專利名稱：在結締組織保護和修復中的硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素的制作方法
在結締組織保護和修復中的硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨
素本發(fā)明一般性地涉及結締組織的保護和修復。具體來說，本發(fā)明涉及硫酸軟骨素 及其衍生物在結締組織保護和修復中的用途。骨關節(jié)炎(OA)為累及老年人的最普遍的致殘性慢性疾病之一。其最突出的特征 為關節(jié)軟骨的進行性破壞，其引起關節(jié)活動受損、重度痛，最終致殘。它的高患病率和它對 日常生活中度至重度的影響導致了重要的公共健康問題。已對西歐的膝關節(jié)OA患病率進 行估計，60-79歲年齡之間的荷蘭男性為18-25%，女性為24_40%，西班牙為28_34%。估 計在歐盟國家中有1億人口患有OA。在法國，2001年估計的OA直接成本為16. 4億歐元。 在美國，2001年患有OA的人口為0. 699億?，F今，OA的治愈仍難以實現，且OA的治療大部 分為集中于緩解癥狀的姑息治療。 對OA治療的當前推薦包括非藥理學干預(體重減輕、教育計劃、鍛煉等)和藥理學治療(對 乙酰氨基酚、非留體抗炎藥物-NSAIDs-等)的組合。硫酸軟骨素(CS)是治療OA的最常用的治療之一。硫酸軟骨素經口攝入，但取決 于具體的國家，其作為藥物或作為食品添加物進行銷售。與葡糖胺一起，據估計CS的市場 規(guī)模為每年8億美元。CS減輕骨關節(jié)炎患者的膝痛和改善膝功能的能力已在多項臨床試 驗中得到證明，并在薈萃分析(meta-analyses)中得到證實。根據歐洲風濕病防治聯合會 (European League against Rheumatism)的科學建議，CS顯示了對膝關節(jié)OA療效的最高 水平的證據(即，隨機臨床試驗-RCT的薈萃分析)。在7個持續(xù)時間為3-24個月的評價 CS對膝關節(jié)OA的改善癥狀作用的雙盲、安慰劑對照的RCT中，6個得出的結論為CS在減輕 自發(fā)性疼痛和增加運動性方面比安慰劑更有效[L' Hirondel JL,Litera Rheumatologica 1992,14 -Jl-M ；Bucsi L, Poor G，骨關節(jié)炎和軟骨(Osteoarthritis Cartilage) 1998, 6增刊A 31-36 ；Uebelhart D等人，骨關節(jié)炎和軟骨1998,6增刊A 39-46 ；Pavelka K等 人，Litera Rheumatologica 1999,24 21-30 ；Bourgeois P 等人，骨關節(jié)炎和軟骨 1998，6 增刊 A 25-30 ；Uebelhart D 等人，骨關節(jié)炎和軟骨 2004，12 :269_276]。800mg 和 1200mg 一天一次比安慰劑或200mg劑量對疼痛和運動性更有效。在1200mg CS 一天一次和400mg 一天三次之間對運動性而言沒有發(fā)現統(tǒng)計學顯著性差異，兩種治療皆優(yōu)于安慰劑。在一 年內使用SOOmg —天一次的兩個為期3個月的治療通過改善運動性表明與安慰劑相比具 有持續(xù)療效。效果不是立即產生的；在患者能夠檢測到疼痛和運動性方面的顯著性差異 之前至少需要2周。在一項試驗中，CS(每天IOOOmg)在改善功能方面并不比安慰劑更好 [Mazieres B 等人，JRheumatol 2001，28 :173_181]。在一項雙盲 RCT 中，400mg CS—天 三次比50mg雙氯芬酸一天三次在改善Lesquesne指數(疼痛和功能的驗證指數)方面見 效更慢，但在減輕疼痛的視覺模擬評分方面則不慢[Morreale P等人，J Rheumatol 1996， 23:1385-1391]。當治療終止后，CS的作用比雙氯芬酸的作用持續(xù)時間更長。