專利名稱:用于治療β-淀粉樣變的化合物的制作方法
用于治療β-淀粉樣變的化合物本發(fā)明涉及模擬表位用于預(yù)防,治療和診斷與β-淀粉樣蛋白形成和/或聚集 (β-淀粉樣變)有關(guān)的疾病的用途。各種變性性疾病的特征在于特定蛋白質(zhì)的異常聚合和累積。這些所謂的蛋白病 (proteopathy)包括神經(jīng)學(xué)病癥諸如阿爾茨海默氏病,帕金森氏病和亨廷頓氏病以及不同 的系統(tǒng)包括淀粉樣變。本發(fā)明涉及在術(shù)語“β_淀粉樣變”之下概括的淀粉樣蛋白蛋白 質(zhì)有關(guān)的蛋白病的預(yù)防,治療和診斷。淀粉樣變的最突出形式是阿爾茨海默氏病(AD)。 其它例子包括但不限于具有Lewy小體的癡呆和唐氏綜合征中的癡呆。AD的特征在于細(xì)胞外淀粉狀蛋白斑的異常累積一與廣泛的星形細(xì)胞增多和微觀 神經(jīng)膠質(zhì)增多(microgliosis)以及神經(jīng)元營養(yǎng)不良(dystrophicneurons)和神經(jīng)元損失 密切相關(guān)。這些淀粉狀蛋白斑主要由淀粉樣蛋白(Αβ)肽Αβ40和Αβ42組成,其衍生 自在神經(jīng)系統(tǒng)中的多種細(xì)胞類型上表達(dá)的淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)。Αβ肽被認(rèn)為是直 接涉及AD的發(fā)病和進(jìn)展。APP在正常情況中通過兩個切割步驟來加工,形成當(dāng)前已知形式的 Αβ χ-40/42/43。第一次切割由所謂的β _位點(diǎn)APP切割酶1和2(BACE1和BACE2)實(shí)施; 第二個蛋白水解步驟由Y-分泌酶復(fù)合物實(shí)施(見綜述De Strooper et al. JCell Sci 113(2000) :1857-1870)。BACE酶識別假定A β肽的N端部分中的兩個位點(diǎn)BACE與APP的第一相互作用導(dǎo) 致序列DAEFR(Ai3中位置1)處的切割和Aβ I-X形成?;蛘?,BACE也能在Αβ內(nèi)位置11處 切割,產(chǎn)生片段11-Χ。如此,BACE介導(dǎo)的APP加工創(chuàng)建多種不同Αβ種類,主要成分為全長 A β 1-40/42。Y-分泌酶活性導(dǎo)致3種主要片段生成Αβ 1-40/42/43。一旦這些肽生成,它 們就被氨肽酶進(jìn)一步加工,導(dǎo)致它們后續(xù)的逐步降解。這些進(jìn)一步的步驟分別導(dǎo)致其它形 式像例如Αβ 3-40/42形成。在人中,平均60-85%的淀粉狀蛋白斑材料由N端截短的和常 常修飾的A β 40/42衍生物形成。N端截短的A β種類的相對量關(guān)于A β水平,突變和BACE 活性是多變的。最豐富的截短形式的Αβ是Αβ 3-40/42和Αβ 11-40/42。這兩種肽都含有N端谷 氨酸殘基,它常常被酶促修飾成焦谷氨酸,分別導(dǎo)致A β 3 (ρΕ) -40/42和A β 11 (ρΕ) -40/42 形成。因?yàn)棣ˇ?(ρΕ)和11(ρΕ)肽的氨基末端被內(nèi)部內(nèi)酰胺所封閉,所以它受到保護(hù)免于 焦谷氨酸特異性氨肽酶以外的氨肽酶的蛋白水解作用且能如此在組織中保持穩(wěn)定。N端截短的修飾的淀粉樣蛋白的最突出形式是由肽3 (ρΕ) -40/42形成的,認(rèn)為占 到所有截短形式的多達(dá)50%。這意味著這種同等型(isoform)占AD腦中所有淀粉樣蛋 白肽的25-40%。截短的Αβ肽的另一種突出形式是Αβ 11-40/42 :Naslund等人和Huse 等人能證明在AD患者的人腦中以及在AD的亞臨床(infra-clinical)患者中能檢測到顯 著水平的這些截短種類。另外,這些肽經(jīng)歷分子內(nèi)脫水并形成穩(wěn)定(PE)形式,后果與關(guān)于 3 (ρΕ)-40/42所述相似。先前顯示了截短的和修飾的肽在神經(jīng)組織中比全長Αβ要更穩(wěn)定。另外,N端截短 形式的Αβ比未修飾的Αβ肽更能生成淀粉樣蛋白,如此提高斑形成的速率,而且還在應(yīng)用于培養(yǎng)的神經(jīng)元時以及在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯示神經(jīng)毒性活性。截短形式的Αβ早就能在AD早 期階段中A β的彌漫性聚集中檢測到,而且可能涉及早期斑形成,在體內(nèi)起各種子的作用。有令人信服的證據(jù)表明N端截短的Αβ種類的存在與散發(fā)性和家族性阿爾茨海默 氏病以及唐氏綜合征患者中神經(jīng)變性的早期發(fā)作和嚴(yán)重性升高有關(guān)。這些肽的聚集效應(yīng)與 升高的穩(wěn)定性一起使得它們成為AD發(fā)生中一個潛在的危險因素。對患有家族性AD或唐氏 綜合征的亞臨床患者的分析清楚地顯示了在疾病的最早階段(也稱作“種子”階段)期間 能檢測到A β 3 (ρΕ) -42。此時,檢測不到神經(jīng)學(xué)癥狀或只能檢測到次要的神經(jīng)學(xué)病癥,盡管 攜帶Αβ3(ρΕ)-42肽種類的斑開始累積。如此,來自此類患者的數(shù)據(jù)暗示截短的Αβ種類 的早期形成與疾病發(fā)作以及進(jìn)展之間的聯(lián)系。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn),降低AD患者中這些肽種類的量以改變疾病進(jìn)展及降低毒性和伴 隨的認(rèn)知衰退似乎是重要的。一種最佳的AD疫苗應(yīng)當(dāng)如此在不干擾APP信號傳導(dǎo)的生理 功能(特別是sAPPa的功能)的情況中引發(fā)如下的免疫應(yīng)答,其能夠靶向AD患者的腦中 存在的最突出形式的Αβ肽。確實(shí),在AD的動物模型中,使用針對全長Αβ的主動和被動免疫接種策略的免疫 治療性處理導(dǎo)致Αβ斑縮小/減少,而且對疾病進(jìn)展具有有益影響。在AD的小鼠模型中 進(jìn)行的被動免疫接種實(shí)驗(yàn)清楚地顯示了特異性針對A β 40/42的N和C末端的抗體能夠降 低腦中的斑負(fù)荷,而且還改善處理動物的認(rèn)知功能,如根據(jù)行為分析所判斷的。通過在小鼠 中使用不同辦法來誘導(dǎo)針對Αβ 40/42的免疫應(yīng)答,在主動免疫接種實(shí)驗(yàn)中得到了類似的 觀察結(jié)果。所有這些辦法使用全長A β 40/42或含有A β天然序列的片段,而且大多降低轉(zhuǎn) 基因小鼠模型中的淀粉樣蛋白負(fù)荷。重要的是,這些動物還顯示出改善的認(rèn)知功能。驚人 的是,Lemere等人(Am J Pathol 165(2004) =283-297)能在非人靈長類動物中重現(xiàn)這些結(jié) 果,其顯示斑沉積及相關(guān)病理響應(yīng)全長Aβ的主動免疫接種而清楚地減輕。然而,由于嚴(yán)重 的神經(jīng)炎癥副作用,包括自身反應(yīng)性T細(xì)胞的腦浸潤,使用全長A β 42作為抗原在AD患者 中進(jìn)行的第一次IIa期臨床免疫接種試驗(yàn)不得不停止。不過,調(diào)查在用ΑΝ-1792處理的患 者中的臨床效果的研究揭示,發(fā)生了針對Αβ 42的抗體應(yīng)答但沒有遭受腦膜腦炎的患者在 認(rèn)識測試中表現(xiàn)比不響應(yīng)的患者要好,指示免疫療法會是AD的非常有用治療辦法。最重要的是,最近自分析接受過ΑΝ1792免疫接種的患者尸檢案例獲得的結(jié)果顯 示了全長Αβ種類自腦清除,但是N端截短形式的Αβ得到維持。這強(qiáng)調(diào)靶向全長Αβ以 及N端截短和修飾形式的這種分子的新疫苗發(fā)明的必要性。