改良的抗體分子的制作方法

文檔序號：1175460閱讀：562來源：國知局

專利名稱：改良的抗體分子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有抗IL-6受體抗體作為有效成分的藥物組合物及其制備方法等。
背景技術：
抗體在血漿中的穩(wěn)定性高、副作用也少，因此作為藥品而受到關注。其中，有多種 IgG型抗體藥物已上市，目前還有多種抗體藥物正在開發(fā)中(非專利文獻1、非專利文獻2)。 IL-6是與各種自身免疫疾病、炎癥性疾病、惡性腫瘤等有關的細胞因子(非專利文獻3)，作為人源化抗IL-6受體IgGl抗體的T0CILIZUMAB(卜)'J ^ W)與IL-6受體進行特異性結合。由于T0CILIZUMAB中和IL-6的生物學作用，因此認為T0CILIZUMAB可以用作類風濕性關節(jié)炎等與IL-6有關的疾病的治療藥(專利文獻1、2、3、非專利文獻4)，在日本 T0CILIZUMAB被承認作為卡斯爾曼病(Castleman's disease)和類風濕性關節(jié)炎的治療藥 (非專利文獻5)。T0CILIZUMAB這樣的人源化抗體是第1代抗體藥物，將第1代抗體藥物改良使藥效、便利性、成本得到改善的第2代抗體藥物目前正在開發(fā)中。作為可適用于第2代抗體藥物的技術，人們開發(fā)了各種技術，有人報道了提高效應子功能、抗原結合能力、藥物動力學、穩(wěn)定性的技術或降低免疫原性風險的技術等。作為增強藥效或者減少給藥量的方法，有人報道了通過取代IgG抗體Fc區(qū)的氨基酸來增強抗體依賴性細胞毒性(ADCC活性)或補體依賴性細胞毒性(CDC活性)的技術(非專利文獻6)。另外，作為增強抗原結合能力、抗原中和能力的技術，有人報道了親和力成熟技術(非專利文獻7)，通過向可變區(qū)的互補性決定區(qū)(CDR !complementarity determining region)等的氨基酸中導入突變，可以增強與抗原的結合活性。通過增強抗原結合能力，可以提高在體外的生物活性、或者減少給藥量，還可以進一步提高在體內的藥效(非專利文獻8)。目前，發(fā)揮優(yōu)于抗RSV抗體的第一代藥物、即帕利珠單抗(Palivizumab)的效果的莫維珠單抗(Motavizumab)(利用親和力成熟技術制作)的臨床試驗正在進行(非專利文獻9)。在抗IL-6受體抗體中，有人報道了比 T0CILIZUMAB的親和力強的、親和力為約0. 05nM的抗體(專利文獻4)，但具有強于0. 05nM 的親和力的人抗體或人源化抗體或嵌合抗體未見報道。目前的抗體藥物所面臨的問題有給藥蛋白量非常多所導致的高制造成本。就人源化抗IL-6受體IgGl抗體、即T0CILIZUMAB而言，給藥量也設定為8mg/kg/月左右的靜脈內注射(非專利文獻4)。關于給藥方式，當為慢性自身免疫疾病時，優(yōu)選皮下給藥制劑。通常皮下給藥制劑必需是高濃度制劑，當為IgG型抗體制劑時，從穩(wěn)定性等方面考慮，通常認為lOOmg/mL左右的制劑是極限(非專利文獻10)。為了能夠發(fā)揮持續(xù)的治療效果，通過延長抗體的血漿中半衰期來減少給藥蛋白量、賦予高穩(wěn)定性，從而可以以長給藥間隔進行皮下給藥，可以提供成本低且便利性高的第2代抗體藥物。在抗體的藥物動力學方面，FcRn參與較多，關于抗體同種型間的血漿中半衰期的不同，已知IgGl和IgG2的血漿中半衰期最優(yōu)異，而IgG3和IgG4比它們差(非專利文獻 11)。作為進一步提高血漿中半衰期優(yōu)異的IgGl和IgG2抗體的血漿中半衰期的方法，有人報道了增強與FcRn的結合的恒定區(qū)的氨基酸取代(非專利文獻12、13)。另外，從免疫原性的角度考慮，與恒定區(qū)相比，更希望通過可變區(qū)的氨基酸取代來進一步提高血漿中半衰期 (專利文獻5)，但迄今為止未見通過修飾可變區(qū)來提高IL-6受體抗體的血漿中半衰期的報道。開發(fā)生物藥品時，最重要的一個問題是免疫原性。通常，小鼠抗體通過人源化而使免疫原性降低。通過在人源化時的模板構架中使用種系、”A >，germline)序列，可以進一步降低免疫原性的風險(非專利文獻14)。但即使是作為完全人抗TNF抗體的阿達木單抗(Adalimumab)，也顯現高頻率(13 17% )免疫原性，在顯現出免疫原性的患者中發(fā)現治療效果下降(非專利文獻15、16)。即使是人抗體，也有可能在CDR中存在T細胞表位，CDR上的T細胞表位有可能成為免疫原性的原因。有人報道了在計算機芯片上或者在體外預測T細胞表位的方法(非專利文獻17、18)，認為通過除去采用上述方法預測的 T細胞表位，可以降低免疫原性風險(非專利文獻19)。作為人源化抗IL-6受體IgGl抗體的T0CILIZUMAB是將小鼠PMl抗體人源化得到的IgGl抗體。H鏈、L鏈分別使用人NEW、人REI的序列作為模板構架進行CDR嫁接，但作為對保持活性重要的氨基酸，有5個氨基酸作為小鼠序列殘留在構架中(非專利文獻20)。迄今為止尚無在不使作為人源化抗體的T0CILIZUMAB的構架中殘留的小鼠序列活性降低的情況下進行完全人源化的報道。另外，T0CILIZUMAB的⑶R序列是小鼠序列，與阿達木單抗一樣，在CDR中有可能存在T細胞表位，不能否定免疫原性的風險。在T0CILIZUMAB的臨床試驗中，在8mg/kg的藥效用量時沒有確認到抗T0CILIZUMAB抗體的出現，但在4mg/kg和2mg/ kg時確認到了該抗體(專利文獻6)。由此認為在T0CILIZUMAB的免疫原性上還存在改善的空間。但迄今為止尚無有關通過氨基酸取代使免疫原性風險得到改善的T0CILIZUMAB的報道。T0CILIZUMAB的同種型是IgGl，但同種型的不同即為恒定區(qū)序列的不同，認為恒定區(qū)的序列對效應子功能、藥物動力學、理化性質等有很大影響，所以恒定區(qū)序列的選擇對抗體藥物的開發(fā)極為重要(非專利文獻11)。近年來，人們非常重視抗體藥物的安全性，認為在TGN1412的I期臨床試驗中發(fā)現的重大副作用的原因之一是抗體的Fc部分與Fc γ受體的相互作用(效應子功能)(非專利文獻21)。在以中和抗原的生物學作用為目的的抗體藥物中，不必與對ADCC等的效應子功能重要的Fc γ受體結合，從副作用方面考慮，認為可能也寧可不優(yōu)選與Fcy受體的結合。作為降低與Fcy受體結合的方法，有將IgG抗體的同種型由IgGl變?yōu)镮gG2或IgG4的方法(非專利文獻22)，但從與Fc γ受體I的結合和藥物動力學方面考慮，與IgG4相比更優(yōu)選IgG2(非專利文獻11)。T0CILIZUMAB的同種型是 IgGl、即IL-6受體中和抗體，所以在不需要ADCC等的效應子功能、而考慮副作用的可能性時，認為同種型還有可能優(yōu)選IgG2。另一方面，在開發(fā)抗體作為藥品時，其蛋白質的理化性質、其中均勻性和穩(wěn)定性極為重要，有報道稱IgG2同種型其來自鉸鏈區(qū)的二硫鍵的異質性(heterogeneity)非常多 (非專利文獻23)。在維持來源于此的目標物質/相關物質的異質性的制造間差的同時作為藥品進行大量制造并不容易，考慮到成本增加的關系，優(yōu)選盡可能是單一物質。并且作為抗體H鏈C末端序列的異質性，有人報道了由C末端氨基酸的賴氨酸殘基的缺失、和C末端的2個氨基酸的甘氨酸、賴氨酸的缺失引起的C末端羧基的酰胺化(非專利文獻24)，開發(fā)IgG2同種型的抗體作為藥品時，希望在維持高穩(wěn)定性的同時降低上述異質性。為了制作便利性優(yōu)異的、穩(wěn)定的高濃度皮下給藥制劑，希望不僅穩(wěn)定性高、而且血漿中半衰期也較 TOCILIZUMAB的同種型、即IgGl優(yōu)異。但迄今為止尚無與IgG2同種型的恒定區(qū)的抗體有關的異質性下降、具有高穩(wěn)定性、具有優(yōu)于IgGl同種型的恒定區(qū)抗體的血漿中半衰期的恒定區(qū)序列的報道。本發(fā)明的在先技術文獻如下。專利文獻1 :W092/19759 專利文獻2 :W096/11020專利文獻3 :W096/12503專利文獻4 :W02007/143168專利文獻5 :W02007/114319專利文獻6 :W02004/096273非專利文獻 1 Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura BFaden & Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology 23，1073-1078(2005) ·非專禾丨J文獻 2 :Pavlou AK, Belsey MJ. , The therapeutic antibodiesmarket to 2008.，Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr ；59 (3) 389-96.非專禾U 文獻 3 :Nishimoto N, Kishimoto Τ. ， Interleukin 6 :from benchto bedside. , Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov ；2 (11) :619_26·非專利文獻4 =Maini RN, Taylor PC, Szechinski J, Pavelka K, BrollJ, Balint G, Emery P, Raemen F, Petersen J, Smolen J, Thomson D, Kishimoto T ；CHARISMA Study Group. , Double-blind randomizedcontrolled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist,Tocilizumab, in European patients with rheumatoid arthritis who had anincomplete response to methotrexate. ,Arthritis Rheum. 2006 Sep ；54(9) 2817-29.非專禾Ij文獻 5 :Nishimoto N, Kanakura Y, Aozasa K, Johkoh Τ, Nakamura Μ, Nakano S, Nakano N, Ikeda Y, Sasaki Τ, Nishioka K, HaraM, Taguchi H, Kimura Y, Kato Y, Asaoku H, Kumagai S, Kodama F, Nakahara H, Hagihara K, Yoshizaki K, Kishimoto Τ. 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發(fā)明內容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明鑒于上述狀況而設，其目的在于提供包含優(yōu)于T0CILIZUMAB的第2代分子的藥物組合物(以下，在本說明書中有時還記作“藥劑”或“制劑”)、以及上述藥物組合物的制備方法，所述優(yōu)于T0CILIZUMAB的第2代分子是指通過修飾人源化抗IL-6受體IgGl抗體、即T0CILIZUMAB的可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列，使抗原中和能力增強、同時提高了藥物動力學，從而減少了給藥頻率、持續(xù)發(fā)揮治療效果，且免疫原性、安全性、理化性質(穩(wěn)定性和均勻性)得到改善。解決課題的方法本發(fā)明人等為了研制優(yōu)于T0CILIZUMAB的第2代分子進行了深入研究，通過修飾第1代人源化抗IL-6受體IgGl抗體、即T0CILIZUMAB的可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列，使藥效增強、同時提高藥物動力學，從而減少給藥頻率、持續(xù)發(fā)揮治療效果，且免疫原性、安全性、理化性質(穩(wěn)定性和均勻性)得到改善。其結果，本發(fā)明人等在T0CILIZUMAB的可變區(qū) 中發(fā)現了多個使與抗原的結合能力(親和力)提高的CDR突變，利用其組合成功地大幅提高了親和力。另外，本發(fā)明人等通過導入使可變區(qū)序列的等電點降低的修飾，成功提高了藥物動力學。本發(fā)明人等通過對與作為抗原的IL-6受體的結合賦予ρΗ依賴性，可以利用1分子抗體多次中和抗原，成功提高了藥物動力學。本發(fā)明人等通過將殘留在T0CILIZUMAB的構架中的、來自小鼠的序列完全人源化，降低了可變區(qū)中通過在計算機芯片上預測的T細胞表位肽的數目，從而成功降低了免疫原性風險。并且，本發(fā)明人等在T0CILIZUMAB的恒定區(qū)中成功發(fā)現了新的恒定區(qū)序列，所述新的恒定區(qū)序列為了提高安全性，使與Fc γ受體的結合低于IgGl，使藥物動力學較IgGl得到改善，并且在不降低穩(wěn)定性的情況下降低來源于 IgG2的鉸鏈區(qū)的二硫鍵的異質性和來源于H鏈C末端的異質性。通過適當組合上述⑶R區(qū) 氨基酸序列的修飾、可變區(qū)氨基酸序列的修飾、恒定區(qū)氨基酸序列的修飾，成功研制了優(yōu)于 T0CILIZUMAB的第2代分子。本發(fā)明涉及包含人源化抗IL-6受體IgG抗體的藥物組合物、以及上述藥物組合物的制備方法，所述人源化抗IL-6受體IgG抗體是通過修飾人源化抗IL-6受體IgGl抗體、即T0CILIZUMAB的可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列，具有更優(yōu)異的、與抗原(IL-6受體)結合的能力、具有更優(yōu)異的藥物動力學、更優(yōu)異的安全性、免疫原性風險、理化性質(穩(wěn)定性、均勻性)。更具體而言，本發(fā)明提供下述[1] [11]。[1]下述(a) (f)中任一項所述的多肽(a)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO :1 (VH4-M73的⑶Rl)的序列的⑶Rl、具有 SEQ ID NO :2(VH4-M73 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :3 (VH4-M73 的 CDR3)的序列的⑶R3 ；(b)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO :4(VH3_M73的CDR1)的序列的CDR1、具有 SEQ ID NO :5(VH3-M73 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :6 (VH3-M73 的 CDR3)的序列的⑶R3 ；(c)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO :7 (VH5-M83的⑶Rl)的序列的⑶R1、具有 SEQ ID NO :8(VH5-M83 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :9 (VH5-M83 的 CDR3)的序列的⑶R3 ；
(d)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO 10 (VLl的CDR1)的序列的CDRl、具有SEQ ID NO 11 (VLl 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 12 (VLl 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；(e)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO :13 (VL3的CDR1)的序列的CDR1、具有SEQ ID NO 14 (VL3 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 15 (VL3 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；(f)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO 16 (VL5的⑶Rl)的序列的⑶Rl、具有SEQ ID NO 17 (VL5 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 18 (VL5 的 CDR3)的序列的 CDR3。[2]下述(a) (C)中任一項所述的抗體(a)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 1 (VH4-M73 的 CDR1)的序列的 CDR1、具有 SEQ ID NO 2 (VH4-M73 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :3(VH4-M73 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 10 (VLl的CDR1)的序列的CDRl、具有SEQ ID NO :11 (VLl 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 12 (VLl 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；(b)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 4 (VH3-M73 的 CDR1)的序列的 CDR1、具有 SEQ ID NO 5 (VH3-M73 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :6(VH3-M73 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO :13 (VL3的CDR1)的序列的CDR1、具有SEQ ID NO :14(VL3 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :15(VL3 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；(c)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 7 (VH5-M83 的 CDR1)的序列的 CDR1、具有 SEQ ID NO 8 (VH5-M83 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :9(VH5-M83 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO :16 (VL5的CDR1)的序列的CDR1、具有SEQ ID NO :17(VL5 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :18(VL5 的 CDR3)的序列的 CDR3。[3]下述(a) (f)中任一項所述的可變區(qū)(a)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :19(VH4_M73的可變區(qū))的序列；(b)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :20(VH3_M73的可變區(qū))的序列；(c)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO 21 (VH5-M83的可變區(qū))的序列；(d)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :22(VL1的可變區(qū))的序列；
