專利名稱：脂籠蛋白-2作為心臟和中風(fēng)風(fēng)險的預(yù)后和診斷標(biāo)記的制作方法
脂籠蛋白-2作為心臟和中風(fēng)風(fēng)險的預(yù)后和診斷標(biāo)記發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及脂籠蛋白-2(lipOCalin-2)作為心臟風(fēng)險、慢性心臟病和中風(fēng)風(fēng)險的 診斷標(biāo)記的用途。具體地說，本發(fā)明涉及通過測量受試者循環(huán)脂籠蛋白_2的濃度并與標(biāo) 準(zhǔn)化的人群或標(biāo)準(zhǔn)人群的脂籠蛋白_2水平比較所測量的水平，來評估風(fēng)險和這些風(fēng)險的發(fā)展。背景 心血管病在發(fā)達(dá)國家仍然是最普遍的發(fā)病和死亡的原因。因此，預(yù)防心血管病 是主要的公共衛(wèi)生重要領(lǐng)域。目前業(yè)已闡述未來心血管病的若干風(fēng)險因子，并在臨床上 廣泛用于檢測高風(fēng)險個體，例如評估總膽固醇、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白 (LDL)水平。然而，大量心血管病發(fā)生在明顯具有低到中等風(fēng)險概況(riskprofile)的個體 中，鑒定所述患者的能力受到限制。此外，積累的數(shù)據(jù)提示，某些預(yù)防性及治療性治療 對處于心血管病風(fēng)險中或已知患有心血管病的患者的有益作用，在不同患者群中變化極 大。然而，目前缺乏闡述確定是否可預(yù)期某些治療更有效或更無效的診斷測定的數(shù)據(jù)。脂籠蛋白-2也被稱為24p3 (1)和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂籠蛋白(NGAL) (2)， 是25kDa的分泌性糖蛋白，其最初在小鼠腎細(xì)胞和人嗜中性粒細(xì)胞顆粒中鑒定。其屬 于由超過20個分泌性小蛋白組成的脂籠蛋白超家族，所述小蛋白包括RBP4、脂肪酸結(jié) 合蛋白(FABP)、主要尿蛋白(MUP)、載脂蛋白D(apoD)和前列腺素D合成酶(PGDS) (3)。該蛋白家族的共同特征是其結(jié)合并運(yùn)輸諸如游離脂肪酸、類視黃醇、花生四烯酸和 各種類固醇(4)等小親脂物質(zhì)的能力。盡管先前業(yè)已報道脂籠蛋白_2與白細(xì)胞三烯B4 及脂多糖(5)有微弱結(jié)合，但仍有待鑒定其高親和力的內(nèi)源配體。脂籠蛋白_2除在嗜 中性粒細(xì)胞中表達(dá)之外，還在若干其它組織中表達(dá)，包括肝、肺、腎、脂肪細(xì)胞和巨噬 細(xì)胞(6-8)。諸如脂多糖和“IL-Ιβ”等幾種炎性刺激物可在這些細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)脂籠 蛋白-2表達(dá)及分泌(6，9)。顯而易見的是，業(yè)已顯示促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B通過與在 脂籠蛋白_2基因啟動子區(qū)內(nèi)的共有基序結(jié)合來反式激活(tnmsactivate)脂籠蛋白_2表達(dá) (10)，這表明該分泌性蛋白質(zhì)可能參與炎性反應(yīng)。最近發(fā)現(xiàn)升高的血漿脂籠蛋白_2水平與動脈粥樣硬化病變中增加的蛋白水解活 性有關(guān)，并表明其為缺血性損傷、順鉬中毒性腎損害或感染后的腎衰竭的起因(11-15)。 脂籠蛋白-2與基質(zhì)金屬肽酶9(MMCN9)的部分結(jié)合表明，脂籠蛋白_2可通過保護(hù) MMCN9免遭降解(2，16)并保留其酶活性而對MMCN9發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。最近的研究 表明，MMCN9和脂籠蛋白_2共同位于人動脈粥樣硬化斑的巨噬細(xì)胞及光滑肌肉細(xì)胞 (SMC)中。原位淋巴造影術(shù)(zymphography)顯示脂籠蛋白_2表達(dá)得越多的地方， MMCN9活性越高，這表明脂籠蛋白_2在調(diào)節(jié)MMCN9活性及破壞硬化斑的穩(wěn)定中的潛 在作用(15)。發(fā)明簡述
本發(fā)明實(shí)施方案涉及通過免疫測定或免疫試驗(yàn)來測量體液(包括但不限于血 液、血清、血漿、尿液、唾液、淚液等)中的脂籠蛋白_2，以用于(1)預(yù)測未來心血管 病的風(fēng)險；和(2)測定某些個體自使用設(shè)計(jì)為預(yù)防和/或治療心血管病的某些治療中獲得 較大或較小程度的益處的可能性。業(yè)已發(fā)現(xiàn)脂籠蛋白_2水平升高預(yù)示未來心血管病。例如，明顯健康的人脂籠蛋 白-2水平升高預(yù)示心肌梗塞(MI)風(fēng)險增加。作為另一實(shí)例，脂籠蛋白_2水平升高預(yù)示 未來中風(fēng)的可能性增加。還已發(fā)現(xiàn)可從個體的脂籠蛋白-2基線水平，測定某些個體從使用降低未來心血 管病風(fēng)險的某些治療劑獲得較大或較小程度益處的可能性。本發(fā)明部分基于脂籠蛋白_2 具有不依賴于其它未來心血管病指示物的預(yù)示值這一意想不到的發(fā)現(xiàn)。具體而言，脂籠 蛋白_2不依賴于C-反應(yīng)蛋白(CRP)和髓過氧化物酶(MPO)預(yù)測未來有害的心血管病。 因此，脂籠蛋白_2可單獨(dú)作為未來有害心血管病的指示物使用，或與包括但不限于膽固 醇、CRP和MPO等現(xiàn)有技術(shù)的指示物聯(lián)合使用。因此，本發(fā)明不包括簡單地重復(fù)先前 可用其它指示物進(jìn)行的測量。相反，將脂籠蛋白_2水平添加到現(xiàn)有技術(shù)的指示物中。如上所述，這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致新的診斷測試。本發(fā)明一個方面提供用于表征個體發(fā) 展未來心血管病的風(fēng)險概況的方法。所述方法包括獲得個體的脂籠蛋白-2水平。然后 將該脂籠蛋白-2水平與預(yù)測定值比較，然后基于脂籠蛋白_2水平與預(yù)測定值的比較，表 征發(fā)展未來心血管病的個體風(fēng)險概況。預(yù)測定值可為單一值、多個值、單一范圍或多個 范圍。因此，在一個實(shí)施方案中，預(yù)測定值是預(yù)測定標(biāo)記水平范圍的多個值，而比較步 驟包括確定受試者標(biāo)記水平所屬于的預(yù)測定標(biāo)記水平范圍。本發(fā)明另一方面提供使用脂籠蛋白_2水平與另一已知心血管病標(biāo)記一起用于表 征個體發(fā)展未來心血管病的風(fēng)險概況的方法，所述已知心血管病標(biāo)記包括但不限于膽固 醇組分(cholesterol fraction)或CRP或MP0。獲得個體的脂籠蛋白_2水平。將該脂籠 蛋白-2水平與第一預(yù)測定值比較，以確立第一風(fēng)險值。還獲得個體的另一已知心血管病 標(biāo)記(包括但不限于膽固醇或CRP或MPO)的水平。將個體的第二標(biāo)記(包括但不限于 膽固醇或CRP或MPO)水平與第二預(yù)測定值比較，確立第二風(fēng)險值。然后基于第一風(fēng)險 值和第二風(fēng)險值的組合表征個體發(fā)展心血管病的風(fēng)險概況，其中第一風(fēng)險值和第二風(fēng)險 值的組合確立了不同于第一風(fēng)險值和第二風(fēng)險值的第三風(fēng)險值。本發(fā)明又一方面提供評估個體從用用于降低心血管病風(fēng)險的藥物治療獲得益處 的可能性的方法。