CS對膝關節(jié) OA的改善癥狀作用進一步得到了 3項薈萃分析的支持[Leeb BF等人，J Rheumatol 2000, 27 205-211 ；McAlindon TE 等人，Jama-美國醫(yī)學協(xié)會雜志(Journal of the American Medical Association) 2000, 283 1469-1475 ；Richy F 等人，Arch Intern Med2003,163 1514-1522]。這些薈萃分析得出結論CS優(yōu)于安慰劑，對骨關節(jié)炎癥狀具有顯著的作用，對 OA的疼痛和功能的多項驗證工具(Lesquene指數、疼痛的視覺模擬評分、運動性和反應狀 態(tài)的視覺模擬評分)是有效的。 除了它的改善癥狀作用之外，在3項試驗中報告CS能夠減緩OA患者的軟骨破壞。 這些試驗使用耗時數年采用連續(xù)X-射線測定的關節(jié)間隙損失/寬度(當前用于軟骨破壞 的金標準替代標記)作為主要終點。在第一項為期一年、雙盲、安慰劑對照的RCT中，采用 X-射線測定的關節(jié)間隙寬度和關節(jié)間隙表面積的平均值和最小值在安慰劑組中顯著降低， 但在800mgCS組中無顯著降低[Uebelhart D等人，骨關節(jié)炎和軟骨2004，12 :269_276]。在 該試驗中，在骨鈣素、硫酸角質素、吡啶啉(pyridinoline)和脫氧-吡啶啉生物標記方面的 變化表明CS影響骨骼和軟骨的代謝。在第二項對膝蓋OA進行的為期2年的雙盲RCT中， SOOmg—天一次可預防關節(jié)間隙狹窄，而在安慰劑組中平均關節(jié)間隙損失為0. 14mm[Michel BA等人，關節(jié)炎(Arthritis Rheum) 2005，52 779-786]。這些結果在第3項選取了 622 位患者的對膝蓋OA進行的為期2年的雙盲RCT中得到證實(ST0PP試驗，即將發(fā)表)。最 后，在一項小型安慰劑對照的開放試驗中，800mg CS 一天一次給藥10天顯著增加膝關節(jié) 滑液中的粘度和透明質酸鹽濃度同時降低膠原酶、磷脂酶A2和N-乙酰氨基葡糖苷酶的活 性，進一步支持存在改善癥狀和改善結構的作用[Ronca F等人，骨關節(jié)炎和軟骨1998，6: 14-21]。CS的改善結構作用還獲得了動物研究的支持。在年輕的大鼠中，在向膝關節(jié)注射 緩激肽(bradikinin)之前的兩周開始100和300mg/kg體重/天的6-硫酸軟骨素(臨床 劑量的5倍和15倍)給藥，減少或阻止軟骨中蛋白聚糖耗竭[Omata T等人，藥物研究雜志 (Arzneimittelforschung) 1999，49 :577_581]。在年輕的兔子中，在注射木瓜凝乳蛋白酶之 前11天開始20mg/kg體重/天的CS給藥，并持續(xù)到注射后21天，可降低軟骨破壞和蛋白 聚糖損失[Uebelhart D等人，骨關節(jié)炎和軟骨1998，6 :6_13]。總之，上面概述的現有技術給出如下結論現今，硫酸軟骨素為少數能夠改善癥狀 和減緩關節(jié)軟骨破壞的分子之一。然而，盡管有效，但它的作用是緩慢的(即達到全面癥狀 緩解最多需要2個月)和部分的(即患者感覺有所好轉但不會感覺良好)。因此，本發(fā)明的目的為鑒別特殊的硫酸軟骨素，其與本領域中普遍已知的和應用 的硫酸軟骨素相比具有更優(yōu)良的作用和更高的效力。因此，本發(fā)明目的在于向骨關節(jié)炎患 者和患有其它結締組織疾病的患者提供更有效的療法。本發(fā)明的發(fā)明人已研究了 CS的糖類，并且已證明它們中極特殊的一組，即不飽和 的二糖硫酸軟骨素、尤其是4-硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素，對本發(fā)明的目的而言是特 別有效的。值得注意的是，其它已測試過的CS糖類，如任何已測試過的飽和二糖類或商品化 的CS在測試試驗中都不能使軟骨中葡糖氨基聚糖類(GAG)的破壞降低到與本發(fā)明所要求 保護的化合物相似的程度。對于本發(fā)明的目的而言，硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素的這一特別高的效力為 新的和出乎意料的。因此，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現通過權利要求1中的用途可以達到本發(fā)明 的目的。本發(fā)明的一個實施方案為用于形成(developing)、保護和/或修復結締組織的不 飽和二糖硫酸軟骨素。