(e)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :23(VL3的可變區(qū))的序列；(f)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :24(VL5的可變區(qū))的序列。[4]下述(a) (C)中任一項所述的抗體 (a)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO
19(VH4-M73的可變區(qū))的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :22 (VLl的可變區(qū))的序列；(b)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO
20(VH3-M73的可變區(qū))的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :23 (VL3的可變區(qū))的序列；(c)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO
21(VH5-M83的可變區(qū))的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :24(VL5的可變區(qū))的序列。[5]下述(a) (f)中任一項所述的重鏈或輕鏈(a)重鏈，其中具有 SEQ ID NO :25(VH4_M73)的序列；(b)重鏈，其中具有 SEQ ID NO :26(VH3_M73)的序列；(c)重鏈，其中具有 SEQ ID NO :27(VH5_M83)的序列；(d)輕鏈，其中具有SEQ ID NO 28 (VLl)的序列；(e)輕鏈，其中具有SEQ ID NO :29(VL3)的序列；(f)輕鏈，其中具有SEQ ID NO :30(VL5)的序列。[6]下述(a) (C)中任一項所述的抗體(a)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQ ID NO :25 (VH4-M73)的序列，所述輕鏈具有SEQ ID NO 28 (VLl)的序列；(b)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQ ID NO :26(VH3-M73)的序列，所述輕鏈具有SEQ ID NO :29(VL3)的序列；(c)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQ ID NO :27 (VH5-M83)的序列，所述輕鏈具有SEQ ID NO :30(VL5)的序列。[7]基因，該基因編碼[1] [6]中任一項所述的多肽。[8]載體，該載體包含[7]所述的基因。[9]宿主細胞，該宿主細胞保有[8]所述的載體。[10]通過培養(yǎng)[9]的宿主細胞來制備[1] [6]中任一項所述的多肽的方法。[11]藥物組合物，其中含有[1] [6]中任一項所述的多肽或按照[10]所述的方法制備的多肽。發(fā)明效果根據本發(fā)明得到的人源化抗IL-6受體IgG抗體通過增強藥效、提高藥物動力學，可以減少給藥頻率，可以持續(xù)發(fā)揮治療效果。

圖1是顯示匯總了提高T0CILIZUMAB與IL_6受體的親和性的突變位點的列表的圖。HCDR2的T0CILIZUMAB序列見SEQ ID NO :81，HCDR2的突變后序列(上段)見SEQ IDNO :82，HCDR2 的突變后序列(下段)見 SEQ ID NO :83，HCDR3 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQID NO :84，!CDR3的突變后序列(上段)見SEQ ID NO :85，HCDR3的突變后序列(下段)見SEQ ID NO :86，LCDRl 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :87，LCDRl 的突變后序列(上段)見 SEQ ID NO :88，LCDRl 的突變后序列(下段)見 SEQ ID NO :89，LCDR3 的 TOCILIZUMAB 序列見SEQ ID NO :90，IXDR3的突變后序列(上段)見SEQ ID NO :91，IXDR3的突變后序列 (下段)見 SEQ ID NO :92ο圖2是顯示TOCILIZUMAB和RDC-23在BaF/gpl30中的中和活性的圖。圖3是顯示匯總了在不大幅降低TOCILIZUMAB與IL_6受體的結合的情況下可以降低可變區(qū)的等電點的突變位點的列表的圖。圖中的星號是為了形成人序列雖然不影響等電點但發(fā)生了突變的位點。HFRl的TOCILIZUMAB序列見SEQ ID NO :93，HFRl的突變后序列見 SEQ ID NO :94，HCDRl 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :95，HCDRl 的突變后序列見 SEQ ID NO :96，HFR2 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :97，HFR2 的突變后序列見 SEQ ID NO :98，HCDR2 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :81，HCDR2 的突變后序列見 SEQ ID NO :99，HFR4 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :100，HFR4 的突變后序列見 SEQ ID NO 101，LFRl 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :102，LFRl 的突變后序列見 SEQ ID NO :103， LCDRl 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :87，LCDRl 的突變后序列見 SEQ ID NO :104，LFR2 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :105，LFR2 的突變后序列見 SEQ ID NO :106，LCDR2 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :107，LCDR2 的突變后序列見 SEQ ID NO :108，109，LFR3 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :110，LFR3 的突變后序列見 SEQ ID NO :111，LFR4 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ IDNO 112，LFR4 的突變后序列見 SEQ ID N0:113。圖4是顯示TOCILIZUMAB和H53/L28在BaF/gpl30中的中和活性的圖。圖5是顯示將TOCILIZUMAB和H53/L28對小鼠進行靜脈內給藥后血漿中濃度變化的曲線圖。圖6是顯示將TOCILIZUMAB和H53/L28對小鼠進行皮下給藥后血漿中濃度變化的曲線圖。圖7是顯示IgG分子通過在核內體內從膜型抗原上解離而再次與新抗原結合的模式圖。圖8是顯示匯總了可以對TOCILIZUMAB與IL_6受體的結合賦予pH依賴性(在 PH7. 4時結合、在pH5. 8時解離)的突變位點的列表的圖。HFRl的TOCILIZUMAB序列見SEQ ID NO 93,HFRl 的突變后序列見 SEQ ID NO 114,HCDRl 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ IDNO 95，HCDRl 的突變后序列見 SEQ ID NO :115，LCDRl 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID NO :87， LCDRl 的突變后序列見 SEQID NO 116，LCDR2 的 TOCILIZUMAB 序列見 SEQ ID N0:107，LCDR2 的突變后序列見SEQ ID NO :1170圖9是顯示TOCILIZUMAB和H3pl/L73在BaF/gpl30中的中和活性的圖。圖10是顯示將TOCILIZUMAB和H3pl/L73對食蟹猴(力二夕4廿 > )進行靜脈內給藥后血漿中濃度變化的曲線圖。圖11是顯示將TOCILIZUMAB和H3pl/L73對人IL-6受體轉基因小鼠進行靜脈內給藥后血漿中濃度變化的曲線圖。圖12是顯示利用陽離子交換色譜評價TOCILIZUMAB、TOCILIZUMAB Δ K禾口TOCILIZUMABAGK的來自C末端的異質性的結果的圖。圖13是顯示利用陽離子交換色譜評價TOCILIZUMAB-IgGl、TOCILIZUMAB-IgG2禾口 TOCILIZUMAB-SKSC的來自二硫鍵的異質性的結果的圖。圖14是顯示利用差示掃描量熱法(DSC)測定的TOCILIZUMAB-IgGl、 T0CILIZUMAB-IgG2和TOCILIZUMAB-SKSC的變性曲線和各Fab結構域的Tm值的圖。圖 15 是顯示將 TOCILIZUMAB-IgGl、T0CILIZUMAB-M44、T0CILIZUMAB-M58 禾口 T0CILIZUMAB-M73對人FcRn轉基因小鼠進行靜脈內給藥后血漿中濃度變化的曲線圖。圖16是顯示T0CILIZUMAB、對照和Fv5_M83在BaF/gpl30中的中和活性的圖。圖 17 是顯示 T0CILIZUMAB、Fv3-M73 和 Fv4_M73 在 BaF/gpl30 中的中和活性的圖。圖18是顯示將T0CILIZUMAB、對照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83對食蟹猴進行靜脈內給藥后血漿中濃度變化的曲線圖。圖19是顯示將T0CILIZUMAB、對照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83對食蟹猴進行靜脈內給藥后CRP濃度變化的曲線圖。圖20是顯示將T0CILIZUMAB、對照、Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83對食蟹猴進行靜脈內給藥后非結合型可溶型IL-6受體率的變化的曲線圖。圖21是顯示T0CILIZUMAB和Fv4_M73對來自人RA患者的滑膜細胞的MCP-I產生的抑制作用的圖。圖22是顯示T0CILIZUMAB和Fv4_M73對來自人RA患者的滑膜細胞的VEGF產生的抑制作用的圖。實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明提供下述(a) (f)中任一項所述的多肽。(a)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO :1 (VH4-M73的CDR1)的序列的CDRl、具有 SEQ ID NO :2(VH4-M73 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :3 (VH4-M73 的 CDR3)的序列的⑶R3 ；(b)多肽，該多肽包含具有SEQ ID N0:4(VH3-M73的CDR1)的序列的CDR1、具有 SEQ ID NO :5(VH3-M73 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :6 (VH3-M73 的 CDR3)的序列的⑶R3 ；(c)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO :7 (VH5-M83的⑶Rl)的序列的⑶R1、具有 SEQ ID NO :8 (VH5-M83 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO :9 (VH5-M83 的 CDR3)的序列的⑶R3 ；(d)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO 10 (VLl的⑶Rl)的序列的⑶Rl、具有SEQ ID NO 11 (VLl 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 12 (VLl 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；(e)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO :13 (VL3的CDR1)的序列的CDR1、具有SEQ ID NO 14 (VL3 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 15 (VL3 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；(f)多肽，該多肽包含具有SEQ ID N0:16(VL5的CDR1)的序列的CDR1、具有SEQ ID NO 17 (VL5 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 18 (VL5 的 CDR3)的序列的 CDR3。在本發(fā)明中，對多肽沒有特別限定，但優(yōu)選為與人IL-6受體具有結合活性的抗原結合物質?？乖Y合物質的優(yōu)選例子有抗體的重鏈可變區(qū)(VH)、抗體的輕鏈可變區(qū)(VL)、抗體的重鏈、抗體的輕鏈、抗體等。