所述藥物可選自抗炎性藥物、抗血栓藥物、抗血小板藥物、血纖蛋白 溶解藥、降脂藥物、凝血酶直接抑制劑和糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑和結(jié)合細(xì)胞粘附分子 并抑制白血細(xì)胞附著于所述分子能力的藥物(例如抗細(xì)胞粘附分子抗體)。為實(shí)行所述方 法，獲得個體的脂籠蛋白_2水平。然后將該水平與預(yù)測定值比較，其中與預(yù)測定值比較 的脂籠蛋白_2水平預(yù)示該個體從用該藥物治療獲益的可能性。然后可在通過用所述藥物 治療獲得的可能凈利益方面對個體進(jìn)行表征。因此，本發(fā)明提供評估某些治療對于候選患者的可能的凈利益的信息。 本發(fā)明還涵蓋包括包裝的試劑盒，所述包裝包括用于脂籠蛋白_2的測定物 (assay)和使用說明書及任選相關(guān)材料如數(shù)字圖表或顏色圖表，其用于將通過所述測定物 而確定的脂籠蛋白_2水平與發(fā)展未來心血管病的風(fēng)險或與其它上述患者標(biāo)準(zhǔn)關(guān)聯(lián)起來。在另外的實(shí)施方案中，試劑盒還包括用于至少第二標(biāo)記(包括但不限于膽固醇、CRP、 MPO等)的測定物。附圖
簡述圖IA和IB顯示具有心臟病發(fā)作/中風(fēng)高風(fēng)險的患者中血清和尿液脂籠蛋白_2 (LCN2)。顯示具有心臟病發(fā)作/中風(fēng)高風(fēng)險的患者(η = 46) (y-軸)和36名健康 對照受試者(χ-軸)的濃度。方框里的線條表示中值，同時方框表明第25百分位數(shù)和第 75百分位數(shù)之間的間隔。細(xì)絲線(whisker)表示第10百分位數(shù)和第90百分位數(shù)之間的 間隔。高風(fēng)險組和健康組之間的血清和尿液LCN2濃度之間的差異(分別為P<0.001和 P < 0.05)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著。發(fā)明詳述本說明書所用術(shù)語“測試樣品”指為診斷、預(yù)后或評估目標(biāo)受試者(例如患者) 的目的獲得的生物流液樣品。在某些實(shí)施方案中，可為了測定不斷進(jìn)展的病況結(jié)果或治 療方案對病況的作用的目的獲得所述樣品。優(yōu)選測試樣品包括但不限于血液、血清、血 漿、尿液、唾液和淚液。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到某些測試樣品在分級分離或純 化程序(例如將全血分離為血清或血漿組分)后將更易于被分析。本文所用術(shù)語心血管病(CVD)和冠狀動脈病(CAD)可互換，意欲包括但不限 于心臟病、動脈粥樣硬化、微血管病、高血壓、中風(fēng)、糖尿病血管病變、心肌梗死、 急性冠狀動脈綜合征、不穩(wěn)定性心絞痛和糖尿病視網(wǎng)膜病。本說明書所用術(shù)語“診斷”指從一系列風(fēng)險值和/或患者癥狀預(yù)測疾病或病況 類型。這與疾病預(yù)測相反，疾病預(yù)測是在疾病發(fā)生前預(yù)測其發(fā)生，而術(shù)語“預(yù)后”是從 一個或多個在前時間點(diǎn)的指示值預(yù)測在未來時間點(diǎn)的疾病進(jìn)展。本文所用術(shù)語“標(biāo)記”是指以下物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)或多肽或其它物質(zhì)，其用作 用于篩選從受試者獲得的測試樣品的靶標(biāo)。認(rèn)為本發(fā)明用作標(biāo)記的“蛋白質(zhì)或多肽”包 括任何免疫學(xué)可檢測片段、其可確認(rèn)的片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，從腦缺血發(fā)作 (cerebral attack)期間受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)可能被降解或斷裂為所述片 段。另外，某些標(biāo)記作為無活性形式合成，隨后可例如通過蛋白水解將其激活。所述標(biāo) 記實(shí)例包括白細(xì)胞介素(IL-Ιβ)，很多其它標(biāo)記為本領(lǐng)域所知。本文所用術(shù)語“相 關(guān)標(biāo)記”指特定標(biāo)記的一種或多種片段，它們本身可作為該標(biāo)記的替代品被檢測。這些 相關(guān)標(biāo)記可為標(biāo)記的例如“前”、“原”或“前原”形式，或用以形成成熟標(biāo)記而除掉 的“前”、“原”或“前原”片段。作為“前”、“原”或“前原”形式合成的例示 性標(biāo)記例如IL-IB為本領(lǐng)域所知。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這些“前”、“原”或“前原” 形式或除掉的“前”、“原”或“前原”片段在本文所述方法中以與成熟標(biāo)記的同等方 式被使用。應(yīng)該注意，除非上下文明確指出不是這樣，否則本文及所附權(quán)利要求中所用的 單數(shù)形式“一個”、“和”及“所述”包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如對“一種脂籠蛋 白-2結(jié)合組分”的提及包括多種所述結(jié)合組分及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等寸。提供本文討論的出版物僅為了其在本發(fā)明提交日期前公開的內(nèi)容。此處無論如何不能解釋為承認(rèn)憑借先前發(fā)明本發(fā)明就沒有資格先于所述出版物。此外，提供的出版 日期可能與實(shí)際出版日期不同，所述實(shí)際出版日期可能需要單獨(dú)確認(rèn)。艦為響應(yīng)本領(lǐng)域需求，本發(fā)明提供用于通過采用LCN2作為生物標(biāo)記或篩選工具 來評估哺乳動物受試者發(fā)展心血管病的風(fēng)險或評估心血管病進(jìn)展的方法。本發(fā)明提供哺 乳動物受試者的LCN2水平和心血管病發(fā)展或進(jìn)展的風(fēng)險水平之間的相關(guān)性。本發(fā)明一方面提供用于通過采用LCN2作為所述疾病的新型生物標(biāo)記來測定哺 乳動物受試者的心血管病風(fēng)險或進(jìn)展的診斷方法。因此，本發(fā)明方法包括通過測量哺乳 動物受試者生物流液中脂籠蛋白_2水平來測定心血管病的風(fēng)險或進(jìn)展。將所測量的水平 與群體中LCN2水平標(biāo)準(zhǔn)比較。與標(biāo)準(zhǔn)相比LCN2水平升高預(yù)示疾病風(fēng)險增加。在一個 實(shí)施方案中，LCN2水平高于形成群體的LCN2水平的最低25%預(yù)示心血病管風(fēng)險。在 另一實(shí)施方案中，若受試者LCN2水平高于形成群體的LCN2水平的50%，則診斷為心血 管病中等風(fēng)險。在又一實(shí)施方案中，LCN2水平高于形成群體的LCN2水平的75%預(yù)示 心血管病高風(fēng)險或已有的心血管病進(jìn)展。在另一實(shí)施方案中，LCN2水平高于形成群體 的LCN2水平的80%預(yù)示疾病的最高風(fēng)險。本發(fā)明方法另一方面進(jìn)一步包括測量樣品中心血管病第二生物標(biāo)記的濃度或第 二炎性生物標(biāo)記的濃度，并將LCN2水平與該第二生物標(biāo)記物水平相關(guān)聯(lián)，其中LCN2濃 度和第二生物標(biāo)記濃度的組合預(yù)示心血管風(fēng)險。本發(fā)明方法另一方面包括隨時間重復(fù)測量循環(huán)LCN2，以監(jiān)測心血管病風(fēng)險的進(jìn)展。