在人中誘導(dǎo)針對A β 40/42肽的免疫應(yīng)答會干預(yù)AD患者中的認(rèn)知衰退,但是安全 的阿爾茨海默氏病疫苗必須避免自身反應(yīng)性T細(xì)胞形成。使用天然Aβ 40/42肽或其片段 的免疫接種遭受在患者中誘導(dǎo)自身免疫性疾病的內(nèi)在風(fēng)險,因?yàn)槊庖邞?yīng)答不能專一地靶向 Αβ。本發(fā)明的一個目的是提供可用于治療和/或預(yù)防β -淀粉樣變包括阿爾茨海默氏 病的化合物和藥物。這些化合物應(yīng)當(dāng)在給個體施用時不顯示誘導(dǎo)自身免疫性疾病的風(fēng)險或 顯示顯著降低的誘導(dǎo)自身免疫性疾病的風(fēng)險。依照本發(fā)明的另一個目的,所述化合物可以 在個體體內(nèi)誘導(dǎo)形成針對截短和/或穩(wěn)定形式的Αβ (它們通常是淀粉樣蛋白沉積物的主 要成分)的抗體。因此,本發(fā)明涉及至少一種包含下述氨基酸序列的化合物在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療淀粉樣變的藥物中的用途,X1RX2DX3 (X4) n (X5) m (X6) 0 (式 I),其中X1為異亮氨酸(I)或纈氨酸(V),X2為色氨酸(W)或酪氨酸⑴,X3為蘇氨酸⑴,纈氨酸(V),丙氨酸㈧,甲硫氨酸(M),谷氨酰胺(Q)或甘氨酸 (G), X4為脯氨酸⑵,丙氨酸㈧,酪氨酸⑴,絲氨酸⑶,半胱氨酸(C)或甘氨酸(G),X5為脯氨酸⑵,亮氨酸(L),甘氨酸(G)或半胱氨酸(C),X6為半胱氨酸(C),n,m禾口 ο獨(dú)立地為0或1,所述化合物具有結(jié)合對包含氨基酸序列EFRHDSGY和/或pEFRHDSGY的淀粉樣蛋 白β肽(Αβ)表位特異性的抗體的能力。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)包含式I氨基酸序列的化合物能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)針對截短Αβ形式 ΑβρΕ3-40/42和Αβ 3-40/42的抗體形成。所形成的抗體能夠結(jié)合所述A β片段,導(dǎo)致Αβ
斑崩解。式I和II和本文中公開的所有其它肽分子模擬天然存在Αβ肽和變體 A β 1-40/42,A β ρΕ3-40/42, A β 3-40/42和A β 11-40/42,使得包含本文中公開的氨基酸序 列的化合物能夠誘導(dǎo)相應(yīng)抗體形成。本文中呈現(xiàn)的發(fā)明指如下的抗原,其不包含天然A β肽的序列且模擬通過諸如WO 2004/062556中記載的模擬表位檢測不到的新表位的結(jié)構(gòu)。此類基于模擬表位的AD疫苗因 此會誘導(dǎo)與本文所述病理A β分子廣泛起反應(yīng)但不與親本結(jié)構(gòu)像APP起反應(yīng)的抗體應(yīng)答。 另外,模擬表位不含有潛在的T細(xì)胞自身表位,而且避免誘導(dǎo)有害的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。如本文中使用的,“ β -淀粉樣變(amyloidoses) ”指以特定蛋白質(zhì)的異常聚合和 累積(所謂的蛋白病)為特征的多種變性性疾病。本發(fā)明涉及與術(shù)語淀粉樣變下總結(jié) 的β-淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)有關(guān)的蛋白病的預(yù)防,治療和診斷。淀粉樣變的最突出形式是 阿爾茨海默氏病(AD)。其它例子包括但不限于具有Lewy小體的癡呆和唐氏綜合征中的癡 呆。進(jìn)一步的例子是Lewy小體癡呆,肌炎,散發(fā)性包含體肌炎,具有淀粉樣變的遺傳性腦出 血(荷蘭型),大腦淀粉樣蛋白血管病,Αβ相關(guān)血管炎。依照本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案,“ β -淀粉樣變”為阿爾茨海默氏病。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案,所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序列的 肽IRWDTP(C),VRffDVYP(C),IRYDAPL(C),IRYDMAG(C),IRffDTSL(C),IRffDQP(C),IRffDG(C) 禾口 IRWDGG(C) ο本發(fā)明的特別優(yōu)選的化合物包含上文鑒定的氨基酸序列或由其組成,由此所述肽 的C末端可以包含或不包含半胱氨酸殘基(通過使用括號所指示的),使得得到的化合物可 以例如偶聯(lián)至載體分子。然而,當(dāng)然也有可能將半胱氨酸殘基連接至所述肽的N末端。依照本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案,所述氨基酸序列為IRWDTP(C), VRffDVYP(C),IRYDAPL(C)或 IRYDMAG(C)。本發(fā)明的另一個方面涉及至少一種包含下述氨基酸序列的化合物在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療β-淀粉樣變的藥物中的用途EX1WHX2X3(X4)n(X5)m (式 II),其中X1為纈氨酸(V),精氨酸(R)或亮氨酸(L),X2為精氨酸(R)或谷氨酸(E),X3為丙氨酸(A),組氨酸(H),賴氨酸(K),亮氨酸(L),酪氨酸(Y)或甘氨酸(G),X4為脯氨酸⑵,組氨酸(H),苯丙氨酸(F),谷氨酰胺(Q)或半胱氨酸(C)&為半胱氨酸(C),η和m獨(dú)立地為0或1,所述化合物具有結(jié)合對包含氨基酸序列EVHHQKL的淀粉樣蛋白β肽(Αβ )表位 特異性的抗體的能力。施用包含式II氨基酸序列的化合物引起針對截短Aβ形式Aβ 11-40/42的免疫應(yīng)答。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案,所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序 列的肽EVWHRHQ (C),ERffHEKH (C),EVffHRLQ (C),ELffHRYP (C),ELffHRAF (C),ELffHRA (C), EVffHRG(C), EVffHRH(C)禾口 ERWHEK(C),優(yōu)選 EVWHRHQ(C),ERffHEKH(C), EVffHRLQ(C), ELffHRYP(C)和 ELWHRAF(C)。本發(fā)明的另一個方面涉及至少一種包含選自下組的氨基酸序列的化合物在生產(chǎn) 用于預(yù)防和/或治療β -淀粉樣變的藥物中的用途=QDFRHY(C),SEFKHG(C),TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(C), SQFRHY (C), LMFRHN(C), SAFRHH (C), LPFRHG(C), SHFRHG(C), ILFRHG(C),QFKHDL(C),NffFPHP(C),EEFKYS(C),NELRHST(C),GEMRHQP(C),DTYFPRS(C), VELRHSR(C),YSMRHDA(C),AANYFPR(C),SPNQFRH(C),SSSFFPR(C),EDffFFffH(C),SAGSFRH(C), QVMRHHA(C),SEFSHSS(C),QPNLFYH(C),ELFKHHL(C),TLHEFRH(C),ATFRHSP(C),APMYFPH(C), TYFSHSL(C),HEPLFSH(C),SLMRHSS(C),EFLRHTL(C),ATPLFRH(C),QELKRYY(C),THTDFRH(C), LHIPFRH(C),NELFKHF(C),SQYFPRP(C),DEHPFRH(C),MLPFRHG(C),SAMRHSL(C),TPLMFffH(C), LQFKHST(C),ATFRHST(C),TGLMFKH(C),AEFSHWH(C),QSEFKHW(C),AEFMHSV(C),ADHDFRH(C), DGLLFKH(C),IGFRHDS(C),SNSEFRR(C),SELRHST(C),THMEFRR(C),EELRHSV(C),QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C),SNFRHSV(C),APIQFRH(C),AYFPHTS(C),NSSELRH(C),TEFRHKA(C),TSTEMWH(C), SQSYFKH(C),(C)SEFKH, SEFKH (C),(C)HEFRH和 HEFRH(C)。