專利名稱：C-met和egfr拮抗劑的聯(lián)合療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)和生長因子調(diào)控的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用 于病理狀況(諸如癌癥)治療的聯(lián)合療法。
背景技術(shù)：
HGF是一種對(duì)多種不同細(xì)胞類型具有促有絲分裂，促運(yùn)動(dòng)和形態(tài)發(fā)生活性的 間充質(zhì)衍生多效因子。HGF效應(yīng)是經(jīng)由一種特異性酪氨酸激酶，c-met介導(dǎo)的，而且 在多種腫瘤中頻繁觀察到異常HGF和c-met表達(dá)。參見例如Maulik et al.，Cytokine & Growth Factor Reviews (2002), 13: 41—59; Danilkovitch—Miagkova & Zbar, J.Clin.Invest. (2002)，109(7) : 863-867。腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移涉及對(duì)HGF/c_Met信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。 參見例如 Trasolino &Comoglio，Nature Rev. (2002)，2 289-300)。HGF結(jié)合c-met受體酪氨酸激酶(RTK)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并調(diào)控多種生物學(xué)過 程，諸如細(xì)胞播散，增殖和存活。HGF-Met信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于正常胚胎發(fā)育(尤其在肌肉 祖細(xì)胞的遷移中)及肝和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是至關(guān)重要的(Bladt etal.，Nature(1995), 376，768-771. ； Hamanoue et al.，F(xiàn)aseb J (2000)，14，399-406 ； Maina et al.， Cell (1996), 87，531—542; Schmidt et al., Nature (1995)，373，699—702; Ueharaet al., Nature(1995), 373，702-705)。Met和HGF敲除小鼠的發(fā)育表型非常相似，提 示 HGF 是 Met 受體的關(guān)聯(lián)配體(Schmidt et al., 1995, supra ； Uehara et al., 1995, supra)。HGF-Met還在肝再生、血管發(fā)生和傷口愈合中發(fā)揮作用(Bussolino et al.，J Cell Biol (1992)，119，629-641; Matsumoto and Nakamura，Exs (1993), 65，225-249; Nusrat etal.，JClin Invest (1994) 93, 2056-2065)。前體 Met 受體經(jīng)歷蛋白水解切割，變 成通過二硫鍵相連接的細(xì)胞外α亞基和跨膜β亞基(Tempest etal.，Br J Cancer (1988)， 58，3-7)。 β亞基含有細(xì)胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域且在C端包含多底物停泊位點(diǎn)，銜接蛋白質(zhì) 在那里結(jié)合并啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)(Bardelli et al.，Oncogene(1997)，15，3103-3111 ； Nguyen et al., J Biol Chem(1997)，272，20811-20819 ； Pelicci et al.，Oncogene(1995)，10， 1631-1638 ； Ponzetto et al.，Cell (1994), 77，261-271 ； Weidner et al.，Nature (1996)， 384，173-176)。在HGF結(jié)合后，Met的活化分別經(jīng)由Gabl和Grb2/Sos介導(dǎo)的PI3激酶 和Ras/MAPK活化而導(dǎo)致酪氨酸磷酸化和下游信號(hào)傳導(dǎo)，這驅(qū)動(dòng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖(Furge et al., Oncogene(2000)，19，5582-5589； Hartmannetal., J Biol Chem(1994)，269， 21936-21939 ； Ponzetto etal.，J Biol Chem (1996)，271，14119-14123 ； Royal and Park，
J Biol Chem (1995)，270，27780-27787)。顯示了 Met在用致癌原處理的骨肉瘤細(xì)胞系中轉(zhuǎn)化(Cooper et al.,Nature (1984), 311，29-33 ； Parketal., Cell (1986), 45，895-904)。已經(jīng)在多種人癌癥 中觀察到Met過表達(dá)或基因擴(kuò)增。例如，Met蛋白質(zhì)在結(jié)腸直腸癌中過表達(dá)至少5倍，而 且有報(bào)告說在肝轉(zhuǎn)移中基因擴(kuò)增(Di Renzo et al.，Clin Cancer Res (1995)，1，147-154 ； Liuetal.，Oncogene(1992)，7，181-185)。還有報(bào)告說Met蛋白質(zhì)在口腔鱗狀細(xì)胞癌， 肝細(xì)胞癌，腎細(xì)胞癌，乳腺癌和肺癌中過表達(dá)(Jinet al.，Cancer(1997), 79，749-760 ； Morello et al.，J Cell Physiol (2001), 189，285-290 ; Natali et al.，Int J Cancer (1996)， 69，212-217 ； Olivero et al., Br J Cancer (1996)，74，1862-1868; Suzuki et al., Br J Cancer(1996), 74，1862-1868)。另外，已經(jīng)在肝細(xì)胞癌，胃癌和結(jié)腸直腸癌中觀察 到 mRNA 的過表達(dá)(Boix et al.，Hepatology (1994), 19，88-91 ； Kuniyasu et al.，Int J Cancer(1993), 55，72-75; Liuetal.，Oncogene(1992)，7，181-185)。已經(jīng)在腎乳頭狀癌中找到Met的激酶結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)致組成性受體活化的多種突 變(Olivero etal.，Int J Cancer (1999)，82，640-643; Schmidt et al., Nat Genet(1997)， 16，68-73 ； Schmidt et al.，Oncogene(1999)，18，2343-2350)。這些活化性突變賦予 組成性Met酪氨酸磷酸化并導(dǎo)致MAPK活化，病灶形成和腫瘤發(fā)生(Jeffers et al., Proc NatlAcad Sci U S A(1997), 94，11445-11450)。另外，這些突變?cè)鰪?qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵入 (Giordano et al., Faseb J (2000), 14，399-406 ； Lorenzato etal., Cancer Res (2002)，62， 7025-7030)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的HGF依賴性Met活化介導(dǎo)升高的運(yùn)動(dòng)，播散和遷移，這最終 導(dǎo)致侵入性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移(Jeffers etal.，Mol Cell Biol (1996)，16，1115-1125； Meiners etal., Oncogene(1998)，16，9-20)。已經(jīng)顯示了 Met與其它驅(qū)動(dòng)受體活化，轉(zhuǎn)化和侵入的蛋白質(zhì)相互作用。在贅生 性細(xì)胞中，有報(bào)告說Met與α 6β 4整聯(lián)蛋白(細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分諸如層粘連蛋白的 一種受體)相互作用，以促進(jìn)HGF依賴性侵入性生長(Trusolino etal.，Cell(2001)，107， 643-654)。另外，已經(jīng)顯示了 Met的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與腦信號(hào)蛋白家族的一個(gè)成員，叢蛋 白 Bl 相互作用，以增強(qiáng)侵入性生長(Giordano etal.，Nat Cell Biol (2002)，4，720-724)。 另外，還有報(bào)告說已知涉及腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的CD44v6與Met和HGF形成復(fù)合物并導(dǎo)致 Met 受體活化(Orian-Rousseau et al., Genes Dev (2002)，16，3074-3086)。Met是包括Ron和Sea的受體酪氨酸激酶(RTK)亞家族的一個(gè)成員(Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev (2002), 13，41-59)。Met 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)提 示與腦信號(hào)蛋白和叢蛋白的共享同源性。Met的N端含有大約500個(gè)氨基酸的Sema結(jié)構(gòu) 域，它在所有腦信號(hào)蛋白和叢蛋白中是保守的。腦信號(hào)蛋白和叢蛋白屬于分泌和膜結(jié)合 蛋白質(zhì)的一個(gè)大家族，最初記載了它們?cè)谏窠?jīng)發(fā)育中的作用(Van Vactor and Lorenz，Curr Bio(1999), 19，R201-204)。然而，最近已經(jīng)將腦信號(hào)蛋白過表達(dá)與腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移關(guān) 聯(lián)起來。在叢蛋白，腦信號(hào)蛋白和整聯(lián)蛋白中找到的一種富含半胱氨酸的PSI結(jié)構(gòu)域(也 稱作Met相關(guān)序列結(jié)構(gòu)域)鄰近Sema結(jié)構(gòu)域，接著是四個(gè)IPT重復(fù)，它們是在叢蛋白和 轉(zhuǎn)錄因子中找到的免疫球蛋白樣區(qū)。一項(xiàng)最近的研究提示Met Sema結(jié)構(gòu)域足以實(shí)現(xiàn)HGF 和肝素結(jié)合(Gherardi etal.，Proc Natl Acad Sci U S A (2003), 100(21) 12039-44)。如上所述，Met受體酪氨酸激酶受其關(guān)聯(lián)配體HGF活化，而且受體磷酸化活化 下游 MAPK，PI-3 激酶和 PLC- Y 途徑(L.Trasolino and P.M.Comoglio, Nat Rev Cancer 2，289 (2002) ； C.Birchmeier et al., Nat Rev Mol Cell Biol 4，915 (2003))。激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)Y1234/Y1235的磷酸化對(duì)于Met激酶活化是至關(guān)重要的，而多底物停泊位點(diǎn)中的 Y1349和Y1356對(duì)于src同源性_2(SH2)，磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)和Met結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (MBD)蛋白質(zhì)的結(jié)合是重要的(C.Ponzetto et al.，Cell 77，261(1994) ； K.M.Weidner et al.，Nature 384，173(1996) ； G.Pelicci et al., Oncogene 10，1631(1995))，以介導(dǎo)下游 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。另一個(gè)近膜磷酸化位點(diǎn)，Y1003，已經(jīng)詳細(xì)表征了它對(duì)Cbl E3連 接酶的酪氨酸激酶結(jié)合(TKB)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合(P.Peschard etal.，Mol Cell 8，995(2001)； P.Peschard, N.Ishiyama, T.Lin, S.Lipkowitz, M.Park, J Biol Chem 279，29565(2004))。 有報(bào)告說Cbl結(jié)合驅(qū)動(dòng)吞蛋白介導(dǎo)的受體胞吞，遍在蛋白化和后續(xù)受體降解(A.Petrelli etal., Nature 416，187(2002))。先前已經(jīng)在還包含相似Cbl結(jié)合位點(diǎn)的EGFR家族中 描述了這種受體下調(diào)機(jī)制(K.Shtiegman，Y.Yarden, Semin Cancer Biol 13, 29(2003)； M.D.Marmor, Y.Yarden, Oncogene 23，2057(2004) ； P.Peschard, M.Park, Cancer Cell 3，519(2003))。 已經(jīng)在多種腫瘤中報(bào)告了 Met和HGF的失調(diào)。已經(jīng)在數(shù)種癌癥中觀 察到配體驅(qū)動(dòng)的Met活化。在肺，乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤中觀察到升高的血清和腫瘤 內(nèi) HGF(J.M.Siegfried etal., Ann Thorac Surg 66，1915 (1998) ； P.C.Ma et al., Anticancer Res 23，49(2003) ； B.E.Elliott et al.Can J Physiol Pharmacol 80, 91(2002) ； C.Seidel，et al, Med Oncol 15，145(1998))。 已經(jīng)在多種癌癥中報(bào)告了 Met和/或HGF的過表達(dá)， Met擴(kuò)增或突變，諸如結(jié)腸直腸癌，肺癌，胃癌和腎癌，而且認(rèn)為驅(qū)動(dòng)不依賴配體的受體 活化(C.Birchmeier et al，Nat Rev Mol Cell Biol 4，915(2003) ； G.Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev 13, 41(2002))。 另外，肝小鼠模型中可誘導(dǎo)的Met過表達(dá)引起肝 細(xì)胞癌，證明受體過表達(dá)驅(qū)動(dòng)不依賴配體的腫瘤發(fā)生(R.Wang，et al, J Cell Biol 153， 1023(2001))。在家族性和散發(fā)性腎乳頭狀癌(RPC)患者中報(bào)告了將Met與癌癥聯(lián)系起來 的最有力證據(jù)。Met的激酶結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)致受體組成性活化的突變被鑒定為RPC中的種系 和體細(xì)胞突變(L.Schmidt etal.，Nat Genet 16，68(1997))。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中引入這些 突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移(M. Jeffers etal.，Proc Natl Acad Sci U S A 94，11445(1997))。涉及c-met 和 c-met 拮抗劑的出版物包括 Martens，Τ, et al(2006)Clin Cancer Res 12(20 Pt 1) 6144 ； US 6,468,529 ； W02006/015371 ； W02007/063816 ； W02006/104912 ； W02006/104911 ； W02006/113767 ； US2006-0270594 ； US2006-美 國專利 No.7,481,993 ； W02009/007427 ； W02005/016382 ； W02009/002521 ； W02007/143098 ； W02007/115049 ； W02007/126799。表皮生長因子受體(EGFR)家族包含四種密切相關(guān)的受體(HER1/EGFR， HER2，HER3和HER4)，其涉及細(xì)胞應(yīng)答，諸如分化和增殖。EGFR激酶或其配體 TGF-α的過表達(dá)常常與多種癌癥有關(guān)，包括乳腺癌，肺癌，結(jié)腸直腸癌，卵巢癌，腎 細(xì)胞癌，膀胱癌，頭頸癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和星形細(xì)胞瘤，而且認(rèn)為有助于這些腫瘤的惡 性生長。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EGFR基因(EGFRvIII)中的一種特定刪除突變提高細(xì)胞致腫瘤性。 EGFR刺激的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化促進(jìn)多種潛在促進(jìn)癌癥的過程，例如增殖，血管發(fā)生， 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵入，降低的凋亡和藥物抗性的誘導(dǎo)。升高的HER1/EGFR表達(dá)常常與晚期 疾病，轉(zhuǎn)移和差的預(yù)后有聯(lián)系。例如，在NSCLC和胃癌中，已經(jīng)顯示了升高的HERl/ EGFR表達(dá)與高的轉(zhuǎn)移率，差的腫瘤分化和升高的腫瘤增殖相關(guān)。已經(jīng)在NSCLC和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤觀察到活化受體的內(nèi)在蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性和/或提高下游信號(hào)傳導(dǎo)的突變。然而，突變?cè)谫x予對(duì)EGFR受體抑制劑(例如 Erlotinib (TARCEVA )或Gefitinib)的敏感性中作為首要機(jī)制的作用仍然有爭(zhēng)議。已 經(jīng)有報(bào)告預(yù)測(cè)全長EGF受體的突變體形式對(duì)EGF受體酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib的 響應(yīng)性(Paez, J.G.et al. (2004) Science304 1497-1500 ； Lynch, T.J.et al. (2004) N.Engl. J.Med.350 2129-2139)。細(xì)胞培養(yǎng)研究顯示了表達(dá)此類EGF受體突變體形式的細(xì)胞系 (即H3255)對(duì)EGF受體酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib的生長抑制作用更敏感，而且抑制表 達(dá)野生型EGF受體的腫瘤細(xì)胞系需要濃度高得多的Gefitinib。這些觀察結(jié)果提示EGF受 體的特定突變體形式可能反映對(duì)EGF受體抑制劑的更大敏感性，但是不鑒定完全無響應(yīng) 的表型。直接抑制EGFR的激酶活性的化合物，以及通過阻斷EGFR活化來降低EGFR 激酶活性的抗體作為抗腫瘤藥的使用的開發(fā)是研究努力密集的領(lǐng)域(de Bono J.S.and Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol.Medicine 8 S19-S26 ； Dancey, J.and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev.Drag Discovery 2:92-313)。數(shù)項(xiàng)研究已經(jīng)證明了，披露了， 或提示了 一些EGFR激酶抑制劑在與某些其它抗癌或化療藥劑或治療聯(lián)合使用時(shí)可能 改善對(duì)腫瘤細(xì)胞或瘤的殺傷(例如 Herbst, R.S.et al. (2001) Expert Opin.Biol.Ther.l 719-732 ； Solomon, B.et al (2003) Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55 713-723 ； Krishnan, S.et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, el-13 ； Grunwald, V.and Hidalgo, M. (2003) J.Nat. Cancer Inst.95 851-867; Seymour L. (2003) Current Opin.Investig.Drags4 (6) 658-666; Khalil, M.Y.et al. (2003) Expert Rev.Anticancer Ther.3 367—380 ; Bulgaru，A.M.et al. (2003) Expert Rev.Anticancer Ther.3 269-279 ； Dancey, J.and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev.Drug Discovery 2 92-313 ； Ciardiello, F.et al. (2000) Clin.Cancer Res.6 2053-2063 ；及專利公開文本 No: US2003/0157104)。Erlotinib (例如 Erlotinib HC1,也稱作 TARCEVA 或 OSI-774)是 EGFR 激