在這些方法的一個實(shí)施方案中，血漿或血清LCN2水平預(yù)示在無心血管病臨床 癥狀和/或非糖尿病的哺乳動物受試者中心血管病(例如動脈粥樣硬化)的風(fēng)險。在另一 實(shí)施方案中，本發(fā)明方法預(yù)測有代謝綜合征癥狀的哺乳動物受試者的心血管病風(fēng)險。在 又一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法評估糖尿病受試者心血管病的風(fēng)險。在再一實(shí)施方案中， 可采用本發(fā)明方法來跟蹤受試者的所述疾病隨時間的風(fēng)險。本發(fā)明再一方面提供用于通過降低受試者循環(huán)LCN2水平或作用來治療哺乳動 物受試者的炎性疾病或心血管病或延遲其進(jìn)展的方法。本發(fā)明提供用于通過諸如免疫測定或免疫試驗(yàn)等測定來測量生物流液(包括但 不限于血液、血清、血漿、尿液、唾液、淚液等)中的脂籠蛋白_2的方法和儀器，其用 于(1)預(yù)測未來心血管病的風(fēng)險；和(2)測定某些個體自使用設(shè)計(jì)為預(yù)防和/或治療心 血管病的某些治療中獲得較大或較小程度的益處的可能性。 根據(jù)一個實(shí)施方案，用于表征個體發(fā)展中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病風(fēng)險的方 法包括從個體獲得生物流液樣品，測定樣品中的脂籠蛋白_2濃度，和將所測定的脂籠蛋 白_2濃度與預(yù)測定的和健康個體相關(guān)的參考值進(jìn)行比較。與參考值比較若樣品中脂籠蛋 白-2的濃度升高，則存在發(fā)展中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病的風(fēng)險。預(yù)測定值可為單一 值、多個值、單一范圍或多個范圍。在其中預(yù)測定值為多個預(yù)測定的標(biāo)記物水平范圍的 實(shí)施方案中，測定的脂籠蛋白_2濃度與預(yù)測定的參考值的比較可包括確定個體的脂籠蛋 白-2水平所屬的預(yù)測定的標(biāo)記物水平范圍。被用作風(fēng)險評估的心血管病可為慢性心臟病、急性冠狀動脈癥狀或心機(jī)能不全。

在另一實(shí)施方案中，除了通過脂籠蛋白_2濃度測定的風(fēng)險值外，還可測定膽固 醇組分(包括HDL、LDL或二者)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、髓過氧化物酶(MPO)或其它 風(fēng)險標(biāo)記的濃度，并與他們的相應(yīng)預(yù)測定參考值(與健康個體有關(guān))進(jìn)行比較，以確立第 二風(fēng)險值。可基于第一風(fēng)險值(通過脂籠蛋白_2濃度測定)和第二風(fēng)險值表征個體的風(fēng) 險。在一個實(shí)施方案中，可基于第三風(fēng)險值表征個體風(fēng)險值，該第三風(fēng)險值是基于聯(lián)合 第一風(fēng)險值和第二風(fēng)險值的風(fēng)險評估。A.測定各種標(biāo)記的方法本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉用于檢測和分析本發(fā)明標(biāo)記的若干方法及設(shè)備。就患 者測試樣品中的多肽或蛋白質(zhì)而言，通常使用免疫測定設(shè)備和方法。作為備選或另外 地，可選擇適配體用于以甚至更高特異性結(jié)合，這在本領(lǐng)域眾所周知。在各種夾心測 定、競爭性測定或非競爭性測定形式中，這些設(shè)備和方法可利用標(biāo)記的分子，以產(chǎn)生與 目標(biāo)分析物的存在或量有關(guān)的信號。另外，可采用某些方法和設(shè)備(例如生物傳感器和 光學(xué)免疫測定)來測定分析物的存在情況或量而無需標(biāo)記的分子。優(yōu)選用免疫測定來分析標(biāo)記，但其它方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(例如標(biāo)記 RNA水平的測量)。通常用針對各標(biāo)記的抗體并檢測特異性結(jié)合來測定標(biāo)記的存在情況 或量。可利用任何合適的免疫測定，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定 (RIA)、競爭性結(jié)合測定等?？芍苯踊蜷g接檢測抗體與標(biāo)記的特異性免疫結(jié)合。連接到 抗體的直接標(biāo)記包括熒光或冷光標(biāo)簽、金屬、染料、放射性核素等。間接標(biāo)記包括本領(lǐng) 域眾所周知的各種酶，例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等。舉一個怎樣在儀器上實(shí)施 該程序的實(shí)例，人們可使用被稱為Clinical Reader sup.TM.的RAMP Biomedical設(shè)備，其 利用熒光標(biāo)簽方法，但技術(shù)人員應(yīng)知道實(shí)施同一測定的很多不同的儀器及操作方案。將 稀釋的全血加到樣品孔中。紅血細(xì)胞留在樣品墊上，分離的血漿沿條帶移動。讓熒光染 色的乳膠顆粒結(jié)合分析物，并將其固定在檢測區(qū)。在內(nèi)部對照區(qū)固定另外的粒子。在 RAMP Clinical Reader sup.TM.上測量檢測區(qū)和內(nèi)部對照區(qū)的熒光，然后計(jì)算這些值之間 的比率。該比率用于測定分析物濃度，即通過將該比率插入(interpolation)指定批號的標(biāo) 準(zhǔn)曲線(lot-specific standard curve)來測定，該標(biāo)準(zhǔn)曲線由制造商在每批測試試劑盒中為 每一測定提供。本發(fā)明亦涵蓋針對標(biāo)記的固定化抗體的用途，其為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所熟 知。可將抗體固定到多種固相支持體上，所述固相支持體例如磁?；蛏V基質(zhì)顆粒、測 定場所表面(例如微量滴定孔)、固相基底材料片(例如塑料、尼龍、紙)等。可通過在 固相支持體上以陣列包被一種或多種抗體來制備測定條。然后可將該測定條浸入測試樣 品中，然后通過洗滌和檢測步驟快速處理，以產(chǎn)生可測量的信號，例如色斑?？蓡为?dú)或同時用一個測試樣品進(jìn)行多種標(biāo)記分析。為了有效處理多個樣品，可 將若干種標(biāo)記組合到一個測試中。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能識別來自同一個體的多個 樣品的測試值(例如在連續(xù)的時間點(diǎn))。所述系列樣品的測試應(yīng)使得能鑒定標(biāo)記物水平隨 時間的變化。標(biāo)記物水平的增加或降低以及標(biāo)記物水平不發(fā)生變化，將提供關(guān)于疾病狀 態(tài)的有用信息，所述信息包括但不限于確定離事件發(fā)生的大約時間、可搶救的組織的存 在情況或量、藥物治療的恰當(dāng)性、各種療法的有效性、確定事件的嚴(yán)重程度、確定疾病嚴(yán)重程度和確定患者結(jié)果(包括未來事件的風(fēng)險)。 可創(chuàng)建由本發(fā)明所提及的標(biāo)記組合構(gòu)成的測定，以提供關(guān)于鑒別診斷的相關(guān)信 息?？捎?、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多種標(biāo)記或各別的標(biāo)記來構(gòu)建 這樣的小組，但是最優(yōu)選數(shù)目低于4種標(biāo)記的實(shí)施方案?？