專利名稱：診斷抗體測(cè)定的制作方法
診斷抗體測(cè)定本發(fā)明涉及新診斷測(cè)定，其用于診斷淀粉樣變，這是與淀粉樣蛋白相關(guān)的一組病 癥和異常，如阿爾茨海默病及相關(guān)方面。本發(fā)明特別提供了抗體測(cè)定。淀粉樣變不是單一的疾病實(shí)體，而是一組不同的進(jìn)行性疾病，特征在于稱作淀粉 樣蛋白的蠟狀淀粉樣蛋白的細(xì)胞外組織沉積，其積聚在一種或多種器官或者機(jī)體系統(tǒng)中。 隨著淀粉樣蛋白沉積物的積聚，它們開(kāi)始干擾所述器官或者機(jī)體系統(tǒng)的正常功能。存在至 少15種不同類型的淀粉樣變。主要形式是無(wú)已知先例的原發(fā)淀粉樣變，一些其它病癥之后 的繼發(fā)性淀粉樣變，以及遺傳性淀粉樣變。繼發(fā)性淀粉樣變?cè)诼愿腥净蜓仔约膊∑陂g發(fā)生，如結(jié)核病、稱作家族性地中海 熱的細(xì)菌感染、骨感染(骨髓炎)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小腸炎癥(肉芽腫性回腸炎)、霍奇金 病和麻風(fēng)病。淀粉樣蛋白沉積物包括淀粉樣蛋白P(五邊形)組分(AP)，其與正常血清淀粉樣 蛋白P(SAP)相關(guān)的糖蛋白；以及硫酸化糖胺聚糖(GAG)，其是結(jié)締組織的復(fù)合碳水化合物。 淀粉樣蛋白原纖維占淀粉樣材料的大約90%，其包含若干種不同類型蛋白的一種。這些蛋 白能折疊成所謂的“β-折疊”原纖維，這是呈現(xiàn)出導(dǎo)致淀粉樣蛋白獨(dú)特的染色性質(zhì)的剛果 紅結(jié)合位點(diǎn)的獨(dú)特蛋白構(gòu)型。許多衰老性疾病基于或與淀粉樣蛋白相關(guān)，且部分地特征在于促使發(fā)病以及該疾 病進(jìn)展的淀粉樣蛋白或淀粉樣材料的細(xì)胞外積聚的形成。這些疾病包括但不限于神經(jīng)性病 癥如輕度認(rèn)知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿 爾茨海默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)，唐氏綜合征中 的神經(jīng)變性，盧伊體癡呆，具有淀粉樣變的遺傳性腦出血(Dutch型)；關(guān)島帕金森-癡呆綜 合征(Guam Parkinson-Dementia complex)。基于或者與淀粉樣蛋白相關(guān)的其它疾病是進(jìn) 行性核上麻痹、多發(fā)性硬化癥；克-雅病(Creutzfeld Jacob disease)，帕金森病，HIV-相 關(guān)癡呆，ALS (肌萎縮側(cè)索硬化癥)，成人發(fā)病型糖尿??；老年性心臟淀粉樣變；內(nèi)分泌性腫 瘤及其它疾病，包括黃斑變性。盡管這些疾病的發(fā)病機(jī)制可能不同，但是它們的特征性沉積物通常含有許多共有 的分子組分。這在很大程度上可以歸因于促炎途徑的局部活化，從而導(dǎo)致激活的補(bǔ)體組分、 急性期反應(yīng)物、免疫調(diào)節(jié)物及其它炎性介導(dǎo)物的同時(shí)沉積(McGeer et al.，Tohoku J Exp Med. 174(3) :269-277 (1994))。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明阿爾茨海默病涉及N末端修飾的Αβ肽變體。針對(duì)性 活組織檢查表明Aβ 1-40和Αβ 1-42不僅存在于阿爾茨海默病患者的腦中，也存在于未受 影響個(gè)體的老年斑中。然而，N-末端截短的和焦谷氨酸修飾的A β Ν3ρΕ-40/Αβ Ν3ρΕ_42 幾乎只存在于阿爾茨海默病患者的斑中，使得這種Αβ變體是適當(dāng)?shù)脑\斷標(biāo)記物和潛在的 藥物開(kāi)發(fā)靶標(biāo)。目前一些商業(yè)生產(chǎn)廠家提供了 ELISA試劑盒，其允許檢測(cè)低皮克(pg)范圍的 Αβ 1-40/1-42 和 Αβ Ν3ρΕ-40/Αβ Ν3ρΕ_42。阿爾茨海默病(AD)患者腦的形態(tài)學(xué)特征是存在神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及新皮層腦結(jié)構(gòu)中 Αβ 肽的沉積(Selkoe，D. J.& Schenk，D. Alzheimer ‘ s disease :molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics.Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43,545-584(2003)) ο在被β-和Y -分泌酶相繼切割后，A β肽從淀粉樣前體 蛋白(APP)中釋放。Y-分泌酶切割導(dǎo)致Αβ 1-40和Αβ 1-42肽的產(chǎn)生，它們的C-末 端不同且呈現(xiàn)出不同的聚集、原纖維形成及神經(jīng)毒性效力(Shin，R. W. et al. Amyloid beta-protein (Abeta)1-40 but not Abeta l_42contributes to the experimental formation of Alzheimer disease amyloid fibrils in rat brain. J. Neurosci. 17, 8187-8193(1997) ；Iwatsubo,T.et al.Visualization of Abeta 42 (43)and Abeta 40 in senile plaques with end-specific Abeta monoclonals :evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron 13，45-53 (1994) ；Iwatsubo，T.，Mann, D. M.，Odaka，A.，Suzuki, N. & Ihara，Y. Amyloid beta protein (Abeta) deposition Abeta 42 (43)precedes Abeta 40 in Down syndrome. Ann. Neurol.37，294-299 (1995); Hardy，J. A. & Higgins, G.A. Alzheimerr s disease :the amyloid cascade hypothesis. Science 256,184-185(1992) ；Ro ^ner, S. ，Ueberham，U. ， Schliebs， R. ，Perez-Polo, J. R. & Bigl, V.The regulation of amyloid precursor protein metabolism by cholinergic mechanisms and neurotrophin receptor signaling. Prog. Neurobiol. 56, 541-569 (1998)) ο除了 C末端可變性之外，N末端修飾的Αβ肽是大量的(Saido, T. C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species，A beta N3(pE)，in senile plaques. Neuron 14,457-466(1995) ；Russo，C. et al.Presenilin-I mutations in Alzheimer ' s disease. Nature 405，531-532(2000)； Saido，T. C.，Yamao, H.，Iwatsubo, Τ. & Kawashima, S. Amino-and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215，173-176(1996))?？雌饋?lái)Αβ肽的大部分經(jīng)歷了 N末端截短兩個(gè)氨基酸，從 而暴露谷氨酸殘基，其隨后被環(huán)化為焦谷氨酸(ΡΕ)，這產(chǎn)生Αβ3(ρΕ)-42肽(Mido， Τ. C.et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species，A beta N3 (pE)，in senile plaques. Neuron 14，457-466 (1995)； Saido, T. C.，Yamao, H.，Iwatsubo, Τ. & Kawashima，S. Amino-and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215,173-176(1996))?；蛘?