在上述(a) (f)的多肽中，(a) (C)的多肽的優(yōu)選例子有抗體的重鏈可變區(qū)， (d) (f)的多肽的優(yōu)選例子有抗體的輕鏈可變區(qū)。上述可變區(qū)可以用作抗人IL-6受體抗體的一部分。使用了上述可變區(qū)的抗人 IL-6受體抗體具有優(yōu)異的結合活性、優(yōu)異的藥物動力學、優(yōu)異的安全性·免疫原性、和/或優(yōu)異的理化性質。在本發(fā)明中，優(yōu)異的藥物動力學或藥物動力學的提高是指對機體內給予抗體時，由血漿中濃度變化算出的藥物動力學參數之一、即“清除率(Clearance，CL)，，的減少、“濃度曲線下面積(Area Under Curve、AUC) ”的增大、“平均滯留時間(Mean Residence Time)”的增大、“血漿中半衰期(t1/2)”的增大中的任一者。在本發(fā)明中，對優(yōu)異的理化性質或理化性質的提高沒有特別限定，意思是指穩(wěn)定性的提高、異質性的降低等。與CDR連接的人抗體構架區(qū)(framework region ；FR)選擇CDR形成良好的抗原結合部位的構架區(qū)。對本發(fā)明的可變區(qū)中所用的FR沒有特別限定，可以使用任意的FRJfi 優(yōu)選使用來自人的FR。來自人的FR可以使用具有天然序列的FR，也可以根據需要取代、缺失、添加和/或插入具有天然序列的構架區(qū)的1個或多個氨基酸等，使CDR形成適當的抗原結合部位。例如，通過測定、評價使用進行了氨基酸取代的FR的抗體與抗原的結合活性，可以選擇具有所期望性質的突變FR序列(Sato, K.等人，Cancer Res. (1993) 53，851-856)。在上述CDR序列中，可以取代、缺失、添加和/或插入1個或多個氨基酸等。優(yōu)選取代、缺失、添加和/或插入1個或多個氨基酸后的CDR序列在結合活性、中和活性、穩(wěn)定性、免疫原性和/或藥物動力學方面與修飾前的CDR序列具有相同的活性。對取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸數目沒有特別限定，但每一個CDR中優(yōu)選3個氨基酸以內，進一步優(yōu)選 2個氨基酸以內，更優(yōu)選為1個氨基酸。作為將1個或多個氨基酸殘基取代成其他目標氨基酸的方法，例如有位點特異性誘變法(Hashimoto-Gotoh，T，Mizuno，T，Ogasahara，Y，and Nakagawa, Μ. (1995). An oligo deoxyribonucleotide-directed dualamber method for site-directed mutagenesis (寡脫氧核糖核苷酸定向雙琥珀色法位點定向誘變).Gene 152，271-275、Zoller, MJ, and Smith, Μ. (1983)01igonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors (DNA片段克隆到M13載體的寡聚核苷酸定向誘變).Methods Enzymo 1. 100,468—500、Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, Μ, and Fritz, HJ(1984)The gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed mutation construction (帶缺口的雙鏈體DNA接近于寡聚核苷酸定向突變結構).Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456> Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutationsvia gapped duplex DNA Methods (經由帶缺 O 的雙鏈體 DNA 法突變的寡聚核苷酸定向結構).Enzymol. 154，350-367、Kunkel，TA (1985) Rapid andefficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection(無表型蹄選的迅速及高效的位點特異性誘變法).Proc Natl Acad Sci U S A. 82，488-492)。利用該方法可以將抗體所期望的氨基酸取代成其他目標氨基酸。另外，通過使用構架改組(Mol Immunol. 2007 Apr ；44(11) 3049-60)和 CDR 修復(US2006/0122377)等文庫技術，還可以將構架和CDR中的氨基酸取代成其他適當的氨基酸。本發(fā)明還提供下述(a) (C)中任一項所述的抗體。(a)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQ IDNO 1 (VH4-M73 的 CDR1)的序列的 CDR1、具有 SEQ ID NO 2 (VH4-M73 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有SEQ ID NO :3(VH4-M73的CDR3)的序列的CDR3，所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQID NO: 10 (VLl的CDR1)的序列的CDRl、具有SEQ ID NO 11 (VLl的CDR2)的序列的CDR2和具有 SEQ ID NO 12 (VLl 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；(b)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 4 (VH3-M73 的 CDR1)的序列的 CDR1、具有 SEQ ID NO 5 (VH3-M73 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有SEQ ID NO :6(VH3-M73的CDR3)的序列的CDR3，所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQID NO: 13(VL3的CDR1)的序列的CDRl、具有SEQ ID NO 14 (VL3的CDR2)的序列的CDR2和具有 SEQ ID NO :15(VL3 的 CDR3)的序列的 CDR3 ；(c)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 7 (VH5-M83 的 CDR1)的序列的 CDR1、具有 SEQ ID NO 8 (VH5-M83 的 CDR2)的序列的 CDR2 和具有SEQ ID NO :9(VH5-M83的CDR3)的序列的CDR3，所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQID NO: 16 (VL5的CDR1)的序列的CDRl、具有SEQ ID NO :17(VL5的CDR2)的序列的CDR2和具有 SEQ ID NO :18(VL5 的 CDR3)的序列的 CDR3。上述抗體可以用作具有優(yōu)異的結合活性、優(yōu)異的藥物動力學、優(yōu)異的安全性免疫原性、和/或優(yōu)異的理化性質的抗人IL-6受體抗體。
本發(fā)明的與CDR連接的人抗體的構架區(qū)選擇CDR形成良好的抗原結合部位的構架區(qū)。對本發(fā)明的可變區(qū)中使用的FR沒有特別限定，可以使用任何的FR，但優(yōu)選使用來自人的FR。來自人的FR可以使用具有天然序列的FR，根據需要可以取代、缺失、添加和/或插入具有天然序列的構架區(qū)的1個或多個氨基酸等，使CDR形成適當的抗原結合部位。例如，通過測定、評價使用了進行了氨基酸取代的FR的抗體與抗原的結合活性，可以選擇具有所期望性質的突變 FR 序列(Sato, K.等人，Cancer Res. (1993)53,851-856)。對本發(fā)明的抗體中使用的恒定區(qū)沒有特別限定，可以使用任何的恒定區(qū)。本發(fā)明的抗體中使用的恒定區(qū)的優(yōu)選例子有來自人的恒定區(qū)(來自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、CK、 CA的恒定區(qū)等)。來自人的恒定區(qū)中可以取代、缺失、添加和/或插入1個或多個氨基酸。例如，作為來自人的恒定區(qū)的優(yōu)選例子，當為重鏈恒定區(qū)時，例如有具有SEQ ID N0 31 (VH4-M73的恒定區(qū))的氨基酸序列的恒定區(qū)、具有SEQ ID NO :32(VH3_M73的恒定區(qū)) 的氨基酸序列的恒定區(qū)、具有SEQ ID N0:33(VH5-M83的恒定區(qū))的氨基酸序列的恒定區(qū)；當為輕鏈恒定區(qū)時，例如有具有SEQ ID N034 (VLl)的氨基酸序列的恒定區(qū)、具有SEQ ID N0:35(VL3)的氨基酸序列的恒定區(qū)、具有SEQ IDN0:36(VL5)的氨基酸序列的恒定區(qū)。在上述CDR序列中可以取代、缺失、添加和/或插入1個或多個氨基酸等。優(yōu)選取代、缺失、添加和/或插入1個或多個氨基酸后的CDR序列在結合活性、中和活性、穩(wěn)定性、免疫原性和/或藥物動力學方面與修飾前的CDR序列具有同等的活性。對取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸數目沒有特別限定，每個CDR優(yōu)選3個氨基酸以內，進一步優(yōu)選2個氨基酸以內、更優(yōu)選為1個氨基酸。氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等還可以通過上述方法來進行。本發(fā)明還提供下述(a) (f)中任一項所述的可變區(qū)。(a)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :19(VH4_M73的可變區(qū))的序列；(b)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :20(VH3_M73的可變區(qū))的序列；
(c)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO 21 (VH5-M83的可變區(qū))的序列；(d)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :22(VL1的可變區(qū))的序列；(e)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :23(VL3的可變區(qū))的序列；(f)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO :24(VL5的可變區(qū))的序列。上述可變區(qū)可以用作抗人IL-6受體抗體的一部分。使用了上述可變區(qū)的抗人IL-6受體抗體具有優(yōu)異的結合活性、優(yōu)異的藥物動力學、優(yōu)異的安全性·免疫原性、和/或優(yōu)異的理化性質。上述可變區(qū)中可以取代、缺失、添加和/或插入1個或多個(例如5個氨基酸以內、優(yōu)選3個氨基酸以內)氨基酸。作為將1個或多個氨基酸殘基取代成其他目標氨基酸的方法，例如有上述方法。本發(fā)明還提供包含上述可變區(qū)的多肽。本發(fā)明還提供下述(a) (C)中任一項所述的抗體。(a)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO
19(VH4-M73的可變區(qū))的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :22 (VLl的可變區(qū))的序列；(b)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO
20(VH3-M73的可變區(qū))的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :23 (VL3的可變區(qū))的序列；(c)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO
21(VH5-M83的可變區(qū))的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :24(VL5的可變區(qū))的序列。上述可變區(qū)可以用作抗人IL-6受體抗體的一部分。使用了上述可變區(qū)的抗人 IL-6受體抗體具有優(yōu)異的結合活性、優(yōu)異的藥物動力學、優(yōu)異的安全性·免疫原性、和/或優(yōu)異的理化性質。上述可變區(qū)中可以取代、缺失、添加和/或插入1個或多個(例如5個氨基酸以內、優(yōu)選3個氨基酸以內)氨基酸。作為將1個或多個氨基酸殘基取代成其他目標氨基酸的方法，例如有上述方法。此外，對本發(fā)明的抗體中使用的恒定區(qū)沒有特別限定，可以使用任何的恒定區(qū)。本發(fā)明的抗體中使用的恒定區(qū)的優(yōu)選例子有來自人的恒定區(qū)(來自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 κ鏈、λ鏈的恒定區(qū)等)。來自人的恒定區(qū)中可以取代、缺失、添加和/或插入1個或多個氨基酸。例如，作為來自人的恒定區(qū)的優(yōu)選例子，當為重鏈恒定區(qū)時，例如有具有SEQ ID NO 31 (VH4-M73的恒定區(qū))的氨基酸序列的恒定區(qū)、具有SEQ ID NO :32(VH3_M73的恒定區(qū))的氨基酸序列的恒定區(qū)、具有SEQ ID N0:33(VH5-M83的恒定區(qū))的氨基酸序列的恒定區(qū)；當為輕鏈恒定區(qū)時，例如有具有SEQ ID NO34(VLl)的氨基酸序列的恒定區(qū)、具有SEQ ID N0:35(VL3)的氨基酸序列的恒定區(qū)、具有SEQ IDNO :36(VL5)的氨基酸序列的恒定區(qū)。本發(fā)明還提供下述(a) (f)中任一項所述的重鏈或輕鏈。(a)重鏈，該重鏈具有SEQ ID NO :25(VH4_M73)的序列；(b)重鏈，該重鏈具有SEQ ID NO :26(VH3_M73)的序列；(c)重鏈，該重鏈具有SEQ ID NO :27(VH5_M83)的序列；
(d)輕鏈，該輕鏈具有SEQ ID NO 28 (VLl)的序列；(e)輕鏈，該輕鏈具有SEQ ID NO :29(VL3)的序列；(f)輕鏈，該輕鏈具有SEQ ID NO :30(VL5)的序列。上述重鏈或輕鏈可以用作抗人IL-6受體抗體的一部分。使用了上述重鏈或輕鏈的抗人IL-6受體抗體具有優(yōu)異的結合活性、優(yōu)異的藥物動力學、優(yōu)異的安全性免疫原性、和/或優(yōu)異的理化性質。上述重鏈或輕鏈中可以取代、缺失、添加和/或插入1個或多個(例如10個氨基酸以內、優(yōu)選5個氨基酸以內、進一步優(yōu)選3個氨基酸以內)氨基酸。作為將1個或多個氨基酸殘基取代成其他目標氨基酸的方法，例如可以使用上述方法。1個或多個氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入可以在可變區(qū)中進行，也可以在恒定區(qū)中進行，或者在可變區(qū)和恒定區(qū)兩區(qū)中進行。本發(fā)明還提供下述(a) (C)中任一項所述的抗體。
(a)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQ ID NO :25 (VH4-M73)的序列，所述輕鏈具有SEQ ID NO 28 (VLl)的序列；(b)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQ ID NO :26 (VH3-M73)的序列，所述輕鏈具有SEQ ID NO :29(VL3)的序列；(c)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQ ID NO :27 (VH5-M83)的序列，所述輕鏈具有SEQ ID NO :30(VL5)的序列。上述抗體是具有優(yōu)異的結合活性、優(yōu)異的藥物動力學、優(yōu)異的安全性·免疫原性、和/或優(yōu)異的理化性質的抗人IL-6受體抗體。上述抗體中可以取代、缺失、添加和/或插入1個或多個(例如20個氨基酸以內、優(yōu)選10個氨基酸以內、進一步優(yōu)選5個氨基酸以內)氨基酸。作為將1個或多個氨基酸殘基取代成其他目標氨基酸的方法，例如有上述方法。1個或多個氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入可以在可變區(qū)中進行，也可以在恒定區(qū)中進行，或者在可變區(qū)和恒定區(qū)兩區(qū)中進行。本發(fā)明的抗體優(yōu)選為人源化(humanized)抗體。人源化抗體也稱重構(reshaped)人抗體，其是將來自人以外的哺乳動物的⑶R嫁接到人抗體的CDR中得到的抗體，其一般的基因重組手法也已知(參照歐州專利申請公開號EP125023號公報、W096/02576號公報)。具體而言，例如使用制作成在CDR和FR的末端區(qū)均具有重疊部分的多個寡核苷酸作為引物，利用PCR法合成設計成連接目標CDR和目標構架區(qū)(FR)的DNA序列(參照 W098/13388號公報中記載的方法)。將得到的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)或人抗體恒定區(qū)變體的DNA連接，之后插入到表達載體中，再將其導入宿主中，產生人源化抗體而得到(參照歐州專利申請公開號EP239400、國際專利申請公開號W096/02576)。與CDR連接的人抗體的構架區(qū)選擇CDR形成良好的抗原結合部位的構架區(qū)。根據需要，可以對抗體可變區(qū)中的構架區(qū)的氨基酸進行取代、缺失、添加和/或插入等。在人源化抗體的恒定區(qū)中，可以使用人抗體恒定區(qū)或者在人抗體恒定區(qū)中取代、缺失、添加和/或插入1個或多個氨基酸的人抗體恒定區(qū)變體。例如，在H 鏈中可以使用 Cy 1、C γ 2、C γ 3、C γ 4、Cy、CS、Cal、Ca2、Ce，在 L鏈中可以使用Ck、CX。Ck的氨基酸序列見SEQ ID NO :38，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列見SEQ ID N0:37。C γ 1的氨基酸序列見SEQ ID NO :40，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列見SEQ IDNO 390 C γ 2的氨基酸序列見SEQ ID NO :42，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列見SEQ ID N0:41。C γ 4的氨基酸序列見SEQ ID NO :44，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列見 SEQ ID NO :43ο另外，為了改善抗體或其產生的穩(wěn)定性，可以對人抗體C區(qū)進行修飾。人源化時所用的人抗體可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等任何的同種型的人抗體，但在本發(fā)明中優(yōu)選使用 IgG0 作為 IgG，可以使用 IgGU IgG2、IgG3、IgG4 等。需要說明的是，制作人源化抗體后，可以將可變區(qū)(例如CDR、FR)或恒定區(qū)中的氨基酸用其他氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等，本發(fā)明的人源化抗體中還包含上述進行了氨基酸取代等的人源化抗體。在本發(fā)明的抗體中，只要與IL-6受體具有結合活性和/或中和活性即可，不僅包含IgG所代表的二價抗體，還包含一價抗體或IgM所代表的多價抗體。本發(fā)明的多價抗體中包含具有完全相同的抗原結合部位的多價抗體或具有一部分不同或完全不同的抗原結合部位的多價抗體。