捎帽景l(fā)明所述方法進(jìn)行單標(biāo) 記或包含較大標(biāo)記小組的標(biāo)記集的分析，以使各種臨床設(shè)置中的臨床靈敏度或特異性最 優(yōu)化。將測定的臨床靈敏度定義為所述測定正確預(yù)測的疾病患者的百分?jǐn)?shù)，測定的特異 性定義為所述測定正確預(yù)測的無疾病患者的百分?jǐn)?shù)(Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 第 2 版，Carl Burtis 和 EdwardAshwood 編輯，W.B.Saunders 和 Company，第 496 頁)。也可以多種物理形式進(jìn)行標(biāo)記分析。例如，可使用微量滴定板或自動操作來幫 助處理大量測試樣品?；蛘?，可開發(fā)單樣品形式來促進(jìn)以實(shí)時方式的即時治療和診斷， 例如，在移動運(yùn)輸或急救室設(shè)施(setting)中。尤其有用的物理形式包含具有用于檢測多 種不同分析物的多個可尋址的離散位置的表面。所述形式包括蛋白微陣列或“蛋白芯 片”(參見例如 Ng 和 Ilag，J.CellMol.Med.6 329-340(2002))和毛細(xì)管裝置。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于分析標(biāo)記的試劑盒。所述試劑盒優(yōu)選包括 用于分析至少一個測試樣品的裝置和試劑以及用于實(shí)施所述測定的使用說明書。試劑盒 可含有針對靶標(biāo)記的適配體。任選試劑盒可含有一種或多種工具，所述工具用于用從對 標(biāo)記小組實(shí)施的免疫測定獲得的信息來確定或排除某些診斷?？蓪?biāo)記抗體或抗原納入 到免疫測定診斷試劑盒中，這視所測量的標(biāo)記自身抗體或抗原而定。第一容器可包括包 含抗原或抗體制備物的組合物。應(yīng)該優(yōu)選以合適滴定形式(titrated form)提供的抗體制 備物和抗原制備物二者，且所給抗原濃度和/或抗體效價易于在定量測定應(yīng)用中作為參 考。試劑盒還可包括用于檢測所提供的抗原和/或抗體(如果是在該情況下)與診 斷樣品之間的特異性免疫反應(yīng)的免疫檢測試劑或標(biāo)記。合適的檢測試劑在本領(lǐng)域眾所周 知，例如放射性配體、酶配體或其它發(fā)色配體，其通常與抗原和/或抗體聯(lián)合使用，或 與對第一抗體具有特異性的第二抗體聯(lián)合使用。因此，借助檢測或定量所述標(biāo)記來檢測 或定量所述反應(yīng)。適合于與本發(fā)明新型方法聯(lián)系使用的免疫檢測試劑和過程通常在本領(lǐng) 域眾所周知。試劑也可包括輔助劑，例如緩沖劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，例如多糖等。診斷試劑盒 必要時可進(jìn)一步包括用于降低測試中的背景干擾的試劑；用于增加信號的試劑；用于 聯(lián)合和插入標(biāo)記值以產(chǎn)生目標(biāo)臨床結(jié)果預(yù)測的軟件和算法；用于實(shí)行測試的儀器；標(biāo)定 曲線和圖表；標(biāo)準(zhǔn)曲線和圖表等?？赏ㄟ^任何測定方法測量樣品中的脂籠蛋白_2濃度，優(yōu)選通過適配體結(jié)合或通 過免疫學(xué)方法，優(yōu)選通過免疫測定或免疫試驗(yàn)，更優(yōu)選通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 或測試條(dipstick)?？刹捎糜靡詸z測所述蛋白的任何合適的LCN2抗體或適配體來測量生物樣品中 LCN2的濃度。所述適配體或抗體可為本領(lǐng)域目前現(xiàn)存的或目前可市購使用的，或可通過 免疫學(xué)領(lǐng)域目前常用的技術(shù)開發(fā)。本文所用術(shù)語“抗體”指具有兩條輕鏈和兩條重鏈的 完整的免疫球蛋白或其任何片段。因此，分離的單一抗體或片段可為多克隆抗體、高親 和力的多克隆抗體、單克隆抗體、合成抗體、重組抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。術(shù)語“抗體片段”指小于完整抗體的結(jié)構(gòu)，包括但不限于分離的單抗體鏈、Fv構(gòu)建 體、Fab構(gòu)建體、輕鏈可變區(qū)序列或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列等。在本發(fā)明診斷測定中還 可使用荷有抗-LCN2抗體的結(jié)合部分的重組分子(例如攜帶結(jié)合LCN2的一個或多個可 變鏈CDR序列的重組分子)。在適當(dāng)情況下，本文所用術(shù)語“抗體”亦可指結(jié)合LCN2 的不同抗體或抗體片段的混合物。所述不同的抗體可結(jié)合LCN2的不同部分，而不是混 合物中的其它抗體?？贵w可變區(qū)的CDR序列可反映所述測定中所用抗體的所述差異。例 如，如果抗體本身為含有人CDR序列的非人抗體或含有非人來源序列的嵌合抗體或某些 其它重組抗體片段，那么也可由抗體主鏈產(chǎn)生所述差異。用于本發(fā)明方法的抗體或片段 可用常規(guī)技術(shù)合成或重組產(chǎn)生，或可從血漿分離并純化，或進(jìn)一步處理以提高其結(jié)合親 和力。應(yīng)該理解，在本發(fā)明方法中可采用如上所述的結(jié)合LCN2或LCN2的特定序列的 任何抗體、抗體片段或其混合物，而不管所述抗體或抗體混合物如何產(chǎn)生。同樣地，可用能夠提供檢測信號的試劑對抗體作標(biāo)簽或?qū)⑵錁?biāo)記，這視測定形 式而定。這些標(biāo)記能夠單獨(dú)或與其它組合物或化合物一起提供檢測信號。當(dāng)在診斷方法 中使用不止一種抗體時，期望所述標(biāo)記相互作用以產(chǎn)生可檢測的信號。最期望的是，可 肉眼(例如通過比色)檢測標(biāo)記。在測定中多種酶系統(tǒng)起作用而顯示比色信號，例如葡糖 氧化酶(其用葡萄糖作為底物)在過氧化物酶和氫供體存在下釋放作為產(chǎn)物的過氧化物， 所述氫供體例如是四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，TMB產(chǎn)生可肉眼看見藍(lán)色的氧化TMB。其它 實(shí)例包括辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)和與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶聯(lián)用的己 糖激酶，所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與ATP、葡萄糖和NAD+反應(yīng)產(chǎn)生NADH等產(chǎn)物， 可因340nm波長處的吸光度增加而檢測NADH。 可在本發(fā)明方法中利用的其它標(biāo)記系統(tǒng)可通過其它方式檢測，所述方式例如是 在適合的檢測中，可用其中埋入染料的彩色乳劑微粒(Bangs Laboratories，Indiana)代 替酶來提供表示存在所得到的LCN2-抗體復(fù)合體的肉眼可見信號。其它標(biāo)記還包括熒 光化合物、放射性化合物或元素。優(yōu)選抗-LCN2抗體與可檢測熒光的熒光染料結(jié)合或 綴合，所述熒光染料例如異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅素(PE)、別藻藍(lán)蛋白(APC)、 coriphosphine-0 (CPO)或串聯(lián)染料、PE-花色素苷-5 (PE_Cy5)禾Π PE-德克薩斯紅 (ECD)。