每一種化合物均能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)針對Aβ 1-40/42,Αβ ρΕ3_40/42和Αβ 3-40/42 的抗體形成。因此,這些化合物特別適合于治療和/或預(yù)防淀粉樣變,諸如AD,因?yàn)槭?用一種化合物導(dǎo)致能夠識別三種主要Aβ形式即Aβ 1-40/42,ΑβρΕ3-40/42和Αβ 3-40/42 的抗體形成。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案,所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序列 的肽或由其組成QDFRHY(C),SEFKHG (C),TSFRHG (C),TSVFRH(C),TPFRHT (C),SQFRHY (C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG (C), SHFRHG (C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NffFPHP (C), EEFKYS(C),SPNQFRH(C),TLHEFRH(C),THTDFRH(C),DEHPFRH(C),QSEFKHW(C),ADHDFRH(C), DGLLFKH (C),EELRHSV(C),TEFRHKA(C),(C)SEFKH, SEFKH (C),(C)HEFRH 和 HEFRH(C)優(yōu) 選 SEi7KHG (C),TSVFRH(C), SQFRHY (C),LMFRHN(C), ILFRHG(C),SPNQFRH (C),ELFKHHL (C),TLHEFRH(C),THTDFRH(C),DEHPFRH(C),QSEFKHW(C),ADHDFRH(C),YEFRHAQ(C),TEFRHKA(C)。本文中公開的氨基酸序列被認(rèn)為是包含氨基酸序列EFRHDSGY,pEFRHDSGY或 EVHHQKL&Ai3表位的模擬表位。依照本發(fā)明,術(shù)語“模擬表位(mimotope) ”指具有拓?fù)鋵W(xué) 與它所模擬的表位等同的構(gòu)象的分子。模擬表位結(jié)合抗體免疫特異性結(jié)合期望抗原的相同 抗原結(jié)合區(qū)。模擬表位會在宿主中引發(fā)免疫學(xué)應(yīng)答,其能與它所模擬的抗原起反應(yīng)。模擬 表位還可在涉及表位和結(jié)合所述表位的抗體的體外抑制測定法(例如ELISA抑制測定法) 中起它所模擬的表位的競爭物的作用。然而,本發(fā)明的模擬表位可不必在體外抑制測定法 中阻止或競爭它所模擬的表位的結(jié)合,盡管它能夠在給哺乳動物施用時誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng) 答。包含此類模擬表位(還有上文列出的那些)的本發(fā)明化合物具有避免形成自身反應(yīng)性 T細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn),因?yàn)榛衔锏碾木哂信c天然存在淀粉樣蛋白β肽的氨基酸序列不同的氨基 酸序列。如本文中使用的,術(shù)語“表位”指抗原受到特定抗體分子識別的免疫原性區(qū)。一般 而言,抗原會擁有一個或多個表位,每一個均能夠結(jié)合識別該特定表位的抗體。本發(fā)明的模擬表位可以通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法來合成生成,或是作為分 離的肽或作為另一肽或多肽的一部分?;蛘?,肽模擬表位可以在生成肽模擬表位的微生物 中生成,然后分離并(如果想要的話)進(jìn)一步純化。肽模擬表位可以在微生物諸如細(xì)菌,酵 母或真菌中,在真核細(xì)胞諸如哺乳動物或昆蟲細(xì)胞中,或在重組病毒載體諸如腺病毒,痘病 毒,皰疹病毒,Simliki森林病毒,桿狀病毒,噬菌體,辛德畢斯病毒或仙臺病毒中生成。用 于生成肽模擬表位的合適細(xì)菌包括大腸桿菌(E. coli),枯草桿菌(B. subtilis)或能夠表 達(dá)肽諸如肽模擬表位的任何其它細(xì)菌。用于表達(dá)肽模擬表位的合適酵母類型包括釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),假絲酵母屬 (Candida),巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)或能夠表達(dá)肽的任何其它酵母。相應(yīng)的 方法是本領(lǐng)域公知的。用于分離和純化重組生成的肽的方法也是本領(lǐng)域公知的,而且包括 例如凝膠過濾,親和層析,離子交換層析等。為了便于分離肽模擬表位,可生成融合多肽,其中肽模擬表位翻譯融合(共價連 接)至能夠通過親和層析來分離的異源多肽。典型的異源多肽為His標(biāo)簽(例如His6 ;6 個組氨酸殘基),GST標(biāo)簽(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)等。融合多肽不見便于純化模擬表位, 而且還能防止模擬表位多肽在純化期間被降解。如果想要在純化后除去異源多肽,那么融 合多肽可在肽模擬表位與異源多肽之間的接合處包含切割位點(diǎn)。切割位點(diǎn)由受到該位點(diǎn)處 的氨基酸序列特異性的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列組成。本發(fā)明的模擬表位還可在它們的N和/或C端處或附近修飾,使得在所述位置處 結(jié)合半胱氨酸殘基。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中,末端位置(位于肽的N和C端)的半胱氨 酸殘基用于經(jīng)二硫鍵來環(huán)化肽。半胱氨酸還可用于結(jié)合將別的分子(例如載體)結(jié)合至所 述肽/化合物。本發(fā)明的模擬表位還可用于各種測定法和試劑盒,特別是免疫學(xué)測定法和試劑 盒。因此,特別優(yōu)選的是,模擬表位可以是另一肽或多肽的一部分,特別是在免疫學(xué)測定法 中用作報告物的酶。此類報告酶包括例如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。依照本發(fā)明的模擬表位優(yōu)選是它們的氨基酸序列不同于Αβ或Αβ片段的氨基酸 序列的抗原性多肽。在這個方面,本發(fā)明的模擬表位可不僅包含一種或多種天然存在氨基酸殘基的氨基酸替代,而且還可包含一種或多種非天然氨基酸(即不是來自20種“經(jīng)典的” 氨基酸)的氨基酸替代或者它們可以完全由此類非天然氨基酸裝配而成。此外,本發(fā)明誘 導(dǎo)針對及結(jié)合Aβ 1-40/42, Aβ ρΕ3-40/42, Aβ 3-40/42和Αβ 11-40/42抗體的抗原可以由 D-氨基酸或L-氨基酸或DL-氨基酸的組合裝配而成,而且任選,它們可以通過進(jìn)一步修飾, 環(huán)閉合或衍生化而進(jìn)行了改變。