，pE可以在BACEl的β，-切割之后形成，從而產(chǎn)生 Aβ Nil(pE)-42(Naslund，J. et al. Relative abundance of Alzheimer A beta amyloid peptide variants in Alzheimer disease and normal aging. Proc. Natl.Acad.Sci. U.S.A.91,8378-8382(1994) ；Liu, K. et al.Characterization of Abetal1-40/42 peptide deposition in Alzheimer' s disease and young Down' s syndrome brains implication of N-terminally truncated Abeta species in the pathogenesis of Alzheimer' s disease. Acta Neuropathol. 112,163-174 (2006)) 0 特別地，已經(jīng)證實(shí) Αβ Ν3(ρ^-42在散發(fā)性和家族性阿爾茨海默病(FAD)中是Αβ沉積物的主要組分(Mido， Τ. C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species，A beta N3 (pE)，in senile plaques. Neuron 14,457-466 (1995) ；Miravalle，L et al. Amino-terminally truncated Abeta peptide species are the main component ofcotton wool plaques. Biochemistry 44,10810-10821 (2005)) Αβ N3pE-42 肽與 Αβ 1-40/1-42 肽共存(Saido，Τ. C. et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, Abeta N3pE, in senile plaques. Neuron 14,457-466 (1995) ；Saido, T. C. , Yamao, H. , Iwatsubo, T. & Kawashima,S. Amino-and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215，173-176 (1996))，并且基于許多觀察 結(jié)果可以在AD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。例如，已經(jīng)概述了 Αβ Ν3ρΕ-42肽的特殊神 經(jīng)毒性(Russo, C. et al. Pyroglutamate-modified amyloid beta-peptides—AbetaN3 ( pE)__strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489(2002)，以及N-截短的Aβ肽的pE-修飾賦予對(duì)大部分氨肽酶及Aβ -降解內(nèi) 妝酶的抗性(Russo, C. et al. Pyroglutamate-modif ied amyloid beta-peptides—AbetaN 3 (pE)__strongly affect cultured neuron and astrocyte survival. J. Neurochem. 82, 1480-1489 (2002) ；Saido, T. C. Alzheimer ' s disease as proteolytic disorders anabolism and catabolism of beta-amyloid. Neurobiol. Aging 19,S69-S75 (1998))。谷 氨酸環(huán)化為PE導(dǎo)致N末端電荷喪失，從而引起與未修飾的Αβ肽相比Αβ Ν3ρΕ的加速聚集 (He,W.& Barrow,C. J. The Abeta 3-pyroglutamyl and 11-pyroglutamyl peptides found in senile plaque have greater beta-sheet forming and aggregation propensities in vitro than full-length A beta. Biochemistry 38,10871-10877(1999) ；Schilling, S. et al. On the seeding and oligomerization of pGlu-amyloid peptides(in vitro). Biochemistry 45,12393-12399 (2006)) 因此，A β N3pE_42 形成的減少應(yīng)使所述肽去穩(wěn) 定，這通過(guò)使它們更易降解及隨之防止較高分子量Αβ聚集的形成以及增強(qiáng)神經(jīng)元存活率 而進(jìn)行的。然而，長(zhǎng)期以來(lái)還未知怎樣發(fā)生Αβ肽的PE-修飾。近年來(lái)，揭示了谷氨酰胺酰 基環(huán)化酶OiC)在略酸性條件下能催化A β Ν3ρΕ-42形成，以及特異性QC抑制劑防止A β Ν3ρΕ-42 在體夕卜產(chǎn)生(Schilling, S. ，Hoffmann, Τ. ，Manhart, S. ，Hoffmann, Μ. & Demuth， H. -U. Glutaminyl cyclases unfold glutamyl cyclase activity under mild acid conditions. FEBS Lett. 563,191-196(2004) ；Cynis, H. et al. Inhibition of glutaminyl cyclase alters pyroglutamate formation in mammalian cells. Biochim. Biophys. Acta 1764，1618-1625(2006))。盧伊體癡呆(LBD)是神經(jīng)變性病癥，其可以在65歲以上的人中發(fā)生，并且通常導(dǎo) 致認(rèn)知(思考)障礙和異常行為改變的癥狀。癥狀可包括認(rèn)知障礙，神經(jīng)病征，睡眠障礙以 及自主衰竭。認(rèn)知障礙在大多數(shù)情況中是LBD的代表性特征?；颊呓?jīng)常發(fā)生逐漸惡化的精 神錯(cuò)亂的現(xiàn)象。認(rèn)知能力的波動(dòng)通常與注意力和警覺(jué)度的改變程度相關(guān)。認(rèn)知障礙和思想 波動(dòng)可以在幾分鐘、幾小時(shí)或幾天內(nèi)變化。盧伊體形成自磷酸化和未磷酸化的神經(jīng)絲蛋白； 它們含有突觸蛋白α-突觸核蛋白以及泛素，其參與損傷或異常蛋白的清除。除了盧伊體 之外，也可以存在盧伊神經(jīng)突，其是神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞過(guò)程中的包涵體。淀粉樣斑可以在DLB 患者腦中形成，然而它們的數(shù)目比在阿爾茨海默病患者中所觀察到的數(shù)目少。AD的另一微 病理學(xué)特點(diǎn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)不是LBD的主要特征，但是是除了淀粉樣斑之外經(jīng)常存在。肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALQ特征在于上和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性。在一些ALS患者中，可以存在癡呆或失語(yǔ)(ALS-D)。癡呆是最常見(jiàn)的額顳癡呆(FTD)，許多這些病例在齒狀回和 額葉及顳葉淺層神經(jīng)元中具有泛素陽(yáng)性、tau-陰性的包涵體。包涵體肌炎(IBM)是致殘性疾病，通常在50歲以上的人中發(fā)現(xiàn)，其中肌纖維發(fā)生 炎癥并開(kāi)始萎縮，但是腦不受影響，患者保留其全部智力。發(fā)現(xiàn)參與淀粉樣β蛋白產(chǎn)生的 兩種酶在這種老年人最常見(jiàn)的晚期肌病患者的肌細(xì)胞中增加，其中淀粉樣蛋白也增 加。基于或者與淀粉樣蛋白的積聚和沉積相關(guān)的另一疾病是黃斑變性。黃斑變性是常 見(jiàn)的眼病，其導(dǎo)致是視網(wǎng)膜(眼后面的極薄組織，其中光敏細(xì)胞輸送視覺(jué)信號(hào)至腦)中心區(qū) 域的黃斑退化。敏銳、清晰、“筆直”視力由黃斑處理形成。黃斑損傷導(dǎo)致產(chǎn)生盲點(diǎn)及模糊 或失真的視力。