在一些不 同的軟骨素二糖和一些更高分子量形式的硫酸軟骨素中，4"硫酸化不飽 和硫酸軟骨素二糖(AdiAS)是到目前為止在體外減緩細胞因子-誘導的軟骨破壞方面最 有效的化合物。硫酸化(理想情況為在N-乙?；?半乳糖胺殘基的4位)和在葡萄糖醛 酸環(huán)2上的4位和5位之間的不飽和看來有益于這一顯著的效力，因為在結構上密切相關 的化合物不能像本發(fā)明的4-硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素那樣減少細胞因子_誘導的 軟骨破壞。常規(guī)商品化的硫酸軟骨素不具有任何顯著的作用。根據平行比較，在大鼠腸彎模型中，如果測試分子的分子量降低則硫酸軟骨素的 生物利用度增加。因此，表明4-硫酸化的不飽和硫酸軟骨素二糖也比常規(guī)高分子量的硫酸 軟骨素的生物利用度更高。本發(fā)明因此提供例如比常規(guī)商品化的高分子量硫酸軟骨素更有效的和具有更高 生物利用度形式的硫酸軟骨素。鑒于此，本發(fā)明化合物將向OA患者提供比現有技術的硫酸軟骨素更高的疼痛緩 解和更好的對抗軟骨破壞的保護作用。該發(fā)現因此是治療領域的重大進步，在所述治療領 域中除了修復手術外沒有干預能夠充分減輕骨關節(jié)炎疼痛、能夠讓患者感覺良好，并且其 中幾乎沒有干預能有效減緩軟骨破壞。因此，本發(fā)明的一個實施方案為至少一種硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素在制備 用于保護和/或修復結締組織的組合物中的用途。另一個實施方案為至少一種硫酸化的不 飽和二糖硫酸軟骨素在制備用于治療和/或預防結締組織疾病癥狀的組合物中的用途。結締組織為傳統(tǒng)分類中的4種組織類型之一(其它為上皮組織、肌肉組織和神經 組織)。在通常情況下結締組織為涉及結構和支撐的組織，其特征在于存在重要的細胞外有 機基質。例如，軟骨為典型的結締組織。硫酸軟骨素為硫酸化的糖胺聚糖(GAG)，由交替的糖(N-乙酰半乳糖胺和葡糖醛 酸)鏈組成。經常發(fā)現其連接在蛋白質上作為蛋白聚糖的部分。軟骨素鏈可以具有100個 以上的個體糖。每個單糖可能為未硫酸化的、一次硫酸化的或兩次硫酸化的。最常見的是， N-乙?；?半乳糖胺的4位和6位的羥基被硫酸化。本發(fā)明的硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素優(yōu)選選自4-硫酸化不飽和二糖硫酸軟 骨素(Adi4S)、6_硫酸化不飽和二糖硫酸軟骨素(Adi6S)和非硫酸化的不飽和二糖硫酸 軟骨素(AdiOS)0可以通過應用本發(fā)明來制備的組合物是能夠用于向人或寵物施用硫酸化的不飽 和二糖硫酸軟骨素的任何組合物。優(yōu)選地，其為藥物組合物、飲料、食物產品、食品補充劑和
/或營養(yǎng)食品。組合物可以優(yōu)選選自基于奶粉的產品；速溶飲料(instant drinks)；方便飲料制 品；營養(yǎng)粉；基于奶的產品，特別是酸乳酪或冰淇淋；谷類制品；餅干；壓縮干糧；飲料；水； 咖啡；熱牛奶咖啡(cappuccino)；茶；果汁；麥芽飲料；巧克力調味的飲料；烹調用制品； 湯；糖果制品；巧克力；局部用乳膏劑、栓劑、片劑、糖漿劑和經皮施用的制劑。在本發(fā)明的一方面，通過應用本發(fā)明來制備的組合物用于治療或預防結締組織 疾病。典型的結締組織疾病既可以是遺傳性的也可以是環(huán)境因素造成的，并包括馬方 (Marfan)綜合征、壞血病(scurvy)、Ehlers_Danlos綜合征、Loeys-Dietz綜合征、彈性假黃色瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成骨不全(脆骨病)、進行性骨化性纖維發(fā)育不良、自發(fā)性氣胸和/ 或肉瘤。