酶的一種可得口服抑制劑。在體外，已經(jīng)在多種人腫瘤細(xì)胞系(包括結(jié)腸直腸和乳 腺癌)中證明了 Erlotinib針對(duì)EGFR激酶的實(shí)質(zhì)性抑制活性(Moyer J.D.et al. (1997) Cancer Res.57 4838)，而且臨床前評(píng)估已經(jīng)證明針對(duì)多種表達(dá)EGFR的人腫瘤異種移 植物的活性(Pollack，V.A.et al(1999) J.Pharmacol.Exp.Ther.291 739)。已經(jīng)在臨床試 驗(yàn)中證明了 Erlotinib在多種適應(yīng)證中的活性，包括頭頸癌(Soulieres，D.，et al. (2004) J.Clin.Oncol.22 77)，NSCLC (Perez-Soler R, et al. (2001) Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20 310a, abstractl235)，CRC (Oza, M.，et al. (2003) Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22 196a, abstract785)禾PMBC(Winer，E.，et al. (2002)Breast Cancer Res.Treat.76 5115a, abstract445 ； Jones, R.J., et al. (2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22 45a, abstract 180)。 在一項(xiàng)III期試驗(yàn)中，Erlotinib單一療法在具有晚期治療不應(yīng)性NSCLC的患者中顯著延長 存活，延遲疾病進(jìn)展和延長肺癌相關(guān)癥狀惡化(Shepherd，F(xiàn).et al. (2004) J.Clin.Oncology, 22 14S (July 15 Supplement)，Abstract 7022)。在 2004 年 11 月，美國食品和藥品管理 局(FDA)批準(zhǔn)了TARCEVA 用于在至少一種在先化療方案失敗后治療具有局部晚期或 轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的患者。盡管癌癥治療獲得了重大進(jìn)展，但是仍然在尋找改良的療法。通過述及完整收錄本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)和出版物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于治療病理狀況(諸如癌癥)的聯(lián)合療法，其中組合c-met拮抗劑 與EGFR拮抗劑，由此提供顯著的抗腫瘤活性。一方面，本發(fā)明提供治療受試者中的癌癥的方法，包括對(duì)受試者施用治療有效 量的c-met拮抗劑和EGFR拮抗劑。c-met拮抗劑的例子包括但不限于可溶性c-met受體，可溶性HGF變體，對(duì) c—met或HGF特異性的適體(apatmers)或肽體(peptibodies), c_met小分子，抗c_met抗 體和抗HGF抗體。在一些實(shí)施方案中，c-met拮抗劑是抗c_met抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗c-met抗體包含重鏈可變域，其包含圖7中所繪 CDRl-HC, CDR2-HC 和 CDR3-HC 序列(SEQIDN0 13-15)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。在一 些實(shí)施方案中，所述抗體包含輕鏈可變域，其包含圖7中所繪CDR1-LC，CDR2-LC和 CDR3-LC序列(SEQ ID NO 5_7)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。在一些實(shí)施方案中，重鏈可變域包 含圖 7 中所繪 FR1-HC，F(xiàn)R2-HC, FR3-HC 和 FR4-HC 序列(SEQ ID NO 9-12)。在 一些實(shí)施方案中，輕鏈可變域包含圖7中所繪FR1-LC，F(xiàn)R2-LC，F(xiàn)R3-LC和FR4-LC序 列(SEQ ID NO 1-4)。在一些實(shí)施方案中，抗c_met抗體是單價(jià)的且包含F(xiàn)c區(qū)。在一 些實(shí)施方案中，所述抗體包含圖7中所繪Fc序列(SEQ ID NO: 17)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是單價(jià)的且包含F(xiàn)c區(qū)，其中所述Fc區(qū)包含第一和 第二多肽，其中所述第一多肽包含圖7中所繪Fc序列(SEQ ID NO: 17)且所述第二多肽 包含圖8中所繪Fc序列(SEQ ID NO 18)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗c-met抗體包含(a)第一多肽，其包含具有下述序列的重 鏈可變域QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIG MIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDY WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO 19)，圖 7 中所繪 CHl 序列(SEQID NO 16)和圖 7 中 所繪Fc序列(SEQ ID NO: 17)；和(b)第二多肽，其包含具有下述序列的輕鏈可變域 DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAST RESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO 20)和圖7中所繪CLl序列(SEQ ID NO 8)；和(c)第三多肽，其包含圖8中所 繪 Fc 序歹丨J (SEQ ID NO 18)。一方面，抗c-met抗體包含至少一項(xiàng)促進(jìn)抗體片段內(nèi)的Fc序列異二聚化，同時(shí) 將同二聚化降至最低的特征。此類特征改善免疫球蛋白群的收率和/或純度和/或同質(zhì) 性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體包含構(gòu)成“結(jié)”(knobs)和“穴”(holes)的Fc突 變，如W02005/063816中所記載的。例如，穴突變(hole mutation)可以是Fc多肽中 的T366A，L368A和/或Y407V中的一項(xiàng)或多項(xiàng)，而腔突變(cavity mutation)可以是 T366W。在一些實(shí)施方案中，c-met拮抗劑是 SGX-523，PF-02341066, JNJ-38877605， BMS-698769, PHA-665,752, SU5416, SU 1274，XL-880，MGCD265, ARQ 197， MP-470, AMG 102，抗體 223C4 或人源化抗體 223C4 (W02009/007427)，L2G7, NK4, XL-184, MP-470,或 Comp-1。c-met拮抗劑可用于降低或抑制HGF/c-met相關(guān)效應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)方面，包括但不限于c-met活化，下游分子信號(hào)傳導(dǎo)(例如促分裂原活化的蛋白質(zhì)激酶(MAPK)磷 酸化，AKT磷酸化，c-met磷酸化，PI3激酶介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo))，細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移， 細(xì)胞存活，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和血管發(fā)生。這些效應(yīng)可以通過任何生物學(xué)有關(guān)機(jī)制來調(diào)控， 包括破壞配體(例如HGF)對(duì)c-met的結(jié)合，c_met磷酸化和/或c_met多聚化。EGFR拮抗劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。EGFR拮抗劑還包 括小分子，諸如 US5616582，US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, W09814451, W09850038, W09909016, W09924037, W09935146, W00132651, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498 中記載的化合物。具 體的小分子 EGFR拮抗劑包括 OSI-774(CP_358774，Erlotinib, OSI Pharmaceuticals)； PD 183805 (CI 1033，2-丙烯酰胺，N_[4_[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4_ 嗎啉基) 丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二氫氯化物，Pfizer Inc.) ； lrcssa (ZD 1839，Gefitinib， AstraZeneca) ； ZM 105180 ((6-氨基-4- (3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)； BIBX-1382 (N8- (3-氯-4-氟-苯基)_N2_ (1-甲基-哌啶 _4_ 基)-嘧啶并[5，4_d] 嘧啶 _2，8- 二 胺，Boehringer Ingelheim) ； PKI-166 ((R)-4_[4_[ (1-苯基乙基)氨 基]-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羥基苯基)-4-[(1_苯基乙 基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785 (N_[4_[ (3-溴苯基)氨基]_6_喹 唑啉yl]-2- 丁炔酰胺)；EKB-569(N_[4-[(3-氯_4_氟苯基)氨基]-3_氰基_7_乙氧 基 _6_ 喹啉基]-4_ ( 二甲基氨基)-1- 丁烯酰胺)；lapatinib (Tykerb，GlaxoSmithKline)； ZD6474 (Zactima, AstraZeneca) ； CUDC — 101 (Curis) ； canertinib (CI—1033)； AEE788 (6-[4-[ (4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N_[(lR)-l-苯基乙基]_7H_吡咯并 [2, 3_d]嘧啶-4-胺，W02003013541，Novartis)禾PPKI166(4-[4_[[(1R)-1-苯基乙基] 氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚，W09702266 Novartis)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，EGFR拮抗劑具有依照US 5,757,498 (通過述及收入 本文)的通式I 其中m 為 1，2，或 3 ；每個(gè)R1獨(dú)立地選自下組氫，鹵素，羥基，羥基氨基，羧基，硝基，胍基，脲 基，氰基，三氟甲基和-(Ci-Q亞烷基亞烷基)-w-(苯基)，其中W為單鍵，0，S或 NH ；
或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自R9*^-^烷基，其是被氰基取代的，其中R9選自下 組R5，-OR6, -NR6R6，-C(0)R7，-NHOR5，-0C(0)R6，氰基，A 和 _YR5 ; R5 為
Ci-C；烷基；R6獨(dú)立地為氫或R5; R7為R5，-OR6或-NR6R6; A選自哌啶子基，嗎啉代， 吡咯烷子基，4-R6-哌嗪-1-基，咪唑-1-基，4-吡啶酮-1-基，-(CfC；亞烷基亞烷基) (co2h),苯氧基，苯基，苯基硫基，c2-c4烯基和-(CVQ亞烷基亞烷基)C(0)NR6R6 ； 且Y為S，SO,或S02;其中R5，-OR6和-NR6R6中的烷基部分任選是被1-3個(gè)鹵素取 代基取代的且R5，-OR6和_NR6R6中的烷基部分任選是被1或2個(gè)R9基團(tuán)取代的，且其 中所述任選取代基的烷基部分任選是被鹵素或R9取代的，前提是沒有兩個(gè)雜原子連接于 同一碳原子；或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自_NHS02R5，鄰苯二甲酰亞氨基-(CfC；)-烷基磺?；?氨基，苯甲酰氨基，苯磺?；被?-苯基脲基，2-氧代吡咯烷-1-基，2，5-二氧 代吡咯烷-1-基和Rlcl-(C2-C4)_烷?；被?，其中R1(l選自鹵素，-OR6，C2_C4烷?；?氧，-C(O)R7和-NR6R6;且其中所述-nhso2R5，鄰苯二甲酰亞氨基-(q-c;-烷基磺酰 基氨基，苯甲酰氨基，苯磺酰基氨基，3-苯基脲基，2-氧代吡咯烷-1-基，2，5-二氧 代吡咯烷-1-基和R1(l_ (C2-C4)-烷?；被鵕1基團(tuán)任選是被1或2個(gè)獨(dú)立地選自鹵素， q-c;烷基，氰基，甲磺酰基和q-c;烷氧基的取代基取代的；或者兩個(gè)R1基團(tuán)與它們所連接的碳一起形成5-8元環(huán)，其包括1或2個(gè)選自0， S和N的雜原子；R2為氫或CVQ烷基，其任選是被1-3個(gè)獨(dú)立地選自鹵素，CVC；烷氧 基，-nr6R6和-SO2R5的取代基取代的；n為1或2且每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，CrQ烷基，_NR6R6和 <^_(4烷氧基，其中所述R3基團(tuán)的烷基部分任選是被1-3個(gè)獨(dú)立地選自鹵素，Ci-C4烷氧 基，-NR6R6和_S02R的取代基取代的；且R4為疊氮基或_(乙炔基)_R"，其中R"為氫或烷基，其任選是被羥 基，-OR6，或-NR6R6取代的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，EGFR拮抗劑是選自下組的依照式I的化合物(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)_(3_乙炔基苯基)_胺；(6，7_ 二甲氧基 喹唑啉-4-基)-[3-(3'-羥基丙炔-1-基)苯基]_胺；[3-(2' _(氨基甲基)_乙 炔基)苯基]-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6_硝基喹唑 啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(4_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲 氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-2-甲基苯基)-胺；(6-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔 基苯基)_胺；(3-乙炔基苯基)-(6_甲磺酰基氨基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯 基)-(6，7-亞甲二氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔 基-6-甲基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(7_硝基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯 基)-[6-(4'-甲苯磺酰基氨基)喹唑啉-4-基h胺；(3-乙炔基苯基)-{6-[2'-苯二 酰亞氨基-乙-1'-基-磺?；被鵠喹唑啉-4-基}"胺；(3-乙炔基苯基)-(6_胍 基喹唑啉-4-基)-胺；(7-氨基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基 苯基)_(7_甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯 基)_胺；(7-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；[6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-基h(3-乙炔基苯基)_胺；(3-疊氮基苯基)_(6，7-二甲氧基喹唑 啉-4-基)-胺；(3-疊氮基-5-氯苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(4-疊 氮基苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺?；?喹唑 啉-4-基)-胺；(6-乙硫基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基-4-氟-苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-[3-(丙 炔-1'-基)-苯基]-胺；[6，7-雙-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(5-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-雙-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(3-乙炔 基-4-氟-苯基)_胺；[6，7-雙-(2-氯-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；[6- (2-氯-乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h (3-乙炔基-苯 基)_胺；[6，7-雙-(2-乙酰氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h(3-乙炔基-苯基)-胺； 2-[4- (3-乙炔基-苯基氨基)-7- (2-羥基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基h乙醇；[6- (2-乙 酰氧基_乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)_胺； [7- (2-氯-乙氧基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)_胺； [7-(2-乙酰氧基-乙氧基)-6-(2_甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-羥基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙 醇；2-[4-(3_乙炔基-苯基氨基)-7-(2_甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙 醇；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基h乙醇； [6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2_甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；(3-乙炔基-苯基)-{6- (2-甲氧基-乙氧基)-7-[2- (4-甲基-哌嗪-1-基)-乙 氧基]-喹唑啉-4-基}-胺；(3-乙炔基-苯基)-[7-(2_甲氧基-乙氧基)-6-(2_嗎 啉-4-基)-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔 基苯基)_胺；(6，7-二丁氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二異丙 氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-雙-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6- (2-羥基-乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧 基)-喹唑啉-1-基]-胺；[6，7-雙-(2-羥基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯 基)-胺；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基h乙 醇；(6，7-二丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基-5-氟-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基-4-氟-苯基)_胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(5_乙炔基-2-甲基-苯 基)_胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-4-甲基-苯基)-胺；(6-氨基甲 基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-苯基)-胺；(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑 啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺； (6-氨基羰基甲基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙 基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-異丙氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺； (6-氨基羰基乙基-7-異丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；和(6-氨基羰基乙基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)_胺；(6，7-二乙氧基喹唑 啉-1-基)_ (3-乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6- (2-羥基-乙氧基)-7-(2-甲氧 基-乙氧基)-喹唑啉-1-基h胺；[6，7-雙-(2-羥基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙 炔基苯基)-胺；[6，7-雙-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基h(3-乙炔基苯基)-胺； (6，7-二甲氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺?；?氨基-喹唑啉-1-基)-胺；和(6-氨基-喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，式I的EGFR拮抗劑為N-(3-乙炔基苯基)_6，7_雙 (2-甲氧基乙氧基)-4_喹唑啉胺。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，EGFR拮抗劑N-(3-乙炔基 苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺為HCl鹽形式。在另一個(gè)具體的實(shí)施方 案中，EGFR拮抗劑N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)_4_喹唑啉胺為基本 上同質(zhì)的結(jié)晶多型形式(在WO 01/34,574中描述為多型B)，其展現(xiàn)特征性峰的X射線粉 末衍射花樣，該特征性峰具有以度表示大約6.26、12.48、13.39、16.96、20.20、21.10、 22.98、24.46、25.14 和 26.91 的 2-theta。N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧 基)-4-喹唑啉胺的此類多型形式稱作Tarceva 以及OSI-774，CP-358774和Erlotinib。EGFR拮抗劑可用于降低或抑制EGFR-EGFR配體相關(guān)效應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)方面， 包括但不限于EGFR活化，下游分子信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞增殖。這些效應(yīng)可以通過任何生物 學(xué)有關(guān)機(jī)制來調(diào)控，包括破壞配體對(duì)EGFR的結(jié)合和破壞EGFR磷酸化。本發(fā)明的方法可用于改變?nèi)魏魏线m的病理狀態(tài)。例如，本發(fā)明的方法可用于治 療不同癌癥，實(shí)體瘤以及軟組織瘤。本發(fā)明的治療可改善的癌癥的非限制性例子包括乳 腺癌，結(jié)腸直腸癌，直腸癌，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，腎細(xì) 胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，軟組織肉瘤，卡波西氏肉瘤，類癌，頭頸癌，成膠質(zhì) 細(xì)胞瘤，黑素瘤，卵巢癌，胃癌，間皮瘤和多發(fā)性骨髓瘤。在模型方面，所述癌癥是轉(zhuǎn) 移性的。在其它方面，所述癌癥是非轉(zhuǎn)移性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在癌癥(諸如非小細(xì)胞肺癌)的聯(lián)合療法中使用抗c-met抗 #禾口 Erlotinib。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥不是EGFR拮抗劑(例如Erlotinib或Gefitinib)抗
性癌癥。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥不是Erlotinib或Gefitinib抗性癌癥。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥不是酪氨酸激酶抑制劑抗性癌癥。在某些實(shí)施方 案中，所述癌癥不是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑抗性癌癥。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥展示c-met和/或EGFR表達(dá)，擴(kuò)增，或活化。在 某些實(shí)施方案中，所述癌癥不展示c-met和/或EGFR表達(dá)，擴(kuò)增，或活化。在某些實(shí) 施方案中，所述癌癥展示c-met擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥展示c-met擴(kuò)增和 EGFR擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥展示野生型EGFR基因。在某些實(shí)施方案中，所 述癌癥展示野生型EGFR基因和c-met擴(kuò)增和/或c_met突變。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥展示EGFR突變。突變可位于EGFR基因的任 何部分或與EGFR基因有關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)中。例示性的EGFR突變包括例如外顯子18， 19，20或21中的突變，激酶結(jié)構(gòu)域中的突變，G719A，L858R，E746K，L747S， E749Q, A750P, A755V, V765M, S768I, L858P, E746-R748 刪除，R748-P753 刪除，M766-A767 AI 插入，S768-V769 SVA 插入，P772-H773 NS 插入，24020C， 24820A, 2486T > C, 2491G > C, 24940C, 25100T, 25390A, 25490T, 25630T, 2819T > C, 2482-2490 刪除，2486-2503 刪除，2544-2545 插入 GCCATA，2554-2555 插 入CCAGCGTGG，或2562-2563插入AACTCC。本領(lǐng)域知道EGFR活化性突變的其它例 子(參見例如美國專利公開文本No.2005/0272083)。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞或細(xì)胞系 不包含EGFR基因中的T790M突變。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥展示c-met和/或EGFR活化。在某些實(shí)施方案 中，所述癌癥不展示c-met和/或EGFR活化。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥展示組成性c-met和/或EGFR活化。在一些實(shí) 施方案中，所述組成性EGFR包含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的突變。在某些實(shí)施方案中，所 述癌癥不展示組成性c-met和/或EGFR活化。在某些實(shí)施方案中，所述癌癥展示不依賴配體的c-met和/或EGFR活化。在 某些實(shí)施方案中，所述癌癥不展示不依賴配體的c-met和/或EGFR活化。c-met拮抗劑可以與EGFR拮抗劑連續(xù)或聯(lián)合施用，或是在同一組合物中或是 作為分開的組合物?？梢酝瑫r(shí)進(jìn)行c-met拮抗劑和EGFR拮抗劑的施用，例如作為單一 組合物或者作為兩種或更多種不同組合物，使用相同或不同施用路徑?；蛘?另外，可 以以任何次序序貫進(jìn)行施用?；蛘?另外，可以作為序貫和同時(shí)二者任何次序的組合 來實(shí)施各步驟。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)或更多個(gè)組合物的施用之間可以存在范圍為 數(shù)分鐘至數(shù)天，至數(shù)周至數(shù)月的間隔。例如，可以先施用EGFR拮抗劑，接著是c-met 拮抗劑。然而，還涵蓋同時(shí)施用或者先施用c-met拮抗劑。因而，一方面，本發(fā)明提 供方法，包括施用c-met拮抗劑(諸如抗c-met抗體)，接著施用EGFR拮抗劑(諸如 Erlotinib(TARCEVA ))0在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)或更多個(gè)組合物的施用之間可以存 在范圍為數(shù)分鐘至數(shù)天，至數(shù)周至數(shù)月的間隔。一方面，本發(fā)明提供供治療癌癥中使用的組合物，其包含有效量的c-met拮抗 劑和藥學(xué)可接受載體，其中所述使用包括同時(shí)或序貫施用EGFR拮抗劑。在一些實(shí)施 方案中，所述c-met拮抗劑是抗c-met抗體。在一些實(shí)施方案中，所述EGFR拮抗劑是 Erlotinib (TARCEVA )?！矫妫景l(fā)明提供供治療癌癥中使用的組合物，其包含有效量的c-met拮抗 劑和藥學(xué)可接受載體，其中所述使用包括同時(shí)或序貫施用EGFR拮抗劑。在一些實(shí)施 方案中，所述c-met拮抗劑是抗c-met抗體。在一些實(shí)施方案中，所述EGFR拮抗劑是 Erlotinib (TARCEVA )。根據(jù)要治療的具體癌癥適應(yīng)證，本發(fā)明的聯(lián)合療法可以與別的治療劑諸如化療 劑或者別的療法諸如放療或手術(shù)聯(lián)合。許多已知的化療劑可以在本發(fā)明的聯(lián)合療法中使 用。優(yōu)選地，會(huì)使用作為具體適應(yīng)證標(biāo)準(zhǔn)治療的那些化療劑。聯(lián)合中要使用的每種治療 劑的劑量或頻率優(yōu)選與相應(yīng)藥劑在沒有其它藥劑的情況中使用時(shí)的劑量或頻率相同，或 更少。附圖簡述

圖1A和1B 通過qRT-PCR證實(shí)NSCLC細(xì)胞系和原發(fā)性腫瘤中的EGFR和
MET mRNA共表達(dá)。通過定量RT-PCR測(cè)定一組NSCLC細(xì)胞系(1A)或冷凍的原發(fā)性NSCLC腫瘤溶胞物(IB)中的EGFR和METmRNA的表達(dá)。在細(xì)胞系(P =0.59，ρ < 0.0001)和原發(fā)性 NSCLC 標(biāo)本(P = 0.48，ρ = 0.0003)中 EGFR 和 MET mRNA 水平
正相關(guān)。圖2 在對(duì)照培養(yǎng)基(Con)或含O.lug/ml四環(huán)素類似物多西環(huán)素(Dox)的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)含有針對(duì)c-met的四環(huán)素誘導(dǎo)型shRNA或針對(duì)GFP的對(duì)照shRNA(shGFP2)的 EBCl shMet 4.12細(xì)胞(shMet 4.12)48小時(shí)。血清饑餓2小時(shí)后，細(xì)胞不處理㈠或者用 TGFa (Τ, 20nM)或調(diào)蛋白bl(Hrg，2nM)處理20分鐘。如所示地對(duì)全細(xì)胞溶胞物評(píng)估 總的和磷酸-蛋白質(zhì)的表達(dá)。檢測(cè)肌動(dòng)蛋白以顯示各道之間的當(dāng)量加載。圖3 在對(duì)照培養(yǎng)基或含有O.lug/ml Dox的培養(yǎng)基(Dox)中培養(yǎng)含有針對(duì)c_met 的誘導(dǎo)型shRNA或針對(duì)GFP的對(duì)照shRNA的NSCLC H441細(xì)胞48小時(shí)。血清饑餓2 小時(shí)后，細(xì)胞不處理(_)或者用TGF a (T)或調(diào)蛋白bl (H)處理20分鐘。檢測(cè)β -肌動(dòng) 蛋白(第4道)以顯示各道之間的當(dāng)量加載。圖4 Erlotinib與shRNA敲低c_met在EBC-1 NSCLC異種移植物模型中的聯(lián) 合功效。在裸(CRLnu/nu)動(dòng)物中建立EBC-l-shMet-4.5腫瘤，然后用甲基纖維素吐溫 (MCT)媒介加含有5%蔗糖的飲用水(Sue) (PO，QD,在箭頭所指之處)，MCT加在5% 蔗糖中配制的含lmg/mL多西環(huán)素的飲用水(DOX)(100mg/kg; PO, QD,在箭頭所指之 處)，Eriotinib加含有5%蔗糖的飲用水(PO，QD,在箭頭所指之處)，或Erlotinib力口在 5%蔗糖中配制的含lmg/mL多西環(huán)素的飲用水(PO，QD,箭頭所指之處)處理。在箭 頭所指之日進(jìn)行口服給藥。在整個(gè)研究期間用瓶裝蔗糖或Dox水，每2-3天更換。如實(shí) 施例中所述計(jì)算腫瘤體積和SEM。圖 5 MetMAb 與 Erlotinib 在 NCI-H596 hu-HGF-Tg-C3H_SCID 異種移植物模 型中的聯(lián)合功效。在hu-HGF-Tg-C3H_SCID或C3H-SCID同窩幼仔對(duì)照動(dòng)物中培養(yǎng) NCI-H596 腫瘤，并用 Captisol 媒介(PO，QD, x2 周)，Erlotinib (實(shí)心圓，短虛線； 150mg/kg, PO, QD, x2 周)，MetMAb (30mg/kg, IP, 一次)，或 MetMAb 加 Erlotinib
的組合以相同的劑量和日程表處理。在圖的底部指示了 MetMAb (空心尖頭)和Erlotinib 或媒介(實(shí)心箭頭頭)的給藥。通過測(cè)徑器進(jìn)行腫瘤測(cè)量，每周2-3次，持續(xù)約9周或 直至由于組內(nèi)腫瘤尺寸大而自研究中除去。如實(shí)施例中所述計(jì)算腫瘤體積和SEM。圖6 為每個(gè)組計(jì)算腫瘤倍增時(shí)間(TTD)測(cè)量(定義為腫瘤尺寸倍增需要的時(shí) 間)，并用于生成Kaplan-Meier存活曲線。MetMAb加Erlotinib的組合顯示出腫瘤進(jìn)展 的顯著改善，TTD均值為49.5 (士2.6)天，比較而言，MetMAb處理組為17.8 (士2.2)天， Erlotinib處理組為9.5 (士 1.2)天，而媒介對(duì)照組為9.5 (士 1.2)天。媒介和Erlotinib組的 曲線完美交疊。圖7 描繪抗c-met抗體的一個(gè)實(shí)施方案的框架區(qū)(FR)，高變區(qū)(HVR)，第一 恒定域(CL或CHl)和Fc區(qū)(Fe)的氨基酸序列。所描繪的Fc序列包含突變T366S， L368A 和 Y407V，如 WO 2005/063816 在所記載的。圖8:描繪包含突變T366W的Fc多肽的序列，如WO 2005/063816中所記載 的。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含此序列的Fc多肽與包含圖7之Fc序列的Fc多肽形成復(fù)合 物以生成Fc區(qū)。圖9A-E c-met活性調(diào)節(jié)EGFR配體表達(dá)。A)在HGF響應(yīng)性NSCLC細(xì)胞系中HGF處理誘導(dǎo)EGFR配體上調(diào)。Hop92或NCI-H596細(xì)胞血清饑餓過夜，然后不處理 (無HGF)或者用HGF (50ng/ml)處理6小時(shí)(HGF)。來自細(xì)胞-/+HGF處理的RNA進(jìn) 行微陣列分析，如實(shí)施例中所記載的。RMA=相對(duì)微陣列。B)在不依賴配體的NSCLC 細(xì)胞系EBC-I中c-met敲低降低EGFR配體表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)針對(duì)c_met的shRNA的克 隆(克隆3-15和4-12)不處理(無Dox)或者用多西環(huán)素處理(Dox) 24或48小時(shí)。來 自細(xì)胞的RNA進(jìn)行微陣列分析，如實(shí)施例中所記載的。C)在沒有HGF (無HGF)或有 HGF(100ng/ml)2小時(shí)的情況中穩(wěn)定表達(dá)針對(duì)c_met的shRNA的EBClshMet4_12細(xì)胞不 處理(無Dox)或者用Dox處理(Dox) 24小時(shí)。來自細(xì)胞的RNA進(jìn)行微陣列分析，如實(shí) 施例中所記載的。D)穩(wěn)定表達(dá)針對(duì)c-met的shRNA的EBCshMet4_12細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá) shGFP2的對(duì)照細(xì)胞不處理(無Dox)或者用Dox處理(Dox) 24小時(shí)。來自細(xì)胞的RNA 進(jìn)行微陣列分析，如實(shí)施例中所記載的。E)在裸(CRLnu-nu)動(dòng)物中自EBClshMet_4.12 或EBCshMet-3.15細(xì)胞建立腫瘤，并給予小鼠在5%蔗糖中含lmg/ml Dox(Dox)或單獨(dú) 的5%蔗糖的飲用水。3天后，通過ELISA評(píng)估腫瘤溶胞物中的TGF α水平。圖IOA-C (A)EBCshMet 4.12 或 EBCshGFP2 細(xì)胞不處理(-)或者用 Dox 處理 (+)24，48或72小時(shí)。通過Western印跡對(duì)蛋白質(zhì)溶胞物評(píng)估c-met，pEGFR或Her3。 (B)EBCshMet 4.12細(xì)胞用Dox(100ng/ml)處理48小時(shí)，并通過FACS分析細(xì)胞表面 Her3。 (C)具有EBCshMet 4.12腫瘤的小鼠給予在5%蔗糖中含lmg/ml Dox(Dox)或單 獨(dú)的5%蔗糖(蔗糖)的飲用水3天。通過Western印跡對(duì)腫瘤溶胞物評(píng)估Her3蛋白質(zhì)。圖11 EBOl ShMet 細(xì)胞(3.15 或 4.5 或 4.12)不處理(-)或者用 100ng/ml Dox (+)單獨(dú)處理96小時(shí)，或者啟動(dòng)Dox處理后48小時(shí)添加HGF (5或100ng/ml)或 TGFa(l 或 50nM)。使用 Cell Titer Glo 評(píng)估細(xì)胞數(shù)。圖12 在HGF存在(右邊小圖)或缺失(左右小圖)的情況中用NCI-H596細(xì) 胞實(shí)施時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)。在刺激后10分鐘(10’)，24小時(shí)，48小時(shí)或72小時(shí)制備細(xì)胞溶 胞物，并實(shí)施Western印跡以檢測(cè)總c_met(頂圖)，磷酸-EGFR(第2圖)和總EGFR(第 3圖)。檢測(cè)β-肌動(dòng)蛋白(第4圖)以顯示各道之間的當(dāng)量加載。圖13 在存在無配體，單獨(dú)的TGF- α，TGF- α +HGF或單獨(dú)的HGF的情況中 分配NCI-H596細(xì)胞。在刺激后10分鐘和24小時(shí)制備細(xì)胞溶胞物，并實(shí)施對(duì)c_met的免 疫沉淀(IP)，接著是對(duì)磷酸_酪氨酸(4G10;頂圖)，c-met(第2圖)和EGFR(第3圖) 的Western印跡。磷酸-酪氨酸印跡顯示配體依賴性方式的EGFR(頂帶)和c_met(底帶) 活化，24小時(shí)后削弱。c-met免疫沉淀在所有條件中下拉EGFR，不管EGFR或c_met的 活化狀態(tài)。圖14 用NCI-H596細(xì)胞實(shí)施存活力測(cè)定法以評(píng)估在存在TGFa和不同濃度 HGF的情況中細(xì)胞對(duì)Erlotinib的響應(yīng)，如所示的。在HGF水平自0.5ng/ml升高至50ng/ ml時(shí)檢測(cè)到對(duì)Erlotinib的相對(duì)響應(yīng)的降低。圖15 在存在TGF α禾Π HGF(50ng/ml)，有或無MetMAb(l μ Μ)和不同濃度