年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)在美國(guó)是視力障礙的主要因素，并且對(duì)于65歲 以上的白種人是導(dǎo)致法定盲的主要因素。大約180萬(wàn)年齡為40歲及更大的美國(guó)人患有晚 期AMD，并且患有中期AMD的另外730萬(wàn)人處于視力喪失的危險(xiǎn)中。政府估計(jì)到2020年將 有290萬(wàn)人患有晚期AMD。通常令人驚奇及沮喪地發(fā)現(xiàn)對(duì)AMD患者的這種失明狀況的原因 的了解及治療很少。存在兩種形式黃斑變性干性黃斑變性和濕性黃斑變性。其中黃斑的細(xì)胞緩慢開(kāi) 始破壞的干性形式占診斷的黃斑變性病例的85%。雙眼通常均受干性AMD的影響，但是一 只眼睛可以喪失視力，而另一只眼睛保持未受影響。玻璃疣是視網(wǎng)膜下的黃色沉積物，其通 常是干性AMD的早期跡象。發(fā)生晚期干性AMD或濕性AMD的風(fēng)險(xiǎn)隨著玻璃疣的數(shù)目或大小 的增加而增加。干性AMD進(jìn)展且導(dǎo)致視力喪失而不變成該疾病的濕性形式是可能的；然而， 早期干性AMD迅速變成濕性形式也是可能的。濕性形式AMD盡管只占病例的15%，但導(dǎo)致90 %的患者失明，并且被認(rèn)為是晚期 AMD (沒(méi)有早期和中期階段的濕性AMD)。干性形式的疾病總是先于濕性AMD。隨著干性形式 的惡化，一些人開(kāi)始具有黃斑后的異常血管生長(zhǎng)。這些血管非常脆弱，并會(huì)滲出液體和血液 (因此“濕性”黃斑變性)，從而導(dǎo)致黃斑的快速損傷。干性形式AMD最初通常導(dǎo)致輕微的視力模糊。特別是視力中心可變得模糊，且這 個(gè)區(qū)域隨著疾病的進(jìn)展而漸漸擴(kuò)大。如果僅一只眼睛受影響，則無(wú)可注意到的癥狀。在濕 性AMD中，直線可出現(xiàn)波浪，且可迅速發(fā)生中心視力喪失。黃斑變性的診斷通常包括散瞳眼底檢查，視力靈敏度測(cè)試及使用稱作眼底檢查的 程序檢查眼的背部以幫助診斷AMD，并且如果懷疑是濕性AMD，也可以進(jìn)行熒光素血管造影 術(shù)。如果干性AMD達(dá)到晚期階段，目前還沒(méi)有防止視力喪失的治療方法。然而，特別的高 劑量抗氧化劑和鋅配方可延緩或防止中期AMD發(fā)展為晚期階段。Macugen (哌加他尼鈉 (pegaptanib sodium)注射劑)、激光凝固術(shù)和光動(dòng)力學(xué)療法可以控制黃斑的異常血管生長(zhǎng) 及出血，這有助于患有濕性AMD的一些人；然而，通過(guò)這些技術(shù)不能恢復(fù)已經(jīng)喪失的視力。 如果視力已經(jīng)喪失，現(xiàn)有的低視力輔助器可有助于改善生存質(zhì)量。年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的最早征兆之一是視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)的基底層與 布魯赫膜(BM)之間稱作玻璃疣的胞外沉積物的積聚。最近Anderson等的研究證實(shí)玻璃疣 含有淀粉樣蛋白 β (Experimental Eye Research 78(2004)243-256) 本發(fā)明的目的是建立高靈敏性且同時(shí)強(qiáng)力的(robust)檢測(cè)技術(shù)，其使得可以定 量確定諸如液體或血清樣品、優(yōu)選血清樣品的生物樣品中的Αβ變體、特別是pGlu-Αβ肽?？紤]到Αβ肽在血液中的低豐度，這是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。然而，具有這種檢測(cè)技術(shù)是在藥物篩 選程序中研究小分子抑制劑的效力的前提條件。本發(fā)明提供了新的方法和包含高特異性和高有效性抗體的組合物，所述抗體包括 嵌合抗體及其片段，包括部分或完全人源化抗體及其片段，其具有特異性識(shí)別及結(jié)合一系 列淀粉樣蛋白抗原、特別是pGlu-Αβ肽的特異性表位的能力，所述抗原可以單體、二聚 體、三聚體等形式或聚合物形式，集合物(aggregate)、纖維、絲的形式或者斑的濃縮形式呈 遞給抗體。本發(fā)明教導(dǎo)的抗體特別用于診斷淀粉樣變，該淀粉樣變是一組與淀粉樣斑形成 相關(guān)的疾病和病癥，包括繼發(fā)性淀粉樣變和年齡相關(guān)性淀粉樣變，包括但不限于神經(jīng)性病 癥如阿爾茨海默病(AD)，盧伊體癡呆，唐氏綜合征，具有淀粉樣變的遺傳性腦出血(Dutch 型)；關(guān)島帕金森-癡呆綜合征；以及基于或者與淀粉樣蛋白相關(guān)的其它疾病，如進(jìn)行性核 上麻痹，多發(fā)性硬化癥；克-雅病，具有淀粉樣變的遺傳性腦出血(Dutch型)，帕金森病， HIV-相關(guān)癡呆，ALS (肌萎縮側(cè)索硬化癥)，成人發(fā)病型糖尿病；老年性心臟淀粉樣變；內(nèi)分 泌性腫瘤及其它疾病，包括黃斑變性等等。為了滿足上述所有需求，特別優(yōu)選基于ELISA的技術(shù)。使用ΑβΝ3ρΕ ELISA開(kāi)始 研究，因?yàn)閷?duì)于這種Αβ變體，已經(jīng)可以商購(gòu)ELISA系統(tǒng)(Human Amyloid β (N3pE)Assay Kit-IBL, Code No. 27716)，其用作參考和內(nèi)部質(zhì)量對(duì)照。Αβ Ν3ρΕ_40肽的捕獲使用TGC ^ hA^ (x-40)ELISA(HS) ii ^f (The Genetics Company, Inc. , Wagistrasse 23,8952 Schlieren, Zurich area Switzerland)，其應(yīng)當(dāng)便于和加速開(kāi)發(fā)過(guò)程。發(fā)明_既述本發(fā)明特別涉及抗體或其變體，特征在于其以高親和力與Αβ_肽結(jié)合。所述高親 和力在本發(fā)明中是指親和力Kd值為1(ΓΜ或更好，優(yōu)選Kd值為或更好，甚至更優(yōu)選Kd 值為 1(Γ9Μ-10^Μ。特別地，所述抗體優(yōu)選為單克隆抗體，并選自以下組A β 5-5-6A β 6-1-6A β 17-4-3A β 24-2-3本發(fā)明的抗體可特別用于診斷方法以檢測(cè)淀粉樣變，特別是阿爾茨海默病。附圖
描述圖 1Α)通過(guò)增加pGlu-6166抗體(克隆12-1)的濃度檢測(cè)lOng/ml淀粉樣蛋g βΝ3ρΕ-40。B)確定檢測(cè)lOng/ml淀粉樣蛋白β Ν3ρΕ_40所需的pGlu-6166抗體(克隆12-1)
的最高濃度。圖 2各個(gè)IgG產(chǎn)生克隆的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的斑點(diǎn)印跡分析。圖 3pGlu-6166雜交瘤細(xì)胞克隆和IBL-A β Ν3ρΕ抗體的P印Spot分析。圖4
20 μ g pGlu-6166抗體和雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的12% SDS-PAGE。圖 5雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的Biacore分析。圖示了監(jiān)測(cè)的結(jié)合過(guò)程的疊加。圖 6抗-Αβ N3pE抗體克隆6_1_6與Αβ pE3_40相互作用的傳感圖。S 7抗-Αβ N3pE抗體克隆與Αβ pE3_40相互作用的傳感圖。S 8克隆6-1-6 的 N3pE-ELISA，Αβ pE3-40 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。S 9Ν3ρΕ抗體克隆6-1-6的傳感圖。圖 10利用以下方法的ΑβρΕ3-42定量1 20稀釋于EIA緩沖液，用860 μ 1 3. 5Μ Tris 進(jìn)行PH滴定的中和。圖 11阿爾茨海默病(AD)患者的染色腦切片。(A)用識(shí)別總A β的抗-A β抗體6Ε10染色的散發(fā)性AD (SAD)患者的腦，(B)用識(shí)別A β ρΕ3-χ的Ν3ρΕ抗體克隆染色的散發(fā)性AD (SAD)患者的腦，(C)用識(shí)別A β ρΕ3-χ的Ν3ρΕ抗體克隆染色的家族性AD (FAD)患者的腦。發(fā)明詳述定義術(shù)語(yǔ)“抗體”以其最廣泛的含義使用，并且特別包括完整的單克隆抗體、多克隆抗 體、從至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)以及抗體片段(只要 它們呈現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)?？