根據本發(fā)明的用途最優(yōu)選治療或預防的兩種結締組織疾病為骨關節(jié)炎和類風濕 t生關節(jié)炎(rheumatoid arthritis) 0通過應用本發(fā)明制備的組合物還可用于治療或預防骨關節(jié)炎或類風濕性關節(jié)炎 的癥狀，諸如例如疼痛和運動性受損。其還可用于美容方面，例如治療或預防皮膚老化的體征諸如皺紋的出現。本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素特別可以用于平衡軟骨 細胞的合成代謝和分解代謝活性和/或減緩或停止軟骨破壞，尤其是關節(jié)軟骨破壞。由于它的高的效力和生物利用度，包含硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素的組合物 還可以用于緩解疼痛，尤其是在OA患者中。通過應用本發(fā)明制備的組合物還可用于改善活動性，尤其是改善關節(jié)功能。硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素可以單獨使用或與其它化合物聯合使用。通過應 用本發(fā)明制備的組合物還可含有本文公開的硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素的組合，和/ 或還可含有本領域中現已知的硫酸軟骨素。組合物還可以進一步包含至少一種軟骨聚集蛋白聚糖、至少一種膠原、至少一種 硫酸軟骨素和/或至少一種葡糖胺或其部分(fractions)。與II型膠原一起，軟骨聚集蛋白聚糖構成軟骨(尤其是關節(jié)軟骨)的主要結構成 分。軟骨聚集蛋白聚糖包含N-末端的兩個球形結構域和C-末端的一個球形結構域，二者 被主要用葡糖氨基聚糖類修飾的一個大型結構域分隔開。N-末端球形結構域之間的連接域 (稱為球間結構域)對蛋白水解高度敏感。已將這種降解與關節(jié)炎的形成相關聯。能夠降 解軟骨聚集蛋白聚糖的蛋白酶稱為軟骨聚集蛋白聚糖酶，它們?yōu)锳DAMTS(具有凝血酶敏感 蛋白模體的解聚素和金屬蛋白酶)蛋白家族的成員。因此，如果通過應用本發(fā)明制備的組 合物進一步包含至少一種ADAMTS抑制劑，尤其是軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制劑和/或基質金 屬蛋白酶抑制劑，則能夠增加組合物的療效。依賴于根據本發(fā)明制備的組合物的預期用途，組合物可以進一步包含至少一種其 它化合物，例如至少一種選自下列的化合物疼痛解除劑(pain relieving agent)、穩(wěn)定 齊 、矯味劑、著色劑、潤滑劑、抗炎劑、血管發(fā)生抑制劑、軟骨保護劑、抗骨質吸收劑和/或增 加骨形成的藥物。根據本發(fā)明制備的組合物以受控方式在很長時期內緩慢釋放它的活性化合物可 能是需要的。通過這種方式，能夠避免頻繁的施用并能夠實現長期效果。對于該目的，可以 將組合物制備成例如持續(xù)釋放制劑?？梢詫⒒钚曰衔锢邕m當地包囊，以便將它們以相 應于即時需要的量緩慢釋放。組合物還可以包含載體。載體確保例如良好的給藥性(dosability)和長期貯藏 的可能性。本領域中任何已知的載體適用于本發(fā)明，并且它的選取將取決于組合物和其預 期用途。組合物預期用于人類或動物尤其是寵物和/或伴侶動物。對于動物，優(yōu)選預期具 有較長壽命的動物。本發(fā)明的組合物能夠例如用來確保長時間良好的運動性。特別優(yōu)選貓 和狗。