Erlotinib的情況中用NCI-H596細(xì)胞實(shí)施存活力測(cè)定法。數(shù)據(jù)表述為相對(duì)于未處理對(duì)照的 百分比。未處理對(duì)照值顯示為圖左上部的各點(diǎn)。圖16 MetMAb和Erlotinib聯(lián)合處理導(dǎo)致更有效的對(duì)磷酸-Akt和磷酸-ERK1/2 的抑制。將攜帶NCI-H596腫瘤的人HGF轉(zhuǎn)基因SCID(hu-HGF-Tg-SCID)小鼠用媒介(MetMAb緩沖液(100 μ L，IP)和甲基纖維素吐溫(MCT，100 μ L，PO)， MetMAb ((30mg/kg, IP, 一次)禾口 MCT)，Erlotinib ((100mg/kg,在 MCT 中，100 μ L, PO)和MetMAb緩沖液(100 μ L，IP))或MetMAb和Erlotinib (劑量給藥與為每一項(xiàng)所 述相同)處理。MetMAb (或緩沖液)在時(shí)間零(tOhr)給藥，Erlotinib (或MCT)在時(shí)間 18小時(shí)(tl8hr)給藥，在時(shí)間24小時(shí)(t24hr)對(duì)小鼠處以安樂死并收集腫瘤。通過直接 Western印跡和免疫沉淀接著Western印跡對(duì)腫瘤溶胞物分析總的和磷酸-蛋白質(zhì)?？s寫 pTyr=磷酸-酪氨酸，EGFR =表皮生長因子受體，ERK(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶_1和 2。檢測(cè)肌動(dòng)蛋白以顯示各道之間的當(dāng)量加載。圖17Α和17Β:示意性描繪本申請(qǐng)中所記載的一些結(jié)果。發(fā)明詳述I.定義如本文中所使用的，除非另有說明，術(shù)語“肝細(xì)胞生長因子”或“HGF”指能 夠在容許HGF/c-met信號(hào)途經(jīng)發(fā)生的條件下激活所述過程的任何天然或變異的(或是天 然的或是合成的)HGF多肽。術(shù)語“野生型HGF” 一般指包含天然發(fā)生HGF蛋白質(zhì)的 氨基酸序列的多肽。術(shù)語“野生型HGF序列” 一般指在天然發(fā)生HGF中發(fā)現(xiàn)的氨基酸 序列。c-met是HGF的一種已知受體，HGF細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)經(jīng)由C_met在生物學(xué)上實(shí) 行。如本文中所使用的，術(shù)語“HGF變體”指在天然HGF序列中包含一處或多處氨 基酸突變的HGF多肽。任選地，所述一處或多處氨基酸突變包括氨基酸替代?！疤烊恍蛄小倍嚯陌ㄅc衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如 此，天然序列多肽可具有來自任何哺乳動(dòng)物的天然存在多肽的氨基酸序列。此類天然序 列多肽可以從自然界分離，或者可通過重組或合成手段生成。術(shù)語“天然序列”多肽明 確涵蓋該多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的變異形 式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。多肽“變體”指與天然序列多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性的生物學(xué)活 性多肽。此類變體包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸 殘基的多肽。通常，變體將會(huì)與天然序列多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性，更優(yōu) 選至少約90%氨基酸序列同一性和甚至更優(yōu)選至少約95%氨基酸序列同一性?！癊GFR”(可互換地稱作“ErbBl”、“HER1”和“表皮生長因子受體”) 指Ullrich etal.，Nature (1984) 309 418425中記載的受體酪氨酸激酶多肽表皮生長因子受 體，或者指Her-I和c-erbB基因產(chǎn)物，及其變體，諸如EGFRvIII。EGFR的變體還包括 刪除、替代和插入變體，例如 Lynch etal.，New England Journal of Medicine 2004, 350 2129 ； Paez etal.，Science 2004，304 1497 ； Pao etal.，PNAS 2004, 101 13306 中所 記載的那些?！吧飳W(xué) ÷樣品”(可互換地稱作“樣品”或“組織或細(xì)胞樣品”)涵蓋自個(gè)體獲 得的且可用于診斷或監(jiān)測(cè)測(cè)定法的多種樣品類型。該定義涵蓋血液和生物學(xué)起源的其它 液體樣品、固體組織樣品諸如活檢標(biāo)本或組織培養(yǎng)物或自其衍生的細(xì)胞、及其后代。該 定義還涵蓋在獲得它們后已經(jīng)進(jìn)行過操作的樣品，諸如用試劑處理、增溶、或富集某些 成分諸如蛋白質(zhì)或多核苷酸、或?yàn)榍衅康亩癫卦诎牍腆w或固體基質(zhì)中。術(shù)語“生物學(xué)樣品”涵蓋臨床樣品，而且還包括培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞溶胞物、血清、 血漿、生物學(xué)流體、和組織樣品。生物學(xué)樣品的來源可以是實(shí)體組織，像來自新鮮的、 冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體 液，諸如腦脊液、羊水、腹膜液、或間質(zhì)液；來自受試者的妊娠或發(fā)育中任何時(shí)間的細(xì) 胞。在有些實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品是自原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤獲得的。生物學(xué)樣品可含 有在自然界中不與該組織天然混和的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、 營養(yǎng)物、抗生素、諸如此類?！癱-met拮抗劑”(可互換地稱作“c-met抑制劑”)指干擾C_met活化或功能 的藥劑。c-met抑制劑的例子包括c-met抗體；HGF抗體；小分子c_met拮抗劑；c_met 酪氨酸激酶抑制劑；反義和抑制性RNA (例如shRNA)分子(參見例如W02004/87207)。 優(yōu)選地，c-met抑制劑是結(jié)合c-met的抗體或小分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，C_met 抑制劑具有約1,OOOnM或更低的對(duì)c-met的結(jié)合親和力(解離常數(shù))。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，c-met抑制劑具有約IOOnM或更低的對(duì)c-met的結(jié)合親和力。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，c-met抑制劑具有約50nM或更低的對(duì)c_met的結(jié)合親和力。在一個(gè)具體的實(shí)施方案 中，c-met抑制劑共價(jià)結(jié)合c-met。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，c_met抑制劑以Ι,ΟΟΟηΜ 或更低的IC50抑制c-met信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，c_met抑制劑以500nM或更 低的IC50抑制c-met信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，C_met抑制劑以50nM或更低的 IC50抑制c-met信號(hào)傳導(dǎo)。如本文中所使用的，術(shù)語“c-met靶向藥物”指結(jié)合c-met并抑制c-met活化的 治療劑。c-met靶向藥物的一個(gè)例子是MetMAb (OA5D5.v2)。“c-met活化”指c-met受體的活化或磷酸化。一般而言，C_met活化導(dǎo)致信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由c-met受體的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域引起的，磷酸化c-met或底物多肽中的酪氨 酸殘基)。c-met活化可以由c-met配體(HGF)結(jié)合感興趣c_met受體來介導(dǎo)。HGF對(duì) c-met的結(jié)合可活化c-met的激酶結(jié)構(gòu)域并由此導(dǎo)致c_met中酪氨酸殘基的磷酸化和/或 別的底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化?！癊GFR拮抗劑”(可互換地稱作“EGFR抑制劑”)指干擾EGFR活化或功 能的藥劑。EGFR抑制劑的例子包括EGFR抗體；EGFR配體抗體；小分子EGFR拮 抗劑；EGFR酪氨酸激酶抑制劑；反義和抑制性RNA(例如shRNA)分子(參見例如 W02004/87207)。優(yōu)選地，EGFR抑制劑是結(jié)合EGFR的抗體或小分子。在一些實(shí)施方 案中，EGFR抑制劑是EGFR靶向藥物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，EGFR抑劑具有約 Ι,ΟΟΟηΜ或更低的對(duì)EGFR的結(jié)合親和力(解離常數(shù))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR抑 制劑具有約IOOnM或更低的對(duì)EGFR的結(jié)合親和力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR抑制 劑具有約50ηΜ或更低的對(duì)EGFR的結(jié)合親和力。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，EGFR抑制 劑共價(jià)結(jié)合EGFR。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，EGFR抑制劑以Ι,ΟΟΟηΜ或更低的IC50 抑制EGFR信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR抑制劑以500ηΜ或更低的IC50抑制 EGFR信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR抑 制劑以50ηΜ或更低的IC50抑制EGFR 信號(hào)傳導(dǎo)。表述“ ErbB2，，禾Π “ HER2，，在本文中可互換使用，指例如Semba et al.， PNAS (USA) 82 6497-6501(1985)和 Yamamoto et al.Nature 319 230-234(1986)中記載的人HER2蛋白質(zhì)(Genebank登錄號(hào)X03363)。術(shù)語“erbB2”指編碼人ErbB2的基因， 而“neu”指編碼大鼠ρ185·的基因。優(yōu)選的HER2是天然序列人HER2。
“ErbB3” 禾Π “HER3” 指例如美國專利 Νο.5,183,884 和 5,480,968 以及 ICraus et al.PNAS(USA)86 9193-9197(1989)中披露的受體多肽。 術(shù)語“ErbB4”和“HER4”在本文中指例如歐洲專利申請(qǐng)No.599,274 ； Plowman et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90: 1746-1750(1993)；和 Plowman et al.， Nature, 366 473-475(1993)中披露的受體多肽，包括其同等型(isoforms)，例如1999 年4月22日公布的W099/19488中披露的。如本文中所使用的，“ErbB”指受體多肽EGFR，HER2, HER3禾Π HER4?！癊GFR活化”指EGFR的活化或磷酸化。一般而言，EGFR活化導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)(例如由EGFR受體的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域引起的，磷酸化EGFR或底物多肽中的酪氨酸 殘基)。EGFR活化可以由EGFR配體結(jié)合包含EGFR的EGFR 二聚體來介導(dǎo)。EGFR 配體對(duì)EGFR 二聚體的結(jié)合可活化二聚體中一個(gè)或多個(gè)EGFR的激酶結(jié)構(gòu)域并由此導(dǎo)致一 個(gè)或多個(gè)EGFR中酪氨酸殘基的磷酸化和/或別的底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化。如本文中所使用的，術(shù)語“EGFR靶向藥物”指結(jié)合EGFR并抑制EGFR活化 的治療劑。此類藥劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。結(jié)合EGFR的抗體的例子 包括 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB 8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb 528 (ATCC CRL 8509)(參見美國專利第 4,943,533 號(hào)，Mendelsohn et al.)及其變體，諸如嵌合化225 (C225或Cetuximab ； ERBUTIX )和重構(gòu)人225 (H225) (參見 WO 96/40210，Imclone Systems Inc.) ； IMOl 1F8，一種完全人的 EGFR 靶向抗 體(Imclone)；結(jié)合II型突變體EGFR的抗體(美國專利No.5,212,290)；結(jié)合EGFR的 人源化和嵌合抗體，如美國專利No.5,891,996中所記載的；及結(jié)合EGFR的人抗體，諸 如 ABX-EGF (參見 WO 98/50433，Abgenix) ； EMD 55900 (Stragliotto et al.，Eur.J.Cancer 32A 636-640 (1996)) ； EMD7200 (matuzumab)，一種針對(duì) EGFR 的人源化 EGFR 抗體， 其與EGF和TGF- α 二者競(jìng)爭(zhēng)EGFR結(jié)合；及mAb 806或人源化mAb 806 (Johns et al., J.Biol.Chem.279 (29) 30375-30384(2004))?？笶GFR抗體可偶聯(lián)細(xì)胞毒劑，如此產(chǎn)生免 疫偶聯(lián)物(參見例如EP 659,439 A2，Merck Patent GmbH)。結(jié)合EGFR的小分子的例子包 括 ZD1839 或 Gefitinib (IRESSA ； Astra Zeneca) ； CP-358774 或 Erlotinib (TARCEVA ； Genentech/OSI)；和 AG1478、AG1571 (SU 5271 ； Sugen) ； EMD-7200?！癊GFR抗性”癌癥意味著癌癥患者在接受EGFR拮抗劑療法的同時(shí)有發(fā)展(即 患者是“EGFR不應(yīng)性”的)，或者患者在完成基于EGFR拮抗劑的治療方案后12個(gè)月 內(nèi)(例如1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，或6個(gè)月內(nèi))有發(fā)展。例如，包含T790M突變體EGFR的 癌癥對(duì)Erlotinib和Gefitinib療法有抗性。“ Erlotinib或Gefitinib抗性”癌癥意味著癌癥患者在接受基于Erlotinib或 Gefitinib的療法的同時(shí)有發(fā)展(即患者是“Erlotinib或Gefitinib不應(yīng)性”的)，或者患者 在完成基于Erlotinib或Gefitinib的治療方案后12個(gè)月內(nèi)(例如1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，或6個(gè)
月內(nèi))有發(fā)展。如本文中所使用的，如例如應(yīng)用于受體信號(hào)傳導(dǎo)活性，術(shù)語“不依賴配體的” 指不依賴配體的存在的信號(hào)傳導(dǎo)活性。例如，EGFR信號(hào)傳導(dǎo)可源自與其它HER家族成員(諸如HER2)的二聚化。具有不依賴配體的激酶活性的受體不會(huì)必然排除配體結(jié)合該 受體以產(chǎn)生額外的激酶活性活化。如本文中所使用的，如例如應(yīng)用于受體激酶活性，術(shù)語“組成性”指受體不依 賴配體或其它活化性分子的存在的持續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)活性。例如，常常在多形性成膠質(zhì)細(xì)胞 瘤中找到的EGFR變體III(EGFRVIII)刪除了它很大部分的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。雖然配體不能 夠結(jié)合EGFRvIII，但是它是持續(xù)有活性的且與異常增殖和存活有關(guān)。根據(jù)受體的性質(zhì)， 所有活性可以是組成性的，或者受體的活性可以通過其它分子(例如配體)的結(jié)合而進(jìn)一 步活化。導(dǎo)致受體活化的細(xì)胞事件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。例如，活化可包括寡 聚化(例如二聚化，三聚化，等)成高級(jí)受體復(fù)合物。復(fù)合物可包含單一種類的蛋白質(zhì)， 即同聚復(fù)合物?；蛘?，復(fù)合物可包含至少兩種不同蛋白質(zhì)種類，即異聚復(fù)合物?？梢酝?過例如受體的正?；蛲蛔凅w形式在細(xì)胞表面上的過表達(dá)來引起復(fù)合物形成。也可以通過 受體中的特定突變來引起復(fù)合物形成。短語“基因擴(kuò)增”指在特定細(xì)胞或細(xì)胞系 中形成多拷貝的基因或基因片段的 過程。復(fù)制區(qū)(擴(kuò)增的DNA的區(qū)段)常常稱作“擴(kuò)增子”。通常，所產(chǎn)生的信使 RNA(mRNA)的量，即基因表達(dá)的水平，也按由所表達(dá)特定基因形成的拷貝數(shù)的比例增 加。“酪氨酸激酶抑制劑”指一定程度抑制酪氨酸激酶(諸如c-met受體)的酪氨酸 激酶活性的分子。“展示出C-met和/或EGFR表達(dá)、擴(kuò)增或活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè) 試中表達(dá)(包括過表達(dá))c-met和/或EGFR，具有擴(kuò)增的c_met和/或EGFR基因和/或 以其它方式展現(xiàn)出c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品?！安徽故綾-met和/或EGFR表達(dá)、擴(kuò)增或活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè) 試中不表達(dá)(包括過表達(dá))c-met和/或EGFR，不具有擴(kuò)增的c_met和/或EGFR基因和 /或不以其它方式展現(xiàn)出c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。“展示出c-met和/或EGFR活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展現(xiàn)出 c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過ELISA 來測(cè)量c-met和/或EGFR磷酸化)或間接測(cè)定。“不展示c-met和/或EGFR活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中不展現(xiàn)出 c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過ELISA 來測(cè)量c-met和/或EGFR磷酸化)或間接測(cè)定。“展示出組成性c-met和/或EGFR活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中展 現(xiàn)出組成性c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例 如通過ELISA來測(cè)量c-met和/或EGFR磷酸化)或間接測(cè)定?！安徽故綾-met和/或EGFR擴(kuò)增”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中不具有擴(kuò) 增的c-met和/或EGFR基因的癌或生物學(xué)樣品?！罢故境鯿-met和/或EGFR擴(kuò)增”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中具有擴(kuò)增 的c-met和/或EGFR基因的癌或生物學(xué)樣品。“不展示組成性c-met和/或EGFR活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè)試中不 展現(xiàn)組成性c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過ELISA來測(cè)量c-met和/或EGFR磷酸化)或間接測(cè)定?！罢故境霾灰蕾?配體的c-met和/或EGFR活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè) 試中展現(xiàn)出不依賴配體的c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活 化可直接(例如通過ELISA來測(cè)量c-met和/或EGFR磷酸化)或間接測(cè)定。“不展示不依賴配體的C-met和/或EGFR活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測(cè) 試中不展現(xiàn)不依賴配體的c-met和/或EGFR活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活 化可直接(例如通過ELISA來測(cè)量c-met和/或EGFR磷酸化)或間接測(cè)定?！傲姿?ELISA測(cè)定法”(phosho-ELISA assay)在本文中指在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 法(ELISA)中評(píng)估一種或多種c-met和/或EGFR的磷酸化的測(cè)定法，其中使用檢測(cè)磷 酸化的c-met和/或EGFR、底物或下游信號(hào)分子的試劑(通常是抗體)。優(yōu)選的是，使 用檢測(cè)磷酸化c-met和/或EGFR的抗體。該測(cè)定法可以對(duì)細(xì)胞溶胞物，優(yōu)選來自新鮮 的或冷凍的生物學(xué)樣品的細(xì)胞溶胞物進(jìn)行。“c-met和/或EGFR過表達(dá)或擴(kuò)增”的癌細(xì)胞指與同一組織類型的非癌性細(xì)胞 相比，具有顯著更高水平的c-met和/或EGFR蛋白質(zhì)或基因的癌細(xì)胞。此類過表達(dá)可以 是由基因擴(kuò)增或者轉(zhuǎn)錄或翻譯增加引起的?？稍谠\斷或預(yù)后測(cè)定法中通過評(píng)估細(xì)胞表面 上存在的c-met和/或EGFR蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過免疫組化測(cè)定法；IHC)來測(cè)定 c-met和/或EGFR過表達(dá)或擴(kuò)增?；蛘?另外，可測(cè)量細(xì)胞中編碼c_met和/或EGFR的 核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(FISH ；參見1998年10月公布的WO 98/45479)、 Southern印跡或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，諸如定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)。在上述測(cè) 定法之外，熟練從業(yè)人員還可利用多種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可將患者身體內(nèi)的細(xì)胞暴露 于任選用可檢測(cè)標(biāo)記物例如放射性同位素標(biāo)記的抗體，并且可評(píng)估該抗體對(duì)患者身體內(nèi) 細(xì)胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的 活檢?！安贿^表達(dá)或擴(kuò)增c-met和/或EGFR”的癌細(xì)胞指與同一組織類型的非癌性細(xì) 胞相比，不具有高于正常的c-met和/或EGFR蛋白質(zhì)或基因水平的癌細(xì)胞。術(shù)語“突變”在用于本文時(shí)指特定蛋白質(zhì)或核酸(基因，RNA)分別相對(duì)于野 生型蛋白質(zhì)或核酸的氨基酸或核酸序列的差異。突變的蛋白質(zhì)或核酸可以由基因的一個(gè) 等位基因(雜合的)或兩個(gè)等位基因(純合的)表達(dá)或者在其中找到，而且它可以是體細(xì) 胞的或種系的。在本發(fā)明中，突變一般是體細(xì)胞的。突變包括序列重排，諸如插入、刪 除、和點(diǎn)突變(包括單核苷酸/氨基酸多態(tài)性)?！耙种啤敝概c參照相比減小或降低活性、功能、和/或量。蛋白質(zhì)“表達(dá)”指基因中編碼的信息轉(zhuǎn)換成信使RNA(mRNA)，然后轉(zhuǎn)換成蛋 白質(zhì)。在本文中，“表達(dá)”感興趣蛋白質(zhì)(諸如HER受體或HER配體)的樣品或細(xì)胞 指其中測(cè)定出存在編碼該蛋白質(zhì)的mRNA或蛋白質(zhì)(包括其片段)的樣品或細(xì)胞?！懊庖吲悸?lián)物”(可互換地稱作“抗體_藥物偶聯(lián)物”或“ADC”)指抗體偶 聯(lián)至一種或多種細(xì)胞毒劑，諸如化療劑，藥物，生長抑制劑，毒素(例如蛋白質(zhì)毒素， 細(xì)菌，真菌，植物，或動(dòng)物起源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射偶 聯(lián)物)。