本發(fā)明的抗體并不限于抗體的全長分子，只要與IL-6受體蛋白結合即可，可以是小分子抗體或其修飾物。小分子抗體是包含全長抗體(whole antibody，例如whole IgG等)的一部分發(fā) 生缺失的抗體片段的抗體，只要與IL-6受體具有結合活性和/或中和活性即可，沒有特別限定。在本發(fā)明中，小分子抗體只要包含全長抗體的一部分即可，沒有特別限定，優(yōu)選包含 VH或VL，特別優(yōu)選為包含VH和VL兩者的小分子抗體。另外，本發(fā)明的小分子抗體的其他優(yōu)選例子有包含抗體的CDR的小分子抗體。小分子抗體所含的CDR可以包含抗體的全部 6個⑶R，也可以包含部分⑶R。本發(fā)明中的小分子抗體優(yōu)選比全長抗體的分子量小，例如有時還會形成二聚體、三聚體、四聚體等多聚物等，其分子量有時比全長抗體的分子量大?？贵w片段的具體例子有例如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv等。小分子抗體的具體例子有例如 Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv(單鏈 Fv)、雙抗體、sc(Fv)2(單鏈(Fv) 2)等。這些抗體的多聚物(例如二聚體、三聚體、四聚體、聚合物)也包含在本發(fā)明的小分子抗體內?？贵w片段例如可以通過用酶處理抗體生成抗體片段而得到。作為生成抗體片段的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或者纖溶酶等是公知的?；蛘撸瑯嫿ň幋a上述抗體片段的基因，將其導入表達載體中，之后可以使之在適當的宿主細胞中表達(例如參照 Co，M. S.等人，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976 ;Better，M. & Horwitz， Α. H. Methodsin Enzymology(1989) 178,476-496 ；Pluckthun, A. & Skerra， A. Methodsin Enzymology(1989) 178,476-496 ；Lamoyi, Ε. ， Methods inEnzymology(1989) 121,652-663 ； Rousseaux, J.等 K, Methods inEnzymology (1989) 121,663-669 ；Bird, R. E.等人， TIBTECH(1991)9,132-137)。消化酶切斷抗體片段的特定位置，產生下述特定結構的抗體片段。對于利用上述酶得到的抗體片段，當應用基因工程學方法時，可以使抗體的任意部分缺失。使用上述消化酶時得到的抗體片段如下。木瓜蛋白酶消化F (ab) 2或Fab
胃蛋白酶消化F (ab，)2或Fab，纖溶酶消化Facb
本發(fā)明中的小分子抗體只要與IL-6受體具有結合活性和/或中和活性即可，可以包含缺失了任意區(qū)的抗體片段。雙抗體是指通過基因融合構建的二價(bivalent)抗體片段(Holliger P等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)、EP404, 097 號、W093/11161 號等)。雙抗體是由兩條多肽鏈構成的二聚體。通常，構成二聚體的多肽鏈各自在相同鏈中VL和VH經由接頭進行結合。雙抗體中的接頭通常短至VL和VH彼此無法結合。具體而言，構成接頭的氨基酸殘基例如為5個殘基左右。因此，編碼在同一多肽鏈上的VL和VH無法形成單鏈可變區(qū)片段，而是與其他單鏈可變區(qū)片段形成二聚體。其結果，雙抗體具有2個抗原結合部位。scFv抗體是將VH和VL通過接頭等結合形成單鏈多肽的抗體(Huston，J. S.等 A, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1988)85,5879-5883 ；Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，，第 113 卷，Resenburg 禾口 Moore 編，Springer Verlag, New York, 第269-315頁，(1994))。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以來自本說明書所記載的任一種抗體。對連接V區(qū)的肽接頭沒有特別限定。例如可以使用包含3 25個殘基左右的任意單鏈肽作為接頭。具體而言，例如可以使用后述的肽接頭等。兩鏈的V區(qū)例如可以按照上述PCR法進行連接。為了利用PCR法連接V區(qū)，首先在下述DNA中，利用編碼全部或所期望的部分氨基酸序列的DNA作為模板。編碼抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA序列、以及
編碼抗體的L鏈或L鏈V區(qū)的DNA序列通過使用了具有與應擴增的DNA兩端序列對應的序列的一對引物的PCR法，分別擴增編碼H鏈和L鏈的V區(qū)的DNA。之后，準備編碼肽接頭部分的DNA。編碼肽接頭的DNA 也可以利用PCR來合成。此時，可以在利用的引物的5’側添加能夠與另外合成的各V區(qū)的擴增產物連接的核苷酸序列。之后，利用[H鏈V區(qū)DNA]-[肽接頭DNA]-[L鏈V區(qū)DNA]的各DNA和裝配PCR用引物進行PCR反應。裝配PCR用引物包含在[H鏈V區(qū)DNA]的5，側退火的引物和在[L鏈V區(qū)DNA] 的3’側退火的引物的組合。即，裝配PCR用引物是指能夠擴增編碼應合成的scFv的全長序列的DNA的引物組。另一方面，在[肽接頭DNA]中添加能夠與各V區(qū)DNA連接的核苷酸序列。其結果，上述DNA被連接起來，再通過裝配PCR用引物最終以擴增產物的形式生成全長scFv。若暫且制作編碼scFv的DNA，則按照常規(guī)方法可以取得含有這些DNA的表達載體和通過該表達載體進行轉化的重組細胞。其結果，通過培養(yǎng)所得的重組細胞，使編碼該scFv 的DNA表達，可以取得該scFv。對所結合的VH和VL的順序沒有特別限定，可以按照任意順序進行排列，例如有下述排列。[VH]接頭[VL][VL]接頭[VH]sc (Fv) 2是將2個VH和2個VL通過接頭等結合形成單鏈的小分子抗體(Hudson 等人，J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc (Fv) 2 例如可以通過用接頭連接 scFv來制作。另外，優(yōu)選2個VH和2個VL以單鏈多肽的N末端側為基點按照VH、VL、VH、VL ([VH] 接頭[VL]接頭[VH]接頭[VL])的順序進行排列為特征的抗體，2個VH和2個VL的順序并非特別限于上述排列，可以按照任意順序進行排列。例如有下述排列。[VL]接頭[VH]接頭[VH]接頭[VL][VH]接頭[VL]接頭[VL]接頭[VH][VH]接頭[VH]接頭[VL]接頭[VL][VL]接頭[VL]接頭[VH]接頭[VH][VL]接頭[VH]接頭[VL]接頭[VH]可以對小分子抗體中VH或VL的氨基酸序列進行取代、缺失、添加和/或插入。并且，當使VH與VL締合時，只要具有抗原結合活性即可，可以使一部分缺失，還可以添加其他多肽。另外，可以將可變區(qū)嵌合化或人源化。在本發(fā)明中，連接抗體可變區(qū)的接頭可以使用能通過基因工程導入的任意的肽接頭或合成化合物接頭、例如Protein Engineering，9 (3)，299-305，1996中公開的接頭。在本發(fā)明中，優(yōu)選的接頭為肽接頭。對肽接頭的長度沒有特別限定，本領域技術人員可以根據目的適當選擇，但通常為1 100氨基酸、優(yōu)選3 50氨基酸、進一步優(yōu)選5 30氨基酸、特別優(yōu)選為12 18氨基酸(例如15氨基酸)。作為肽接頭的氨基酸序列，例如有下述序列。SerGly · SerGly · Gly · SerSer · Gly · GlyGly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO 45)Ser · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO 46)Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO 47)Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO 48)Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO 49)Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO 50)Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO 51)Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO 52)(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (SEQ ID NO :47))n(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (SEQ ID NO :48))n[η為1以上的整數]等。關于肽接頭的氨基酸序列，本領域技術人員根據目的可以適當選擇。例如，決定上述肽接頭長度的η通常為1 5，優(yōu)選1 3，更優(yōu)選為1或2。合成化合物接頭(化學交聯(lián)劑)是通常用于肽交聯(lián)的交聯(lián)劑，例如有Ν-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)、辛二酸雙(磺基琥珀酰亞胺酯)(BS3)、二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺酯)(DSP)、二硫代雙(丙酸磺基琥珀酰亞胺酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀酸琥珀酰亞胺酯)(EGS)、乙二醇雙(琥珀酸磺基琥珀酰亞胺酯)(Sulfo-EGS)、二琥珀酰亞氨基酒石酸鹽(DST)、二磺基琥珀酰亞氨基酒石酸鹽(Sulfo-DST)、雙[2-(琥珀酰亞氨氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、雙[2-(磺基琥珀酰亞氨氧基羰基氧基)乙基] 砜(Sulfo-BSOCOES)等，上述交聯(lián)劑市場上可以買到。在連接4個抗體可變區(qū)時，通常需要3個接頭。這些接頭可以使用相同的也可以使用不同的。本發(fā)明的抗體還包括在本發(fā)明抗體的氨基酸序列中添加有1個或多個氨基酸殘基的抗體。上述抗體與其他肽或蛋白融合的融合蛋白也包括在內。制作融合蛋白的方法可以采用本領域技術人員所公知的方法，例如連接編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸與編碼其它肽或多肽的多核苷酸使構架一致，之后將其導入表達載體中，使之在宿主中表達即可。作為用于與本發(fā)明抗體融合的其他肽或多肽，例如有FLAG(Hopp，Τ. P.等人，Bio Technology (1988) 6，1204-1210)、包含 6 個 His (組氨酸)殘基的 6XHis、10XHis、流感血凝素(HA)、人 c-myc 片段、VSV-GP 片段、pl8HIV 片段、T7_tag、HSV-tag、Ε-tag, SV40T 抗原片段、lCktag、a-微管蛋白片段、B-tag、蛋白C片段等公知的肽。另外，作為用于與本發(fā)明抗體融合的其他多肽，例如有GST (谷胱甘肽-S-轉移酶)、HA (流感血凝素)、免疫球蛋白恒定區(qū)、β-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖結合蛋白)等。使編碼市售的上述肽或多肽的多核苷酸與編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸融合，并使由此制備的融合多核苷酸表達，從而可以制備融合多肽。本發(fā)明的抗體可以是與聚乙二醇(PEG)或透明質酸等高分子物質、放射性物質、熒光物質、發(fā)光物質、酶、毒素等各種分子結合的綴合抗體。上述綴合抗體可以通過對所得抗體實施化學修飾而得到。需要說明的是，抗體的修飾方法在該領域已經確立(例如 US5057313、US5156840)。本發(fā)明中的“抗體”還包含上述綴合抗體。本發(fā)明的抗體還包含糖鏈發(fā)生修飾的抗體。并且，本發(fā)明所使用的抗體可以是雙重特異性抗體(雙特異性抗體，bispecific antibody)。雙重特異性抗體是指在同一抗體分子內具有識別不同表位的可變區(qū)的抗體。本發(fā)明中，雙重特異性抗體可以是識別IL-6受體分子上的不同表位的雙重特異性抗體，還可以是其中一個抗原結合部位識別IL-6受體、另一個抗原結合部位識別其他物質的雙重特異性抗體。作為包含識別IL-6受體的本發(fā)明抗體的雙重特異性抗體的另一個抗原結合部位所結合的抗原，例如有:IL-6,TNFa , TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-I α， IL-β，IL-1R, RANKL, RANK, IL-17，IL-17R，IL-23，IL-23R，IL-15，IL-15R，BlyS，淋巴細胞毒素 α，淋巴細胞毒素 β，LIGHT 配體，LIGHT，VLA-4, CD25, IL-12，IL-12R，CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32，IL-21，IL-21R，GM-CSF, GM-CSFR，M-CSF, M-CSFR，IFN-α，VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL, APRILR 等。用于制備雙重特異性抗體的方法是公知的。例如，使識別抗原不同的2種抗體結合，可以制作雙重特異性抗體。進行結合的抗體可以是分別具有H鏈和L鏈的1/2分子，也可以是僅包含H鏈的1/4分子?；蛘撸巩a生不同單克隆抗體的雜交瘤融合，也可以制作雙重特異性抗體產生融合細胞。還可以利用基因工程學方法制作雙重特異性抗體。如后所述，本發(fā)明的抗體根據產生抗體的細胞或宿主或者純化方法而在氨基酸序列、分子量、等電點、或是否具有糖鏈、或構象等方面有所不同。但所得抗體只要與本發(fā)明的抗體具有同等的功能，即包含在本發(fā)明中。例如，使本發(fā)明的抗體在原核細胞、例如大腸桿菌中表達時，在原抗體(original antibody)的氨基酸序列的N末端添加甲硫氨酸殘基。本發(fā)明的抗體也包括這樣的抗體。本發(fā)明的抗IL-6受體抗體等多肽可以利用本領域技術人員所公知的方法進行制備。例如，根據所得抗IL-6受體抗體的序列，使用本領域技術人員所公知的基因重組技術，可以制作抗IL-6受體抗體。具體而言，根據識別IL-6受體的抗體的序列，構建編碼抗體的多核苷酸，將其導入表達載體中，之后使之在適當的宿主細胞中表達即可(例如參照 Co, M. S.等人，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976 ；Better, Μ. and Horwitz, Α. H.， Methods Enzymo1. (1989) 178,476-496 ；Pluckthun, A. and Skerra, Α. , Methods Enzymo1. (1989) 178,497-515 ；Lamoyi, Ε.，Methods Enzymol. (1986) 121,652-663 ；Rousseaux, J.等人，Methods Enzymol. (1986) 121,663-669 ；Bird, R. E. and Walker, B. W.，Trends Biotechnol. (1991)9,132-137) 因此，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的多肽、或由編碼本發(fā)明多肽的基因編碼的多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)宿主細胞的步驟，所述宿主細胞包含導入有編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的載體。更具體而言，提供本發(fā)明的多肽的制備方法，該方法包括以下步驟。(a)培養(yǎng)宿主細胞的步驟，所述宿主細胞包含導入有編碼本發(fā)明多肽的基因的載體；(b)取得由該基因編碼的多肽的步驟。載體的例子有M13系載體、pUC 系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script 等。為了亞克隆、切除cDNA時，除上述載體外，例如還有pGEM-T、pDIRECT、pT7等。為了生產本發(fā)明的抗體而使用載體時，表達載體特別有用。作為表達載體，例如為了在大腸桿菌中表達時，載體除了具有在大腸桿菌中擴增的特征外，還必須持有可以在JM109、DH5 α、 ΗΒ101、XLl-Blue等大腸桿菌宿主中高效率地表達的啟動子、例如IacZ啟動子(Ward等人，Nature (1989) 341，544-546 ；FASEB J. (1992)6,2422-2427)、araB 啟動子(Better 等人，Science (1988) 240，1041-1043)或T7啟動子等。作為這樣的載體，除上述載體外，還有 pGEX-5X-l (Pharmacia M )、"QIAexpress system" (Quiagen M )、pEGFP ■ pET (ift時