贵w可以是IgM, IgG(例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4)、 IgD、IgA或IgE。然而，優(yōu)選所述抗體不是IgM抗體?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分，通常是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？?體片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab' ) 2和Fv片段雙抗體、單鏈抗體分子以及從抗體片 段形成的多特異性抗體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指得自一群基本均質(zhì)的抗體的抗體，即該群包 含的各個(gè)抗體除了可能少量天然存在的突變之外是相同的。單克隆抗體對(duì)于單一抗原性位 點(diǎn)是高度特異性的。此外，與通常包含不同決定簇(表位)的不同抗體的“多克隆抗體”制 備物相反，每個(gè)單克隆抗體只針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗 體通常的有利之處是它們通過(guò)雜交瘤培養(yǎng)合成，未被其它免疫球蛋白污染?！皢慰寺　笔侵?抗體的特性，其得自基本均質(zhì)的抗體群，不應(yīng)理解為需要通過(guò)任何特殊方法來(lái)產(chǎn)生抗體。例 如，本發(fā)明中使用的單克隆抗體可以通過(guò)首先由K6hleret al. ,Nature, 256 :495(1975)所 述的雜交瘤方法產(chǎn)生，或者可以通過(guò)通常已知的重組DNA方法產(chǎn)生。“單克隆抗體”也可以 分離自噬菌體抗體文庫(kù)，使用如 Clackson et al.，Nature，352 :6^-6 (1991)和Marks et al.，J. Mol. Biol.，222 :581-597 (1991)所述的技術(shù)。本文的單克隆抗體特別包括嵌合抗體(免疫球蛋白)，其中一部分重鏈和/或輕鏈與衍生自特定物種的抗體或者屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或者同 源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種的抗體或者屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相 應(yīng)序列相同或者同源；以及這樣的抗體的片段，只要它們呈現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性?！叭嗽椿毙问降姆侨?例如鼠)抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段 (如Fv、Fab、Fab'、F(ab' ) 2或者抗體的其它抗原結(jié)合子序列)，其含有衍生自非人免疫 球蛋白的最小序列。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自受體的 互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基由具有期望的特異性、親和力和能力(capacity)的非人物種(供 體抗體)如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基代替。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū) (FR)殘基由相應(yīng)的非人殘基代替。此外，人源化抗體可包含這樣的殘基，其在受體抗體及引 入的CDR或構(gòu)架序列中均未發(fā)現(xiàn)。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步精制和優(yōu)化抗體的性能。通常，人源化抗體包含基本上所 有的至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有CDR區(qū)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋 白的那些區(qū)域，并且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些區(qū)域。人源化抗體 最優(yōu)選還包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)。進(jìn)一步 的細(xì)節(jié)參見(jiàn) Jones et al.，Nature, 321 :522-525 (1986)，Reichmann et al, Nature. 332 323-329(1988) R Presta, Curr. Op. Struct. Biel.，2 :593-596 (1992)。人源化抗體包括 I^imatized 抗體，其中所述抗體的抗原結(jié)合區(qū)源自通過(guò)用所關(guān)注的抗原免疫恒河猴而產(chǎn) 生的抗體?！皢捂淔v”或“sFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在 于單多肽鏈中。通常地，F(xiàn)v多肽還包含Vh與\結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接物(linker)，這使 得sFv形成抗原結(jié)合所期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述見(jiàn)Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. ,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。術(shù)語(yǔ)“雙抗體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包含在相同多 肽鏈中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vd)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh) (Vh-Vd)。通過(guò)使用過(guò)短而不 允許在相同鏈上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接物，迫使結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)， 并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體在Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sol. USA,90 6444-6448(1993)中得以更充分描述?！胺蛛x的”抗體是已經(jīng)鑒定并從其天然環(huán)境的組分中分離和/或回收的抗體。其 天然環(huán)境的污染組分是干擾抗體的診斷或治療用途的材料，并且可以包括酶、激素及其它 蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化為(1)通過(guò)勞里(Lowry)方 法確定為大于95重量％的抗體，最優(yōu)選大于99重量％ ； (2)通過(guò)使用旋杯測(cè)序儀足以以 獲得N末端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度；或者(3)通過(guò)還原或非還原條件 SDS-PAGE使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染純化的均一性。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)原位抗體， 因?yàn)椴淮嬖诳贵w天然環(huán)境的至少一種成分。然而，通常分離的抗體通過(guò)至少一個(gè)純化步驟 來(lái)制備。如本文所用，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有這些 名稱均包括后代。因此，詞語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括初始的對(duì)象細(xì)胞及從其衍生 的培養(yǎng)物而不論轉(zhuǎn)移的數(shù)目。還應(yīng)當(dāng)理解，由于有意或無(wú)意的突變所致所有后代的DNA含量可以不完全相同。本發(fā)明包括經(jīng)篩選與原始轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有相同功能或生物學(xué)活性的突 變體后代。在使用不同名稱的情況下，從上下文可明了。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白，，可互換使用，是指由通過(guò)肽鍵連接的氨 基酸組成的生物分子。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(a) ”、“一個(gè)(an) ”及“這個(gè)(the) ”是指“一個(gè)或多個(gè)”，