如本文中所使用的，術(shù)語“Fe區(qū)” 一般指包含免疫球蛋白重鏈C端多肽序列 的二聚體復(fù)合物，其中C端多肽序列是通過木瓜蛋白酶消化完整抗體可獲得的。Fc區(qū) 可包含天然或變體Fc序列。雖然免疫球蛋白重鏈的Fc序列的邊界可以有所變化，但是 人IgG重鏈Fc序列通常定義為Fc序列自位于大約位置Cys226的氨基酸殘基，或自大約 位置Pro230，至羧基端的區(qū)段。免疫球蛋白的Fc序列一般包含兩個(gè)恒定域，CH2域和 CH3域，且任選包含CH4域。Fc區(qū)的C端賴氨酸(依照EU編號(hào)系統(tǒng)的殘基447)可以 消除，例如在抗體純化期間，或者通過對(duì)編碼抗體的核酸進(jìn)行重組工程改造。因而，依 照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的抗體的組合物可包含具有K447的抗體、消除了所有K447的抗 體、或有和無K447殘基的抗體的混合物?！癋e多肽”在本文中 指構(gòu)成Fc區(qū)的多肽之一。可以自任何合適的免疫球蛋白 獲得 Fc 多肽，諸如 IgG1, IgG2, IgG3,或 IgG4 亞型，IgA，IgE, IgD 或 IgM。在一些
實(shí)施方案中，F(xiàn)c多肽包含部分或整個(gè)野生型鉸鏈序列(一般位于其N端)。在一些實(shí)施 方案中，F(xiàn)c多肽不包含功能性或野生型鉸鏈序列。如本文中所使用的，“鉸鏈區(qū)”，“鉸鏈序列”，及其變化形式包括本領(lǐng) 域知道的含義，其例示于例如 Janeway et al., Immuno Biology the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY)(第 4 版，1999) ； Bloom et al., Protein Science (1997)，6 407-415; Humphreys et al., J.Immunol.Methods (1997)，209 193-202。貫穿本說明書和權(quán)利要求書，免疫球蛋白重鏈中的殘基編號(hào)方式是如Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991)(通過述及明確收入本文)中的EU索引的編號(hào)
方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgGl EU抗體的殘基編號(hào)方式。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多 克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、單價(jià)抗體、多價(jià)抗體、及抗體片段，只 要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。“抗體片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于 完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能。在一個(gè)實(shí)施方案中， 抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時(shí)通常與 之有關(guān)的至少一項(xiàng)生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補(bǔ)體結(jié) 合。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價(jià)抗體。例 如，此類抗體片段可包含一個(gè)抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列 相連。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是如W02005/063816中所記載的單臂抗體。在 一個(gè)實(shí)施方案中，單臂抗體包含如W02005/063816中所記載的構(gòu)成“結(jié)(knob) ”和“穴 (hole)”的Fc突變。例如，穴突變(hole mutation)可以是Fc多肽中的T366A、L368A 禾口 /或Y407V中的一個(gè)或多個(gè)，而腔突變(cavity mutation)可以是T366W。“阻斷性”抗體或抗體“拮抗劑”指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性 的抗體。優(yōu)選的阻斷性抗體或拮抗性抗體完全抑制抗原的生物學(xué)活性。除非另有說明，貫穿本說明書，表述“多價(jià)抗體”用于指包含三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體。多價(jià)抗體優(yōu)選改造成具有三個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，而且一般不 是天然序列IgM或IgA抗體。"Fv"片段是包含完整 抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。該區(qū)域由緊密結(jié)合 (該結(jié)合的本質(zhì)可以是共價(jià)的，例如在scFv中)的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二 聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，每個(gè)可變域的三個(gè)CDR相互作用而在Vh-V^ 二聚體表面 上限定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR或其子集一起賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然 而，即使是單個(gè)可變域(或是只包含對(duì)抗原特異性的三個(gè)CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和 結(jié)合抗原的能力，只是通常親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。在用于本文時(shí)，“抗體可變域”指抗體分子的輕鏈和重鏈中包含互補(bǔ)決定區(qū) (CDR ；即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架區(qū)(FR)氨基酸序列的那部分。Vh指重鏈可 變域。V^指輕鏈可變域。依照本發(fā)明所使用的方法，歸為CDR和FR的氨基酸位置可 以依,照 Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.，1987和1991))來限定?？贵w或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號(hào)方式也依照 Kabat。在用于本文時(shí)，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR ；即CDR1、CDR2、禾Π CDR3)指抗 體可變域中其存在是抗原結(jié)合所必需的氨基酸殘基。每個(gè)可變域通常具有三個(gè)CDR，鑒 定為CDR1、CDR2和CDR3。每個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)可以包含來自如Kabat定義的“互補(bǔ)決 定區(qū)”的氨基酸殘基(即大約是輕鏈可變域的殘基24-34 (Li)、50-56 (L2)和89-97 (L3) 及重鏈可變域的殘基 31-35 (Hl)、50-65 (Η2)和 95-102 (Η3) ； Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service， National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))和/或來自“高變環(huán)”的殘基(即大約是輕鏈可變域的 殘基 26-32 (Li)、50-52 (L2)和 91-96 (L3)及重鏈可變域的殘基 26-32 (Hl)、53-55 (H2) 禾口 96-101 (H3) ； Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196 901-917 (1987))。在有些情況中， 互補(bǔ)決定區(qū)可以包含來自Kabat定義的CDR和高變環(huán)二者的氨基酸。例如，抗體4D5重 鏈的CDRHl包含氨基酸26-35?！翱蚣軈^(qū)”(以下的FR)指可變域中CDR殘基以外的殘基。每個(gè)可變域通常 具有四個(gè)FR，鑒定為FR1、FR2、FR3和FR4。 如果CDR是依照Kabat定義的，那 么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基1-23 (LCFRl)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)、和 98-107 (LCFR4),而重鏈 FR 殘基位于大約重鏈殘基 1_30 (HCFRl)、36-49 (HCFR2)、 66-94 (HCFR3)、禾Π 103-113 (HCFR4)。 如果CDR包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，那 么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基1-25 (LCFRl)、33-49 (LCFR2)、53-90 (LCFR3)、和 97-107 (LCFR4),而重鏈 FR 殘基位于大約重鏈殘基 1_25 (HCFRl)、33-52 (HCFR2)、 56-95 (HCFR3)、和102-113 (HCFR4)。在有些情況中，在CDR包含來自Kabat定義的 CDR和高變環(huán)二者的氨基酸時(shí)，F(xiàn)R殘基將做相應(yīng)的調(diào)整。例如，當(dāng)CDRHl包含氨基酸 Η26-Η35時(shí)，重鏈FRl殘基位于1_25位，而FR2殘基位于36-49位?！癋ab”片段包含輕鏈的可變域和恒定域及重鏈的可變域和第一恒定域(CHl)。 F(ab' )2抗體片段包含一對(duì)Fab片段，這對(duì)Fab片段一般通過它們之間的鉸鏈半胱氨酸在 它們羧基末端附近共價(jià)連接。本領(lǐng)域還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和Vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，F(xiàn)v多肽在Vh與Vl結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)一步包含多肽 接頭，其使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun， 于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編， Springer-Verlag，New York，第 269Il5 頁，I"4。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多 肽鏈(Vh及VJ中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(VJ。通過使用過短的 接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié) 構(gòu)域配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載于例如EP 404,097 ； WO 93/11161 ； Hollinger 等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448(1993)。表述“線性抗體”指Zapata 等.，Protein Eng., 8(10) 1057-1062(1995)中所 描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對(duì)串聯(lián)的Fd區(qū)段(Vh-ChI-Vh-ChI),該區(qū)段與互 補(bǔ)的輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性 的。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得 的特征，不應(yīng)解釋 為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發(fā)明 使用的單克隆抗體可 通過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如Kohler and Milstein.，Nature, 256 495-97(1975) ； Hongo et al.，Hybridoma, 14(3) 253-260(1995)，Harlow et al.， Antibodies A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)； Hammerling et al., in Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981))、重組DNA法(參見例如美國專利No.4,816,567)、噬菌體展示技術(shù)(參 見例如 Clackson et al., Nature 352 624-628(1991) ； Marks et al., J.Mol.Biol.222 581-597 (1992) ； Sidhu et al., J.Mol.Biol.338 (2) 299-310 (2004) ； Lee et al.， J.Mol.Biol.340(5) 1073-1093(2004) ； Fellouse, Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34) 12467-12472(2004) ； Leeetal., J.Immunol.Methods 284(1-2) 119-132(2004))、及用 于在具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中生成 人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如 WO 1998/24893 ； WO 1996/34096 ； WO 1996/33735 ； W01991/10741 ； Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 2551 (1993)； Jakobovits et al.，Nature 362 255-258 (1993) ； Braggemann et al.，Year in Immunol.7 33(1993)；美國專禾丨J No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016 ； Marks et al., Bio/Technology 10 779-783(1992) ； Lonberg et al., Nature 368 856-859(1994) ； Morrison, Nature368 812-813(1994) ； Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14 845-851(1996) ； Neuberger, Nature Biotechnol. 14 826(1996) ； Lonberg and Huszar, Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分 與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈 的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或 同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(參見例如美國專利 No.4,816,567 ；及 Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 6851-6855 (1984))。嵌合 抗體包括“靈長類化”抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過用感興趣抗原免疫短尾猴(macaque monkey)而生成的抗體。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白 的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變 區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或 非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框 架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗 體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。通常，人源化抗 體包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變區(qū)，其中所有或基本上所有高變環(huán)對(duì)應(yīng) 于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR。人 源化抗體任選還包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。 更多細(xì)節(jié)參見 Jones etal.，Nature 321 522-525 (1986) ； Riechmann et al.，Nature 332 323-329(1988) ； Presta, Curr.Op.Struct.Biol.2 593-596(1992)。“人抗體”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和/或使 用本文所公開的用于生成人抗體的任何技術(shù)生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包 含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。人抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來生成。在 一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體是從噬菌體文庫選擇的，該噬菌體文庫表達(dá)人抗體(Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 309-314(1996) ； Sheets et al., Proc.Natl.Acad.Sci.95 6157-6162(1998) ； Hoogenboom and Winter, J.Mol.Biol.227 381(1991) ； Marks et al., J.Mol.Biol.222 581(1991))。人抗體還可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入內(nèi)源免疫球 蛋白基因已經(jīng)部分或完全滅活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)來生成。在受到攻擊時(shí)，觀察 到人抗體生成，它在所有方面與在人體中看到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體 全集。這種方法記載于例如美國專利No.5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,661,016，及以下科學(xué)出版物Marks et al., Bio/Technology 10 779-783(1992) ； Lonberg et al.，Nature 368 856-859(1994) ； Morrison, Nature 368 812-13(1994) ； Fishwild et al.，Nature Biotechnology 14 845-51 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnology 14 826(1996) ； Lonberg and Huszar, Intern.Rev.Immunol. 13 65-93(1995)。或者，人抗體可通過生成針對(duì)靶抗原的抗體的人B淋巴細(xì)胞的永生化 來制備(此類B淋巴細(xì)胞可從個(gè)體回收，或者可在體外免疫)。參見例如Cole et al.， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss， p.77 (1985) ； Boerner et al.， J.Immunol. 147(1) 86-95(1991)；及美國專利 No.5,750,373?！奥憧贵w(裸露的抗體)，，指未偶聯(lián)異源分子諸如細(xì)胞毒性模塊或放射性標(biāo)記物 的抗體?！坝H和力成熟的”抗體 指在抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一處或多處改變、導(dǎo) 致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。優(yōu)選的親和 力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級(jí)的對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體 可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。Marks etal.