優(yōu)選表達T7 RNA聚合酶的BL21)等。在表達質粒的載體中可以包含用于抗體分泌的信號序列。作為用于抗體分泌的信號序列，當向大腸桿菌的周質中產生時，可以使用PelB信號序列(Lei，S.P.等人， J. Bacteriol. (1987) 169，4379)。例如可以利用氯化鈣法、電穿孔法將載體導入宿主細胞中。除大腸桿菌外，作為用于制備本發(fā)明抗體的載體，例如還有來源于哺乳動物的表達載體(例如 pcDNA3 (Invitrogen 社制)或 pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990，18 (17)，第5322頁)、pEF、pCDM8)；來源于昆蟲細胞的表達載體(例如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達系統(tǒng)”(Gibco-BRL制)、pBacPAK8)；來源于植物的表達載體(例如pMHl、pMH2)；來源于動物病毒的表達載體(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)；來源于反轉錄病毒的表達載體(例如 pZIPneo)；來源于酵母的表達載體(例如“Pichia Expression試劑盒”(Invitrogen制)、 pNVIU SP-QO1)；來源于枯草桿菌的表達載體(例如pPL608、pKTH50)。
為了在CH0細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞中表達時，表達質粒的載體必須具有在細胞內表達所必需的啟動子、例如SV40啟動子(Mulligan等人， Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR 啟動子、EF1 a 啟動子(Mizushima 等人，Nucleic Acids Res. (1990) 18，5322)、CMV啟動子等，進一步優(yōu)選具有用于選擇轉化細胞的基因(例如可用藥物(新霉素、G418等)判別的耐藥性基因)。作為具有上述特性的載體，例如有pMAM、 pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、p0P13 等。并且，為了穩(wěn)定表達基因且擴增細胞內的基因拷貝數時，可以列舉以下方法，即向缺乏核酸合成路徑的CH0細胞中導入填補該路徑的具有DHFR基因的載體(例如 pSV2~dhfr("Molecular Cloning第二片反”Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)) 等)，再用甲氨蝶呤(MTX)擴增該載體的方法。另外，為了瞬時表達基因，可以列舉以下方法，即使用染色體上具有表達SV40 T抗原的基因的COS細胞，用持有SV40的復制起點的載體(pcD等)進行轉化的方法。復制起點可以使用來源于多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒 (BPV)等的起點。為了在宿主細胞系中擴增基因拷貝數，表達載體可以進一步含有氨基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt) 基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記。如此操作而得到的本發(fā)明抗體，可以將其從宿主細胞內或細胞外(培養(yǎng)基等)分離，并純化成實質上純粹且均勻的抗體?？贵w的分離、純化可以使用通?？贵w的純化中所使用的分離、純化方法，但沒有任何限制。例如，可以適當選擇、組合層析柱、過濾器、超濾、鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、重結晶等來分離、純化抗體。層析例如有親合層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析、吸附層析 ^ (Strategies for Protein Purification andCharacterization (SSMt'tift.^^/^^ 驗指南):A Laboratory CourseManual. Ed Daniel R.Marshark 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996)。上述層析可以使用液相層析例如HPLC、FPLC等來進行。用于親合層析的柱有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有HyperD，P0R0S，S印harose FF(GE Amersham Biosciences)等。本發(fā)明還包含利用上述純化方法被高度純化的抗體。所得抗體與IL-6受體的結合活性可以利用本領域技術人員所公知的方法進行測定。例如，作為測定抗體的抗原結合活性的方法，可以采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、 EIA(酶免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)或熒光抗體法。例如，采用酶免疫測定法時，在包被有抗原的平板上加入含有抗體的試樣、例如抗體產生細胞的培養(yǎng)上清或純化抗體。添加用堿性磷酸酶等酶標記的二次抗體并溫育平板，清洗后加入對硝基苯磷酸等酶底物，之后測定吸光度，從而可以評價抗原結合活性。藥物組合物本發(fā)明還提供含有上述多肽作為有效成分的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可用于與IL-6相關的類風濕性關節(jié)炎等疾病。即，本發(fā)明還提供以上述抗體作為有效成分的類風濕性關節(jié)炎等疾病的治療劑。作為本發(fā)明的對象疾病的優(yōu)選例子有類風濕性關節(jié)炎、幼年特發(fā)性關節(jié)炎、全身型幼年特發(fā)性關節(jié)炎、卡斯爾曼病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎、克羅恩氏病(Crohn’ s disease)、淋巴瘤、潰瘍性大腸炎、貧血、血管炎、川崎病、Still 病、淀粉樣變性病、多發(fā)性硬化癥、移植、老年性黃斑變性、強直性脊椎炎、干癬、干癬性關節(jié)炎、慢性阻塞性肺病(C0PD)、IgA腎病、變形性關節(jié)癥、哮喘、糖尿病性腎病、GVHD、子宮內膜癥、肝炎(NASH)、心肌梗塞、動脈硬化、敗血癥、骨質疏松癥、糖尿病、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、腎癌、B細胞性非霍奇金淋巴瘤、胰癌、肺癌、食道癌、大腸癌、癌惡液質、癌神經浸潤、心肌梗塞、近視性脈絡膜新生血管、特發(fā)性脈絡膜新生血管、葡萄膜炎、慢性甲狀腺炎、延遲性過敏癥、接觸性皮炎、特應性皮炎、間皮瘤、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、全葡萄膜炎、前葡萄膜炎、中間葡萄膜炎、鞏膜炎、角膜炎、眼眶炎癥、視神經炎、糖尿病視網膜病變、增生性玻璃體視網膜病變、干眼、術后炎癥等，但并不限于這些?！昂锌笽L-6受體抗體作為有效成分”是指含有抗IL-6受體抗體作為至少一種活性成分，對其含有率沒有限定。本發(fā)明的藥物組合物除含有上述多肽外，可以一并含有其他有效成分。需要說明的是，本發(fā)明的藥物組合物不僅用于治療目的，還可用于預防目的。本發(fā)明的多肽可以按照常規(guī)方法制成制劑(例如，Remington' sPharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U. S. A)。并且，根據需要，可以同時含有藥物上可接受的載體和/或添加劑。例如可以含有表面活性劑(PEGJween 等)、賦形劑、抗氧劑(抗壞血酸等)、著色劑、著香劑、保存劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑(磷酸、枸櫞酸、其他有機酸等)、螯合劑(EDTA等)、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、矯味劑等。但本發(fā)明的炎癥性疾病的預防或治療劑并不限于這些，可以適當含有其他常用的載體。具體有輕質硅酸酐、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、淀粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯縮醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機堿等。此外，可以含有其他小分子的多肽、血清白蛋白、明膠和免疫球蛋白等蛋白、以及氨基酸。制成注射用水溶液時，例如可以將抗IL-6受體抗體溶于含有生理鹽水、葡萄糖或其他輔劑的等滲溶液中。作為輔劑，例如有D-山梨醇、D-倭勒米糖、D-甘露醇、氯化鈉，還可以與適當的助溶劑、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性表面活性劑(聚山梨酯80、HC0-50)等結合使用。此外，根據需要，可以將多肽封入微囊(羥甲基纖維素、明膠、聚甲基丙烯酸甲酯] 等的微囊)中、或者制成膠體給藥系統(tǒng)(脂質體、白蛋白微球、微乳、納米微粒和納米囊等) (參照 Remington，s PharmaceuticalScience 第 16 版，Oslo Ed. (1980)等)。并且，將藥物制成緩釋制劑的方法也已公知，可應用于多肽(Langer等人，J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15 167-277 ；Langer, Chem. Tech. (1982) 12 :98_105 ；美國專利第 3，773，919 號；歐州專利申請公開(EP)第 58，481 號；Sidman 等人，Biopolymers (1983) 22 :547_56 ；EP 第 133，988號)。并且，通過在本劑中添加或者混合透明質酸酶，還可以增加皮下給藥的液量 (例如 W02004/078140 等)。本發(fā)明的藥物組合物可以口服給藥，也可以胃腸外給藥，但優(yōu)選胃腸外給藥。具體而言，對患者進行注射給藥和經皮給藥。注射劑型的例子有例如可以通過靜脈內注射、肌肉內注射或皮下注射等進行全身或局部給藥。可以對治療部位或其周邊進行局部注入，特別是肌肉內注射。經皮給藥劑型的例子有例如軟膏劑、凝膠劑、霜劑、濕布劑和貼劑等，可以進行全身或局部給藥。此外，可以根據患者的年齡、癥狀選擇適當的給藥方法。給藥量例如可以是每次每1kg體重在0. 000lmg 100mg的范圍內選擇活性成分?；蛘?，例如對病
24人給藥時，每名患者以0. 001 1000mg/kg體重的范圍選擇活性成分，每次的給藥量例如優(yōu) 選含有0. 01 50mg/kg體重左右的量的本發(fā)明抗體。但本發(fā)明的藥物組合物并不限于上述給藥量。需要說明的是，本發(fā)明中記載的氨基酸序列中所含的氨基酸有時在翻譯后會經受修飾(例如N末端的谷氨酰胺通過焦谷氨?；?pyroglutamylation)修飾成焦谷氨酸，這是本領域技術人員所熟知的修飾)，即使是按照這種方式將氨基酸翻譯后進行修飾，當然也包含在本發(fā)明所記載的氨基酸序列中。進行結合的糖鏈的結構可以是任何結構。EU編號的第297位糖鏈可以是任何的糖鏈結構(優(yōu)選巖藻糖基化的糖鏈)，也可以不結合糖鏈(例如可以在大腸桿菌中生產、或者進行修飾使糖鏈不結合在EU編號的第297位上)。需要說明的是，本說明書中引用的所有在先技術文獻均作為參照而納入本說明書中。
實施例以下，通過實施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實施例。[實施例1]提高T0CILIZUMAB與IL_6受體的親和性的可變區(qū)突變位點的鑒定為了提高 T0CILIZUMAB(H 鏈 WT-IgGl/SEQ ID NO :53、L 鏈 WT_ k/SEQ ID NO 54) 與IL-6受體的親和性，制作在CDR序列中導入有突變的文庫進行研究。篩選在CDR中導入有突變的文庫，結果發(fā)現了提高與IL-6受體的親和性的突變，將其匯總在圖1中。組合有這些突變的高親和性 T0CILIZUMAB 的例子有RDC_23(H 鏈 RDC23H_IgGl/SEQ ID NO :55、L 鏈RDC-23L- k /SEQ ID NO 56)。將RDC-23的與可溶型IL_6受體的親和性和BaF/gpl30所產生的生物活性、與T0CILIZUMAB進行比較(方法參照參考例)。親和性的測定結果見表1。BaF/gpl30所產生的生物活性(IL-6終濃度為30ng/ mL)的測定結果見圖2。結果發(fā)現與T0CILIZUMAB相比，RDC-23的親和性提高約60倍，作為BaF/gpl30的100%抑制濃度，提高約100倍活性。[表 1] [實施例2]提高由T0CILIZUMAB的等電點降低引起的藥物動力學的突變的鑒定為了提高T0CILIZUMAB的藥物動力學，研究在不使與IL_6受體的結合大幅下降的情況下可以降低可變區(qū)的等電點的突變位點。篩選由T0CILIZUMAB的立體結構模型推測的可變區(qū)突變位點，結果發(fā)現了在不使與IL-6受體的結合大幅下降的情況下可以降低可變區(qū)的等電點的突變位點，將它們匯總在圖3中。組合有這些突變的等電點降低T0CILIZUMAB 的例子有H53/L28 (H 鏈 H53_IgGl/SEQ ID NO :57、L 鏈 L28- k /SEQ ID NO 58)。將 H53/ L28的與可溶型IL-6受體的親和性、BaF/gpl30所產生的生物活性、等電點和在小鼠體內的藥物動力學、與T0CILIZUMAB進行比較(方法參照參考例)。
親和性的測定結果見表2。BaF/gpl30所產生的生物活性(IL-6終濃度為30ng/mL) 的測定結果見圖4。與T0CILIZUMAB相比，H53/L28的親和性提高約6倍，作為BaF/gpl30 的100%抑制濃度，活性提高數倍左右。[表 2] 利用本領域技術人員公知的等電點電泳測定等電點，結果T0CILIZUMAB的等電點為約9. 3，H53/L28的等電點為約6. 5 6. 7，H53/L28與T0CILIZUMAB相比等電點下降約2. 7。通過GENETYX (GENETYX CORPORATION)計算可變區(qū)VH/VL的理論等電點時，T0CILIZUMAB的理論等電點為9. 20，H53/L28的理論等電點為4. 52，H53/L28與 T0CILIZUMAB相比等電點下降約4. 7。為了評價等電點降低了的修飾抗體H53/L28的藥物動力學，比較T0CILIZUMAB 和H53/L28在正常小鼠體內的藥物動力學。將T0CILIZUMAB和H53/L28以lmg/kg對小鼠(C57BL/6J、日本CharlesRiver)進行靜脈內(IV)和皮下(SC)單次給藥，評價血漿中的濃度變化。T0CILIZUMAB和H53/L28靜脈內給藥后的血漿中濃度變化見圖5，皮下給藥后的血漿中濃度變化見圖6，通過WinNonlir^Pharsight社制)得到的藥物動力學參數 (清除率(CL)、半衰期(T1/2))見表3。H53/L28靜脈內給藥后的血漿中半衰期(T1/2)延長至T0CILIZUMAB的約1. 3倍，清除率下降約1. 7倍。H53/L28皮下給藥后的T1/2延長至 T0CILIZUMAB的約2倍，清除率下降約2. 1倍。結果發(fā)現通過如此地利用氨基酸取代來降低T0CILIZUMAB的等電點，可以大幅提高藥物動力學。[表 3] [實施例3]降低T0CILIZUMAB的免疫原性的突變位點的鑒定降低由存在于可變區(qū) 白勺T細朐,表位產牛的免,疫i^J牛風險的突變位點的鑒定使用TEPITOPE(Methods. 2004 Dec ；34(4) 468-75)分析存在于 T0CILIZUMAB 的可變區(qū)序列中的T細胞表位。其結果，預測L鏈CDR2中存在多個與HLA結合的T細胞表位 (存在免疫原性風險高的序列)。因此，在TEPITOPE分析中，研究了降低L鏈CDR2的免疫原性風險但不降低穩(wěn)定性、結合活性、中和活性的氨基酸取代。篩選的結果發(fā)現通過象下述那樣將T0CILIZUMAB的L鏈⑶R2(SEQ ID NO 59) 的 L51 (Kabat 編號、Kabat EA 等人.1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)的蘇氨酸取代成甘氨酸、將L53的精氨酸取代成谷氨酸(SEQ ID NO :60)，可以在不降低穩(wěn)定性、結合活性、中和活性的情況下降低免疫原性風險。TOCILIZUMAB L鏈 CDR2(SEQ ID NO 59)除去了 T 細胞表位的 TOCILIZUMAB L 鏈 CDR2 (SEQ ID NO 60)[實施例4]TOCILIZUMAB的可變區(qū)構架序列的完全人源化所引起的免疫原性風險的降低在TOCILIZUMAB 的可變區(qū)序列中，H 鏈 FR1 的 H27，H28, H29, H30 和 H 鏈 FR3 的 H71 (Kabat 編號、Kabat EA 等人.1991. Sequencesof Proteins of Immunological Interest. NIH)為了在人源化過程中維持結合活性，在構架序列中殘留有小鼠序列(Cancer Res. 1993 Feb 15；53(4) :851_6)。由于殘留的小鼠序列是提高免疫原性風險的原因，所以為了進一步降低TOCILIZUMAB的免疫原性風險，研究將構架序列完全人源化。結果發(fā)現通過將TOCILIZUMAB的H鏈FR1 (SEQ ID NO 61)取代成下述的人源化 H 鏈 FR1-A(SEQ ID NO :62)、將 TOCILIZUMAB 的 H 鏈 FR3 (SEQ ID NO :63)取代成下述的人源化H鏈FR3 (SEQ IDN0 64)，可以在不降低穩(wěn)定性、結合活性、中和活性的情況下將 TOCILIZUMAB的整個構架完全人源化。TOCILIZUMAB H鏈 FR1(SEQ ID NO 61)人源化H 鏈 FR1-A (SEQ ID NO :62)(來自種系 IMGT hVH_4_)TOCILIZUMAB H鏈 FR3(SEQ ID NO 63)人源化H 鏈 FR3 (SEQ ID NO :64)(來自 Mol. Immunol. 2007,44 (4) -.412-422)[實施例5]用于提高TOCILIZUMAB與IL_6受體的pH依賴性結合的藥物動力學的突變位點的鑒定作為提高TOCILIZUMAB的藥物動力學的方法之一，考慮改良分子使1分子的 TOCILIZUMAB反復結合、中和多個IL-6受體的方法。認為T0CILIZUMAB與膜型IL-6受體結合后，保持與膜型IL-6受體結合的狀態(tài)不變，通過內化整合到細胞內的核內體中，之后 TOCILIZUMAB在與膜型IL-6受體結合的狀態(tài)下直接移至溶酶體中，同時被溶酶體分解。艮口，認為通常1分子的TOCILIZUMAB與1分子 2分子的膜型IL-6受體(一價二價)結合，內化后被溶酶體分解，所以1分子的TOCILIZUMAB只能結合、中和1分子 2分子的膜型 IL-6受體。因此，如圖7所示，認為只要能夠制作出在中性條件下TOCILIZUMAB的結合得到維持而在酸性條件下TOCILIZUMAB的結合大幅降低的pH依賴性結合的TOCILIZUMAB，pH依賴性結合的TOCILIZUMAB在核內體內從作為抗原的膜型IL-6受體上解離，與存在于核內體內的FcRn結合，從而可以返回到血漿中，返回到血漿中的pH依賴性結合的TOCILIZUMAB 可以再次與膜型IL-6受體結合。認為通過反復進行上述在血漿中的結合和在核內體內的解離，1分子的T0CILIZUMAB可以反復結合、中和多個分子的IL-6受體，由此認為與 TOCILIZUMAB相比，pH依賴性結合的TOCILIZUMAB的藥物動力學得到提高。為了使TOCILIZUMAB在核內體內的酸性條件下從IL_6受體上解離，與中性條件下相比必需大幅降低酸性條件下的結合。由于TOCILIZUMAB在細胞表面必需與IL-6受體強有力結合以將其中和，所以在細胞表面的PH7. 4下抗體必需與IL-6受體進行和TOCILIZUMAB 相比為同等程度以上的結合。有報道稱核內體內的pH通常為pH5. 5 pH6.0(Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb ；5 (2) :121_32)，由此認為只要是改良成在 pH5. 5 pH6. 0 下與 IL-6