并且包括復(fù)數(shù)形式，除非在上下文中是不適合的。表述“由淀粉樣蛋白或淀粉狀蛋白導(dǎo)致或者與其相關(guān)的疾病和病癥”包括但不限 于由單體、原纖維或多聚體狀態(tài)或者這者的任意組合形式的淀粉樣蛋白的存在或活性導(dǎo)致 的疾病和病癥。這樣的疾病和病癥包括但不限于淀粉樣變、內(nèi)分泌腫瘤以及黃斑變性。術(shù)語(yǔ)“淀粉樣變”是指一組與淀粉樣斑形成相關(guān)的疾病和病癥，包括但不限于繼發(fā) 性淀粉樣變和年齡相關(guān)性淀粉樣變，例如這樣的疾病，包括但不限于神經(jīng)性病癥如阿爾茨 海默病(AD)，包括特征在于認(rèn)知記憶能力喪失的疾病或疾病狀況(condition)，如輕度認(rèn) 知障礙(MCI)，散發(fā)性阿爾茨海默病，盧伊體癡呆，唐氏綜合征，具有淀粉樣變的遺傳性腦出 血(Dutch型)；關(guān)島帕金森-癡呆綜合征，家族形式的阿爾茨海默病如家族性英國(guó)型癡呆 (FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)；以及基于或者與淀粉樣蛋白相關(guān)的其它疾病，如進(jìn)行性 核上麻痹，多發(fā)性硬化癥；克-雅病，帕金森病，HIV-相關(guān)癡呆，ALS (肌萎縮側(cè)索硬化癥)， 包涵體肌炎(IBM)，成人發(fā)病型糖尿病和老年性心臟淀粉樣變；以及各種眼病，包括黃斑變 性、玻璃疣相關(guān)的視神經(jīng)病變及由于β-淀粉樣蛋白沉積所致的白內(nèi)障。“淀粉樣蛋白β、Αβ或淀粉樣蛋白”是本領(lǐng)域公認(rèn)的術(shù)語(yǔ)，并且指淀粉樣β 蛋白和肽、淀粉樣β前體蛋白(APP)及其修飾、片段和任何功能等同物。特別地，如本文所 用，淀粉樣蛋白β是指通過(guò)APP的蛋白酶剪切所產(chǎn)生的任何片段，但特別是涉及或者與淀 粉樣蛋白病理學(xué)相關(guān)的那些片段，包括但不限于AiVpAiV4c^AiV42t5這些Αβ肽的氨基 酸序列如下所示A β 1-42 (SEQ ID NO. 1)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-AlaA β 1-40 (SEQ ID NO. 2)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-ValA β 1-38 (SEQ ID NO. 3)Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly“pGlu-Αβ ”或“Αβ N3pE”是指N末端截短形式的Aβ，其在Aβ的氨基酸序列 的第3位的谷氨酸殘基開(kāi)始，其中所述谷氨酸殘基被環(huán)化形成焦谷氨酸殘基。特別地，如 本文所用，pGlu-Αβ是指涉及或者與淀粉樣蛋白病理學(xué)相關(guān)的那些片段，包括但不限于 pGlu-A β 3—38、pGlu-A β 3—40、p-Glu-A β 3—42。
N末端截短的形式的A β、A β 3-38> A β 3_4(1、A β 3_42的序列如下所示A β 3-42 (SEQ ID NO. 4)Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-AlaA β 3-40 (SEQ ID NO. 5)Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-LeuMet-Val-Gly-Gly-V al-ValA β 3-38 (SEQ ID NO. 6)Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-P he-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-IIe-IIe-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly特別地，本發(fā)明涉及如下項(xiàng)1.抗體，特征在于其與Αβ肽或其變體結(jié)合，優(yōu)選以高親和力結(jié)合。2.項(xiàng)1的抗體，其中所述高親和力是指解離常數(shù)(Kd)為IO-7M或更好。3.項(xiàng)1或2的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。4.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有選自SEQ ID NO :49、 53,57和61的核苷酸序列或者選自SEQ ID NO =50,54,58和62的氨基酸序列。5.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體的重鏈的可變部分具有選自SEQ ID NO :51、 55,59和63的核苷酸序列或者選自SEQ ID NO :52、56、60和64的氨基酸序列。6.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQ ID NO :49的核 苷酸序列或者SEQ ID NO :50的氨基酸序列，并且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有SEQ ID NO 51的核苷酸序列或者SEQ ID NO 52的氨基酸序列。7.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQ ID NO :53的核 苷酸序列或者SEQ ID NO力4的氨基酸序列，并且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有SEQ ID NO 55的核苷酸序列或者SEQ ID NO 56的氨基酸序列。8.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQ ID NO :57的核 苷酸序列或者SEQ ID NO :58的氨基酸序列，并且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有SEQ ID NO 59的核苷酸序列或者SEQ ID NO 60的氨基酸序列。9.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQ ID NO :61的核 苷酸序列或者SEQ ID NO :62的氨基酸序列，并且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有SEQ ID NO 63的核苷酸序列或者SEQ ID NO 64的氨基酸序列。10.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體選自以下組或其功能性變體A β 5-5-6 (保藏號(hào) DSM ACC 2923)A β 6-1-6 (保藏號(hào) DSM ACC 2924)A β 17-4-3(保藏號(hào) DSM ACC 2925)A β 24-2-3 (保藏號(hào) DSM ACC 2926)。11.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是A β 6-1-6 (保藏號(hào)DSM ACC四對(duì))。12.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是A β 24-2-3 (保藏號(hào)DSM ACC四沈)。