，Bio/Technology 10 779-783 (1992)記載了 通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了 CDR和/或框架殘基的隨 機(jī)誘變Barbasetal., Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91 3809-3813(1994) ； Schieretal.，Gene 169 147-155(1995) ； Yelton etal.，J.Immunol. 155 1994-2004(1995) ； Jackson et al.,J.Immunol.l54(7) 3310-9(1995) ； Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226 889-896(1992)。具有指定抗體的“生物學(xué)特征”的抗體指擁有該指定抗體區(qū)別于其它結(jié)合相同抗原的抗體的一項(xiàng)或多項(xiàng)生物學(xué)特征的抗體。為了篩選結(jié)合抗原上感興趣抗體所結(jié)合的表位的抗體，可以實(shí)施常規(guī)交叉阻 斷測(cè)定法，諸如 Antibodies， A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中所記載的。為了延長包含本發(fā)明氨基酸序列的抗體或多肽的半衰期，可如例如美國專利 No.5,739,277中所記載的將補(bǔ)救受體結(jié)合表位附著于抗體(尤其是抗體片段)。例如，可 以將編碼補(bǔ)救受體結(jié)合表位的核酸分子與編碼本發(fā)明多肽序列的核酸在同一讀碼框內(nèi)相 連接，使得由改造后的核酸分子編碼的融合蛋白包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位和本發(fā)明的多肽 序列。在用于本文時(shí)，術(shù)語“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgGp IgG2, IgG3 或IgG4)的Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位(例如Ghetie etal.，Ann.Rev. Immunol. 18 739-766(2000),表1)。其Fc區(qū)中有替代且血清半衰期延長的抗體還記載 于 W000/42072 ； WO 02/060919 ； Shields et al., J.Biol.Chem.276 6591-6604(2001)； Hinton, J.Biol.Chem.279 6213-6216(2004))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還可以通過例如 附著其它多肽序列來延長血清半衰期。例如，可以將在本發(fā)明的方法中有用的抗體或其 它多肽附著于血清清蛋白或血清清蛋白中結(jié)合FcRn受體或血清清蛋白結(jié)合肽的那部分， 使得血清清蛋白結(jié)合該抗體或多肽，例如此類多肽序列披露于W001/45746。在一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，待附著的血清清蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQIDNO 21)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ab的半衰期通過這些方法得到了延長。血清清蛋白結(jié)合 肽序列還可參見 Dennis et al., J.Biol.Chem.277 35035-35043 (2002)?！胺蛛x的”多肽或“分離的”抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分 分開和/或回收的。多肽或抗體的天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾其診斷或治療用途 的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，將多肽或抗體純化至(1)根據(jù)Lowry法的測(cè)定，多肽或抗體重量超過95%且最優(yōu) 選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部 氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色的還原性或非還原性條件 下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然多肽的天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離 的多肽或抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位多肽或抗體。然而，分離的多肽或抗體通常通過至 少一個(gè)純化步驟來制備?！捌巍敝付嚯暮秃怂岱肿拥囊徊糠?，其含有參比核酸分子或多肽全長的的優(yōu) 選至少 10%、20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,或更多。片 段可含有 10、20、30、40、50、60、70、80、90、或 100、200、300、400、500、600、 或更多個(gè)核苷酸，或者 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、 180、190、200或更多個(gè)氨基酸?！疤幚怼焙汀爸委煛?treatment)指治療性處理和預(yù)防性措施二者。需要治療的 受試者包括那些早就患有良性、癌前、或非轉(zhuǎn)移性腫瘤的以及要預(yù)防發(fā)生或復(fù)發(fā)的。術(shù)語“治療有效量”指在哺乳動(dòng)物中治療或預(yù)防疾病或病癥的治療劑量。在癌 癥的情況中，治療有效量的治療劑可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小原發(fā)性腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu) 選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長；和/或一定程度的減輕一種或多種與病 癥有 關(guān)的癥狀。根據(jù)藥物可阻止現(xiàn)有癌細(xì)胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度，它可以 是細(xì)胞抑制性的和/或細(xì)胞毒性的。對(duì)于癌癥療法，體內(nèi)功效可以通過例如評(píng)估存活持 續(xù)時(shí)間、距疾病進(jìn)展的時(shí)間(TTP)、響應(yīng)率(RR)、響應(yīng)持續(xù)時(shí)間、和/或生活質(zhì)量來測(cè) 量。術(shù)語“癌(癥)，，和“癌(性)的”指向或描述哺乳動(dòng)物中典型的以不受調(diào)節(jié)的 細(xì)胞生長為特征的生理疾患。此定義中包括良性和惡性癌癥?！霸缙诎┌Y”或“早期腫 瘤”指非侵入性的或轉(zhuǎn)移性的，或者歸為0期、I期、或II期癌癥的癌癥。癌癥的例子包 括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤(包括髓母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、肉瘤(包括脂 肪肉瘤和滑膜細(xì)胞肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(包括類癌瘤、胃泌素瘤和胰島細(xì)胞癌)、間 皮瘤、施旺氏細(xì)胞瘤(包括聽神經(jīng)瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴樣惡性 腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌包括小細(xì)胞 肺癌(SCLC)、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鱗癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃 癌(gastric or stomach cancer)包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝 癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳 腺癌)、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney or renal cancer),前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽 管腫瘤、及頭和頸癌。術(shù)語“癌前”指典型地在癌之前或發(fā)展成癌的疾患或生長?！鞍┣啊鄙L會(huì)具 有以異常細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、增殖、或分化為特征的細(xì)胞，這些可通過細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞 增殖、或分化的標(biāo)志物來測(cè)定?！鞍l(fā)育異?！敝附M織、器官、或細(xì)胞的任何異常生長或發(fā)育。優(yōu)選的是，發(fā)育 異常是高級(jí)的或癌前的。“轉(zhuǎn)移”指癌自其原發(fā)部位傳播至身體中的其它位置。癌細(xì)胞能脫離原發(fā)性腫 瘤，滲透入淋巴和血管，經(jīng)由血流而循環(huán)和在身體中其它地方的正常組織中的遠(yuǎn)端病灶 (轉(zhuǎn)移)中生長。轉(zhuǎn)移可以是當(dāng)?shù)氐幕蜻h(yuǎn)端的。轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)過程，視腫瘤細(xì)胞自原 發(fā)性腫瘤脫落、經(jīng)由血流而傳播、并在遠(yuǎn)端部位停止而定。在新的部位，該細(xì)胞建立血 供且能生長至形成危及生命的團(tuán)塊。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的刺激性和抑制性分子途徑調(diào)節(jié)這種行為，而且腫瘤細(xì)胞與遠(yuǎn)端部 位中的宿主細(xì)胞之間的相互作用也是重要的?！胺寝D(zhuǎn)移的”指良性的或保留在原發(fā)部位且尚未滲透入淋巴或血管系統(tǒng)或滲透 至原發(fā)部位以外的組織的癌癥。一般而言，非轉(zhuǎn)移性癌癥指作為0期、I期、或II期癌 癥和偶爾的III期癌癥的任何癌癥?！霸l(fā)性腫瘤”或“原發(fā)性癌”指初始的癌癥，而不是位于受試者身體中另一 組織、器官、或位置中的轉(zhuǎn)移病灶?！傲夹阅[瘤”或“良性癌”指仍然局限于起源部位且沒有能力滲透、侵入、或 轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端部位的腫瘤。“腫瘤載荷”指身體中癌細(xì)胞的數(shù)目、腫瘤的尺寸、或癌的量。腫瘤載荷也稱作腫瘤負(fù)荷?！澳[瘤數(shù)目”指腫瘤的數(shù)目?！笆茉囌摺敝覆溉閯?dòng)物，包括但不限于人或非人哺乳動(dòng)物，諸如牛，馬，犬， 綿羊，或貓。優(yōu)選地，受試者是人。術(shù)語“抗癌療法”指在治療癌癥中有用的療法?？拱┲委焺┑睦影ǖ幌?于例如化療劑、生長制劑、細(xì)胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡 齊U、抗微管蛋白劑、和其它治療癌癥的藥劑，抗CD20抗體、血小板衍生生長因子抑制劑 (例如 Gleevec (Imatinib Mesylate))、COX-2 抑制劑(例如 celecoxib)、干擾素、細(xì)胞 因子、結(jié)合一種或多種以下靶物的拮抗劑(例如中和性抗體)(ErbB2、ErbB3、ErbB4、 PDGFR-β、BlyS > APRIL、BCMA 或 VEGF 受體、TRAIL/Apo2)、和其它生物活性和 有機(jī)化學(xué)劑，等。本發(fā)明還包括它們的組合。術(shù)語“細(xì)胞毒劑”在用于本文時(shí)指抑制或阻止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞破壞的 物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9tl和Re186)、化療劑、和毒素諸 如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素或其片段?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物?；焺┑睦影捎糜谥?療癌癥的化學(xué)化合物。化療劑的例子包括烷基化劑類(alkylating agents)，諸如塞替 派(thiotepa)和 CYTOXAN 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates),諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)； 氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替 派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類 (methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三 乙撐磷酉先胺(triethylenephosphoramide) > 三乙撐硫代磷酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛 (bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物 托泊替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin) ； callystatin ； CC-1065 (包括其阿多來 新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類 (cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他汀(dolastatin) ； duocarmycin (包 括合成類似物，KW-2I89 和 CBI-TMl)；艾榴塞洛素(eleutherobin) ； pancratistatin ； sarcodictyin ；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酉先胺(cholophosphamide)、雌莫司 Π" (estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮 芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、 苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿 啼唆氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、 氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(Iomustine)、尼莫司 汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne) (例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y II和加利車霉素ω Il (參 見例如 Agnew (1994) Chem.Intl.Ed.Engl.33 183-186)；蒽環(huán) 類抗生素(dynemicin)， 包括 dynemicin A ； 二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯 二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨 茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin) > 嗜癌霉素(carzinophilin)、色 霄素(chromomycin)、方文線菌素D (dactinomycin)、柔紅霄素(daunorubicin)、 地托比星 (detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin) (包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、 表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorabicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素 (marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素 C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、 泊非霉素(pot&omycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多 比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(Streptonigrin)、鏈佐星(Streptozocin)、殺結(jié)核菌素 (tubercidin)、烏苯美 司(ubenimex)、凈司他 丁 (zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)； 抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物， 諸如二 甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、三 甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤 (mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物， 諸如安西他濱(iincitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫 氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷 (doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪 酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate) > 表硫雄酉享(epitiostanol)、 美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特 (aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉 酸(folinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)； 氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼 P定(eniluracil)；安吖 P定(amsacrine)； bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)； 地美可辛(demecolcine)；地吖酉昆(diaziquone) ； elfornithine ；依禾丨J 醋銨(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)； 香菇多糖(Ientinan)；氯尼達(dá)明(Ionidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)， 諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托 蒽酉昆(mitoxiintrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol) ； 二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；批柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone)； 鬼臼酸(podophyllinic acid) ； 2_ 乙基酰胼(ethylhydrazide)；丙卡巴胼(procarbazine)； PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根 霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸 (tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone) ； 2，2'，2〃 -三氯三乙胺；單端孢菌素類 (trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracarin) A、桿孢菌素(roridin) A和蛇行 菌素(anguidin))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)； 甘露莫司汀(mannomustine) ； 二、溴甘露醇(mitobronitol) ； 二、溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman) ； gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇類(taxoids)，例如TAXOL 帕利 他塞(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE 不 含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造納米顆粒劑型帕利他塞(AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg，Illinois)禾Π TAXOTERE 多西他塞(doxetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁 酸氮芥(chlorambucil) ； GEMZAR 吉西 他濱(gemcitabine) ； 6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨 蝶呤(methotrexate)；鉬類似物，諸如順鉬(cisplatin)和卡鉬(carboplatin)；長春堿 (vinblastine)；鉬(platinum)；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)； 米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine) ； NAVELBINE 長春瑞濱 (vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達(dá)曲沙(edatrexate)； 道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(dá)(xeloda)；伊本膦酸鹽 (ibandronate)；伊立替康(irinotecan) (Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及 5_FU 和 亞葉酸的治療方案)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000 ； 二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類 視黃酸類(retinoids)，諸如視黃酸(retinoic acid)；卡培他濱(capecitabine)；考布他 汀(combretastatin)；亞葉酸(Ieucovorin) (LV)；奧沙利鉬(oxaliplatin)，包括奧沙利鉬 治療方案(FOLFOX) ； PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR (例 如 Erlotinib (TarcevaTM))禾口 VEGF-A的、降低細(xì)胞增殖的抑制劑；及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或衍生 物。