合適的抗體誘導(dǎo)性抗原可以自商品化肽文庫提供。優(yōu)選的 是,這些肽為至少7個氨基酸,且優(yōu)選的長度可以長達(dá)16,優(yōu)選長達(dá)14或20個氨基酸(例 如5至16個氨基酸殘基)。依照本發(fā)明,然而,也可很好地采用更長的肽作為抗體誘導(dǎo)性抗 原。另外,本發(fā)明的模擬表位也可以是多肽的一部分,并因此在它們的N和/或C端包含至 少一個別的氨基酸殘基。為了制備本發(fā)明的模擬表位(即本文中公開的抗體誘導(dǎo)性抗原),當(dāng)然,噬菌體文 庫,肽文庫也是合適的,例如通過組合化學(xué)的手段生成的或通過用于最多變的結(jié)構(gòu)的高通 量篩選技術(shù)的手段獲得的(Display :A LaboratoryManual,Carlos F. Barbas等編;Willats WG, Phage display !practicalities andprospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec. ;50 (6) 837-54)。另外,依照本發(fā)明,也可采用基于核酸的抗A β 1-40/42,A β ρΕ3_40/42, Aβ 3-40/42和Αβ 11-40/42抗體誘導(dǎo)性抗原(“適體”),而且這些也可以用最多變的(寡 核苷酸)文庫(例如具有2-180個核酸殘基)(例如Burgstaller et al. ,Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5)(2002),690-700 ;Famulok et al.,Acc. Chem. Res. 33(2000),591-599 ; Mayer et al.,PNAS 98 (2001),4961-4965 ;等)找到。在基于核酸的抗體誘導(dǎo)性抗原中,核 酸主鏈可例如通過天然磷酸二酯化合物或也通過硫代磷酸酯或組合或化學(xué)變異(例如像 PNA)來提供,其中依照本發(fā)明可主要采用U,T,A,C,G,H和mC作為堿基??梢勒毡景l(fā)明使 用的核苷酸的2’ -殘基優(yōu)選為H,0H, F, Cl, NH2, 0-甲基,0-乙基,0-丙基或0-丁基,其中 核酸還可別不同的修飾,即例如用保護(hù)基團(tuán)修飾,就像它們通常在寡核苷酸合成中被采用 的。如此,基于適體的抗體誘導(dǎo)性抗原也是本發(fā)明范圍內(nèi)的優(yōu)選抗體誘導(dǎo)性抗原。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案,化合物偶聯(lián)至藥學(xué)可接受載體,優(yōu)選KLH(匙 孔蟲威血藍(lán)蛋白),破傷風(fēng)類毒素,清蛋白結(jié)合蛋白,牛血清清蛋白,樹狀聚物(MAP ;Biol. Chem. 358 581),肽接頭(或側(cè)翼區(qū))以及 Singh et al.,Nat. Biotech. 17(1999), 1075-1081 (特別是該文件表 1 中的那些),和 0' Hagan etal.,Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003),727-735 (特別是其中記載的內(nèi)源免疫強(qiáng)化性化合物和投遞系統(tǒng)) 中記載的佐劑物質(zhì),或其混合物。此語境中的偶聯(lián)化學(xué)(例如經(jīng)由異雙功能化合物,諸如 GMBS,當(dāng)然還有其它的,如 “Bioconjugate Techniques", Greg Τ. Hermanson 中記載的)可 選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的反應(yīng)。此外,疫苗組合物可以與佐劑,優(yōu)選低溶解度的鋁組合 物,特別是氫氧化鋁一起配制。當(dāng)然,也可以使用像MF59磷酸鋁,磷酸鈣,細(xì)胞因子(例如 IL-2,IL-12,GM-CSF),皂苷(例如QS21),MDP衍生物,CpG寡聚物,LPS, MPL,聚磷腈,乳狀 液(例如弗氏,SAF),脂質(zhì)體,病毒體,ISC0M,蝸形物(cochleates),PLG微粒,Poloxamer顆 粒,病毒樣顆粒,熱不穩(wěn)定腸毒素(LT),霍亂毒素(CT),突變體毒素(例如LTK63和LTR72), 微粒和/或聚合脂質(zhì)體這些佐劑。本發(fā)明的化合物優(yōu)選經(jīng)選自下組的接頭結(jié)合至載體或佐劑NHS-聚(氧化乙烯) (PEO)(例如NHS-PEO4-馬來酰亞胺)。
包含本發(fā)明化合物(模擬表位)和藥學(xué)可接受載體的疫苗可通過任何合適的應(yīng) 用模式(例如i.d.,i.v, i.p.,i.m.,鼻內(nèi),口服,皮下,等)及在任何合適的投遞裝置中 施用(0,Hagan et al. , Nature Reviews, Drug Discovery 2(9),(2003),727-735)。本 發(fā)明的化合物優(yōu)選為靜脈內(nèi),皮下,皮內(nèi)或肌肉內(nèi)施用而配制(參見例如“Handbook of Pharmaceutical ManufacturingFormulations,,,Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc,2004)o依照本發(fā)明的藥物(疫苗)以0. Ing至10mg,優(yōu)選IOng至lmg,特別是IOOng至 100 μ g,或者例如 IOOfmol 至 ΙΟμπιοΙ,優(yōu)選 IOpmol 至 lymol,特別是 IOOpmol 至 IOOnmol 的量含有依照本發(fā)明的化合物。典型地,疫苗還可含有輔助物質(zhì),例如緩沖劑、穩(wěn)定劑等。本發(fā)明的另一個方面涉及上文限定的化合物用于治療和/或改善突觸核蛋白病 (synucleopathy)癥狀的用途。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物還能用于治療和改善與突觸核蛋白病有關(guān)的癥 狀。淀粉樣變和突觸核蛋白病分別與β -淀粉樣蛋白和α -突觸核蛋白的大腦累積有 關(guān)。一些患者顯示這兩種疾病的臨床和病理特征,提出了致病途徑交疊的可能性。這些患 者還歸類為患有一種新鑒定的綜合征,其描述為具有Lewy小體的癡呆或具有癡呆的帕金 森氏病(DLB/PDD)。在一種最近的轉(zhuǎn)基因動物DLB/PDD模型中,顯示了 α-突觸核蛋白和淀 粉樣蛋白前體蛋白(hAPP) 二者在小鼠中的過表達(dá)導(dǎo)致認(rèn)知和運(yùn)動改變的發(fā)生,其伴有膽 堿能神經(jīng)元的損失和突觸囊泡的減少,廣泛淀粉狀蛋白斑的形成,和haSYN免疫反應(yīng)性神 經(jīng)元內(nèi)纖絲包含。所有這些特征也見于DLB/PDD綜合征。最近描述了這兩種分子潛在地能 夠在體外相互作用及形成雜合寡聚物。還顯示了 APP過表達(dá)能加劇α-突觸核蛋白過表達(dá) 的一些病理效應(yīng)。相反,α-突觸核蛋白能夠增強(qiáng)淀粉樣蛋白β肽的分泌和毒性,及因此 還能提高β -淀粉樣蛋白的效應(yīng),支持神經(jīng)變性過程中致病途徑交疊的想法。在這兩種蛋白病中,肽寡聚物的漸進(jìn)累積被鑒定為導(dǎo)致對于突觸核蛋白病或淀粉 樣變?nèi)我欢缘湫偷母鞣N改變的中樞毒性事件之一。盡管有這種機(jī)制相似性,假設(shè)α-突 觸核蛋白和Αβ對腦的完整性和功能具有不同的,以及趨同的致病效果。認(rèn)為突觸核蛋白 比認(rèn)知功能更嚴(yán)重地影響運(yùn)動功能,而淀粉樣蛋白β肽被描述為具有相反的影響。造成這 種差異的原因目前尚不清楚,也沒有對這兩種分子的相互依賴和影響的清楚描述。