13.前述任一項(xiàng)的抗體，其中所述抗體是保留高親和力的人源化或嵌合抗體或者 抗體片段。14.前述任一項(xiàng)的抗體，其用于檢測(cè)A β肽或其變體。15.項(xiàng)14的抗體，其中所述變體選自下組pGlu-A β 3-38pGlu-A β 3-40pGlu_A33_42，及pGlu_A33_x 變體，其中χ為10至42的整數(shù)，優(yōu)選18至42、更優(yōu)選30至42的整數(shù)。16.前述任一項(xiàng)的抗體，其是人的。17.前述任一項(xiàng)的抗體，其是保留高親和力的雙抗體或單鏈抗體。18.前述任一項(xiàng)的抗體，其與由項(xiàng)15所定義的抗體結(jié)合的表位結(jié)合。19.前述任一項(xiàng)的抗體，其具有項(xiàng)15所定義的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)。20.前述任一項(xiàng)的抗體，其是標(biāo)記的。21.前述任一項(xiàng)的抗體，其固定在固相上。22.抗體，其可得自雜交瘤細(xì)胞系 DSM ACC 2923、DSM ACC 2924、DSM ACC 2925、 DSM ACC 2926的任意一種。23.組合物，其包含前述任一項(xiàng)的抗體。24.項(xiàng)23的組合物，其用于治療、預(yù)防或延緩淀粉樣變。25.項(xiàng)23或M的組合物，其中所述淀粉樣變是選自輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病 和唐氏綜合征中神經(jīng)變性的神經(jīng)變性疾病。26.項(xiàng)23或M的組合物，其中所述淀粉樣變是散發(fā)性阿爾茨海默病或者家族性阿 爾茨海默癡呆。27.項(xiàng)沈的組合物，其中所述家族性阿爾茨海默癡呆是家族性英國(guó)型癡呆或者家 族性丹麥型癡呆。28.雜交瘤細(xì)胞系 DSM ACC 2923。29.雜交瘤細(xì)胞系 DSM ACC 2924。30.雜交瘤細(xì)胞系 DSM ACC 2925。31.雜交瘤細(xì)胞系 DSM ACC 2926。32.項(xiàng)1-22中任一項(xiàng)所定義的抗體或項(xiàng)23_27中任一項(xiàng)所定義的組合物在診斷或 治療方法中的用途。33.項(xiàng)32的用途，其用于診斷淀粉樣變相關(guān)(amyloid-associated)疾病或疾病狀 況。34.項(xiàng)33的用途，其中所述淀粉樣變是選自輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病和唐氏 綜合征中的神經(jīng)變性的神經(jīng)變性疾病。35.項(xiàng)33的用途，其中所述淀粉樣變是散發(fā)性阿爾茨海默病或者家族性阿爾茨海
默癡呆。36.項(xiàng)35的用途，其中所述家族性阿爾茨海默癡呆是家族性英國(guó)型癡呆或者家族 性丹麥型癡呆。
37.診斷淀粉樣變相關(guān)疾病或疾病狀況，特別是阿爾茨海默病的體外診斷方法，包 括如下步驟使項(xiàng)1至22中任一項(xiàng)的抗體與疑似患有所述疾病或疾病狀況的個(gè)體的樣品接觸， 以及檢測(cè)所述抗體與來(lái)自所述樣品的pGlu-淀粉樣蛋白、優(yōu)選pGlu-Αβ肽的結(jié)合。38.診斷試劑盒，其包含項(xiàng)1至22中任一項(xiàng)所定義的抗體和使用說(shuō)明書(shū)，以及任選 存在的其它生物學(xué)活性物質(zhì)。39.項(xiàng)32的診斷試劑盒，其中所述其它生物學(xué)物質(zhì)是谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制 劑。40.寡核苷酸，其選自 SEQ ID No :23_48。本發(fā)明的抗體可用于診斷淀粉樣變。本發(fā)明的抗體可用作親和力純化劑。在這種方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法將抗 體固定在固相樹(shù)脂或?yàn)V紙上。使固定的抗體與含有要純化的Αβ-肽(或其片 段)的樣品接觸，然后用合適的溶劑洗滌該支持物，這會(huì)基本上除去樣品中除了與固定的 抗體結(jié)合的Αβ-肽之外的所有材料。最后，用另一合適溶劑洗滌該支持物，所述另一合適 溶劑如ρΗ 5.0的甘氨酸緩沖液，其會(huì)從抗體中釋放A β肽?？?A β -肽抗體也可用于A β -肽的診斷測(cè)定，例如檢測(cè)其在特定細(xì)胞、組織或血 清中的出現(xiàn)。因此，所述抗體可用于淀粉樣變的診斷，特別是選自如下的神經(jīng)變性疾病輕 度認(rèn)知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海 默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)，以及唐氏綜合征中的 神經(jīng)變性；優(yōu)選阿爾茨海默病。對(duì)于診斷應(yīng)用，所述抗體通常用可檢測(cè)部分標(biāo)記。可使用許多標(biāo)記，其通?？煞譃?如下幾組(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和1311。所述抗體可以利用如Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2,Giitigen et al. ,Ed. ,ffiley-Interscience. New York, New York. Pubs.，(1991)所述的技術(shù)，用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，放射性可以利 用閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量。(b)可以利用熒光標(biāo)記，如稀土金屬螯合物(銪螯合物)或熒光素及其衍生物、若 丹明及其衍生物、丹磺酰、麗絲胺(Lissamine)、藻紅素和得克薩斯紅(Texas Red)?？梢岳?用例如Current Protocols in Immunology，見(jiàn)上文所公開(kāi)的技術(shù)將熒光標(biāo)記與抗體偶聯(lián)。 熒光可以使用熒光計(jì)定量。(c)可以利用各種酶-底物標(biāo)記。酶通常催化生色底物的化學(xué)改變，這可以使用 各種技術(shù)測(cè)量。例如，酶可催化底物顏色改變，這可以通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量?；蛘撸缚筛?變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。定量熒光改變的技術(shù)在上文描述?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過(guò)化學(xué)反應(yīng) 變成電子激發(fā)的，然后可以發(fā)出可測(cè)量的光(如使用化學(xué)發(fā)光計(jì)測(cè)量)或者將能量送給熒 光接受體。酶標(biāo)記的實(shí)例包括螢光素酶(例如螢火蟲(chóng)螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國(guó)專利 4，737，456 號(hào))、螢光素、2，3- 二氫 2，3- 二氮雜萘二酮(2，3-dihydrophthalazinedione)、 蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過(guò)氧化物酶如辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)、堿性磷酸酶、0-半乳糖苷 酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(如尿酸氧化酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶 等。將酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)在 0' Sullivan et al.，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,in Methods in Enzym(ed Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York,73 :147-166(1981)中ffii$。酶-底物組合的實(shí)例包括例如(i)辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)與作為底物的過(guò)氧化氫酶，其中過(guò)氧化氫酶氧化染料 前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3，3' ,5,5'-四甲基鹽酸聯(lián)苯胺(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)與作為生色底物的磷酸對(duì)硝基苯酯；和(iii) β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)與生色底物(例如ρ_硝基苯基-β _D_半乳 糖苷酶)或熒光底物4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷酶G-methylumbelliferyl-ii-D-ga lactosidase)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用許多其它酶-底物組合。