專利名稱：與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白BnL1L及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物中的脂肪酸又被稱為植物油，它廣泛存在于植物的種子中。植物油用途廣泛， 運(yùn)用生物技術(shù)改良植物體內(nèi)脂肪酸的組分和含量具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中，遺傳工程技 術(shù)所選用的操作基因必需是植物體內(nèi)脂肪酸生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，但是目前人們對(duì) 于植物脂肪酸生物合成的分子調(diào)控機(jī)制還不甚了解，因此，利用遺傳工程技術(shù)提高油料作 物含油量的工作目前進(jìn)展緩慢。以雙子葉模式植物擬南芥為例，植物的胚胎發(fā)生主要分為 兩個(gè)階段早期形態(tài)發(fā)生過(guò)程和晚期成熟過(guò)程。整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程中伴隨著淀粉、蛋白質(zhì) 和脂肪酸等貯藏物質(zhì)的積累。在胚胎發(fā)育早期，主要是淀粉的大量積累，在組織和器官形 成以后，淀粉被轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)和脂肪酸。在發(fā)育的種子中，碳水化合物通過(guò)糖酵解途徑被分 解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)體后再轉(zhuǎn)化成丙酮 酸和乙酰CoA，乙酰CoA作為底物參與脂肪酸的合成(Ruuska, S. A.，Girke, T.，Benning,
C., and Ohlrogge, J. B. (2002). Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsis seed filling. Plant Cell 14,1191-1206.)。在種子發(fā)育過(guò)程中，質(zhì)體內(nèi)的脂肪酸合成酶復(fù)合物中的酶類負(fù)責(zé)脂肪酸的合成， 所合成的脂肪酸被導(dǎo)入胞質(zhì)?；鵆oA庫(kù)中以維持三酯酰甘油(TAG)積累。植物種子中的TAG 的生物合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的。TAG的前體是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的過(guò) 程共需要三種酰基轉(zhuǎn)移酶和一種磷酸水解酶，分別是甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)，溶 血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)，二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase) (Ohlrogge 等，1979，Proc Natl Acad Sci，USA，76 1194-1198)。這三種?；D(zhuǎn)移酶催化甘 油骨架的逐步酰基化過(guò)程。近十余年來(lái)，科學(xué)家們對(duì)利用遺傳工程技術(shù)提高植物體內(nèi)，特別 是種子中的脂肪酸含量進(jìn)行了各種有益的探索。Shintani等在煙草中過(guò)量表達(dá)了 ACCase 的一個(gè)亞基_生物素羧化酶(BC亞基)，在煙草葉片中BC的表達(dá)水平提高了 3倍，其它三 個(gè)亞基的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化，但脂肪酸的含量和組成也沒(méi)有明顯改變(Shintani，
D., Roesler, K. , Shorrosh,B.，Savage，L，and Ohlrogge,J. (1997).Antisenseexpression and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves. Plant Physiol 114， 881-886.)。另一項(xiàng)研究表明，增加丙酰CoA的含量能夠提高脂肪酸的含量。Roeseler等 利用種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子在油菜中過(guò)量表達(dá)擬南芥中的HO-ACCase基因，結(jié)果使ACCase 的活性明顯提高，種子中的含油量提高3-5% (Roesler，K.，Shintani, D.，Savage, L.， Boddupalli, S. , and Ohlrogge, J. (1997). Targeting of the Arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds. Plant Physiol 113, 75-81.)。Roeseler等的研究結(jié)果表明，丙酰CoA水平能夠提高脂肪酸的含量，但提高幅度 較小。Dechesh等將菠菜的KASIII基因在煙草中過(guò)量表達(dá)，結(jié)果使KASIII的酶活性提高 7 100-300 倍，但脂肪酸的含量卻降低了 5-10% (Dehesh 等，2001，Plant Physiol.，125 1103-1114)。上述研究結(jié)果表明，植物體內(nèi)的脂肪酸代謝是一個(gè)復(fù)雜和高度協(xié)調(diào)的過(guò)程，通 過(guò)對(duì)脂肪酸代謝途徑中的個(gè)別或單個(gè)基因進(jìn)行遺傳操作并不能夠有效地改變脂肪酸的含 量。因此，Girke等人預(yù)言在脂肪酸的代謝過(guò)程中，很可能存在一種蛋白激酶或其它調(diào)控因 子(例如轉(zhuǎn)錄因子)在起調(diào)控作用(Girke，Τ.，Todd, J.，Ruuska，S.，White, J.，Benning, C. , and Ohlrogge, J. (2000). Microarray analysis of developing Arabidopsis seeds. Plant Physiol 124，1570-1581.)。目前，已發(fā)現(xiàn)的參與植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子有擬南芥的WRIl和LECl等。其 中，WRIl編碼一個(gè)AP2/ERra轉(zhuǎn)錄因子蛋白，它可能是植物體內(nèi)由蔗糖向TAG轉(zhuǎn)化的一個(gè) 關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子(Cernac，Α.