本發(fā)明中呈現(xiàn)的治療辦法描述了一種靶向Αβ的免疫療法,它會導(dǎo)致主要在細(xì)胞 內(nèi)的淀粉樣蛋白的清除。因此認(rèn)為它會減輕淀粉樣蛋白相關(guān)改變,范圍從斑沉積至神經(jīng)元 死亡以及至記憶問題和認(rèn)知衰退。然而,突觸核蛋白的亞細(xì)胞定位指示這些細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì) 主要在突觸處有活性,尤其局限于突觸囊泡。有趣的是,作為突觸核蛋白病的統(tǒng)一病理標(biāo) 志,突觸核蛋白累積也主要在細(xì)胞內(nèi)可檢測到。另外,認(rèn)為突觸核蛋白病的根本致病機(jī)制可 歸于神經(jīng)元內(nèi)變化,范圍從線粒體功能障礙,異常折疊的遍在蛋白化或磷酸化蛋白質(zhì)的累 積以及突觸核蛋白的累積。這些改變因此導(dǎo)致突觸功能的變化,突觸失效,和多巴胺能神經(jīng) 元損失和突觸核蛋白病的經(jīng)典臨床征候。相反,Αβ主要在神經(jīng)元外可檢測到,而且淀粉狀 蛋白斑以及纖絲,初原纖維和淀粉樣蛋白寡聚物在細(xì)胞外或大腦內(nèi)應(yīng)用時能發(fā)揮神經(jīng) 毒性功能。如此,主要影響導(dǎo)致下文描述的典型癥狀的細(xì)胞內(nèi)過程,主要靶向細(xì)胞外淀粉樣 蛋白的辦法會減輕突觸核蛋白病像PD的癥狀對于專家而言是一項(xiàng)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)。甚至 更加令人驚訝的是,當(dāng)前認(rèn)為這兩種分子的交疊效果是由應(yīng)主要存在于細(xì)胞內(nèi)的兩種蛋白
11質(zhì)的直接相互作用引起的。依照本發(fā)明,術(shù)語“突觸核蛋白病(synucleinopathy)”包括以 病理性突觸核蛋白聚集為特征的所有神經(jīng)變性性病癥。數(shù)種神經(jīng)變性性病癥,包括帕金森 氏病(PD),Lewy小體病(LBD),彌漫性Lewy小體病(DLBD),具有Lewy小體的癡呆(DLB), 具有癡呆的帕金森綜合征(PDD),多系統(tǒng)萎縮(MSA)和具有腦鐵累積的神經(jīng)變性I型(NBIA I型)共同分組為突觸核蛋白病。如本文中使用的,“突觸核蛋白病的癥狀”指那些影響患有所述疾病的患者的運(yùn)動 和非運(yùn)動行為的突觸核蛋白病(特別是帕金森氏病)癥狀?!斑\(yùn)動癥狀”包括靜止性震顫, 運(yùn)動徐緩,強(qiáng)直,體位不穩(wěn),彎腰體位,張力障礙,疲勞,細(xì)微運(yùn)動靈巧性和運(yùn)動協(xié)調(diào)受損,整 體運(yùn)動協(xié)調(diào)受損,運(yùn)動缺乏(擺臂縮小),靜坐不能,言語問題,諸如由肌肉控制缺失引起的 嗓音柔和或言語模糊,面部表情喪失,或“掩蔽”,寫字過小,吞咽困難,性功能障礙,流涎等。 “非運(yùn)動”癥狀包括疼痛,癡呆或意識錯亂,睡眠擾動,便秘,皮膚問題,抑郁,恐懼或焦慮,記 憶困難和思考緩慢,泌尿問題,疲勞和疼痛,能量損失,強(qiáng)迫行為,痛性痙攣等。依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案,突觸核蛋白病選自下組帕金森氏病,具有 Lewy小體的癡呆,多系統(tǒng)萎縮和具有腦鐵累積的神經(jīng)變性。特別優(yōu)選帕金森氏病。本發(fā)明的另一個方面涉及具有選自下組的氨基酸序列或由其組成的肽 IRffDTP(C), VRffDVYP (C), IRYDAPL (C), IRYDMAG (C), IRffDTSL (C), IRffDQP(C), IRffDG(C), IRffDGG (C),EVffHRHQ (C),ERffHEKH(C),EVffHRLQ (C),ELffHRYP (C),ELffHRAF (C),ELffHRA (C), EVffHRG (C), EVffHRH(C), ERffHEK (C), QDFRHY(C), SEFKHG(C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT (C), SQFRHY (C), LMFRHN(C), SAFRHH(C), LPFRHG (C), SHFRHG(C), ILFRHG(C), QFKHDL(C),NWFPHP(C),EEFKYS(C),NELRHST(C),GEMRHQP(C),DTYFPRS(C),VELRHSR(C), YSMRHDA(C),AANYFPR(C),SPNQFRH(C),SSSFFPR(C),EDffFFffH(C),SAGSFRH(C),QVMRHHA(C), SEFSHSS(C),QPNLFYH(C),ELFKHHL(C),TLHEFRH(C),ATFRHSP(C),APMYFPH(C),TYFSHSL(C), HEPLFSH(C),SLMRHSS(C),EFLRHTL(C),ATPLFRH(C),QELKRYY(C),THTDFRH(C),LHIPFRH(C), NELFKHF(C),SQYFPRP(C),DEHPFRH(C),MLPFRHG(C),SAMRHSL(C),TPLMFffH(C),LQFKHST(C), ATFRHST(C),TGLMFKH(C),AEFSHWH(C),QSEFKHW(C),AEFMHSV(C),ADHDFRH(C),DGLLFKH(C), IGFRHDS(C),SNSEFRR(C),SELRHST(C),THMEFRR(C),EELRHSV(C),QLFKHSP(C),YEFRHAQ(C), SNFRHSV(C),APIQFRH(C),AYFPHTS(C),NSSELRH(C),TEFRHKA(C),TSTEMWH(C),SQSYFKH(C), (C) SEFKH, SEFKH(C),(C)HEFRH和HEFRH(C)。如使用括號所指示的,本發(fā)明的肽可以包含 或不包含C或N末端處的半胱氨酸殘基。因此,本發(fā)明還涵蓋下面的氨基酸序列IRWDTP, VRffDVYP, IRYDAPL, IRYDMAG, IRffDTSL, IRffDQP, IRWDG,IRffDGG,EVffHRHQ, ERWHEKH, EVffHRLQ, ELffHRYP, ELffHRAF, ELffHRA, EVffHRG, EVffHRH, ERffHEK, QDFRHY, SEFKHG, TSFRHG, TSVFRH, TPFRHT, SQFRHY, LMFRHN, SAFRHH, LPFRHG, SHFRHG, ILFRHG, QFKHDL, NffFPHP, EEFKYS, NELRHST, GEMRHQP, DTYFPRS, VELRHSR, YSMRHDA, AANYFPR, SPNQFRH, SSSFFPR, EDWFFWH, SAGSFRH, QVMRHHA, SEFSHSS, QPNLFYH, ELFKHHL, TLHEFRH, ATFRHSP, APMYFPH, TYFSHSL, HEPLFSH, SLMRHSS, EFLRHTL, ATPLFRH, QELKRYY, THTDFRH, LHIPFRH, NELFKHF, SQYFPRP, DEHPFRH, MLPFRHG, SAMRHSL, TPLMFffH, LQFKHST, ATFRHST, TGLMFKH, AEFSHWH, QSEFKHW, AEFMHSV, ADHDFRH, DGLLFKH, IGFRHDS, SNSEFRR, SELRHST, THMEFRR, EELRHSV, QLFKHSP, YEFRHAQ, SNFRHSV, APIQFRH, AYFPHTS, NSSELRH, TEFRHKA, TSTEMWH, SQSYFKH, (C)SEFKH, SEFKH, HEFRH 和 HEFRH。