有時(shí)，將標(biāo)記與抗體間接偶聯(lián)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的的各種技術(shù)。例 如，可以將抗體與生物素偶聯(lián)，以及可以將任何上述三大類標(biāo)記與抗生物素蛋白偶聯(lián)，或者 反之亦然。生物素選擇性地與抗生物素蛋白結(jié)合，因此可以將該標(biāo)記以這種間接方式與抗 體偶聯(lián)。或者，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與抗體的間接偶聯(lián)，將抗體與小的半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)， 并將上述不同類型標(biāo)記之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。因此，可以實(shí)現(xiàn) 標(biāo)記與抗體的間接偶聯(lián)。Aβ -抗體不需要標(biāo)記，并且其存在可以使用與Aβ -抗體結(jié)合的標(biāo)記的抗體來(lái)檢 測(cè)。本發(fā)明的抗體可用于任何已知測(cè)定方法，如競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定、直接和間接夾心 ^^ ^ ^ ^。 Zola， Monoclonal Antibodies A Manual of Techniques, pp.147-158(CRC Press. Inc.，1987)。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定依賴于標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)物與測(cè)試樣品分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量的抗體 的能力。測(cè)試樣品中Αβ-肽的量與變?yōu)榕c抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量成反比。為了便于確定 變?yōu)榻Y(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物的量，抗體在競(jìng)爭(zhēng)之前或之后通常是不溶的，由此與抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物 和分析物可以方便地與保持未結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)物和分析物分離。夾心測(cè)定涉及使用兩種抗體，每種抗體能夠與要檢測(cè)的蛋白的不同免疫原性部分 或表位結(jié)合。在夾心測(cè)定中，測(cè)試樣品分析物由固定在固體支持物上的第一抗體結(jié)合，然后 第二抗體與分析物結(jié)合，因此形成不溶的三部分復(fù)合物。第二抗體自身可以用可檢測(cè)部分 標(biāo)記(直接夾心測(cè)定)，或者可以使用可檢測(cè)部分標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體測(cè)量(間接夾心 測(cè)定)。例如，一種優(yōu)選類型的夾心測(cè)定是ELISA測(cè)定，其中可檢測(cè)部分是酶。對(duì)于免疫組織化學(xué)，組織樣品可以是新鮮或冷凍的，或者可以包埋在石蠟中及用 防腐劑如福爾馬林固定。診斷試劑盒便利地，本發(fā)明的抗體可以在試劑盒中提供，所述試劑盒即預(yù)定量的試劑與進(jìn)行 診斷測(cè)定的說(shuō)明書(shū)的包裝的組合。在抗體用酶標(biāo)記的情況下，試劑盒包含酶所需的底物和 輔因子(例如提供可檢測(cè)生色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。此外，可以包含其它添加劑，如穩(wěn) 定劑、緩沖液(例如封閉緩沖液或裂解緩沖液)等。各種試劑的相對(duì)量可以是廣泛的，以提供充分優(yōu)化測(cè)定靈敏性的試劑溶液的濃度。特別地，試劑可以干粉，通常是凍干粉末的形式 提供，其包含溶解時(shí)提供具有合適濃度的試劑溶液的賦形劑。本發(fā)明的診斷試劑盒可以含有如下文所述的其它生物學(xué)活性物質(zhì)。特別優(yōu)選用于 所述診斷試劑盒中的是谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑。本發(fā)明的診斷試劑盒可以特別用于檢測(cè)和診斷淀粉樣變相關(guān)疾病和疾病狀況，特 別是選自如下的神經(jīng)變性疾病輕度認(rèn)知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發(fā)性阿爾茨 海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥 型癡呆(FDD)，唐氏綜合征中的神經(jīng)變性；優(yōu)選阿爾茨海默病。本發(fā)明特別涉及特征在于以高親和力與Αβ_肽結(jié)合的抗體。本發(fā)明還涉及特征 在于以高親和力與Αβ-肽或其變體結(jié)合的抗體。本發(fā)明中所述高親和力是指Kd值為10- 或更好的親和力，優(yōu)選Kd值為或更好，甚至更優(yōu)選Kd值為10_9M-10_12M。因此，本發(fā)明 的抗體以高于先前已知的抗體的親和力與A β -肽結(jié)合。特別地，所述抗體優(yōu)選是單克隆抗體，并選自如下組A β 5-5-6 (DSM ACC 2923)A β 6-1-6 (DSM ACC 2924)A β 17-4-3 (DSM ACC 2925)A β 24-2-3 (DSM ACC 2926)本發(fā)明的抗體可特別用于診斷方法中，以檢測(cè)淀粉樣變，特別是選自如下的神經(jīng) 變性疾病輕度認(rèn)知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家 族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)，唐氏綜 合征中的神經(jīng)變性；優(yōu)選阿爾茨海默病。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗體可以是人源化抗體或者嵌合抗體或者人抗體。此外，選自上述組的抗體也可以是所述組的功能性變體。在本發(fā)明中，P-Glu-A β -肽的變體特別是pGlu-Αβ 3-38'pGlu-A^3-40'pGlu-A β 3-42Αβ -肽的其它變體是所有pGlu-Αβ 3_χ變體，已經(jīng)證實(shí)其由于阿爾茨海默病或者 在阿爾茨海默病之前在腦中積聚。X定義為10至42的整數(shù)，例如在上述pGlu-Ai33_42中， “42”是χ所表示的整數(shù)。在本發(fā)明中，本發(fā)明抗體的“功能性變體”是這樣的抗體或其功能性變體，其保留 結(jié)合能力，特別是與PGlu-A β 3-χ肽以高親和力結(jié)合的能力。本領(lǐng)域已知這種功能性變體的 條件，并包含上述可能性，其在抗體及其片段的定義下表示。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是如上文所定義的抗體片段。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是與由上文所定義的抗體結(jié)合的表位結(jié)合 的抗體，特別是抗體5-5-6、抗體6-1-6、抗體17-4-3和抗體對(duì)_2_3。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是具有上文所定義的抗體的互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)的抗體。優(yōu)選地，所述抗體可以是標(biāo)記的；特別地，可能的標(biāo)記是上述那些標(biāo)記以及 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于抗體的診斷用途的所有標(biāo)記。