27受體弱結合的pH依賴性結合的T0CILIZUMAB，在核內體內的酸性條件下即可從IL-6受體上解離。S卩，認為只要是改良成在細胞表面的pH7. 4下與IL-6受體強有力結合、在核內體內的pH5. 5 pH6. 0下與IL-6受體弱結合的pH依賴性結合的T0CILIZUMAB，即可以以1分子與多個IL-6受體結合、中和，由此提高藥物動力學。為了對T0CILIZUMAB與IL-6受體的結合賦予pH依賴性，考慮下述方法將pKa存在于6. 0 6. 5左右、在中性條件下(pH7. 4)與酸性條件下(pH5. 5 pH6. 0)之間質子的解離狀態(tài)發(fā)生變化的組氨酸殘基導入T0CILIZUMAB的可變區(qū)中。因此，篩選由T0CILIZUMAB 的立體結構模型推測的可變區(qū)的組氨酸導入位點。另外，制作設計成T0CILIZUMAB的被選擇的可變區(qū)序列隨機置換成組氨酸的文庫，進行篩選。以在PH7.4下與IL-6受體結合、在 PH5. 5 pH5. 8下從IL-6受體上解離或親和性降低為指標進行篩選。結果發(fā)現了可以賦予T0CILIZUMAB與IL_6受體顯示pH依賴性結合(pH7. 4時結合、pH5. 8時解離的性質)的突變位點，將它們匯總在圖8中。圖8的H27的酪氨酸被取代成組氨酸，這并不是⑶R的突變，而是H鏈的FR1的突變，但如Eur. J. Immunol. 1992. 22 1719-1728所述，H27為組氨酸時的序列以人序列(SEQ ID NO 65)的形式存在，所以通過使用下述的構架，可以與實施例4 一并進行完全人源化。人源化H 鏈 FR1-B (SEQ ID NO 65)組合有上述突變的pH依賴性結合的T0CILIZUMAB的例子有H3pI/L73 (H鏈 H3pI-IgGl/SEQ ID NO :66、L 鏈 L73-k/SEQ ID NO :67)。將 H3pl/L73 的在 pH7. 4 下與可溶型IL-6受體的親和性、在pH7. 4和pH5. 8下從膜型IL-6受體上的解離速度、BaF/gpl30所產生的生物活性以及在食蟹猴和人IL-6受體轉基因小鼠體內的藥物動力學、與T0CILIZUMAB 進行比較(方法參照參考例)。在pH7. 4下與可溶型IL-6受體的親和性的測定結果見表4。BaF/gpl30所產生的生物活性(IL-6終濃度為30ng/mL)的測定結果見圖9。顯示出H3pl/L73與T0CILIZUMAB 相比具有大致相同的、在PH7. 4下與可溶型IL-6受體的親和性和BaF/gpl30的活性。[表 4] T0CILIZUMAB和H3pl/L73在pH7. 4和pH5. 8下從膜型IL-6受體上的解離速度的測定結果見表5。顯示出與T0CILIZUMAB相比，H3pl/L73在pH5. 8時的解離速度變快，從膜型IL-6受體上的解離速度的pH依賴性提高約2. 6倍。[表 5] 將T0CILIZUMAB和H3pl/L73以lmg/kg對食蟹猴進行靜脈內單次給藥，評價血漿中濃度變化。T0CILIZUMAB和H3pl/L73靜脈內給藥后的血漿中濃度變化見圖10。其結果，與T0CILIZUMAB相比，H3pl/L73在食蟹猴體內的藥物動力學大幅改善。將T0CILIZUMAB 和 H3pl/L73 以 25mg/kg對人 IL-6 受體轉基因小鼠(hIL_6R tg 小鼠、Proc Natl Acad Sci USA. 1995 May 23 ；92(11) 4862-6)進行靜脈內單次給藥，評價血漿中濃度變化。T0CILIZUMAB和H3pl/L73靜脈內給藥后的血漿中濃度變化見圖11。其結果，與T0CILIZUMAB相比，H3pl/L73在人IL-6受體轉基因小鼠體內的藥物動力學大幅改
口 o與T0CILIZUMAB相比，pH依賴性結合的T0CILIZUMAB、即H3pl/L73在食蟹猴和人 IL-6受體轉基因小鼠體內的藥物動力學大幅改善，由此認為通過賦予在pH7. 4時與抗原結合、在PH5. 8時從抗原上解離的性質，1分子的H3pl/L73可以和多個IL-6受體進行結合、中和。另外，認為通過對與IL-6受體的結合賦予比H3pl/L73更強的pH依賴性，可以進一步改善藥物動力學。[實施例6]T0CILIZUMAB的恒定區(qū)的最優(yōu)化TOCILIZUMAB H鏈C末端的異質件的降低作為IgG抗體H鏈C末端序列的異質性，有人報道了由C末端氨基酸的賴氨酸殘基的缺失、以及C末端的甘氨酸、賴氨酸這2個氨基酸均缺失引起的C末端羧基的酰胺化 (Anal Biochem. 2007 Jan 1 ；360(1) :75_83)。即使在 TOCILIZUMAB 中，其主要成分也是存在于核苷酸序列上的C末端氨基酸的賴氨酸通過翻譯后修飾發(fā)生缺失的序列，但殘留有賴氨酸的副成分、和甘氨酸、賴氨酸均缺失所引起的C末端羧基的酰胺化的副成分也作為異質性而存在。在維持目標物質/相關物質的異質性的制造間差的同時以藥品的形式大量制造，這并不容易，而且成本也增加，所以希望盡可能是單一物質，在開發(fā)抗體作為藥品時，希望降低上述異質性。因此，以藥品形式進行開發(fā)時，希望H鏈C末端的異質性不存在。為了降低C末端氨基酸的異質性而對C末端氨基酸進行修飾。結果發(fā)現，通過使TOCILIZUMAB H鏈恒定區(qū)的C末端的賴氨酸和甘氨酸預先在核苷酸序列上缺失，可以避免來自C末端的異質性。利用陽離子交換色譜評價TOCILIZUMAB、C末端缺失賴氨酸的 TOCILIZUMAB (TOCILIZUMAB A K、H鏈WT-IgGl A K/SEQ ID NO :68、L鏈WT_ k/SEQ ID NO 54) 和 C 末端缺失賴氨酸和甘氨酸的 TOCILIZUMAB (TOCILIZUMAB A GK、H 鏈 WT-IgGl A GK/SEQ IDN0 :69、L鏈WT-k/SEQ ID NO :54)的異質性。柱使用 ProPac WCX-10,4X 250mm(Dionex), 流動相 A 使用 25mmol/L MES/NaOH, pH6. 1 ；流動相 B 使用 25mmol/L MES/NaOH, 250mmol/ L NaCl, pH6. 1，采用適當的流量和梯度進行實施。利用陽離子交換色譜進行評價的結果見圖12。其結果，通過預先使不僅H鏈恒定區(qū)C末端的賴氨酸、H鏈恒定區(qū)C末端的賴氨酸和甘氨酸也均在核苷酸序列上缺失，首次發(fā)現可以降低C末端氨基酸的異質性。在人抗體恒定區(qū)IgGl、IgG2、IgG4中，C末端序列均為EU編號(參照Sequences of proteins of immunologicalinterest, NIH Publication No. 91-3242)第 447 位變?yōu)橘嚢彼帷⒌?446 位變?yōu)楦拾彼?，由此認為本研究中發(fā)現的、降低C末氨基酸的異質性的方法也可用于IgG2恒定區(qū)和IgG4恒定區(qū)或它們的變體。TOCILIZUMAB的1^2同種型中來自二硫鍵的異質性的下降TOCILIZUMAB的同種型是IgGl，但由于TOCILIZUMAB是中和抗體，所以在考慮免
29疫原性和副作用時，認為與FcY受體的結合有可能并不優(yōu)選。作為降低與FCY受體的結合的方法，考慮將IgG抗體的同種型從IgGl變成IgG2或IgG4的方法(Ann Hematol. 1998 Jun;76(6) :231-48)，從與Fcy受體I的結合和藥物動力學的角度考慮，與IgG4相比，更優(yōu)選 IgG2(Nat Biotechnol. 2007 Dec ;25 (12) 1369-72)。另一方面，開發(fā)抗體作為藥品時，其蛋白的理化性質、其中均勻性和穩(wěn)定性極其重要，關于IgG2同種型，有報道稱其來自鉸鏈區(qū)的二硫鍵的異質性非常多(J Biol Chem. 2008 Jun 6 ；283 (23) 16206-15) 0在維持來自其的目標物質/相關物質的異質性的制造間差的同時以藥品的形式大量制造，這并不容易，而且成本增加，所以希望盡可能是單一物質。因此，開發(fā)IgG2同種型的抗體作為藥品時，希望在不降低穩(wěn)定性的情況下使來自二硫鍵的異質性降低。為了降低IgG2同種型的異質性，對各種變體進行了研究，結果發(fā)現在IgG2恒定區(qū)序列中，通過WT-SKSC(SEQ ID NO :70)可以在不降低穩(wěn)定性的情況下降低異質性，所述 WT-SKSC是指將存在于H鏈的CH1結構域的EU編號第131位的半胱氨酸和第133位的精氨酸分別取代成絲氨酸和賴氨酸、并且將存在于H鏈的上鉸鏈(upper hinge)的EU編號第219位的半胱氨酸取代成絲氨酸的恒定區(qū)。制備T0CILIZUMAB-IgGl(H鏈WT-IgGl/SEQ ID NO :53、L 鏈 WT- k /SEQ ID NO 54)、T0CILIZUMAB_IgG2 (H 鏈 WT-IgG2/SEQ IDN0 :71、L 鏈 WT- k /SEQ ID NO 54)和 TOCILIZUMAB-SKSC (H 鏈 WT-SKSC/SEQ ID NO :70、L 鏈 WT- K / SEQ ID NO :54)，評價異質性和穩(wěn)定性。異質性的評價通過陽離子交換色譜來進行。柱使用ProPacWCX-lO(Dionex)，流動相A使用20mM乙酸鈉，pH5. 0 ；流動相B使用20mM乙酸鈉、 1M NaCl、pH5.0 ；采用適當的流量和梯度來實施。利用陽離子交換色譜進行評價的結果見圖 13。穩(wěn)定性評價通過使用差示掃描量熱法(DSC) (VP-DSC、Microcal社制)進行的熱變性中間溫度(Tm值)的評價來實施。在20mM乙酸鈉、150mM NaCl、pH6. 0的條件下，DSC測定結果和Fab結構域的Tm值見圖14。結果發(fā)現與TOCILIZUMAB-IgGl相比，T0CILIZUMAB_IgG2的異質性顯著增大，但通過形成T0CILIZUMAB-SKSC，可以大幅降低異質性。與TOCILIZUMAB-IgGl相比， T0CILIZUMAB-IgG2在DSC中的Fab結構域的熱變性峰中確認到認為是由雜成分產生的、穩(wěn) 定性低即Tm低的肩峰(Fab)成分，但通過形成TOCILIZUMAB-SKSC，認為是由雜成分產生的 Tm值低的肩峰消失，顯示出與TOCILIZUMAB-IgGl和T0CILIZUMAB_IgG2的Fab結構域同等的約94°C的Tm值，由此發(fā)現T0CILIZUMAB-SKSC具有高穩(wěn)定性。提高T0CILIZUMAB的藥物動力學的恒定區(qū)突變位點的鑒定如上所述，發(fā)現由作為T0CILIZUMAB的同種型的IgGl可以降低C末端的異質性、以及可以在降低與Fc y受體的結合性且維持高穩(wěn)定性的狀態(tài)下降低IgG2同工型的恒定區(qū) 的抗體的異質性，但關于藥物動力學，也希望是比T0CILIZUMAB的同種型-IgGl具有優(yōu)異的恒定區(qū)。為了找到比IgGl同種型的恒定區(qū)的抗體具有優(yōu)異的血漿中半衰期的恒定區(qū)，對于具有高穩(wěn)定性、與IgG2同種型恒定區(qū)的抗體有關的上述異質性已降低的 TOCILIZUMAB-SKSC，為了提高其藥物動力學，篩選突變位點，結果發(fā)現了將WT-SKSC的EU 編號第137位的谷氨酸取代成甘氨酸、將第138位的絲氨酸取代成甘氨酸、將第268位的組氨酸取代成谷氨酰胺、將第355位的精氨酸取代成谷氨酰胺、將第419位的谷氨酰胺取代成谷氨酸、除此以外為了降低H鏈C末端的異質性而使第446位的甘氨酸和第447位的賴氨酸缺失的WT-M58(SEQ ID NO :72(氨基酸序列))。另一方面，制作了將IgGl的第434位的天冬酰胺取代成丙氨酸的WT-M44(SEQ ID NO :73 (氨基酸序列))。并且，為了降低M44 的H鏈C末端的異質性，制作了使M44的第446位的甘氨酸和第447位的賴氨酸缺失的 WT-M83 (SEQ ID NO 74 (氨基酸序列))。制作了將WT-M58的第434位的天冬酰胺取代成丙氨酸的WT-M73 (SEQ ID NO 75(氨基酸序列))。制備T0CILIZUMAB-M44 (H 鏈 WT-M44/SEQ ID NO :73、L 鏈 WT- k /SEQ ID NO 54)、T0CILIZUMAB-M58(H 鏈 WT-M58/SEQ IDNO :72、L 鏈 WT-k/SEQ ID NO 54)禾口 T0CILIZUMAB-M73 (H 鏈 WT-M73/SEQ ID NO :75、L 鏈 WT- k /SEQ ID NO 54)，評價與人 FcRn 的親和性和在人FcRn轉基因小鼠體內的藥物動力學(方法參照參考例)。利用Biacore 評價 TOCILIZUMAB-IgGl、T0CILIZUMAB-M44、T0CILIZUMAB-M58 和 T0CILIZUMAB-M73 與人 FcRn 的結合性，結果見表 6，T0CILIZUMAB-M44、T0CILIZUMAB_M58 和 T0CILIZUMAB-M73的結合性分別比TOCILIZUMAB-IgGl強約2. 7倍、約1. 4倍和約3. 8倍左右。[表 6] 評價TOCILIZUMAB-IgGl、T0CILIZUMAB-M44、T0CILIZU-MAB-M58 禾口 T0CILIZUMAB-M73在人FcRn轉基因小鼠體內的藥物動力學，結果見圖15。如圖15所示，發(fā) 現與 TOCILIZUMAB-IgGl 相比，T0CILIZUMAB-M44、T0CILIZUMAB-M58 和 T0CILIZU-MAB-M73 的藥物動力學均有提高。該藥物動力學的提高效果與和人FcRn的結合能力相關。其中， T0CILIZUMAB-M73與TOCILIZUMAB-IgGl相比，28天后的血漿中濃度改善約16倍，由此認為即使在人體內，具有M73的恒定區(qū)的抗體與具有IgGl的恒定區(qū)的抗體相比藥物動力學也大幅提高。[實施例7]PK/PD已改善的完全人源化IL-6受體抗體的制作制作組合有多個上述實施例中發(fā)現的T0CILIZUMAB的可變區(qū)和恒定區(qū)的突變的T0CILIZUMAB變體，進行各種篩選，結果發(fā)現了作為完全人源化IL-6受體抗體的 Fv3-M73(H鏈 VH4-M73/SEQ IDN0 :25、L 鏈 VL1-k /SEQ ID NO 28)、Fv4_M73(H 鏈 VH3-M73/ SEQID NO :26、L 鏈 VL3- k /SEQ ID NO 29)、Fv5_M83 (H 鏈 VH5-M83/SEQ ID NO :27、L 鏈 VL5-k /SEQ ID NO 30)。將制作的Fv3-M73、Fv4_M73 和 Fv5_M83 與 IL-6 受體的親和性、與 T0CILIZUMAB 進行比較(方法參照參考例)。測定上述抗體在PH7. 4下與可溶型IL-6受體的親和性，結果見表7。另外，將BaF/gpl30的中和活性與T0CILIZUMAB和對照(參考例的公知的高親和性高IL-6受體抗體、US2007/0280945中的VQ8F11-21 hlgGl)進行比較(方法參照參考例)。測定上述抗體的BaF/gpl30所產生的生物活性，結果見圖16 (IL-6終濃度為300ng/ mL :T0CILIZUMAB、對照、Fv5-M83)和圖 17(IL_6 終濃度為 30ng/mL :T0CILIZUMAB、Fv3_M73、