該定義還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素劑諸如抗雌激 素類和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包 括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、 4_羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LYl 17018、 奧那司酮(onapristone)和FARESTON 托瑞米芬(toremifene)；抑制在腎上腺 中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特 (aminoglutethimide)、MEGASE 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR 伏羅唑 (vorozole) > KEMARA 來曲唑(Ietrozole)和ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole)；抗 雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、 亮丙瑞林(Ieuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3-二 氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉異常(abhenmt)細(xì)胞增 殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf和H-Ras;核 酶，諸如VEGF表達(dá)抑制劑(例如ANGIOZYME 核酸)和HER2表達(dá)抑制劑； 疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和 VAXID 疫苗；PROLEUKIN rIL-2 ； LURTOTECAN 拓?fù)洚悩?gòu)酶 1 抑制劑； ABARELIX rmRH ；長春瑞濱(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(見美國專 利No.4,675,187)；及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。術(shù)語“前體藥物”在用于本中請(qǐng)時(shí)指與母藥(parent drug)相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的 細(xì)胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降乃幱没钚晕镔|(zhì)的前體和衍生物形式。 參見例如 Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy”，Biochemical Society Transactions, 14，pp.375-382, 615thMeeting Belfast (1986)和 Stella et al.，‘‘Prodrugs : A Chemical Approach to Targeted Drag Delivery” , Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.)，pp.247-267，Humana Press (1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯
前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨 基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰 胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)化為更具活性而無細(xì)胞毒性的藥 物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的細(xì) 胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑?！胺派浏煼ā被颉胺暖煛敝甘褂枚ㄏ蛸ゑR射線或貝塔射線來誘發(fā)對(duì)細(xì)胞的足夠 損傷，以限制細(xì)胞正常發(fā)揮功能的能力或全然破壞細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，本領(lǐng)域知道許多方 式來確定治療的劑量和持續(xù)時(shí)間。典型的治療作為一次施用來給予，而典型的劑量范圍 為每天10-200個(gè)單位(戈瑞(Gray))。治療劑本發(fā)明特征在于c-met拮抗劑和EGFR拮抗 劑在聯(lián)合療法中治療受試者中的病理 狀況(諸如腫瘤)的用途。c-met 拮抗劑在本發(fā)明的方法中有用的c-met拮抗劑包括特異性結(jié)合c-met的多肽，抗c_met 抗體，c-met小分子，特異性結(jié)合c-met的受體分子和衍生物和融合蛋白。cmet拮抗劑 還包括c-met多肽的拮抗性變體，針對(duì)c-met和HGF的RNA適體和肽體。在本發(fā)明的 方法中有用的c-met拮抗劑還包括抗HGF抗體，抗HGF多肽，特異性結(jié)合HGF的c_met 受體分子和衍生物。下文描述了這些每一項(xiàng)的例子。在本發(fā)明的方法中有用的抗c-met抗體包括任何以足夠親和力和特異性結(jié)合 c-met且能降低或抑制c-met活性的抗體。所選擇的抗體正常情況下會(huì)具有足夠強(qiáng)的對(duì) c-met的結(jié)合親和力，例如抗體會(huì)以介于IOOnM-IpM之間的Kd值結(jié)合人c_met。抗體 親和力可通過例如基于表面等離振子共振的測(cè)定法(諸如BIAcore測(cè)定法，如PCT申請(qǐng) 公開文本NO.W02005/012359中所記載的)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)；和競(jìng)爭(zhēng)測(cè) 定法(例如RIA)來測(cè)定。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗c-met抗體能在靶向和干擾涉及c-met/ HGF活性的疾病或狀況中用作治療劑。還有，可以將所述抗體提交其它生物學(xué)活性測(cè)定 法，例如為了評(píng)估它作為治療劑的效力。此類測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的，而且取決于抗體 的靶抗原和預(yù)定用途。抗c-met抗體是本領(lǐng)域已知的(參見例如Martens, Τ, et al (2006) Clin Cancer Res 12(20 Pt 1) 6144 ； US 6,468,529 ； W02006/015371 ； W02007/063816 ； US7,408,043 ； W02009/007427 ； W02005/016382 ； W02007/126799)。在一個(gè)實(shí)施
方案中，抗c-met抗體包含重鏈可變域，其包含圖7中所繪CDR1-HC，CDR2-HC禾口 CDR3-HC序列(SEQ ID NO 13-15)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體 包含輕鏈可變域，其包含圖7中所繪CDR1-LC，CDR2-LC和CDR3-LC序列(SEQ ID NO: 5-7)中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。在一些實(shí)施方案中，重鏈可變域包含圖7中所繪FR1-HC， FR2-HC, FR3-HC和FR4-HC序列(SEQ ID NO 9-12)。在一些實(shí)施方案中，輕鏈可變域包含圖 7 中所繪 FR1-LC，F(xiàn)R2-LC, FR3-LC 和 FR4-LC 序列(SEQ ID NO 1-4)。 在一些實(shí)施方案中，抗c-met抗體是單價(jià)的且包含F(xiàn)c區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體 包含圖7中所繪Fc序列(SEQ ID NO 17)。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是單價(jià)的且包含F(xiàn)c區(qū)，其中所述Fc區(qū)包含第一和 第二多肽，其中所述第一多肽包含圖7中所繪Fc序列(SEQ ID NO: 17)且所述第二多肽 包含圖8中所繪Fc序列(SEQ ID NO 18)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗c-met抗體包含(a)第一 多肽，其包含具有下述序列的重 鏈可變域QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIG MIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDY WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO 19)，圖 7 中所繪 CHl 序列(SEQID NO 16)和圖 7 中 所繪Fc序列(SEQ ID NO: 17)；和(b)第二多肽，其包含具有下述序列的輕鏈可變域 DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWAST RESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO 20)和圖7中所繪CLl序列(SEQ ID NO 8)；和(c)第三多肽，其包含圖8中所 繪 Fc 序歹丨J (SEQ ID NO 18)。在其它實(shí)施方案中，抗c-met抗體是由以美國典型培養(yǎng)物保藏中心登錄號(hào)ATCC HB_11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細(xì)胞系生成 的單克隆抗體。在其它實(shí)施方案中，所述抗體包含由以美國典型培養(yǎng)物保藏中心登錄號(hào) ATCC HB-11894 (雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (雜交瘤5D5.11.6)保藏的雜交瘤細(xì)胞系 生成的單克隆抗體的一種或多種CDR序列。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的c-met抗體特異性結(jié)合c-met Sema結(jié)構(gòu)域或其變 體的至少一部分。在一個(gè)例子中，本發(fā)明的拮抗性抗體特異性結(jié)合至少一種選自下組的 序列LDAQT (SEQ ID NO 22)(例如 c_met 的殘基 269-273)，LTEKRKKRS (SEQ ID NO 23)(例如 c-met 的殘基 300-308)，KPDSAEPM (SEQID NO 24)(例如 c-met 的殘 基 350-357)和 NVRCLQHF (SEQ ID NO 25)(例如 c_met 的殘基 381-388)。在一個(gè)實(shí)施 方案中，本發(fā)明的拮抗性抗體特異性結(jié)合由至少一種選自下組的序列的部分或整個(gè)形成 的構(gòu)象表位LDAQT (SEQID NO 22)(例如 c_met 的殘基 269-273)，LTEKRKKRS (SEQ ID NO 23)(例如 c-met 的殘基 300-308)，KPDSAEPM (SEQ ID NO 24)(例如 c_met 的殘基 350-357)和 NVRCLQHF (SEQ ID NO 25)(例如 c_met 的殘基 381-388)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的拮抗性抗體特異性結(jié)合與序列LDAQT (SEQ IDNO : 22)， LTEKRKKRS (SEQ ID NO 23)，KPDSAEPM (SEQ ID NO 24)和 / 或NVRCLQHF (SEQ ID NO 25)具有至少50%，60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%序列同一性或相似性 的氨基酸序列?？笻GF抗體是本領(lǐng)域公知的。參見例如Kim KJ, et al.Clin Cancer Res. (2006) 12 (4) 1292-8 ； W02007/115049 ； W02009/002521 ； W02007/143098 ； W02007/017107 ； W02005/017107 ； L2G7 ； AMG-102。特異性結(jié)合HGF的c-met受體分子或其片段能在本發(fā)明的方法中使用，例如用 于結(jié)合和隔絕HGF蛋白質(zhì)，由此阻止其信號(hào)傳導(dǎo)。優(yōu)選地，c-met受體分子或其HGF結(jié) 合片段是可溶性形式。在一些實(shí)施方案中，所述受體的可溶性形式通過結(jié)合HGF，由此阻止它結(jié)合其在靶細(xì)胞表面上存在的天然受體而對(duì)c-met蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性發(fā)揮抑制效 果。還包括c-met受體融合蛋白，下文描述了它的例子。本發(fā)明的可溶性c-met受體蛋白質(zhì)或嵌合c-met受體蛋白質(zhì)包括沒有經(jīng)跨膜結(jié) 構(gòu)域固定至細(xì)胞表面的c-met受體蛋白質(zhì)。因此，c-met受體的可溶性形式(包括嵌合 受體蛋白質(zhì))在能夠結(jié)合和滅活HGF的同時(shí)不包含跨膜結(jié)構(gòu)域且如此一般不變成與表達(dá) 該分子的細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合。參見例如Kong-Beltran，M et al Cancer Cell (2004) 6 (1) 75-84。特異性結(jié)合c-met并阻斷或降低c-met活化，由此阻止它發(fā)信號(hào)的HGF分子或 其片段能在本發(fā)明的方法中使用。適體是形成特異性結(jié)合靶分子(諸如HGF多肽)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸分子。適體 的生成和治療用途是本領(lǐng)域已完善建立的。參見例如美國專利Νο.5,475,096。HGF適體 是PEG化的修飾的寡核苷酸，其采取使之能夠結(jié)合細(xì)胞外HGF的三維構(gòu)象。關(guān)于適體 的別的信息可見于美國專利申請(qǐng)公開文本No.20060148748。肽體是與編碼免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列相連接的肽序列。多 肽可衍生自隨機(jī)化序列，通過任何方法來選擇特異性結(jié)合，包括但不限于噬菌體展示技 術(shù)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將所選擇的多肽連接至編碼免疫球蛋白Fc區(qū)的氨 基 酸序列。特異性結(jié)合并拮抗HGF或c-met的肽體在本發(fā)明的方法中也是有用的。c-met 拮抗劑包括小分子，諸如 US 5,792,783 ； US 5,834,504 ； US5,880,141 ； US 6,297,238 ； US 6,599,902 ； US 6,790,852 ； US 2003/0125370 ； US 2004/0242603 ； US 2004/0198750 ； US 2004/0110758 ； US 2005/0009845 ； US 2005/0009840 ； US 2005/0245547 ； US 2005/0148574 ； US 2005/0101650 ； US 2005/0075340 ； US 2006/0009453 ； US 2006/0009493 ； WO 98/007695 ； WO 2003/000660 ； WO 2003/087026 ； WO 2003/097641 ； WO 2004/076412 ； WO 2005/004808 ； WO 2005/121125 ； WO 2005/030140 ； WO 2005/070891 ； WO 2005/080393 ； WO 2006/014325 ； WO 2006/021886 ； WO 2006/021881, WO 2007/103308 中記載的化合 物。PHA-665752是c-Met的催化活性、以及多種腫瘤細(xì)胞的生長、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵入和 形態(tài)的一種小分子、ATP競(jìng)爭(zhēng)性的活性位點(diǎn)抑制劑(Ma et al(2005)Clin.Cancer Res. 11 2312-2319 ； Christensen et al (2003) Cancer Res.63 7345-7355)。EGFR 拮抗劑EGFR拮抗劑包括抗體，諸如稱作nimotuzumab (YM Biosciences)的人源化 單克隆抗體，完全人的 ABX-EGF (panitumumab, Abgenix Inc.)以及 US6,235,883 中 記載的稱作 El.1，E2.4，E2.5，E6.2，E6.4，E2.ll，E6.3 和 E7.6.3 的完全的抗體； MDX-447 (Medarex Inc)。pertuzumab (2C4)是直接結(jié)合 HER2 但干擾 HER2-EGFR 二 聚化，由此抑制EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的人源化抗體。結(jié)合EGFR的抗體的其它例子包括 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)，MAb 455 (ATCC CRL HB8507)，MAb 225 (ATCC CRL 8508)，MAb 528 (ATCC CRL8509)(參見美國專利 No.4,943,533，Mendelsohn et al.)及 其變體，諸如嵌合化225 (C225或Cetuximab ； ERBUTIX )和重構(gòu)人225 (H225) (參見 WO 96/40210，Imclone Systems Inc. ； IMOl 1F8，一種完全人的 EGFR 靶向抗 體(Imclone)；結(jié)合II型突變EGFR的抗體(美國專利Νο.5,212,290)；結(jié)合EGFR的人源化和嵌合抗體，如美國專利No.5,891,996中所記載的；及結(jié)合EGFR的人抗體，諸 如 ABX-EGF (參見 sW098/50433，Abgenix) ； EMD 55900 (Stragliotto et al.Eur.J.Cancer 32A 636-640(1996)) ； EMD7200 (matuzumab)，一種針對(duì) EGFR 的人源化 EGFR 抗體， 其與EGF和TGF- α 二者競(jìng)爭(zhēng)EGFR結(jié)合；及mAb 806或人源化mAb 806 (Johns et al., J.Biol.Chem.279 (29) 30375-30384(2004))?？?EGFR 抗體可偶聯(lián)細(xì)胞毒劑，如此產(chǎn)生 免疫偶聯(lián)物(參見例如 EP659,439A2，Merck Patent GmbH)。在本發(fā)明的方法中有用的抗EGFR抗體包括任何以足夠親和力和特異性結(jié)合 EGFR且能降低 或抑制EGFR活性的抗體。所選擇的抗體在正常情況下會(huì)具有足夠強(qiáng)的對(duì) EGFR的結(jié)合親和力，例如抗體可以以介于IOOnM-IpM之間的Kd值結(jié)合人c_met?？?體親和力可通過例如基于表面等離振子共振的測(cè)定法(諸如BIAcore測(cè)定法，如PCT申 請(qǐng)公開文本NO.W02005/012359中所記載的)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)；和競(jìng)爭(zhēng)測(cè) 定法(例如RIA)來測(cè)定。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗c-met抗體能在靶向和干擾涉及EGFR/ EGFR配體活性的疾病或狀況中用作治療劑。還有，可以對(duì)所述抗體進(jìn)行其它生物學(xué)活 性測(cè)定法，例如為了評(píng)估它作為治療劑的效力。此類測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的，而且取決 于抗體的靶抗原和預(yù)定用途。雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異 性抗體可結(jié)合EGFR和c-met。