白酶粉末。本發(fā)明的生產(chǎn)α1抗胰蛋白酶的方法生產(chǎn)的α1抗胰蛋白酶產(chǎn)率高、純度高。
文檔編號(hào)C07K1/36GK102558295SQ20101060980
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月28日
發(fā)明者魏舒 申請(qǐng)人:同路生物制藥有限公司