，and Benning, C. (2004). WRINKLEDlencodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compound biosynthesis in Arabidopsis. Plant J 40，575-585. )。LECl屬于能結(jié)合啟動(dòng)子中順式作用元件CCAAT盒的 一類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控胚胎的發(fā)生與種子成熟，同時(shí)可能對(duì)胚胎形成過(guò)程中胚胎儲(chǔ)存物的積 Mii^fiIK (Lotan, T. ，Ohto, M. ，Yee, K. M. ，West, Μ. Α. ，Lo, R. ，Kwong, R. W. ，Yamagishi, K. , Fischer, R. L. , Goldberg, R. B. , and Harada, J. J. (1998). Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells. Cell 93，1195-1205.)。過(guò)量表達(dá)LECl能大幅度增加轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu，J.， Tan, H. , Zheng, Q. , Fu, F. , Liang, Y. , Zhang, J. , Yang, Χ. , Wang, Τ. , Chong, K. , Wang, Χ. J., et al. (2008). LEAFYC0TYLED0N1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis. Plant Physiol 148，1042—1054.)。在擬南芥基因組中，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因占了很大一部分，至少有1500個(gè)，占整 個(gè)基因組的5%以上(Riechmann等，2000，Science，290 :2110_2113)。這些轉(zhuǎn)錄因子大多 屬于大的基因家族，有的基因家族又包括許多亞族，而且有些轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有 的。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果表明，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)一類相關(guān)性狀的很多基因?qū)嵤┱{(diào)節(jié) 控制，從而有效改變植物的相關(guān)特性。CCAAT盒是一個(gè)廣泛存在于基因啟動(dòng)子上的順式作 用元件，與CCAAT序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子又稱為nuclear factor Y (NF-Y)或CCAAT binding factor (CBF)。NF-Y是一個(gè)由三種不同亞基構(gòu)成的異源三聚體復(fù)合物，它特異性地識(shí)別DNA 上的CCAAT序列，并與之結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。NF-Y的三種不同亞基分別屬于3個(gè)亞 族NF-YA(又稱為 HAP2 或 CBF-B)，NF_YB(又稱為 HAP3 或 CBF-A)和 NF_YC(又稱為 HAP5 或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心結(jié)構(gòu)域在序列上與組蛋白H2A和H2B有很高的同源性。 NF-YB/NF-YC形成一個(gè)緊密結(jié)合的異源二聚體復(fù)合物，NF-YA再結(jié)合在這個(gè)復(fù)合物的表面， 形成異源三聚體復(fù)合物。該三聚體復(fù)合物對(duì)DNA有很高的親和力(Gusmaroli，G.，Tonelli， C. , and Mantovani, R. (2002). Regulation of novel members of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits. Gene 283,41-48. ；Romier, C., Cocchiarella, F. ， Mantovani, R. ， and Moras, D. (2003). The NF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation by CCAAT factor NF-Y. J Biol Chem 278，1336-1345)。編碼NF-Y亞基的基因普遍存在于真核生物中，其中在酵母與動(dòng)物體中，各種亞 基都是由單基因編碼的。而在植物的基因組中，NF-Y亞基是由多種不同基因編碼的。在 擬南芥中，Gusmaroli等人先后于2001年和2002年報(bào)道了三個(gè)NF-Y亞族中的共29個(gè)ESTs 的序列(Gusmaroli, G. , Tonelli, C. , and Mantovani, R. (2001). Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana. Gene 264,173-185),本發(fā) 明的發(fā)明人于2004年完成了該家族32個(gè)基因cDNA的克隆，其中9個(gè)HAP2，11個(gè)HAP3， 12 個(gè) HAP5 (Wei 等，2004，Plant Physiol.，135 :773_782)。NF-YB 亞族的轉(zhuǎn)錄因子在基 因內(nèi)部都含有一個(gè)保守的B結(jié)構(gòu)域，依據(jù)B結(jié)構(gòu)域序列的差異，該家族被分為兩類=LEAFY COTYLEDON 1 (LECl)類型和非 LECl 類型(Kwong, R. W.，Bui，A. Q.，Lee，H.，Kwong, L. W.， Fischer,R. L. ,Goldberg,R. B. ,and Harada,J. J. (2003). LEAFY COTYLEDON1-LIKE defines a class of regu lators essential for embryo development. Plant Cell 15，5—18)。 LECl類型包括兩個(gè)基因LECl和LEAFY COTYLEDONl-Iike (LlL)。這兩個(gè)基因都是特異性 地在胚胎和種子發(fā)育過(guò)程中表達(dá)。LECl類型的轉(zhuǎn)錄因子的B結(jié)構(gòu)域含有16個(gè)保守的氨 基酸殘基，這16個(gè)氨基酸殘基在非LECl類型的轉(zhuǎn)錄因子中是不存在的。