在另一個(gè)例子中，例示性的雙特異性抗體可結(jié)合同一蛋白 質(zhì)(例如c-met蛋白質(zhì))的兩種不同表位?；蛘?，可以將c-met或EGFR臂與結(jié)合白細(xì)胞 上觸發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受體(Fe y R)，諸如 Fc Y RI (CD64)，F(xiàn)cyRII (CD32)和Fc Y RIII (CD16)的臂組合，從而將細(xì)胞防御機(jī)制聚焦 于表達(dá)c-met或EGFR的細(xì)胞。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒劑定位至表達(dá)EGFR或 c-met的細(xì)胞。這些抗體擁有結(jié)合EGFR或C_met的臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑(例如皂草毒蛋 白，抗干擾素-α，長春花生物堿，蓖麻毒蛋白A鏈，甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原) 的臂。雙特異性抗體可制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab' )2雙特異性抗體)。EGFR 拮抗劑還包括小分子，諸如 US5616582，US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, W09814451, W09850038, W09909016, W09924037, W09935146, W00132651, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498中記載的化合物。具體的小分子EGFR拮抗劑包括OSI-774 (CP-358774， Erlotinib, OSI Pharmaceuticals) ； PD 183805 (Cl 1033，N_[4-[(3-氯 _4_ 氟苯 基)氨基]-7-[3-(4_嗎啉基)丙氧基h6-喹唑啉基|-2-丙烯酰胺，二氫鹽酸 鹽，PfizerInc.) ； Iressa (ZD 1839，Gefitinib, AstraZeneca) ； ZM 105180 ((6-氨 基-4- (3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca) ； ΒΙΒΧ-1382 (Ν8- (3-氯_4_氟-苯 基)-Ν2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8- 二 胺，Boehringer Ingelheim) ； PKI-166 ((R)-4_[4_[ (1-苯基乙基)氨基]-1Η_ 批咯并[2，3-d]嘧 啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羥基苯基)-4-[(1_苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2， 3-d]嘧啶)；CL-387785 (N_[4_[ (3-溴苯基)氨基]-6_喹唑啉基]_2_ 丁炔酰胺)； EKB-569 (N-[4-[ (3-氯-4-氟苯基)氨基]-3_氰基_7_乙氧基-6-喹啉基]-4_ ( 二甲基氨基)_2_ 丁烯酰胺)；lapatinib (Tykerb，GlaxoSmithKline) ； ZD6474 (Zactima, AstraZeneca) ； CUDC-101 (Curis) ； canertinib (CI—1033) ； AEE788 (6_[4_[ (4-乙
基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N_[ (IR)-I-苯基乙基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺， W02003013541, Novartis)禾Π ΡΚΙ166 (4-[4-[[ (IR)-1-苯基乙基]氨基]-7Η_ 吡咯并[2， 3-d]嘧啶-6-基]-苯酚，W09702266 Novartis)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，EGFR拮抗劑具有依照US 5,757,498 (通過引用并入 本申請(qǐng))的通式I:
權(quán)利要求
1.一種治療受試者中的癌癥的方法，包括對(duì)受試者施用治療有效量的c-met拮抗劑和 EGFR拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述EGFR拮抗劑具有依照US5,757,498 (通過引用并入 本申請(qǐng))的通式I:其中m 為 1，2，或3 ；每個(gè)R1獨(dú)立地選自下組氫，鹵素，羥基，羥基氨基，羧基，硝基，胍基，脲基， 氰基，三氟甲基和-(C1-C4亞烷基亞烷基)-W-(苯基)，其中W為單鍵，O，S或NH;或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自R9和C1-C4烷基，其是被氰基取代的，其中R9選自下組 R5, -OR6, -NR6R6, -C (O)R7, -NHOR5, -OC (O)R6,氰基，A 和-YR5 ； R5 為 C1-C4 烷基；R6獨(dú)立地為氫或R5; R7SR5, -OR6或-NR6R6; A選自哌啶子基，嗎啉代，吡 咯烷子基，4-R6-哌嗪-1-基，咪唑-1-基，4-吡啶酮-1-基，-(C1-C4亞烷基亞烷基) (CO2H),苯氧基，苯基，苯基硫基，C2-C4烯基和-(C1-C4亞烷基亞烷基)C (O)NR6R6 ； 且Y為S，SO,或SO2;其中R5，-OR6和-NR6R6中的烷基部分任選是被1-3個(gè)鹵素取 代基取代的且R5，-OR6和-NR6R6中的烷基部分任選是被1或2個(gè)R9基團(tuán)取代的，且其 中所述任選取代基的烷基部分任選是被鹵素或R9取代的，前提是沒有兩個(gè)雜原子連接于 同一碳原子；或者每個(gè)R1獨(dú)立地選自-NHSO2R5,鄰苯二甲酰亞氨基-(C1-C4)-烷基磺?；?基，苯甲酰氨基，苯磺酰基氨基，3-苯基脲基，2-氧代吡咯烷-1-基，2，5-二氧 代吡咯烷-1-基和Rltl-(C2-C4)-烷?；被渲蠷ltl選自鹵素，-0R6，(2-(4烷酰 基氧，-C (O)R7和-NR6R6;且其中作為R1基團(tuán)的所述-NHSO2R5,鄰苯二甲酰亞氨 基-(C1-C4)-烷基磺?；被?，苯甲酰氨基，苯磺?；被?，3-苯基脲基，2-氧代吡咯 烷-1-基，2，5-二氧代吡咯烷-1-基和Rltl-(C2-C4)-烷?；被芜x是被1或2個(gè)獨(dú)立 地選自鹵素，C1-C4烷基，氰基，甲基磺酰基和C1-C4烷氧基的取代基取代的；或者兩個(gè)R1基團(tuán)與它們所連接的碳一起形成5-8元環(huán)，其包括1或2個(gè)選自0，S和 N的雜原子；R2為氫或C1-C6烷基，其任選是被1-3個(gè)獨(dú)立地選自鹵素，C1-Qg氧基，-NR6R6 和-SO2R5的取代基取代的；η為1或2且每個(gè)R3獨(dú)立地選自氫，鹵素，羥基，C1-C6烷基，-NR6R6和C1-C4烷 氧基，其中所述R3基團(tuán)的烷基部分任選是被1-3個(gè)獨(dú)立地選自鹵素，C1-C4烷氧基，-NR6R6和-SO2R的取代基取代的；且R4為疊氮基或_(乙炔基)_R"，其中R11為氫或C1-C6烷基，所述C1-C6烷基任選是被羥基，-OR6，或-NR6R6取代的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述EGFR拮抗劑為選自下組的依照式I的化合物 (6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑 啉-4-基)-[3-(3 ‘-羥基丙炔-1-基)苯基]_胺；[3-(2' _(氨基甲基)_乙炔 基)苯基]-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6_硝基喹唑 啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(4_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲 氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基-2-甲基苯基)-胺；(6-氨基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔 基苯基)_胺；(3-乙炔基苯基)-(6_甲磺?；被蜻?4-基)-胺；(3-乙炔基苯 基)-(6，7-亞甲二氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-(3-乙炔 基-6-甲基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(7_硝基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯 基)-[6-(4'-甲苯磺?；被?喹唑啉-4-基h胺；(3-乙炔基苯基)-{6-[2'-苯二 酰亞氨基-乙-1'-基-磺酰基氨基]喹唑啉-4-基}"胺；(3-乙炔基苯基)-(6_胍 基喹唑啉-4-基)-胺；(7-氨基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基 苯基)-(7_甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(6-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯 基)_胺；(7-甲氧羰基喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；[6，7-雙(2-甲氧基乙 氧基)喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)-胺；(3-疊氮基苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑 啉-4-基)-胺；(3-疊氮基-5-氯苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(4-疊 氮基苯基)-(6，7-二甲氧基喹唑啉-4-基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺?；?喹唑 啉-4-基)-胺；(6-乙硫基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基-4-氟-苯基)-胺；(6，7-二甲氧基-喹唑啉-4-基)-[3-(丙 炔-1'-基)-苯基]-胺；[6，7-雙-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(5-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-雙-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(3-乙炔 基-4-氟-苯基)_胺；[6，7-雙-(2-氯-乙氧基)-喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；[6- (2-氯-乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h (3-乙炔基-苯 基)_胺；[6，7-雙-(2-乙酰氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h(3-乙炔基-苯基)-胺； 2-[4- (3-乙炔基-苯基氨基)-7- (2-羥基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基h乙醇；[6- (2-乙 酰氧基_乙氧基)-7-(2-甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基h(3-乙炔基-苯基)_胺； [7- (2-氯-乙氧基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基h (3-乙炔基-苯基)_胺； [7-(2-乙酰氧基-乙氧基)-6-(2_甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基|-(3-乙炔基-苯 基)-胺；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-羥基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙 醇；2-[4-(3_乙炔基-苯基氨基)-7-(2_甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-6-基氧基]-乙 醇；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基]-乙醇； [6-(2-乙酰氧基-乙氧基)-7-(2_甲氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯 基)-胺；(3-乙炔基-苯基)-{6- (2-甲氧基-乙氧基)-7-[2- (4-甲基-哌嗪-1-基)-乙 氧基]-喹唑啉-4-基}-胺；(3-乙炔基-苯基)-[7-(2_甲氧基-乙氧基)-6-(2_嗎 啉-4-基)-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔 基苯基)_胺；(6，7-二丁氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二異丙 氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6，7-二乙氧基喹唑啉-1-基)-(3-乙炔 基-2-甲基-苯基)-胺；[6，7-雙-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基-2-甲基-苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6- (2-羥基-乙氧基)-7- (2-甲氧基-乙氧 基)-喹唑啉-1-基]-胺；[6，7-雙-(2-羥基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙炔基苯 基)-胺；2-[4_ (3-乙炔基-苯基氨基)-6- (2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-7-基氧基h乙 醇；(6，7-二丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹 唑啉-4-基)-(3_乙炔基-5-氟-苯基)-胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基-4-氟-苯基)_胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(5_乙炔基-2-甲基-苯 基)_胺；(6，7-二乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-4-甲基-苯基)-胺；(6-氨基甲 基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基-苯基)-胺；(6-氨基甲基-7-甲氧基-喹唑 啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺； (6-氨基羰基甲基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基 乙基-7-乙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-異丙 氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-丙氧基-喹唑 啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基甲基-7-甲氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙 炔基苯基)-胺；(6-氨基羰基乙基-7-異丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3_乙炔基苯基)-胺； (6-氨基羰基乙基-7-丙氧基-喹唑啉-4-基)-(3-乙炔基苯基)-胺；(6，7-二乙氧基喹 唑啉-1-基)_ (3-乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-[6- (2-羥基-乙氧基)-7- (2-甲氧 基-乙氧基)-喹唑啉-1-基h胺；[6，7-雙-(2-羥基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3-乙 炔基苯基)-胺；[6，7-雙-(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-1-基]-(3_乙炔基苯基)-胺； (6，7-二甲氧基喹唑啉-1-基)-(3_乙炔基苯基)-胺；(3-乙炔基苯基)-(6-甲磺酰基 氨基-喹唑啉-1-基)-胺；和(6-氨基-喹唑啉-1-基)-(3-乙炔基苯基)-胺。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述式I的EGFR拮抗劑為N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙 (2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述EGFR拮抗劑N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲 氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺為HCl鹽形式。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述EGFR拮抗劑N-(3-乙炔基苯基)-6，7_(2_甲氧基乙 氧基)-4-喹唑啉胺為基本上同質(zhì)的結(jié)晶多型形式，其展現(xiàn)的X射線粉末衍射圖所具有的 特征峰如下表示大約 6.26、12.48、13.39、16.96、20.20、21.10、22.98、24.46、25.14 禾口 26.91 的 2-theta。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述c-met拮抗劑為抗體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體為單價(jià)抗體。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體為單價(jià)且包含F(xiàn)c區(qū)，其中所述Fc區(qū)包含第一和 第二多肽，其中所述第一多肽包含圖7中所繪Fc序列(SEQ IDNO : 17)且所述第二多肽 包含圖8中所繪序列(SEQ ID NO 18)。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗體包含(a)第一多肽，其包含具有下述序列的重 鏈可變域QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPS NSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO 19)，圖 7 中所繪 CHl 序列(SEQ ID NO 16)和圖 7 中所繪 Fc 序列(SEQIDNO: 17)；和(b)第二多肽，其包含具有下述序列的輕鏈可變域DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYW ASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO 20)和圖7中所繪CLl序列(SEQID NO 8)；和(c)第三多肽，其包含圖8 中所繪Fc序歹丨J (SEQ ID NO 18)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥選自下組乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，直腸癌，非 小細(xì)胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤，腎細(xì)胞癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，軟組織肉瘤， 卡波西氏肉瘤，類癌，頭頸癌，胃癌，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤和多發(fā)性骨髓瘤。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述癌癥為非小細(xì)胞肺癌。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥不是EGFR拮抗劑抗性癌癥。
14.權(quán)利要求1，進(jìn)一步包括對(duì)受試者施用化療劑。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述EGFR拮抗劑為4-(3'-氯-4'-氟苯胺基)_7_甲 氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述EGFR拮抗劑為N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基] 苯基]-6-[5-[[[2-(甲磺酰基)乙基]氨基]甲基h2-呋喃基]-4_喹唑啉胺。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述EGFR拮抗劑為4-(4_溴-2-氟苯胺基)_6_甲氧 基-7-(l-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)和生長因子調(diào)控的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于病理狀況(諸如癌癥)治療的，包含c-met拮抗劑和EGFR拮抗劑的聯(lián)合療法。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102014913SQ200980116491
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月6日
發(fā)明者埃倫·菲爾瓦羅夫, 羅伯特·L·堯克, 馬克·麥錢特 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司