依照一個優(yōu)選的實(shí)施方案,所述肽偶聯(lián)至藥學(xué)可接受載體,優(yōu)選KLH(匙孔i威血藍(lán) 蛋白)。本發(fā)明的又一個方面涉及包含至少一種依照本發(fā)明的肽的藥物配制劑,優(yōu)選疫 苗。所述藥物配制劑可用于治療患有淀粉樣變包括阿爾茨海默氏病的個體或預(yù)防在個 體中形成Αβ斑以阻止淀粉樣變包括阿爾茨海默氏病的形成。本發(fā)明在下面的附圖和實(shí)施例中進(jìn)一步例示,然而,不限于此。
圖1顯示單克隆抗體MV-001對特定肽和重組蛋白的結(jié)合;圖2顯示單克隆抗體MV-003對特定肽和重組蛋白的結(jié)合;圖3顯示單克隆抗體MV-004對特定肽和重組蛋白的結(jié)合;圖4顯示用β-淀粉樣蛋白和N端截短的和/或翻譯后修飾的β-淀粉樣蛋白片 段的模擬表位進(jìn)行的典型結(jié)合測定法;圖5顯示用β-淀粉樣蛋白和N端截短的和/或翻譯后修飾的β-淀粉樣蛋白片 段的模擬表位進(jìn)行的典型抑制測定法;圖6顯示通過模擬表位免疫接種(注射的肽/無關(guān)的肽)引發(fā)的免疫應(yīng)答的體內(nèi) 表征的例子;圖7顯示通過針對淀粉樣蛋白β片段的模擬表位免疫接種引發(fā)的免疫應(yīng)答的體 內(nèi)表征的例子;圖8顯示通過針對全長A β 40/42的模擬表位免疫接種弓I發(fā)的免疫應(yīng)答的體內(nèi)表 征的例子圖9顯示被淀粉狀蛋白斑占據(jù)的面積。以一個月間隔通過s. c接種給Tg2576注射 6次以氫氧化鋁(ALUM)作為佐劑的模擬表位疫苗。對照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉狀 蛋白斑占據(jù)的面積顯示為對照組的百分比。Grl...對照組;Gr2...接受p4381 ;Gr3...接 受 p4390 ;Gr4...接受 p4715。圖10顯示被淀粉狀蛋白斑占據(jù)的面積。以一個月間隔通過8.(接種給182576注 射6次以氫氧化鋁(ALUM)作為佐劑的AFFIT0PE疫苗。對照小鼠只接受PBS-ALUM。被淀粉 狀蛋白斑占據(jù)的面積顯示為對照組的百分比。Grl...對照組;Gr2...接受p4395。
實(shí)施例方法用于依照下面的實(shí)施例的模擬表位鑒定的抗體檢測自人Αβ衍生的氨基酸序列 但不結(jié)合全長人APP。所檢測的序列包括EFRHDS ( = A β初始表位aa3_8),ρ (E) FRHDS (= 經(jīng)修飾的Aβ初始表位aa31),EVHHQK( = Αβ初始表位aall_16)??贵w可以是單克隆或 多克隆抗體制備物或其任何抗體部分或衍生物,唯一的先決條件在于抗體分子特異性識別 至少一種上文所述(自人A β衍生的)表位,但不結(jié)合全長人ΑΡΡ。用此類單克隆抗體和肽文庫鑒定并進(jìn)一步表征模擬表位。實(shí)施例1 生成單克隆抗體,以特異性檢測β -淀粉樣蛋白和N端截短的和/或翻 譯后修飾的淀粉樣蛋白片段實(shí)施例Ia 單克隆抗體MV-001的生成生成了自實(shí)驗(yàn)Alz-5的融合物衍生的單克隆抗體。在實(shí)驗(yàn)Alz-5中,給C57/B16小鼠重復(fù)免疫接種偶聯(lián)至KLH(匙孔i威血藍(lán)蛋白)和作為佐劑的Alum(氫氧化鋁)的初始Αβ 表位DAEFRHDSGYC。通過ELISA (經(jīng)ρ 1253和ρ4371肽包被的ELISA板)來檢測ρ4371肽特 異性抗體生成型雜交瘤。人Αβ 40/42(重組蛋白)用作陽性對照肽包括識別在ELISA板上 固定化的重組蛋白的雜交瘤,因?yàn)樗鼈兲禺愋越Y(jié)合肽和全長Αβ 二者。?1妨4(人々0 33-40) 用作陰性對照肽。另外,針對Ρ4373測試雜交瘤。只有沒有ρ4373結(jié)合或具有有限ρ4373 結(jié)合的雜交瘤用于進(jìn)一步的抗體開發(fā)。純化雜交瘤克隆(MV-00K內(nèi)部名稱824 ;IgGl)并分別分析對pl253,p4371, p4373,pl4M和Αβ的特異性檢測。MV-001在ELISA中識別注射的表位(ρ1253)以及特定 表位(ρ4371)和全長 A β 蛋白(重組蛋白;得自 Bachem AG, Bubendorf, Switzerland) 然 而,它在ELISA中不檢測pl454。另外,MV-001抗體基本上不能檢測編碼A β 3_10的焦谷氨 酸型式的肽Ρ4373 (滴度比初始表位低30倍)。實(shí)施例Ib 單克隆抗體MV-003的生成生成了自實(shí)驗(yàn)Alz-16的融合物衍生的單克隆抗體。在實(shí)驗(yàn)Alz-16中,給BalbC 小鼠重復(fù)免疫接種偶聯(lián)至KLH(匙孔i威血藍(lán)蛋白)和作為佐劑的Alum(氫氧化鋁)的表位 P (E) FRHDSC (p4373)。通過ELISA (經(jīng)p4373肽包被的ELISA板)來檢測p4373肽特異性抗 體生成型雜交瘤。pl253,pl4M和Αβ 40/42用作陰性對照肽。另外,針對ρ4371測試雜交 瘤。只有沒有Ρ4371結(jié)合或具有有限Ρ4371結(jié)合的雜交瘤用于進(jìn)一步的抗體開發(fā)以保證焦 谷氨酸特異性。純化雜交瘤克隆(MV-003(內(nèi)部名稱DU9 ;IgGl)并分別分析對pl253,p4371, p4373,pl4M和Αβ的特異性檢測。MV-003在ELISA中識別注射的表位(ρ4373)但不能檢 測口1妨4力1253或全長八3蛋白(重組蛋白;得自BachemAG,Bubendorf,Switzerland)。另 外,MV-003抗體不能檢測編碼A β 3-10的正常型式的肽p4371 (滴度比初始表位低15倍)。實(shí)施例Ic 單克隆抗體MV-004的生成生成了自實(shí)驗(yàn)Alz-15的融合物衍生的單克隆抗體。在實(shí)驗(yàn)Alz-15中,給BalbC 小鼠重復(fù)免疫接種偶聯(lián)至KLH(匙孔i威血藍(lán)蛋白)和作為佐劑的Alum(氫氧化鋁)的表 位EVHHQKC (p4372)。通過ELISA (經(jīng)p4372肽包被的ELISA板)來檢測p4372肽特異性抗 體生成型雜交瘤。P4376,p4378,pl4M和A β 40/42用作陰性對照肽。只有沒有ρ4376和 Ρ4378結(jié)合或具有有限ρ4376和ρ4378結(jié)合的雜交瘤用于進(jìn)一步的抗體開發(fā)以保證針對位 置aall處游離N末端的特異性。純化雜交瘤克隆(MV-004(內(nèi)部名稱B204 ;IgGl)并分別分析對p4372,p4376, P4378, pl4M和Αβ的特異性檢測。MV-004在ELISA中識別注射的表位(p4372)但不能 檢測pl454,p4376和p4378以及全長A β蛋白(重組蛋白;得自Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)。不能檢測p4376,p4378證明了對截短的A β中位置aall處游離N末端的 特異性。實(shí)施例2 噬菌體展示,體外結(jié)合和抑制ELISA此實(shí)施例中使用的噬菌體展示文庫為Ph. D. 7 =New England BioLabsE8102L (線性 7聚物文庫)。依照制造商的方案(www.neb.com)進(jìn)行噬菌體展示。2或3個后續(xù)輪次的淘選后,挑取單個噬菌體克隆,在包被了淘選過程所用抗體的板上對噬菌體上清液進(jìn)行ELISA。對在此ELISA中呈陽性(對靶物的信號強(qiáng),但對非特異性 對照無信號)的噬菌體克隆測序。根據(jù)DNA序列,推導(dǎo)肽序列。合成這些肽并在結(jié)合和抑 制ELISA中表征。另外,將所述篩選中鑒定出的模擬表位的序列信息組合,創(chuàng)建了一些新模 擬表位,以便鑒定用于模擬表位免疫接種的共有序列。1.