常用熒光染料包括異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅素(PE)、別藻藍(lán)蛋白(APC)， 還包括串聯(lián)染料、PE_Cy5、PE-花色素苷-7 (PE_Cy7)、PE-花色素苷-5.5 (PE_Cy5.5)、 ECD、羅丹明、多甲藻素-葉綠素-蛋白(PerCP)、FITC和Alexa染料?？筛鶕?jù)測 定方法來使用所述標(biāo)記組合，例如德克薩斯紅和羅丹明、FITC+PE、FITC+PE_Cy5和 PE+PE-Cy7 等等。用于與本發(fā)明診斷測定所用的抗體連接的可檢測標(biāo)記可易于自多種已知組合物 中選擇，并易于為診斷測定領(lǐng)域的技術(shù)人員獲得。用于本發(fā)明的抗-LCN2適配體、抗體 或片段不受所采用的特定可檢測標(biāo)記或標(biāo)記系統(tǒng)限制。因此，選擇和/或產(chǎn)生用于本發(fā) 明的具有任選的標(biāo)記的合適抗-LCN2抗體和適配體，在本領(lǐng)域、本說明書提供的、本文 引作參考的文獻(xiàn)和常規(guī)免疫學(xué)教導(dǎo)的范圍內(nèi)。同樣地，用于測量生物樣品中的LCN2的特定測定形式可選自多種免疫測定， 例如酶聯(lián)免疫吸附測定，例如以下實(shí)施例所述測定；夾心免疫測定；均相法測定或其它 常規(guī)測定形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于從任何種類的常規(guī)免疫測定形式中選擇測定方法以實(shí)施本發(fā)明。用于檢測生物樣品中的蛋白質(zhì)的其它試劑(例如肽模擬物、能夠檢測LCN2的合 成化學(xué)化合物)，可在用于定量檢測生物樣品中的LCN2的其它測定形式(例如蛋白質(zhì)印 跡、流式細(xì)胞術(shù)等)中使用。LCN2(優(yōu)選在血漿或血清中)的測量起作為CVD風(fēng)險的生物標(biāo)記的作用。根據(jù)本發(fā)明方法，為了測定心血管病的風(fēng)險或進(jìn)展，測量哺乳動物受試者的生物流液中LCN2 的水平，并將之與群體中的LCN2水平的參考標(biāo)準(zhǔn)比較。與所述標(biāo)準(zhǔn)比較LCN2水平升 高預(yù)示疾病風(fēng)險增加。參考標(biāo)準(zhǔn)通過測量正常群體樣品的LCN2值來確立，所述正常群體固然由不同 心血管健康程度(從健康到各種漸增的CVD/CAD風(fēng)險到罹患CVD/CAD)的哺乳動物受 試者組成。因此，優(yōu)選通過使用測量受試者LCN2水平所用的相同的測定技術(shù)來提供標(biāo) 準(zhǔn)，以在標(biāo)準(zhǔn)化中避免任何誤差。如以下實(shí)施例所證明，可基于與群體的LCN2水平比 較LCN2的增加來測定相對CVD風(fēng)險水平。因此，在一個實(shí)施方案中，當(dāng)受試者LCN2水平在形成群體的LCN2水平的最小 25%的范圍內(nèi)時，受試者具有“正?！?LCN2水平或低心血管病風(fēng)險。因此，當(dāng)受試者 LCN2水平高于群體LCN2水平的最低25%時，該測量值表示一定程度的心血管病風(fēng)險。 例如，在另一實(shí)施方案中，當(dāng)受試者LCN2水平在形成群體的LCN2水平的最低25-50% 的范圍內(nèi)時，受試者具有低的中間值，但心血管病風(fēng)險增加。在其中受試者LCN2水平 高于形成群體的LCN2水平的50%的情況下，診斷受試者具有中等心血管病風(fēng)險。同樣 地，當(dāng)受試者LCN2水平高于形成群體的LCN2水平的75%時，受試者具有發(fā)展心血管病 的高風(fēng)險，或顯示已有的心血管病在進(jìn)展。最后，當(dāng)受試者LCN2水平高于標(biāo)準(zhǔn)群體的 LCN2水平的80%時，受試者具有疾病最高風(fēng)險和/或進(jìn)行性心血管病最高風(fēng)險。評估用心血管藥物或用降低中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病風(fēng)險的藥物治療的個 體從特定治療中獲益的可能性的方法包括從該個體獲得生物流液樣品，測定樣品中脂 籠蛋白_2的濃度，并將所測定的脂籠蛋白_2濃度與預(yù)測定的參考值進(jìn)行比較。在一個 實(shí)施方案中，預(yù)測定的參考值可為從先前測試或用特定藥物治療前的測試中獲得的值。 與參考值相比，若樣品中脂籠蛋白_2濃度降低，則存在從治療獲益的可能性。在某些實(shí) 施方案中，所述藥物可選自抗炎性藥物、抗血栓藥物、抗血小板藥物、血纖蛋白溶解 藥、降脂藥物、直接凝血酶抑制劑和糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑和結(jié)合細(xì)胞粘附分子并抑 制白血細(xì)胞附著所述分子的能力的藥物。本發(fā)明實(shí)施方案可使用脂籠蛋白_2作為用于預(yù)測個體發(fā)展中風(fēng)、心臟病發(fā)作或 心血管病風(fēng)險的體外診斷標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，待預(yù)測的心血管病可為慢性心臟病、急性冠狀動脈癥狀或 心機(jī)能不全。本發(fā)明實(shí)施方案可使用能夠降低個體脂籠蛋白_2濃度的組分用于制備預(yù)防中 風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病的藥物或治療心血管病的藥物。在一個實(shí)施方案中，可使用 針對脂籠蛋白_2的中和抗體或抑制脂籠蛋白_2生產(chǎn)或拮抗脂籠蛋白_2生物活性的化學(xué) 化合物。按照實(shí)施方案，本發(fā)明涵蓋降低中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病風(fēng)險的方法或治療心血管病的方法，所述方法通過將能夠在受試者中降低循環(huán)脂籠蛋白-2濃度的藥物給 予有此需要的受試者來實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明方法的再一實(shí)施方案中，可通過與測量一種或不止一種CVD/CAD生 物標(biāo)記聯(lián)合測量LCN2水平，來進(jìn)行CVD或CAD的風(fēng)險評估。所述另外的生物標(biāo)記包 括但不限于冠狀動脈鈣化、超敏C-反應(yīng)蛋白(CRP)、髓過氧化物酶(MPO)、炎癥標(biāo)記、 脂蛋白、高半胱氨酸、溶纖維蛋白和止血功能標(biāo)記(例如纖維蛋白原、D-二聚體、組織 纖溶酶原激活物(tPA)、纖溶酶原激活物抑制劑1抗原)、炎性標(biāo)記(包括但不限于腫瘤 壞死因子-a (TNFa)、脂蛋白-相關(guān)磷脂酶(LpPLA2)、腦利尿鈉肽(BNP)、白細(xì)胞介 素-Ιβ(Ι -Ιβ)、IL-18、IL-14、IL-6、可溶性 TNF 受體 _1 (solTNFRl)和 CD40 配體 (CD40L)等等)以及膽固醇組分(HDL、LDL或二者)和CVD的其它傳統(tǒng)風(fēng)險因子(例 如本領(lǐng)域眾所周知的那些因子)的測量值。LCN2水平和指示CVD風(fēng)險水平的已知第二 生物標(biāo)記之間的相關(guān)性進(jìn)一步確證CVD的風(fēng)險或進(jìn)展。因此，測量LCN2可起確證對已 知生物標(biāo)記的測定所提供的CVD跡象的作用?；蛘?，測量LCN2可起比已知生物標(biāo)記 (例如CRP)更準(zhǔn)確地診斷CVD/CAD風(fēng)險的作用。