根據本發(fā)明制備的組合物可以應用于任何年齡組。組合物預期用于例如嬰兒、兒 童、青少年、成人和/或老人。然而，因為結締組織保護和修復更正確來講為成人或老年人 群的問題，因此這些年齡組是優(yōu)選的。結締 組織的形成可能是所有年齡組共同的問題，例如受傷后。特別是對于嬰兒，結 締組織的形成例如對確保生成強壯的骨_軟骨系統(tǒng)是非常重要的。本發(fā)明的組合物中的硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素的劑量將主要取決于例如 組合物的性質；待治療的疾??；患者的年齡、尺寸大小、健康狀態(tài)和性別；和/或可能同時服 用的其它藥物，僅列舉少數例子。因此對劑量沒有具體限制，任何有效劑量均適用于本發(fā)明 的目的。有效劑量可以由醫(yī)護人員或營養(yǎng)學家很容易地進行確定。然而，一般來說，優(yōu)選4-硫酸化不飽和硫酸軟骨素以大約lOOng-lg/g干組合物質 量的量存在于組合物中，優(yōu)選大約lmg-lg/g干組合物質量，甚至更優(yōu)選大約200mg-lg/g干 組合物質量。關于日攝入量，如果要施用4-硫酸化不飽和硫酸軟骨素，則優(yōu)選日劑量為大約 lng-100mg/kg待治療的個體體重，優(yōu)選大約lmg-80mg/kg待治療的個體體重，甚至更優(yōu)選 大約5mg-50mg/kg待治療的個體體重。硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素的有效劑量對于成年患者可以例如介于每天大 約800mg至1200mg之間，一次性或例如在一天內分為3個單劑量給予。對于本領域技術人員很明顯的是，他們可以在不脫離公開的發(fā)明范圍的情況下自 由組合本文所述的本發(fā)明的所有特征。具體來說，對本發(fā)明的用途所述的所有特征都可以 用于本發(fā)明的不飽和二糖硫酸軟骨素。根據下列實施例和附圖，本發(fā)明的其它優(yōu)點和特征將是顯而易見的。

圖1 Δ di4S對ILl β -誘導的GAG釋放的作用。負載放射性后，將軟骨外植體僅 用DMEM(黃色)或僅用50ng/ml ILl β (紫色)或用ILl β和ADi4S (藍色)處理72小時。 代謝產物I的劑量范圍為500-50-5μ g/ml。數據以釋放的放射性的百分比(6個培養(yǎng)孔的 平均值士標準差)進行表示，釋放的放射性的百分比=上清液放射性/(上清液放射性+ 外植體放射性)。將釋放的放射性的百分比用作GAG釋放的替代標記；(** :p < 0. 001)。圖2 4硫酸化N-乙酰半乳糖胺(GalNAc 4S)對ILl β -誘導的GAG釋放的作用。 負載放射性后，將軟骨外植體僅用DMEM(黃色)或僅用50ng/mlILl β (紫色)或用ILl β 和GalNac 4S (藍色)處理72小時。GalNac 4S的劑量范圍為500-50_5 μ g/ml。數據以 釋放的放射性的百分比(6個培養(yǎng)孔的平均值士標準差)進行表示，釋放的放射性的百分 比=上清液放射性/ (上清液放射性+外植體放射性)。將釋放的放射性的百分比用作GAG 釋放的替代標記。GalNac 4S對GAG釋放無作用。圖3 Δ di4S對ILl β -誘導的NO產生的作用。將軟骨外植體僅用DMEM(黃色) 或僅用50ng/ml ILl β (紅色)或用ILl β和ADi4S (藍色)處理72小時。Δ di4S的劑量 范圍為500-50-5μ g/ml。數據以上清液中NO的量(uM)除以外植體中DNA的量(ng/ml) 表示，(6個培養(yǎng)孔的平均值士標準差；** :p < 0. 001)圖4 所顯示的為特別優(yōu)選的本發(fā)明的硫酸軟骨素，即4-硫酸化不飽和二糖硫酸 軟骨素(AdiAS) (C4S)、6-硫酸化不飽和二糖硫酸軟骨素(AdieS) (C6S)和非硫酸化的不 飽和二糖硫酸軟骨素(Δ diOS) (COS)實施例骨關 節(jié)炎是一種特征在于關節(jié)軟骨緩慢破壞的疾病。這種軟骨破壞是由于軟骨細 胞的合成代謝和分解代謝活性之間的不平衡造成的。軟骨細胞是存在于軟骨中的獨特的細 胞類型，其負責維持軟骨細胞外基質。在骨關節(jié)炎中，分解代謝增加，其引起軟骨流失。軟 骨的細胞外基質由2種主要分子組成11型膠原和軟骨聚集蛋白聚糖。