31Fv4-M73)。如表7所示，Fv3-M73、Fv4_M73與T0CILIZUMAB相比，具有2 3倍左右的強親和性，Fv5-M83與T0CILIZUMAB相比，顯示出100倍左右的強親和性(由于在Fv5_M83中親和性難以測定，所以使用將恒定區(qū)形成IgGl的Fv5-IgGl(H鏈VH5-IgGl/SEQ ID NO :76、 L鏈VL5-k/SEQ ID NO :30)來測定親和性，認為恒定區(qū)通常不影響親和性)。如圖17所示，Fv3-M73、Fv4-M73與T0CILIZUMAB相比，顯示出稍強的活性，如圖16所示，Fv5_M83與 T0CILIZUMAB相比，在50%抑制濃度下具有100倍以上的極強的活性，且與對照(公知的高親和性高IL-6受體抗體)相比，在50%抑制濃度下也顯示出約10倍左右的高中和活性。
[表 7] 測定T0CILIZUMAB、Fv3-M73 和 Fv4-M73 在 pH7. 4 和 pH5. 8 下從膜型 IL-6 受體上的解離速度，結果見表8 (方法參照參考例)。結果顯示Fv3-M73和Fv4-M73與T0CILIZUMAB 相比，自膜型IL-6受體上的解離速度的pH依賴性分別提高約11倍和10倍。與實施例5 中的H3pl/L73相比，解離速度的pH依賴性大幅提高，由此認為與H3pl/L73相比，Fv3_M73 和Fv4-M73的藥物動力學大幅提高。[表 8] 利用本領域技術人員公知的方法，通過等電點電泳測定T0CILIZUMAB、對照、 Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83的等電點，結果T0CILIZUMAB的等電點為約9. 3、對照的等電點為約8. 4 8. 5、Fv3-M73的等電點為約5. 7 5. 8、Fv4_M73的等電點為約5. 6 5. 7、 Fv5-M83的等電點為5. 4 5. 5，與T0CILIZUMAB和對照相比，所有抗體的等電點均大幅下降。通過GENETYX(GENETYXCORPORATION)計算可變區(qū)VH/VL的理論等電點時，T0CILIZUMAB 的理論等電點為9. 20，對照的理論等電點為7. 79，Fv3-M73的理論等電點為5. 49、Fv4_M73 的理論等電點為5. 01、Fv5-M83的理論等電點為4. 27，與T0CILIZUMAB和對照相比，所有抗體的等電點均大幅下降。實施例2顯示通過降低等電點，藥物動力學得到改善，由此認為與T0CILIZUMAB和對照相比，Fv3_M73、Fv4_M73和Fv5_M83的藥物動力學有所提高。利用TEPIT0PE (Methods. 2004 Dec ；34 (4) :468_75)分析存在于 T0CILIZUMAB、 Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83的可變區(qū)序列中的T細胞表位。其結果，如實施例3所示，預測T0CILIZUMAB的多個序列存在與HLA結合的T細胞表位，但Fv3_M73、Fv4_M73和Fv5_M83的、預測結合在T細胞表位上的序列大幅減少。另外，Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83被完全人源化，在構架中沒有殘留小鼠序列。由此表明Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5-M83與T0CILIZUMAB 相比，免疫原性風險有可能大幅降低。[實施例8]完全人源化IL-6受體抗體在猴中的PK/PD試驗將T0CILIZUMAB、對照、Fv3-M73、Fv4-M73 和 Fv5_M83 以 lmg/kg 對食蟹猴進行靜脈內單次給藥，評價血漿中濃度變化(方法參照參考例)。T0CILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73和 Fv5-M83靜脈內給藥后的血漿中濃度變化見圖18。其結果，Fv3-M73、Fv4_M73和Fv5_M83 與T0CILIZUMAB和對照相比，在食蟹猴體內的藥物動力學均大幅改善。其中，Fv3_M73和 Fv4-M73的藥物動力學與T0CILIZUMAB相比大幅改善。為了評價食蟹猴膜型IL-6受體以某種程度被中和的藥效，在抗體給藥第6天第18天(T0CILIZUMAB則為第3天第10天)將食蟹猴IL-6以5 u g/kg的量在腰背部連續(xù)進行皮下給藥，測定24小時后各個體的CRP濃度(方法參照參考例)。各抗體給藥時的 CRP濃度變化見圖19。為了評價食蟹猴可溶型IL-6受體以某種程度被中和的藥效，測定食蟹猴血漿中的非結合型的食蟹猴可溶型IL-6受體濃度，計算非結合型的可溶型IL-6受體率(方法參照參考例)。各抗體給藥時的非結合型的可溶型IL-6受體率的變化見圖20。Fv3-M73、Fv4_M73 和 Fv5_M83 與 T0CILIZUMAB 和對照(公知的高親和性抗 IL-6 受體抗體)相比，均更持續(xù)地中和食蟹猴膜型IL-6受體，長期抑制CRP的增加。Fv3-M73、 Fv4-M73和Fv5-M83與T0CILIZUMAB和對照相比，均更持續(xù)地中和食蟹猴可溶型IL-6受體，長期抑制非結合型的食蟹猴可溶型IL-6受體的增加。由此發(fā)現對于膜型IL-6受體和可溶型IL-6受體的中和的持續(xù)性，Fv3-M73、Fv4-M73和Fv5_M83均較T0CILIZUMAB和對照優(yōu)異。其中，Fv3-M73和Fv4-M73的中和持續(xù)性極其優(yōu)異。另一方面，與Fv3_M73和Fv4_M73相比， Fv5-M83將CRP和非結合型的食蟹猴可溶型IL-6受體抑制在低水平，由此認為Fv5_M83 比Fv3-M73、Fv4-M73和對照(公知的高親和性抗IL-6受體抗體)更強效地中和膜型IL-6 受體和可溶型IL-6受體。認為這是與對照相比，Fv5-M83與IL-6受體的親和性強、且在 BaF/gpl30中的生物活性強在食蟹猴體內得到反映的結果。由此認為與T0CILIZUMAB和對照相比，Fv3_M73和Fv4_M73作為抗IL-6受體中和抗體，其作用的持續(xù)性極其優(yōu)異，可以大幅降低給藥頻率和給藥量；Fv5-M83作為抗IL-6 受體中和抗體，作用強度極其優(yōu)異，作用的持續(xù)性也優(yōu)異。因此，認為Fv3-M73、Fv4-M73和 Fv5-M83可以作為IL-6拮抗劑用于藥品。[實施例9]已知單核細胞趨化蛋白(MCP)-l參與單核細胞、T細胞、NK細胞、嗜堿細胞的細胞侵襲。有報道稱MCP-1在RA患者的滑膜組織、滑液中高度表達(J Clin Invest. 1992 Sep ； 90(3) :772-9)，認為其與 RA 的病態(tài)有關(Inflamm Allergy Drug Targets. 2008 Mar ；7(1) 53-66)。已知VEGF是強效的血管新生因子，由RA患者滑膜中的巨噬細胞、成纖維細胞、滑膜細胞等產生(J Rheumatol. 1995 Sep ；22 (9) 1624-30) 另外，RA患者血清中的VEGF水平與疾病活動性或放射進展(radiographic progression)相關(Arthritis Rheum. 2003 Jun ；48 (6) 1521-9. , Arthritis Rheum. 2001 Sep ；44 (9) :2055_64)，通過使用抗 IL-6R 抗體T0CILIZUMAB治療RA患者，血清中的VEGF水平降低，由此認為VEGF在RA的病態(tài)中也擔負著重要的作用(Mod Rheumatol. 2009 ；19(1) :12_9.、Mediators Inflamm. 2008 ；2008 129873)。因此，利用下述的方法研究T0CILIZUMAB和Fv4_M73能否抑制由sIL_6R和IL-6 刺激產生的、來自人RA患者的滑膜細胞的MCP-1和VEGF產生。將來自人RA患者的滑膜細胞(T0Y0B0)加入到含5 % FCS的IMDM培養(yǎng)基中以 2X 104/0.05mL/孔接種在96孔平板中，在37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中靜置90分鐘。添加 0. 05mL濃度已適當稀釋的T0CILIZUMAB和Fv4_M73，靜置15分鐘，之后添加0. 05mL可溶型 IL-6受體(SR344 按照參考例的方法進行制備)，再靜置30分鐘，之后進一步添加0. 05mL IL-6 (T0RAY)(可溶型IL-6受體和IL-6的終濃度均為50ng/mL)。培養(yǎng)2天后回收培養(yǎng)上清，使用ELISA試劑盒(Biosource和Pierce Biotechnology)測定培養(yǎng)上清中MCP-1和 VEGF的濃度。結果見圖21和圖22。T0CILIZUMAB和Fv4_M73濃度依賴性地抑制了由可溶型IL-6受體和IL-6刺激產生的、來自人RA患者的滑膜細胞的MCP-1和VEGF產生。由此可知Fv4_M73作為抗IL_6受體中和抗體，其作用(與IL_6受體結合，阻斷膜型IL-6受體和可溶型IL-6受體的信號)的持續(xù)性與T0CILIZUMAB相比極其優(yōu)異，與 T0CILIZUMAB相比，可以大幅減少給藥頻率和給藥量，并且，Fv4-M73抑制來自人RA患者的滑膜細胞的MCP-1和VEGF產生，由此表明Fv4-M73對RA是極有用的治療藥。[參考例]重組可溶型人IL-6警體的制備作為抗原的人IL-6受體的重組可溶型人IL-6受體如下制備。制作 J. Biochem. 108，673-676 (1990)中報道的、包含N末端側第1位第344位氨基酸序列的可溶型人 IL-6 受體(Yamasaki 等人，Sciencel988 ；241 :825_828 (GenBank # X12830))的 CH0細胞恒定表達株(定常発現株)。使用Blue Sepharose 6 FF柱色譜、固定有SR344特異性抗體的柱的親和色譜、凝膠過濾柱色譜這3種柱色譜，從由SR344表達CH0細胞得到的培養(yǎng)上清中純化可溶型人IL-6受體。以作為主峰洗脫的組分作為最終純品。重組可溶型食蟹猴IL-6受體(CIL-6R)的制備根據所公開的恒河猴IL-6受體基因序列(Birney等人，Ensembl2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1 34(Database issue) :D556_61)制作寡 DNA 引物，以由食蟹猴胰臟制備的cDNA為模板，使用引物通過PCR法制備編碼食蟹猴IL-6受體基因全長的DNA 片段。將得到的DNA片段插入哺乳動物細胞表達載體中，使用其制作CH0恒定表達株 (cyno. sIL-6R產生CH0細胞)。將cyno. sIL_6R產生CH0細胞的培養(yǎng)液用HisTrap柱(GE Healthcare Bioscience)進行純化，之后用 AmiconUltra-15 Ultracel-lOk(Millipore)進行濃縮，再用 Superdex200pgl6/60 凝膠過濾柱(GE Healthcare Bioscience)進一步純化，得到可溶型食蟹猴IL-6受體(以下記作“CIL-6R”)的最終純品。重組食蟹猴IL-6(cIL_6)的制備食蟹猴IL-6如下制備。作成編碼在SWISSPR0T Accession No. P79341中注冊的 212個氨基酸的核苷酸序列，克隆到哺乳動物細胞表達載體中，再將其導入CH0細胞中，從而制作恒定表達細胞株(cyno，IL-6產生CH0細胞)。將cyno. IL-6產生CH0細胞的培養(yǎng)液用 SP-Sepharose/FF柱(GE Healthcare Bioscience)進行純化，之后使用 Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)進行濃縮，再用 Superdex75pg26/60 凝膠過濾柱(GE HealthcareBioscience)進一步純化，用 Amicon Ultra-15 Ultracel_5k(Millipore)進行濃縮，得到食蟹猴IL_6(以下記作“cIL-6”)的最終純品。公知高親和件抗IL-6警體抗體的制作作為公知的高親和性抗IL-6受體抗體，為了使US 2007/0280945A1中記載的高親和性抗 IL-6 受體抗體、即 VQ8F11-21 hlgGl (US2007/0280945A1, H 鏈氨基酸序列:SEQ ID N0:77、L鏈氨基酸序列SEQ ID NO 78)表達，構建哺乳動物細胞表達用載體。利用組合有合成寡DNA的PCR法(assembly PCR，裝配PCR)制作抗體可變區(qū)，恒定區(qū)使用IgGl。通過裝配PCR法使抗體可變區(qū)與恒定區(qū)結合，插入哺乳動物表達用載體中，制作目標H鏈表達載體和L鏈表達載體。所得表達載體的核苷酸序列通過本領域技術人員公知的方法來確定。使用制作的表達載體進行表達和純化。表達和純化按照實施例1中記載的方法來進行，得到高親和性抗IL-6受體抗體(以后記作“對照”)。TOCILIZUMAB突變體的制作、表汰和純化關于TOCILIZUMAB的突變體，使用QuikChange位點定向誘變試劑盒 (Stratagene)，按照附錄說明書記載的方法制作突變體，將得到的質粒片段插入哺乳動物細胞表達載體中，制作目標H鏈表達載體和L鏈表達載體。所得表達載體的核苷酸序列按照本領域技術人員公知的方法來確定?？贵w的表達采用下述的方法來進行。將來自人胚腎癌細胞的HEK293H株(Invitrogen)懸浮在含10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養(yǎng) 基(Invitrogen)中，以5 6X105個/mL的細胞密度在粘附細胞用培養(yǎng)皿(直徑為10cm， CORNING)的各皿中分別接種10mL，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)一晝夜，之后吸除培養(yǎng) 基，添加6. 9mLCH0-S-SFM-II (Invitrogen)培養(yǎng)基。利用脂質轉染法將制備的質粒導入細胞中?；厥账玫呐囵B(yǎng)上清，之后在室溫下以約2000g的離心力離心5分鐘以除去細胞，再通過0. 22 μ m的濾器MlLLEX(R)-GV(Millipore)進行滅菌，得到培養(yǎng)上清。使用rProtein A Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)，按照本領域技術人員公知的方法從所得的培養(yǎng)上清中純化抗體。至于純化抗體濃度，使用分光光度計測定280nm處的吸光度。由所得的值通過PACE法算出吸光系數，使用該吸光系數算出抗體濃度(Protein Science 1995；4 2411-2423)。人gpl30表達BaF3細胞株的建立為了得到顯示IL-6依賴增殖性的細胞株，如下建立表達人gpl30的BaF3細胞株。通過PCR 擴增全長人 gpl30 cDNA(Hibi等人、Cell 1990 ；63 1149-1157 (GenBank # ΝΜ_002184)),除去 pCHOI (Hirata 等人、FEBSLetter 1994;356:244-248)的 DHFR 基因表達部位，再克隆到插入有Zeocin耐性基因表達部位的表達載體pC0S2Zeo中，構建 pC0S2Zeo/gpl30。通過 PCR 擴增全長人 IL-6R cDNA，克隆到 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen)中，構建 hIL-6R/pcDNA3. 1 (+)。將10 μ g的pC0S2Zeo/gpl30混合在懸浮于PBS中的BaF3細胞(0. 8 X IO7細胞) 中，使用Gene Pulser(Bio-Rad)以0. 33kV、950y FD的容量施加脈沖。將通過電穿孔處理導入有基因的BaF3細胞在含有0. 2ng/mL的小鼠白介素_3 (Peprotech)、10 %胎牛血清(以下記作“FBS”、HyClone)的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)一晝夜，加入含IOOng/ mL的人白介素-6(R&D systems)、100ng/mL的人白介素-6可溶性受體(R&D systems)和 10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進行篩選，建立人gpl30表達BaF3細胞株(以下記作“BaF3/gpl30”)。由于該8& /^ 130在人白介素-6(1 &0 systems)和可溶型人IL_6受體的存在下增殖，所以可用于評價抗IL-6受體抗體的增殖抑制活性(即IL-6受體中和活性)。評價人gpl30表汰BaF3細胞(BaF/gpl30)的牛物活件使用顯示IL-6/IL-6受體依賴性增殖的BaF3/gpl30評價IL-6受體中和活性。將 BaF3/gpl30用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基清洗3次，之后懸浮于含600ng/mL 60ng/ mL的人白介素-6 (TORAY)(終濃度為300ng/mL 30ng/mL)、適量的可溶型人IL-6受體和 10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，使達到5 X IO4細胞/mL的濃度，向96孔平板(CORNING)的各孔中分別注入50 μ L。接下來，將已純化的抗體用含10% FBS的RPMI1640稀釋，向各孔中分別混合50 μ L。在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)3天，按20 μ L/孔加入經PBS稀釋2倍的WST-8試劑(Cell Counting Kit_8、株式會社同仁化學研究所)，之后立即使用SUNRISE CLASSIC(TECAN)測定450nm處的吸光度(參比波長為620nm)。培養(yǎng)2小時后，再次測定 450nm的吸光度(參比波長為620nm)，以2個小時的吸光度變化為指標，評價IL-6受體中和活性。利用Biacore講行的與可溶型λ IL-6等體的結合i平價使用Biacore TlOO (GE Healthcare)進行抗原抗體反應的速度論的分析。通過胺耦合法將適量的蛋白A或蛋白A/G或抗IgG( γ -鏈特異性)F(ab’ ) 2固定在傳感器芯片上，接下來在PH7. 