體外結(jié)合測定法(ELISA)將自噬菌體展示衍生的肽及其變體偶聯(lián)至BSA并結(jié)合至ELISA板(1 μ M ;如各圖 中指示的)并隨后與用于篩選過程的單克隆抗體一起溫育以分析所鑒定的肽的結(jié)合能力。2.體外抑制測定法(ELISA)將不同量的自噬菌體展示衍生的肽(濃度范圍1(^8至0.0848;連續(xù)稀釋)與 用于篩選過程的單克隆抗體一起溫育。降低后續(xù)的抗體對ELISA板上包被的初始表位的結(jié) 合的肽被認(rèn)為是在此測定法中是抑制性的。實(shí)施例3 體內(nèi)測試模擬表位分析免疫原性和交叉反應(yīng)性1.對模擬表位的體內(nèi)測試將抑制性以及非抑制性肽偶聯(lián)至KLH并與適宜的佐劑(氫氧化鋁)一起注射入小 鼠(野生型C57/B16小鼠;皮下注射入體側(cè))。以兩周間隔給動物免疫接種3-6次并兩周 一次采集血清。用每一份血清測定對注射的肽以及對無關(guān)肽的滴度。另外,分別測定針對 重組人Αβ蛋白和針對初始肽的滴度。一般而言,通過針對在ELISA板上固定化的肽(偶 聯(lián)至牛血清清蛋白(BSA))和重組全長蛋白的反應(yīng)來分析血清。使用抗小鼠IgG特異性抗 體來測定滴度。關(guān)于詳細(xì)的結(jié)果,分別見圖6,7和8。2.結(jié)果2. 1.針對N端截短的和修飾形式的A β的特異性單克隆抗體(mAB)的鑒定圖1描繪自實(shí)驗(yàn)Alz-5衍生的單克隆抗體MV-001 (內(nèi)部名稱824 ;IgGl)的表征, 證明了對全長A β和在位置Ε3處截短的A β的特異性。圖2描繪自實(shí)驗(yàn)Alz-16衍生的單克隆抗體MV_003(內(nèi)部名稱DU9 ;IgGl)的表 征,證明了對在位置P (E) 3處截短和翻譯后修飾的A β的特異性。圖3描繪自實(shí)驗(yàn)Alz-15衍生的單克隆抗體MV-004(內(nèi)部名稱Β204 ;IgGl)的表 征,證明了對在位置Ell處截短的Αβ的特異性。2.2.針對N端截短的和修飾形式的A β的特異性mAB的篩選2. 2. 1.噬菌體展示文庫Ph. D. 72. 2. 1. 1.針對p4373的單克隆抗體的篩選在此篩選中通過篩選W1D 7噬菌體展示文庫鑒定了 8種序列。表IA總結(jié)了所鑒 定的肽及其與初始表位相比的結(jié)合能力。2. 2. 1. 2.針對p4372的單克隆抗體的篩選在此篩選中通過篩選W1D 7噬菌體展示文庫鑒定了 9種序列。表IB總結(jié)了所鑒 定的肽及其與初始表位相比的結(jié)合能力。2. 2. 1. 3.針對p4371的單克隆抗體的篩選在此篩選中通過篩選WiD 7和WiD 12噬菌體展示文庫鑒定了 71種序列。表IC總結(jié)了所鑒定的肽及其與初始表位相比的結(jié)合能力。表IA 結(jié)合親本抗體MV-003的模擬表位
內(nèi)部肽編號SEQ ID No.序列結(jié)合能力p43951IRWDTPC2p43962VRWDVYPC1p43973IRYDAPLC1p43994IRYDMAGC1p47285IRWDTSLC3p47566IRWDQPC3p47927IRWDGC1p47938IRWDGGC2對表IA的說明結(jié)合能力用下面的結(jié)合代碼編碼1 :X描述親本AB的稀釋因子。
結(jié)合代碼OD半最大1 :X0無結(jié)合01弱結(jié)合< 160002中等結(jié)合:16-600003強(qiáng)結(jié)合> 60000表IB 結(jié)合親本抗體MV-004的模擬表位
內(nèi)部肽編號SEQ ID No.序列結(jié)合能力p44179EVWHRHQC2p441810ERWHEKHC3p441911EVWHRLQC3p442012ELWHRYPC2p466513ELWHRAFC2p478614ELWHRAC權(quán)利要求
1.至少一種包含選自下組的氨基酸序列的化合物在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療β-淀 粉樣變的藥物中的用途SEFKHG (C),TLHEFRH (C),ILFRHG (C),TSVFRH (C),SQFRHY (C), LMFRHN(C),SPNQFRH(C),ELi7KHHL(C),THTDFRH(C),DEHPFRH(C),QSEFKHW(C),ADHDFRH(C), YEFRHAQ(C)和 TEFRHKA(C)。
2.至少一種包含下述氨基酸序列的化合物在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療淀粉樣變的 藥物中的用途X1RX2DX3(X4)n(X5)m(X6)0 (式 I), 其中X1為異亮氨酸(I)或纈氨酸(V), X2為色氨酸(W)或酪氨酸⑴,X3為蘇氨酸⑴,纈氨酸(V),丙氨酸㈧,甲硫氨酸(M),谷氨酰胺(Q)或甘氨酸(G), X4為脯氨酸(P),丙氨酸(A),酪氨酸(Y),絲氨酸(S),半胱氨酸(C)或甘氨酸(G), X5為脯氨酸(P),亮氨酸(L),甘氨酸(G)或半胱氨酸(C), X6為半胱氨酸(C), 11,111和0獨(dú)立地為0或1,所述化合物具有與抗體結(jié)合的能力,所述抗體特異于包含氨基酸序列EFRHDSGY和/或 pEFRHDSGY的淀粉樣蛋白β肽(Αβ)表位。
3.依照權(quán)利要求2的用途,其特征在于所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序列的 肽IRWDTP(C),VRffDVYP(C),IRYDAPL(C),IRYDMAG(C),IRffDTSL(C),IRffDQP(C),IRffDG(C) 禾口 IRWDGG(C) ο
4.至少一種包含下述氨基酸序列的化合物在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療淀粉樣變的 藥物中的用途,EX1WHX2X3(X4)n(X5)m (式 II), 其中X1為纈氨酸(V),精氨酸(R)或亮氨酸(L), X2為精氨酸(R)或谷氨酸(E),X3為丙氨酸(A),組氨酸(H),賴氨酸(K),亮氨酸(L),酪氨酸(Y)或甘氨酸(G), )(4為脯氨酸(P),組氨酸(H),苯丙氨酸(F)或谷氨酰胺(Q)或半胱氨酸 X5為半胱氨酸(C), η和m獨(dú)立地為0或1,所述化合物具有與抗體結(jié)合的能力,所述抗體特異于包含氨基酸序列EVHHQKL的淀粉 樣蛋白β肽(Αβ)表位。
5.依照權(quán)利要求4的用途,其特征在于所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序 列的肽EVWHRHQ(C), ERffHEKH(C), EVffHRLQ(C), ELffHRYP(C), ELffHRAF(C), ELffHRA(C), EVffHRG(C), EVffHRH(C)禾口 ERWHEK(C),優(yōu)選 EVWHRHQ(C),ERffHEKH(C), EVffHRLQ(C), ELffHRYP(C)和 ELWHRAF(C)。