而膠原主要是由基 質金屬蛋白酶(MMP)進行消化的，軟骨聚集蛋白聚糖則能夠被MMP和另一類稱為軟骨聚集 蛋白聚糖酶的酶降解。在此研究正常商購的硫酸軟骨素和不同低分子量形式的硫酸軟骨素(包括二糖 類)能否在關節(jié)軟骨的培養(yǎng)外植體中抑制軟骨聚集蛋白聚糖的降解。將源自健康牛關節(jié)軟 骨的外植體置于培養(yǎng)物中，并負載S35。S35被引入到軟骨的軟骨聚集蛋白聚糖分子中的糖胺 聚糖鏈上，并將它在培養(yǎng)基中的釋放看作糖胺聚糖釋放和軟骨聚集蛋白聚糖分解代謝的替 代標記。然而，源自健康牛關節(jié)軟骨的外植體本來顯示極低的分解代謝活性，因此其對于測 試潛在生物活性劑的抗分解代謝活性是不太理想的。為了提高試驗的敏感性，在ILl β (促 炎細胞因子，已知作為MMP和軟骨聚集蛋白聚糖酶活性的強效誘導劑)的存在下培養(yǎng)外植 體。將不同的分子量形式的硫酸軟骨素和ILl β —起加入到培養(yǎng)基中，觀察它們是否可以 降低ILl β _誘導的軟骨聚集蛋白聚糖分解代謝。此外，還研究了低分子量形式的硫酸軟骨 素對ILl β -誘導的NO產生的作用。一氧化氮為已知參加骨關節(jié)炎發(fā)展的活性氧。實驗步驟將關節(jié)軟骨外植體從老牛(8-10歲)的掌指關節(jié)解剖出來。將足上的皮膚除去。 橫向打開關節(jié)。橫切關節(jié)內的韌帶。將軟骨的全厚切片解剖出來，將其置入含有補充有20% FBS(胎牛血清白蛋白)和抗生素(青霉素、鏈霉素和慶大霉素)的DMEM的陪替(Petri) 培養(yǎng)皿中。在通風柜中，將相似數量的軟骨分配在每孔含有500μ 1培養(yǎng)基(DMEM+20% FBS、1%青霉素/鏈霉素、0. 慶大霉素)的24孔板的各孔中。最后，將板置于培養(yǎng)箱中 (37 0C /5% CO2)。在它們收獲后5天，將外植體分至5個不同的處理條件1-陰性對照孔中僅含有培養(yǎng)基。2-陽性刺激對照將白細胞介素1 β (ILl β )以50ng/ml的濃度加入到培養(yǎng)基中。 這種細胞因子用來刺激分解代謝和誘導炎癥。3/4/5-測試化合物這些條件測試在ILl β存在下三種濃度的硫酸軟骨素代謝產 物的作用。外植體在培養(yǎng)箱(37°C ,5% CO2)中進行這些處理，處理72小時。下列方案基于Campbell 等人，Arch Biochem Biophys 234(1) 275-289 和 Hascall VC 等人，Arch Biochem Biophys 224(1) :206_223。外植體收獲后 48 小時，將硫 35(35S)加入到培養(yǎng)基中，以將其結合到外植體的細胞外基質內新合成的多硫酸化葡糖氨 基聚糖類中。72小時后，進行數次洗滌以消除未結合的放射性。然后將外植體處理72小 時，此后，收集上清液，并用粒子計數器測量培養(yǎng)基中釋放的放射性的量，作為GAG分解 代謝的標記。也測量了在外植體中存在的放射性，并用其來標準化釋放到培養(yǎng)基中的放射 性的量。放射性以DPM(每分鐘降解)來表示，通過下面公式評估GAG釋放
GAG釋放=上清液中的放射性/(上清液中的放射性+外植體中的放射性)對于NO 的測量，使用基于 Gilliam 等人，Anal Biochem 212(2) :359_365 的方案。 簡短而言，將50 μ 1培養(yǎng)物上清液(SN)與等體積的磺胺溶液(在磷酸中的)在96孔板中 混合。隨后，將50 μ 1萘基-乙二胺(Naphtyl-ethylene-diamine)溶液加入到各孔中。10 分鐘后，在538nm下測定吸收度。為了定量上清液中的NO 的量，使用亞硝酸鈉(0_60 μ M) 制作標準曲線。結果50ng/ml白細胞介素1 β (ILl β )的刺激，使培養(yǎng)基中的基礎GAG釋放增加 到1.8-4(平均值=2.5，中位值=2.53)倍。與單用ILl β相比，濃度為500 μ g/ml的 Δ UA->GalNAc 4S ( Δ Di4S)在4個獨立試驗中顯著(ρ < 0. 