4下使目標抗體結合，再將在pH7. 4下制備成各種濃度的可溶型IL-6受體以分析物的形式流動，測定抗體與可溶型人IL-6受體的相互作用。所有測定均在37°C下進行。由測定中得到的傳感圖算出動力學參數、即結合速度常數ka(l/Ms)和解離速度常數 kd(l/s)，根據該值算出Kd(M)。使用BiacoreTlOO評估軟件(GE Healthcare)計算各參數。利用Biacore進行的自膜型IL_6受體的pH依賴性解離評價使用Biacore TlOO (GE Healthcare)觀測在 pH5. 8、pH7. 4 下與膜型 IL-6 受體的抗原抗體反應。通過評價與固定在傳感器芯片上的可溶型人IL-6受體的結合，評價與膜型 IL-6受體的結合。按照本領域技術人員公知的方法將SR344生物素化，利用鏈親合素與生物素的親和性經由鏈親合素將生物素化可溶型人IL-6受體固定在傳感器芯片上。所有測定均在37°C下進行，流動相的緩沖液為IOmM MES pH5. 8、150mM NaCl、0. 05% Tween20，在 pH7. 4的條件下向其中注入pH依賴性結合克隆，使其與可溶型人IL-6受體結合，之后(注入樣品緩沖液為IOmM MES pH7. 4、150mM NaCl、0. 05% Tween20)，在流動相的pH5. 8下觀測各克隆的PH依賴性解離。使用Biacore T100評估軟件(GEHealthcare)，僅對樣品濃度為 0. 25μ g/mL、在 IOmM MES ρΗ7· 4、150mMNaCl、0. 05% Tween20 中結合、在 IOmM MES ρΗ5· 8、 150mM NaCl,0. 05% Tween20中解離時的pH5. 8下的解離相進行擬合，從而算出pH5. 8時的解離速度常數(kd(l/s))。同樣，使用Biacore T100評估軟件(GE Healthcare)，僅對樣品濃度為 0. 5 μ g/mL、在 IOmM MES pH7. 4、150mM NaCl、0. 05% Tween20 中結合、在 IOmM MES pH7. 4、150mMNaCl、0. 05%Tween20中解離時的pH7. 4下的解離相進行擬合，從而算出pH7. 4 時的解離速度常數(kd(l/s))。與人FcRn的結合評價FcRn是FcRn與β 2_微球蛋白的復合體。根據公開的人FcRn基因序列 (J. Exp. Med. 180(6) ,2377-2381 (1994))，制作寡 DNA 引物。以人 cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)為模板，使用制作的引物，通過PCR法調整編碼基因全長的DNA片段。以所得DNA片段為模板，利用PCR法擴增編碼包含信號區(qū)的胞外區(qū)(Metl-LeU290)的DNA片段，將其插入哺乳動物細胞表達載體中(人FcRn氨基酸序列/SEQ ID N0:79)。同樣，根據所公開的人β 2-微球蛋白基因序列(Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. 99 (26) ,16899-16903 (2002))制作寡 DNA 引物。以人 cDNA (Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CL0NTECH)為模板，使用制作的引物，利用PCR法制備編碼基因全長的DNA片段。以所得DNA片段為模板，利用PCR法擴增編碼包含信號區(qū)的β2_微球蛋白全長(Metl-Metll9)的DNA片段，將其插入哺乳動物細胞表達載體中(人β2_微球蛋白氨基酸序列 /SEQ ID NO 80)。可溶型人FcRn的表達按以下程序進行。將制備的人FcRn和人β 2_微球蛋白的質粒通過使用了 10%胎牛血清(Invitrogen)的脂質轉染法導入來自人胚腎癌細胞的 ΗΕΚ293Η株(Invitrogen)的細胞中?；厥账玫呐囵B(yǎng)上清，之后使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(AmershamBiosciences)，按照(J Immunol. 2002 Nov 1 ； 169 (9) :5171_80)的方法進行純化。之后通過HiTrap Q HP (GE Healthcare)進行純化。小鼠血漿中抗體濃度的測定
小鼠血漿中抗體濃度的測定通過ELISA法、利用本領域技術人員公知的方法進行測定。m PK/PD i式駘階血漿中杭體濃度、CRP濃度、非結合型可溶型IL-6等體的測丨定食蟹猴血漿中濃度的測定通過ELISA法、利用本領域技術人員公知的方法進行測定。利用Cias R CRP(關東化學株式會社)，使用自動分析裝置(TBA-120FR、東芝 Medical Systems株式會社)測定CRP濃度。食蟹猴血漿中的非結合型的可溶型食蟹猴IL-6受體濃度如下測定。將30 μ L 食蟹猴的血漿放在0. 22 μ m的濾杯(Millipore)中，添加適量的已干燥的rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare)樹脂，使存在于血漿中的所有IgG型抗體(食蟹猴 IgG、抗人IL-6受體抗體和抗人IL-6受體抗體-可溶型食蟹猴IL-6受體復合體)吸附在蛋白A上。之后，用高速離心機進行旋轉下降(spin-down)，回收通過的溶液。由于通過的溶液中不含與蛋白A結合的抗人IL-6受體抗體-可溶型食蟹猴IL-6受體復合體，所以通過測定通過蛋白A的溶液中的可溶型食蟹猴IL-6受體濃度，可以測定非結合型的可溶型 IL-6受體濃度。至于可溶型食蟹猴IL-6受體濃度，以上述制作的可溶型食蟹猴IL-6受體 (CIL-6R)作為標準品，利用測定人IL-6受體濃度的本領域技術人員公知的方法進行測定。非結合型的可溶型IL-6受體率通過下式計算。(抗體給予后的非結合型的可溶性IL-6受體濃度+抗體給予前的可溶性IL-6受體濃度)χ 100
權利要求
下述(a)～(f)中任一項所述的多肽(a)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO1的序列的CDR1、具有SEQ ID NO2的序列的CDR2和具有SEQ ID NO3的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO1為VH4-M73的CDR1、SEQ ID NO2為VH4-M73的CDR2、SEQ ID NO3為VH4-M73的CDR3；(b)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO4的序列的CDR1、具有SEQ ID NO5的序列的CDR2和具有SEQ ID NO6的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO4為VH3-M73的CDR1、SEQ ID NO5為VH3-M73的CDR2、SEQ ID NO6為VH3-M73的CDR3；(c)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO7的序列的CDR1、具有SEQ ID NO8的序列的CDR2和具有SEQ ID NO9的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO7為VH5-M83的CDR1、SEQ ID NO8為VH5-M83的CDR2、SEQ ID NO9為VH5-M83的CDR3；(d)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO10的序列的CDR1、具有SEQ ID NO11的序列的CDR2和具有SEQ ID NO12的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO10為VL1的CDR1、SEQ ID NO11為VL1的CDR2、SEQ ID NO12為VL1的CDR3；(e)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO13的序列的CDR1、具有SEQ ID NO14的序列的CDR2和具有SEQ ID NO15的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO13為VL3的CDR1、SEQ ID NO14為VL3的CDR2、SEQ ID NO15為VL3的CDR3；(f)多肽，該多肽包含具有SEQ ID NO16的序列的CDR1、具有SEQ ID NO17的序列的CDR2和具有SEQ ID NO18的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO16為VL5的CDR1、SEQ ID NO17為VL5的CDR2、SEQ ID NO18為VL5的CDR3。
2.下述(a) (c)中任一項所述的抗體(a)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQID NO 1的序列的CDR1、具有SEQ ID NO 2的序列的CDR2和具有SEQ ID NO 3的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO :1 為 VH4-M73 的 CDR1、SEQ ID NO :2 為 VH4-M73 的 CDR2、SEQ ID NO :3 為 VH4-M73 的 CDR3 ；所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 10的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO :11的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 12 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO :10 為 VL1 的 CDR1、SEQ ID NO: 11 為 VL1 的 CDR2、SEQ ID NO : 12 為 VL1 的 CDR3 ；(b)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQID NO 4的序列的CDR1、具有SEQ ID NO 5的序列的CDR2和具有SEQ ID NO 6的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO :4 為 VH3-M73 的 CDR1、SEQ ID NO :5 為 VH3-M73 的 CDR2、SEQ ID NO :6 為 VH3-M73 的 CDR3 ；所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 13的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO 14的序列的 CDR2 和具有 SEQ ID NO 15 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO :13 為 VL3 的 CDR1、SEQ ID NO: 14 為 VL3 的 CDR2、SEQ ID NO 15 為 VL3 的 CDR3 ；(c)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含具有SEQID NO 7的序列的CDR1、具有SEQ ID NO 8的序列的CDR2和具有SEQ ID NO 9的序列的CDR3，其中，SEQ ID NO :7 為 VH5-M83 的 CDR1、SEQ ID NO :8 為 VH5-M83 的 CDR2、SEQ ID NO :9 為 VH5-M83 的 CDR3 ；所述輕鏈可變區(qū)包含具有SEQ ID NO 16的序列的⑶R1、具有SEQ ID NO 17的序列的CDR2 和具有 SEQ ID NO 18 的序列的 CDR3，其中，SEQ ID NO :16 為 VL5 的 CDR1、SEQ ID NO: 17 為 VL5 的 CDR2、SEQ ID NO :18 為 VL5 的 CDR3。
3.下述(a) (f)中任一項所述的可變區(qū)(a)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQID NO 19的序列，其中SEQ ID NO 19為VH4-M73的可變區(qū)；(b)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQID NO 20的序列，其中SEQ IDN0 20為VH3-M73的可變區(qū)；(c)重鏈可變區(qū)，其中具有SEQID NO 21的序列，其中SEQ ID NO 21為VH5-M83的可變區(qū)；(d)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQID NO 22的序列，其中SEQ IDN0 22為VL1的可變區(qū)；(e)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQID NO 23的序列，其中SEQ ID NO 23為VL3的可變區(qū)；(f)輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQID NO :24的序列，其中SEQ ID NO :24為VL5的可變區(qū)。
4.下述(a) (c)中任一項所述的抗體(a)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQID NO 19 的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO 22的序列，其中，SEQ ID NO 19為VH4-M73的可變區(qū)、SEQ ID NO 22為VL1的可變區(qū)；(b)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQID N0:20 的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO 23的序列，其中，SEQ ID NO 20為VH3-M73的可變區(qū)、SEQ ID NO 23為VL3的可變區(qū)；(c)抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有SEQID N0:21 的序列，所述輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO 24的序列，其中，SEQ ID NO 21為VH5-M83的可變區(qū)、SEQ ID NO 24為VL5的可變區(qū)。
5.下述(a) (f)中任一項所述的重鏈或輕鏈(a)重鏈，該重鏈具有SEQID NO 25的序列，其中SEQ ID NO 25為VH4-M73 ；(b)重鏈，該重鏈具有SEQID NO 26的序列，其中SEQ ID NO 26為VH3-M73 ；(c)重鏈，該重鏈具有SEQID NO 27的序列，其中SEQ ID NO 27為VH5-M83 ；(d)輕鏈，該輕鏈具有SEQID NO 28的序列，其中SEQ ID NO 28為VL1 ；(e)輕鏈，該輕鏈具有SEQID NO 29的序列，其中SEQ ID NO 29為VL3 ；(f)輕鏈，該輕鏈具有SEQID NO 30的序列，其中SEQ ID NO 30為VL5。
6.下述(a) (c)中任一項所述的抗體(a)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQID NO :25的序列，所述輕鏈具有 SEQ ID NO 28 的序列，其中，SEQ ID NO 25 為 VH4-M73、SEQ ID NO 28 為 VL1 ；(b)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQID NO :26的序列，所述輕鏈具有 SEQ ID NO 29 的序列，其中，SEQ ID NO 26 為 VH3-M73、SEQ ID NO 29 為 VL3 ；(c)抗體，該抗體包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有SEQID NO :27的序列，所述輕鏈具有 SEQ ID NO 30 的序列，其中，SEQ ID NO 27 為 VH5_M83、SEQ ID NO 30 為 VL5。
7.基因，該基因編碼權利要求1 6中任一項所述的多肽。
8.載體，該載體包含權利要求7所述的基因。
9.宿主細胞，該宿主細胞保有權利要求8所述的載體。
10.通過培養(yǎng)權利要求9的宿主細胞來制備權利要求1 6中任一項所述的多肽的方法。
11.藥物組合物，其中含有權利要求1 6中任一項所述的多肽或按照權利要求10所述的方法制備的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供包含優(yōu)于TOCILIZUMAB的第2代分子的藥物組合物以及上述藥物組合物的制備方法，所述優(yōu)于TOCILIZUMAB的第2代分子是指通過改變人源化抗IL-6受體IgG1抗體、即TOCILIZUMAB的可變區(qū)和恒定區(qū)的氨基酸序列，使抗原中和能力增強、同時提高藥物動力學，從而減少給藥頻率、持續(xù)發(fā)揮治療效果，并且使免疫原性、安全性、理化性質(穩(wěn)定性和均勻性)得到改善。
文檔編號A61P1/04GK101849006SQ200980100709
公開日2010年9月29日申請日期2009年9月25日優(yōu)先權日2008年9月26日
發(fā)明者井川智之, 前田敦彥, 小島哲郎, 樋口義信, 櫻井實香, 橘達彥, 白巖宙丈, 石井慎也, 角田浩行申請人:中外制藥株式會社

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