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明方法可包括經(jīng)給定時間期間重復(fù)測量LCN2水平的 步驟，藉此起監(jiān)測CVD患者進(jìn)展的作用。所述方法可用于測定CVD/CAD的特定治療 方案的成功程度，并可指出其中需要改變療法的情況。B.用于治療心血管病或炎癥的治療方法作為本發(fā)明人測定作為CAD/CVD生物標(biāo)記的LCN2水平的必然結(jié)果，本發(fā)明進(jìn) 一步提供用于延遲CVD/CAD和/或炎性疾病進(jìn)展的新型治療。所述炎性疾病包括但不 限于糖尿病、肥胖、胰島素抵抗和起因于動脈粥樣硬化心血管病的疾病，例如中風(fēng)、腎 衰竭、失明和栓塞等。所述方法提供治療方案，該治療方案包括給予患者足以降低循環(huán) LCN2或抑制其作用的量的化合物(例如LCN2中和抗體或LCN2拮抗劑)。因?yàn)槿缟纤?述，相對于標(biāo)準(zhǔn)群體CVD/CAD風(fēng)險水平隨血漿或血清中的LCN2增加而增加，所以該方 法試圖降低LCN2水平以連續(xù)降低風(fēng)險水平值。例如，對于基于血清LCN2水平歸類為 極高風(fēng)險的患者，即標(biāo)準(zhǔn)群體最高的75%中的值，該方法涉及將血清LCN2中和到落入 下一級標(biāo)準(zhǔn)最低水平范圍內(nèi)的濃度。然而，就膽固醇水平而言，人們認(rèn)為將高LCN2水 平降低到起始時的高LCN2風(fēng)險水平值以下的任何值是理想的。重復(fù)治療以使LCN2水 平漸進(jìn)式持續(xù)降低，直到LCN2水平穩(wěn)定在標(biāo)準(zhǔn)群體的最小百分位數(shù)，即對于特定患者 盡可能低于或接近正常/低風(fēng)險/標(biāo)準(zhǔn)群體的第一個25%。 因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法涉及通過降低受試者循環(huán)LCN2的水平 或作用，來治療或延遲哺乳動物受試者中炎性疾病或心血管疾病的進(jìn)展。理想情況是， 將所述水平降低至少顯示水平的10%。更為理想的是，將所述水平降低至少顯示水平 的20%。用本文所述測定，人們可通過將受試者水平與標(biāo)準(zhǔn)群體中的LCN2水平進(jìn)行比 較，來測量受試者LCN2水平。因此，同樣理想的是讓受試者水平降低到低于所述標(biāo)準(zhǔn) 群體的最高四分位數(shù)的水平，即75%截點(diǎn)(outpoint)。根據(jù)本方法，可繼續(xù)治療以將受 試者LCN2水平降低到在標(biāo)準(zhǔn)群體的50-75%四分位數(shù)內(nèi)的水平或比其更低的水平。按照 本發(fā)明另一實(shí)施方案，采用所述方法將受試者LCN2水平降低到小于標(biāo)準(zhǔn)群體的最高的 50%的水平。當(dāng)然，當(dāng)將受試者水平降低到標(biāo)準(zhǔn)群的最低的25%范圍內(nèi)的水平時，該方法的實(shí)行最為理想。這些方法可涉及重復(fù)給予拮抗劑，或?yàn)榛颊咛峁┰谄渲醒h(huán)LCN2水平保持在 所期需閾值水平的治療療程，其如本文所述。在某些實(shí)施方案中，使用包含用于預(yù)防中 風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病或用于治療心血管病的藥物的藥物組合物，所述藥物選自抗 炎性藥物(包括阿司匹林(aspirin)和非阿司匹林抗炎性藥物)、抗糖尿病藥物[PPARy激 動劑噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones)(例如羅格列酮(ROSIGLITAZONE))]、抗血栓藥 物、抗血小板藥物、血纖蛋白溶解藥、降脂藥物、直接凝血酶抑制劑、糖蛋白Ilb/IIIa受 體抑制劑、結(jié)合細(xì)胞粘附分子并抑制白血細(xì)胞附著到所述分子的能力的藥劑、鈣通道阻 斷藥、腎上腺素能受體阻滯劑、環(huán)加氧酶_2抑制劑和血管緊張素系統(tǒng)抑制劑；所述 藥物組合物還包含能夠降低個體脂籠蛋白_2濃度的組分。所述治療方法用于已有CVD/CAD的患者或用于循環(huán)LCN2水平高于循環(huán)LCN2
正常值的無臨床癥狀患者。 術(shù)語“LCN2拮抗劑”意指治療后與治療前所存在的比較，可將循環(huán)LCN2降 低到上述較低的風(fēng)險水平的任何化合物。在一個實(shí)施方案中，拮抗劑預(yù)防LCN2與其天 然存在的受體結(jié)合。因此，所述化合物可為合成藥物、抗-LCN2抗體或其片段或降低 LCN2表達(dá)的治療組合物。所述用于該治療方法的LCN2拮抗劑可為市售已知化合物或現(xiàn) 有技術(shù)已知化合物。根據(jù)本方法，可由主治醫(yī)生根據(jù)相關(guān)因素選擇給予患者(優(yōu)選人患者)所選擇的 LCN2拮抗劑的合適的量和制劑，以實(shí)現(xiàn)所期需的循環(huán)LCN2降低。例如，所選擇的降 低LCN2的化合物的劑量隨以下因素變化而變化所用的特定組合物(拮抗劑性質(zhì)，例 如蛋白質(zhì)類、合成化學(xué)藥品等)、化合物的半衰期、心血管病或炎性疾病的特性和/或階 段、患者現(xiàn)有的LCN2水平、患者年齡、體重、性別、一般體質(zhì)條件、給藥途徑、任何 其它藥物和治療以及受試者病史?？赏ㄟ^主治醫(yī)生基于在治療過的個體受試者方面的經(jīng) 驗(yàn)來確定準(zhǔn)確劑量。有效治療劑量含有足以降低循環(huán)LCN2水平的量，并優(yōu)選足以將起 始LCN2水平降低約20%或更多的量。同樣地，給藥途徑、給藥方案和給藥頻率取決于上述鑒定的因子和患者對該治 療的反應(yīng)，其如通過周期性評估LCN2水平所測定。按照另一實(shí)施方案，提供測試試劑盒用于發(fā)展中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病的 風(fēng)險的預(yù)測。所述試劑盒可包括脂籠蛋白_2結(jié)合組分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑盒可 包括中和抗體或另一種脂籠蛋白-2拮抗劑。可將試劑盒用于對中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血 管病進(jìn)行風(fēng)險評估、診斷和/或預(yù)測。在實(shí)施方案中，試劑盒可包括包含用于脂籠蛋白_2的測定物和使用說明和任選 相關(guān)材料的包裝，所述相關(guān)材料例如數(shù)字或顏色圖表，其用于將通過所述測定確定的脂 籠蛋白_2水平與發(fā)展未來心血管病風(fēng)險或與如上所述其它患者標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)聯(lián)。在另外的實(shí) 施方案中，試劑盒還包括對膽固醇、CRP、MPO或其它CVD/CAD標(biāo)記的測定。
實(shí)施例實(shí)施例1人受試者