B結(jié)構(gòu)域是決定 LECl類轉(zhuǎn)錄因子在功能上區(qū)別于其它非LECl類轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵因素(Hyes eimg等，2003， Proc Natl Acad Sci，USA, 100 :2152_2156)。LECl 是 HAP3 家族中功能研究的較為清楚的 一個(gè)蛋白。LECl是擬南芥胚胎發(fā)生過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。LECl參與了種子成熟的 多個(gè)過(guò)程，包括種子的干燥和養(yǎng)分的積累。目前，在玉米、向日葵和胡蘿卜中，均發(fā)現(xiàn)了 LECl 白勺胃(Zhang, S. ， Wo ng, L. ， Meng, L. ， and Lemaux, P. G. (2002). Similarity of expression patterns of k nottedl and ZmLECl during somatic and zygotic embryogenesis in maize(Zea mays L·)· Planta 215,191-194. ；Yazawa, K. , Takahata, K. , and Kamada, H. (2004). Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledonl and expression analysis during somatic and zygotic embryogenesis. Plant Physiol Biochem 42，215-223.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白。本發(fā)明提供與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白，是調(diào)控種子脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子， 來(lái)源于十字花科蕓薹屬甘藍(lán)油菜(Brassica napus L.)，名稱為L(zhǎng)EAFYC0TYLED0N1-LIKE (簡(jiǎn) 稱BnLlL)，該蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與種子脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO :1由209個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端(N端)第56-121 位氨基酸殘基為NF-YB結(jié)構(gòu)域。所述取代和/或缺失和/或添加的一至幾個(gè)氨基酸殘基是1-10個(gè)氨基酸殘基，可 以是非結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。為了使1)中的BnLlL便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與種子脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因是如下1)-4) 中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列2的自5'末端第216-845位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；3)在嚴(yán)格條件下與與1)或幻的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述權(quán)利要求3中，3)或4)的基因 是序列表中序列3所示的基因。
5.含有權(quán)利要求2-4任一所述基因的重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是按照下述1)或2)的 方法制備得到的重組表達(dá)載體1)將序列表中序列4的自5’端第891-1145位所示的啟動(dòng)子與權(quán)利要求2-4任一所述 基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體。2)將序列表中序列4的自5’端第872-1145位所示的啟動(dòng)子與權(quán)利要求2-4任一所述 基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位點(diǎn)間，得到重組表達(dá)載體。
7.一種培育種子含油量高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2-4任一所述的編碼基 因轉(zhuǎn)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物種子的含油量高于所述目的植物種 子的含油量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2-4任一所述的編碼基因是通 過(guò)權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子 葉植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、 棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹(shù)、橄欖樹(shù)、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小 麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁或草坪草。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種與種子脂肪酸合成相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與種子脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。將該蛋白的編碼基因?qū)胫参镏校梢蕴岣哂筒朔N子中的含油量。這對(duì)提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102070708SQ20091023828
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者付福友, 左建儒, 張健, 楊曉輝, 譚河林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所