05)降低上清液中的釋放的GAG 的量(參見圖1中一個代表性試驗的結果)。在結構上與AdiAS密切相關的其它糖類在相 同的濃度下沒有這些作用(參見圖2和表1)。50ng/ml ILl β的刺激使培養(yǎng)基中NO的生成增加到2. 9-190 (平均值=39. 64，中 位值=24.98)倍。與單用ILl β相比，濃度為500yg/ml的AUA—>GalNAc 4S在4個獨 立試驗中顯著(P < 0. 05)降低上清液中NO的量(參見圖3，4個試驗中的1個代表性實驗 中獲得的結果)。相反，在結構上與AdiAS密切相關的其它糖類，在相同的濃度下，對該參 數無作用(數據未顯示)。表1:就糖胺聚糖釋放(DPM)來講，低分子量形式的硫酸軟骨素(劑量范圍 500-50-5 μ g/ml)抑制ILl β的刺激作用的百分比。注意負數表示ILl β刺激作用的放大。
權利要求
1.不飽和二糖硫酸軟骨素在制備用于形成、保護和/或修復結締組織的組合物中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中硫酸化的不飽和二糖硫酸軟骨素選自4-硫酸化不飽和 二糖硫酸軟骨素(Adi4S)、6_硫酸化不飽和二糖硫酸軟骨素(Adi6S)和非硫酸化的不飽 和二糖硫酸軟骨素(Δ diOS)。
3.根據前述權利要求之一的用途，其中組合物為藥物組合物、食物產品、飲料、食品補 充劑和/或營養(yǎng)食品，并尤其是選自基于奶粉的產品；速溶飲料；方便飲料制品；營養(yǎng)粉； 基于奶的產品，特別是酸乳酪或冰淇淋；谷類制品；餅干；壓縮干糧；飲料；水；咖啡；熱牛 奶咖啡；茶；果汁；麥芽飲料；巧克力調味的飲料；烹調用制品；湯；糖果制品；巧克力；局部 用乳膏劑、栓劑、片劑、糖漿劑和經皮施用的制劑。
4.用于治療或預防結締組織疾病的根據前述權利要求之一的用途。
5.用于治療或預防骨關節(jié)炎或類風濕性關節(jié)炎和/或其癥狀的根據前述權利要求之 一的用途。
6.用于治療或預防皮膚老化體征例如皺紋的出現的根據前述權利要求之一的用途。
7.用于平衡軟骨細胞的合成代謝和分解代謝活性的根據前述權利要求之一的用途。
8.用于減緩或停止軟骨破壞特別是關節(jié)軟骨破壞的根據前述權利要求之一的用途。
9.用于緩解疼痛的根據前述權利要求之一的用途。
10.用于改善活動性特別是改善關節(jié)功能的根據前述權利要求之一的用途。
11.根據前述權利要求之一的用途，其中組合物進一步包含軟骨聚集蛋白聚糖、膠原、 硫酸軟骨素和/或葡糖胺或其部分。
12.根據前述權利要求之一的用途，其中組合物進一步包含軟骨聚集蛋白聚糖酶抑制 劑或基質金屬蛋白酶抑制劑。
13.根據前述權利要求之一的用途，其中組合物進一步包含疼痛解除劑、穩(wěn)定劑、矯味 齊U、著色劑、潤滑劑、抗炎劑、血管發(fā)生抑制劑、軟骨保護劑、抗骨質吸收劑和/或增加骨形 成的藥物。
14.根據前述權利要求之一的用途，其中組合物預期用于人類特別是嬰兒、兒童、青少 年、成人和/或老人，或用于寵物。
15.根據前述權利要求之一的用途，其中4-硫酸化不飽和硫酸軟骨素以大約 lOOng-lg/g干組合物質量的量存在于組合物中，和/或以每日大約Ing-lOOmg/kg待治療的 個體體重的量施用。
全文摘要
本發(fā)明一般性地涉及結締組織的保護和修復。具體來說，本發(fā)明涉及硫酸軟骨素及其衍生物在結締組織保護和修復中的用途。本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現不飽和二糖硫酸軟骨素能夠用于制備用來形成、保護和/或修復結締組織的組合物。這使得其能夠例如用來有效地治療或預防骨關節(jié)炎或類風濕性關節(jié)炎和/或其癥狀，以及用來有效地治療或預防皮膚老化的體征諸如皺紋的出現。
文檔編號A61K31/7016GK102046182SQ200980120256
公開日2011年5月4日 申請日期2009年3月26日 優(yōu)先權日2008年4月2日
發(fā)明者D·提索-法福爾, L·阿梅耶, S·奧斯汀 申請人:雀巢產品技術援助有限公司