募集46名患者(平均年齡52士22歲；中間年齡50歲；年齡范圍18_96歲；48% 女性)進(jìn)行研究。如果患者具有以下疾病則將其分為心臟病發(fā)作/中風(fēng)高危組ω冠狀 動脈病先前ΜΙ(在征得同意前>2天)，或穩(wěn)定或先前不穩(wěn)定性心絞痛(在征得同意前 >30天)且有文件證明的多血管冠狀動脈病或陽性應(yīng)激試驗(yàn)，或多血管經(jīng)皮冠狀動脈腔 內(nèi)成形術(shù)(PTCA)(在征得同意前> 30天)，或無心絞痛(若手術(shù)在征得同意前> 4年進(jìn) 行)或手術(shù)后有周期性心絞痛的先前15多血管冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG) ； (ii)外周 動脈病先前肢旁路手術(shù)(limb bypass surgery)或血管成形術(shù)或切斷術(shù)，間歇性跛行歷史 且在至少一側(cè)踝/手臂血壓比率<0.8，或非侵入性檢查；(iii)先前中風(fēng)；(iv)在征得同 意前> 7天且< 1年短暫性缺血發(fā)作(TIA) ； (ν)糖尿病(I型或II型)有證據(jù)顯示終 末器官損傷(視網(wǎng)膜病、左心室肥大、微量白蛋白尿(microalbuminuria)或大量白蛋白尿 (macro albuminuria))，或先前心臟病或血管病的任何證據(jù)。包括36名年齡和性別匹配的健康受試者對照組(平均年齡65士 18歲；中間年齡 72歲；年齡范圍23-87歲；78%女性)。圖IA和IB顯示具有心臟病發(fā)作/中風(fēng)高風(fēng)險的患者和健康對照的血清和尿液脂 籠蛋白-2CLCN2)的框線圖。具有心臟病發(fā)作/中風(fēng)高風(fēng)險的患者的血清LCN2濃度中 值顯著高于健康受試者(51.6對比35.5 μ g/L ； P < 0.001)。具有心臟病發(fā)作/中風(fēng)高風(fēng) 險的患者的尿液LCN2濃度中值亦顯著高于健康受試者(6.6對比1.6 μ g/L ； P < 0.05)。實(shí)施例2
用于定量測定鼠和人脂籠蛋白-2的抗體的產(chǎn)生和夾心ELISA的開發(fā)如上文所述在新西蘭雌性兔中產(chǎn)生針對重組人或鼠脂籠蛋白2的多克隆抗體 (17)。用蛋白A/G珠粒接著用其各自的抗原作為配體進(jìn)行親和色譜，從免疫接種的兔血 清純化抗-人或鼠脂籠蛋白2IgG。用Pierce的試劑盒使經(jīng)親和純化的抗_人或抗_鼠脂籠 蛋白2IgG生物素化，并作為檢測抗體使用。用未標(biāo)記的抗_人或抗_鼠脂籠蛋白_2IgG 在4°C過夜包被96-孔微量滴定板。將人或小鼠血清稀釋(1 50)到PBS中，將100 μ 1 的稀釋樣品或重組標(biāo)準(zhǔn)施加到每一孔中，在37°C保溫1小時。將板洗滌3次，然后用 100 μ 1的檢測抗體再保溫2小時。用PBS再次洗滌3次后，讓孔與鏈霉抗生物素綴合的 辣根過氧化物酶保溫1小時，隨后與四甲基聯(lián)苯胺試劑反應(yīng)15分鐘。將總共ΙΟΟμΙ的 2MH2S04加到各孔中以終止反應(yīng)，測量450nm處的吸光度。通過在總共6個獨(dú)立測定中 一式二份測量5份血清樣品，來確定測定內(nèi)和測定間的差異系數(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于明白，可恰當(dāng)改變本發(fā)明來實(shí)現(xiàn)目的，并獲得所提及的結(jié) 果和優(yōu)點(diǎn)以及其中原有的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文提供的實(shí)施例是優(yōu)選實(shí)施方案的代表，為 例示性的，并非意欲限制本發(fā)明范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到對其中的修改以及其它用 途。這些修改涵蓋在本發(fā)明精神內(nèi)，由所附權(quán)利要求范圍來限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于明白，可對本文公開的發(fā)明進(jìn)行不偏離本發(fā)明范圍和精 神的不同的代替和修改。本說明書中所提及的所有專利及出版物皆表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人 員的水平。所有專利及出版物在此引作參考，其引用程度如同每一單個出版物被明確及 個別地聲明在此用作參考一樣，引用到不與本文的明確教導(dǎo)不一致的程度。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1.用于表征受試者心血管病風(fēng)險或心血管病進(jìn)展的方法，所述方法包括從所述受試者獲得體液樣品；測量所述樣品中的脂籠蛋白-2水平；和將所述受試者的脂籠蛋白_2水平與預(yù)測定的參考值比較，其中所述預(yù)測定的參考值 與群體中的標(biāo)準(zhǔn)脂籠蛋白_2水平相關(guān)，且其中與所述預(yù)測定的參考值比較脂籠蛋白_2水 平升高預(yù)示風(fēng)險增加。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述預(yù)測定值為單一值、多個值、單一范圍或多個范圍。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述預(yù)測定值為多個預(yù)測定的標(biāo)記物水平范圍，其中所述 受試者脂籠蛋白_2水平與所述預(yù)測定的參考值比較包括確定所述受試者脂籠蛋白_2水平所屬的預(yù)測定的標(biāo)記物水平范圍。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述心血管病為慢性心臟病、急性冠狀動脈癥狀、心機(jī)能 不全或中風(fēng)。
5.權(quán)利要求1的方法，所述方法進(jìn)一步包括測量所述樣品中心血管病或炎癥的第二標(biāo)記的水平，并將所述脂籠蛋白_2水平與所 述第二標(biāo)記物水平關(guān)聯(lián)，其中所述脂籠蛋白_2水平和第二標(biāo)記物水平的組合預(yù)測風(fēng)險。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第二標(biāo)記選自膽固醇部分、C-反應(yīng)蛋白(CRP)和髓 過氧化物酶(MPO)；所述方法進(jìn)一步包括基于所述脂籠蛋白_2水平確立第一風(fēng)險值，將 所述膽固醇、CRP或MPO的水平與第二預(yù)測定參考值比較以確立第二風(fēng)險值；和基于所述第一和第二風(fēng)險值的組合來表征所述受試者的風(fēng)險。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述第一和第二風(fēng)險值的組合確立不同于所述第一和第二 風(fēng)險值的第三風(fēng)險值。
8.權(quán)利要求1的方法，其中隨時間重復(fù)進(jìn)行所述測量，以監(jiān)測心血管病風(fēng)險隨時間的 變化或進(jìn)展。
9.用于評估受試者從用降低心血管病風(fēng)險的藥物治療獲得益處的可能性的方法，所 述方法包括從所述受試者獲得體液樣品；測量所述樣品中脂籠蛋白_2的水平；將所測定的脂籠蛋白_2濃度與預(yù)測定的參考值進(jìn)行比較，其中若所述樣品中脂籠蛋 白_2濃度與所述預(yù)測定的參考值相比降低，則存在從所述治療獲益的可能性。
10.包含用于預(yù)防中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病或用于治療心血管病的藥物的藥物組 合物，所述藥物選自抗炎性藥物(包括阿司匹林和非阿司匹林抗炎性藥物)、抗糖尿病藥 物[PPARY激動劑噻唑烷二酮類(例如羅格列酮)]、抗血栓藥物、抗血小板藥物、血纖 蛋白溶解藥、降脂藥物、直接凝血酶抑制劑、糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑、結(jié)合細(xì)胞粘附 分子并抑制白血細(xì)胞附著到所述分子的能力的藥劑、鈣通道阻斷藥、腎上腺素能受體 阻滯劑、環(huán)加氧酶_2抑制劑和血管緊張素系統(tǒng)抑制劑；所述藥物組合物還包括能夠降低 個體脂籠蛋白-2濃度的組分。