6.至少一種包含選自下組的氨基酸序列的化合物在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療β-淀 粉樣變的藥物中的用途QDFRHY (C),SEFKHG (C),TSFRHG (C),TSVFRH (C),TPFRHT (C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), SAFRHH (C), LPFRHG(C), SHFRHG (C), ILFRHG(C), QFKHDL (C),NWFPHP (C),EEFKYS (C),NELRHST (C),GEMRHQP (C),DTYFPRS (C),VELRHSR (C),YSMRHDA (C), AANYFPR(C),SPNQFRH(C),SSSFFPR(C),EDffFFffH(C),SAGSFRH(C),QVMRHHA(C),SEFSHSS(C), QPNLFYH(C),ELFKHHL(C),TLHEFRH(C),ATFRHSP(C),APMYFPH(C),TYFSHSL(C),HEPLFSH(C), SLMRHSS(C),EFLRHTL(C),ATPLFRH(C),QELKRYY(C),THTDFRH(C),LHIPFRH(C),NELFKHF(C), SQYFPRP(C),DEHPFRH(C),MLPFRHG(C),SAMRHSL(C),TPLMFffH(C),LQFKHST(C),ATFRHST(C), TGLMFKH(C),AEFSHWH(C),QSEFKHW(C),AEFMHSV(C),ADHDFRH(C),DGLLFKH(C),IGFRHDS(C), SNSEFRR(C),SELRHST(C),THMEFRR(C),EELRHSV(C),QLFKHSP(C),YEFRHAQ(C),SNFRHSV(C), APIQFRH(C),AYFPHTS (C),NSSELRH(C),TEFRHKA (C),TSTEMWH(C),SQSYFKH(C),(C) SEFKH, SEFKH(C),(C)HEFRH 和 HEFRH(C)。
7.依照權(quán)利要求6的用途,其特征在于所述化合物包含具有選自下組的氨基酸序列 的肽QDFRHY(C),SEFKHG (C),TSFRHG (C),TSVFRH(C),TPFRHT (C),SQFRHY (C),LMFRHN(C), SAFRHH (C), LPFRHG(C), SHFRHG (C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NffFPHP(C), EEFKYS (C), SPNQFRH(C),TLHEFRH(C),THTDFRH(C),DEHPFRH(C),QSEFKHW(C),ADHDFRH(C),DGLLFKH(C), EELRHSV(C),TEFRHKA(C),(C)SEFKH, SEFKH(C),(C)HEFRH 和 HEFRH(C),優(yōu)選 SEFKHG(C), TSVFRH(C), SQFRHY(C), LMFRHN(C), ILFRHG(C), SPNQFRH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), THTDFRH(C),DEHPFRH(C),QSEFKHW(C),ADHDFRH(C),YEFRHAQ(C),TEFRHKA(C)。
8.依照權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的用途,其特征在于所述化合物為包含4-20個氨基酸殘基 的多肽。
9.依照權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的用途,其特征在于所述化合物偶聯(lián)至藥學(xué)可接受載體, 優(yōu)選KLH(匙孔i威血藍(lán)蛋白)。
10.依照權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的用途,其特征在于所述化合物為靜脈內(nèi),皮下,皮內(nèi)或 肌肉內(nèi)施用而配制。
11.依照權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的用途,其特征在于所述化合物與佐劑,優(yōu)選氫氧化鋁 一起配制。
12.依照權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的用途,其特征在于所述化合物以0.Ing至10mg,優(yōu)選 IOng至lmg,特別是IOOng至10 μ g的量包含在藥物中。
13.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)中限定的化合物用于治療和/或改善突觸核蛋白病的癥狀的 用途。
14.依照權(quán)利要求13的用途,其特征在于所述突觸核蛋白病選自下組帕金森氏病,具 有Lewy小體的癡呆,多系統(tǒng)萎縮和具有腦鐵累積的神經(jīng)變性。
15.具有選自下組的氨基酸序列的肽IRWDTP(C),VRffDVYP (C),IRYDAPL(C), IRYDMAG (C), IRffDTSL (C), IRffDQP(C), IRffDG (C), IRffDGG(C), EVffHRHQ (C), ERffHEKH (C), EVffHRLQ(C),ELffHRYP(C),ELffHRAF (C),ELffHRA(C),EVffHRG(C),EVffHRH(C),ERffHEK (C), QDFRHY(C), SEFKHG (C), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT (C), SQFRHY(C), LMFRHN (C), SAFRHH (C), LPFRHG(C), SHFRHG (C), ILFRHG(C), QFKHDL(C), NffFPHP(C), EEFKYS(C), NELRHST(C),GEMRHQP(C),DTYFPRS(C),VELRHSR(C),YSMRHDA(C),AANYFPR(C),SPNQFRH(C), SSSFFPR(C),EDffFFffH(C),SAGSFRH(C),QVMRHHA(C),SEFSHSS(C),QPNLFYH(C),ELFKHHL(C), TLHEFRH(C),ATFRHSP(C),APMYFPH (C),TYFSHSL(C),HEPLFSH(C),SLMRHSS(C),EFLRHTL(C), ATPLFRH(C),QELKRYY(C),THTDFRH(C),LHIPFRH(C),NELFKHF(C),SQYFPRP(C),DEHPFRH(C),MLPFRHG(C),SAMRHSL(C),TPLMFffH(C),LQFKHST(C),ATFRHST(C),TGLMFKH(C),AEFSHWH(C), QSEFKHW(C),AEFMHSV(C),ADHDFRH(C),DGLLFKH(C),IGFRHDS(C),SNSEFRR(C),SELRHST(C), THMEFRR(C),EELRHSV(C),QLFKHSP(C),YEFRHAQ(C),SNFRHSV(C),APIQFRH(C),AYFPHTS (C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMffH(C), SQSYFKH(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH 和 HEFRH(C)。
16.依照權(quán)利要求15的肽,其特征在于該肽偶聯(lián)至藥學(xué)可接受載體,優(yōu)選KLH(匙孔蟲威. 血藍(lán)蛋白)。
17.藥物配制劑,優(yōu)選疫苗,其包含至少一種依照權(quán)利要求15或16的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及模擬表位在治療包括阿爾茨海默氏病的與β-淀粉樣蛋白形成和/或聚集(β-淀粉樣變)有關(guān)的疾病中的用途,由此所述模擬表位能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)針對Aβ1-40/42,AβpE3-40/42,Aβ3-40/42和Aβ11-40/42的抗體形成。
文檔編號A61P25/28GK102123727SQ200980131375
公開日2011年7月13日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者克里斯琴·吉弗斯, 奧萊克桑德爾·奧塔瓦, 安德烈亞·多利??? 弗蘭克·馬特納, 馬庫斯·曼德勒 申請人:阿費(fèi)里斯股份公司