11.權(quán)利要求10的藥物組合物，其中所述組分包含針對脂籠蛋白_2的中和抗體或阻 抑脂籠蛋白_2產(chǎn)生或拮抗脂籠蛋白_2生物活性的化學(xué)化合物。
12.降低中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病風(fēng)險或治療心血管病的方法，所述方法包括給予受試者能夠降低身體中脂籠蛋白-2濃度的藥物。
13.用于預(yù)測發(fā)展中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管病風(fēng)險的測試試劑盒，所述試劑盒包括脂籠蛋白-2結(jié)合組分。
14.權(quán)利要求13的測試試劑盒，其中所述脂籠蛋白_2結(jié)合組分為適配體、抗體或另 一脂籠蛋白-2拮抗劑。
15.包括包裝的測試試劑盒，所述包裝包括用于脂籠蛋白_2的測定物和使用說明書。
16.權(quán)利要求15的測試試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括用于讓通過所述測定確定的脂 籠蛋白_2水平與發(fā)展未來心血管病的風(fēng)險或與其它患者標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)聯(lián)的數(shù)字圖表或顏色圖 表。
17.權(quán)利要求16的測試試劑盒，所述試劑盒進(jìn)一步包括用于心血管病第二標(biāo)記的測定物。
18.權(quán)利要求17的測試試劑盒，其中所述第二標(biāo)記測定物是用于膽固醇、C-反應(yīng)蛋 白或髓過氧化物酶的測定物。
19.在哺乳動物受試者中治療心血管疾病或延遲其進(jìn)展的方法，所述方法包括降低所 述受試者循環(huán)脂籠蛋白_2的水平或作用。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述降低包含給予一定量脂籠蛋白_2拮抗劑。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述拮抗劑為脂籠蛋白_2的抗體或干擾脂籠蛋白_2與 其受體結(jié)合的化合物。
22.脂籠蛋白-2在制備用于表征受試者心血管病風(fēng)險或進(jìn)展的藥物中的用途，其中所 述藥物經(jīng)過調(diào)配以使所述受試者脂籠蛋白_2水平與預(yù)測定的參考值比較，其中所述預(yù)測 定的參考值與群體中脂籠蛋白_2標(biāo)準(zhǔn)水平有關(guān)，且其中與所述預(yù)測定的參考值相比脂籠 蛋白-2水平升高預(yù)示風(fēng)險增加。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述預(yù)測定值為單一值、多個值、單一范圍或多個范圍。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述預(yù)測定值為多個預(yù)測定的標(biāo)記物水平范圍，其中讓 所述受試者脂籠蛋白_2水平與所述預(yù)測定的參考值比較包括確定受試者脂籠蛋白_2水平所屬于的預(yù)測定的標(biāo)記物水平范圍。
25.權(quán)利要求22的用途，其中所述心血管病為慢性心臟病、急性冠狀動脈癥狀、心機(jī) 能不全或中風(fēng)。
26.權(quán)利要求22的用途，其中所述藥物進(jìn)一步包括第二標(biāo)記，并經(jīng)過調(diào)配以測量所述 樣品中心血管病或炎癥的第二標(biāo)記的水平，并且使所述脂籠蛋白_2水平與所述第二標(biāo)記 物水平相關(guān)，其中脂籠蛋白_2水平和第二標(biāo)記物水平的組合預(yù)示風(fēng)險。
27.權(quán)利要求26的用途，其中所述第二標(biāo)記選自膽固醇部分、C-反應(yīng)蛋白(CRP)和 髓過氧化物酶(MPO)；所述用途進(jìn)一步包括基于所述脂籠蛋白_2水平確立第一風(fēng)險值， 將膽固醇、CRP或MPO的水平與第二預(yù)測定的參考值進(jìn)行比較以確立第二風(fēng)險值和基于所述第一和第二風(fēng)險值的組合表征所述受試者風(fēng)險。
28.權(quán)利要求27的用途，其中所述第一和第二風(fēng)險值的組合確立不同于所述第一和第 二風(fēng)險值的第三風(fēng)險值。
29.脂籠蛋白-2在制備用于評估受試者從用降低心血管病風(fēng)險的藥物的治療中獲益的 可能性的藥物中的用途，其中所述藥物經(jīng)過調(diào)配以使所測定的脂籠蛋白_2濃度與預(yù)測定 的參考值進(jìn)行比較，其中若所述樣品中的脂籠蛋白_2濃度與所述預(yù)測定的參考值相比降 低，則存在從所述治療獲益的可能性。
30.能夠降低身體脂籠蛋白-2濃度的藥物在制備用于降低中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心血管 病風(fēng)險或治療心血管病的藥物中的用途。
31.能夠降低哺乳動物受試者身體循環(huán)脂籠蛋白_2水平或作用的藥物在制備用于治療 所述受試者心血管疾病或延遲其進(jìn)展的藥物中的用途。
32.權(quán)利要求31的用途，其中所述藥物為一定量的脂籠蛋白_2拮抗劑。
33.權(quán)利要求31的用途，其中所述藥物為脂籠蛋白_2抗體或干擾脂籠蛋白-2與其受 體結(jié)合的化合物。
34.用于表征受試者心血管病風(fēng)險或進(jìn)展的脂籠蛋白-2，其中所述藥物經(jīng)過調(diào)配以使 所述受試者脂籠蛋白_2水平與預(yù)測定的參考值進(jìn)行比較，其中所述預(yù)測定的參考值與群 體中脂籠蛋白_2標(biāo)準(zhǔn)水平有關(guān)，并且其中與所述預(yù)測定的參考值相比脂籠蛋白_2水平升 高預(yù)示風(fēng)險增加。
35.用于評估受試者從用降低心血管病風(fēng)險的藥物的治療中獲益的可能性的脂籠蛋 白-2，其中所述藥物經(jīng)過調(diào)配以使所測定的脂籠蛋白_2濃度與預(yù)測定的參考值進(jìn)行比 較，其中若所述樣品中的脂籠蛋白_2濃度與所述預(yù)測定的參考值相比降低，則存在從所 述治療獲益的可能性。
36.能夠降低身體內(nèi)脂籠蛋白-2濃度的藥物，其用于降低所述中風(fēng)、心臟病發(fā)作或心 血管病的風(fēng)險或治療心血管病。
37.能夠降低受試者身體內(nèi)循環(huán)脂籠蛋白-2的水平或作用的藥物，其用于治療哺乳動 物受試者心血管疾病或延遲其進(jìn)展。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于通過諸如免疫測定或免疫試驗(yàn)的測定來測量體液(包括但不限于血液、血清、血漿、尿液、唾液、淚液等)中的脂籠蛋白-2以用于以下目的的方法及儀器(1)預(yù)測未來心血管病的風(fēng)險；和(2)測定某些個體自使用設(shè)計(jì)為預(yù)防和/或治療心血管病的某些治療中獲得較大或較小程度的益處的可能性。
文檔編號A61P9/00GK102026655SQ200980116060
公開日2011年4月20日 申請日期2009年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日
發(fā)明者G·W·H·高德禮, M·萊曼, R·任能博, 徐愛民, 汪玉, 陳佩兒 申請人:港大科橋有限公司, 金永發(fā)企業(yè)有限公司