優(yōu)選地，所述抗體固定在固相上。本發(fā)明還涉及可得自雜交瘤細(xì)胞系6-1-6 (DSM ACC 2924)的抗體。本發(fā)明還涉及包含上文所定義的抗體的組合物。特別地，所述組合物是用于診斷 的組合物，特別是用于神經(jīng)變性疾病的診斷，所述神經(jīng)變性疾病選自輕度認(rèn)知障礙(MCI)， 阿爾茨海默病(AD)，如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家 族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)，唐氏綜合征中的神經(jīng)變性；優(yōu)選阿爾茨 海默?。惶貏e是通過(guò)檢測(cè)生物樣品中的Αβ肽或其變體來(lái)進(jìn)行診斷。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明及本文前述的抗體或其片段呈現(xiàn)出的對(duì)Αβ寡聚體、 纖維、原纖維或絲的結(jié)合親和力比對(duì)A β單體的結(jié)合親和力高至少2倍，特別是至少4倍、 特別是至少10倍、特別是至少15倍，更特別是至少20倍，但是特別是至少25倍。仍然在一實(shí)施方案中，提供了本文前述的抗體或其片段，或者嵌合抗體或片段，或 者人源化抗體或其片段，所述抗體充分與哺乳動(dòng)物中，特別是人腦中包括A β斑在內(nèi)的聚 集的Αβ結(jié)合，但是優(yōu)選不表現(xiàn)出與淀粉樣前體蛋白(APP)的任何顯著的交叉反應(yīng)性。在本發(fā)明另一方面，提供了本文前述的抗體或其片段，或者嵌合抗體或其片段，或 者人源化抗體或其片段，所述抗體充分與哺乳動(dòng)物中，特別是人腦中可溶性聚合淀粉樣蛋 白，特別是淀粉樣蛋白β (Αβ)，包括Αβ單體結(jié)合，但是優(yōu)選不表現(xiàn)出與淀粉樣前體蛋白 (APP)的任何顯著的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明還涉及上文所定義的人源化形式的抗體，包含所述人源化抗體的組合物以 及所述組合物在治療淀粉樣變，特別是治療哺乳動(dòng)物特別是人的神經(jīng)變性疾病中的用途。 所述神經(jīng)變性疾病特別選自輕度認(rèn)知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，如散發(fā)性阿爾茨海 默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥型 癡呆(FDD)，唐氏綜合征中的神經(jīng)變性。優(yōu)選所述神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默病。本發(fā)明還涉及如下雜交瘤細(xì)胞系5-5-6、6-1_6、17-4-3和M_2_3。本發(fā)明還涉及上文所定義的抗體或包含所述抗體的組合物在體外診斷方法中的 用途。特別地，這種診斷方法用于診斷選自如下的神經(jīng)變性疾病輕度認(rèn)知障礙
爾茨海默病(AD)，如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家族 性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)，唐氏綜合征中的神經(jīng)變性；優(yōu)選阿爾茨海 默病；特別是通過(guò)檢測(cè)生物樣品中的Αβ肽或其變體來(lái)進(jìn)行診斷。
優(yōu)選地，所述樣品是血清樣品。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，所述樣品是液體或腦脊液(CSF)樣品。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及診斷淀粉樣變相關(guān)疾病或疾病狀況，優(yōu)選 阿爾茨海默病的體外或原位診斷方法，所述方法包括如下步驟使本發(fā)明的抗體與疑似患有所述疾病狀況或疾病的個(gè)體的樣品接觸，所述樣品優(yōu) 選自血清、液體或CSF樣品，最優(yōu)選血清樣品；或者與特定身體部分或身體區(qū)域接觸，以及檢測(cè)所述抗體與樣品的pGlu-淀粉樣蛋白、優(yōu)選pGlu-Αβ肽的結(jié)合。更特別地，本發(fā)明涉及淀粉樣變相關(guān)疾病或疾病狀況，優(yōu)選阿爾茨海默病的診斷 方法，所述方法包括檢測(cè)抗體或其活性片段與樣品中的或原位PGlu-淀粉樣蛋白，優(yōu)選 PGlu-A β肽的免疫特異性結(jié)合，所述方法包括如下步驟(a)使疑似含有淀粉樣蛋白的樣品或者特定的身體部分或身體區(qū)域與本發(fā)明的抗體，特別是單克隆抗體，或者本發(fā)明及本文前述的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其 片段和/或它們的功能性部分接觸，所述抗體與pGlu-Αβ肽結(jié)合；(b)使所述抗體和/或其功能性部分與pGlu-Αβ肽結(jié)合以形成免疫復(fù)合物；(c)檢測(cè)所述免疫復(fù)合物的形成；以及(d)使所述免疫復(fù)合物的存在或不存在與所述樣品或者特定的身體部分或區(qū)域中 WpGlu-Aii肽的存在或不存在相關(guān)連。本發(fā)明還包括確定組織和/或體液中促淀粉樣變斑負(fù)荷(amyloidogenic plaque burden)程度的方法，所述方法包括(a)獲得研究的組織和/或體液的代表性樣品；(b)用本發(fā)明的抗體，特別是單克隆抗體，或者本發(fā)明及本文前述的嵌合抗體或其 片段，或者人源化抗體或其片段和/或它們的功能部性分檢測(cè)所述樣品；(c)確定與蛋白結(jié)合的抗體的量；以及(d)計(jì)算所述組織和/或體液中的斑負(fù)荷。特別地，本發(fā)明涉及確定組織和/或體液中促淀粉樣變斑負(fù)荷的程度的方法，其 中確定步驟c)中免疫復(fù)合物的形成，由此所述免疫復(fù)合物的存在或不存在與淀粉樣蛋白， 特別是pGlu-Αβ肽的存在或不存在相關(guān)。仍然在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明 的抗體，或者本發(fā)明及本文前述的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其片段，包括它們 的任何功能等同的抗體或者任何衍生或功能性部分；特別是藥物組合物，其任選還包含藥 學(xué)可接受的載體。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所述組合物包含治療有效量的抗體。本發(fā)明還包括這樣的混合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的抗體，特別是單克隆 抗體，或者本發(fā)明及本文前述的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其片段，包括它們的 任何功能等同的抗體或者任何衍生或功能性部分；以及任選的其它生物學(xué)活性物質(zhì)和/或 藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑。特別地，本發(fā)明涉及這樣的混合物，其中所述其它生物學(xué)活性物質(zhì)是用于淀粉樣 變藥物中的化合物，所述淀粉樣變是與涉及神經(jīng)變性疾病的淀粉樣蛋白或淀粉狀蛋白如 Αβ蛋白相關(guān)的一組疾病或病癥，所述神經(jīng)變性疾病選自輕度認(rèn)知障礙(MCI)，阿爾茨海默 病(AD)，如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型 癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)，唐氏綜合征中的神經(jīng)變性；優(yōu)選阿爾茨海默病。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，其它生物學(xué)活性物質(zhì)或化合物也可以是治療劑，所述 治療劑可用于治療由淀粉樣蛋白β導(dǎo)致的淀粉樣變，或者可用于其它神經(jīng)性病癥的藥物 中。所述其它生物學(xué)活性物質(zhì)或化合物可以通過(guò)與本發(fā)明的抗體相同或相似機(jī)制，或 者通過(guò)不相關(guān)的作用機(jī)制，或者通過(guò)多種相關(guān)和/或不相關(guān)的作用機(jī)制來(lái)發(fā)揮其生物作用。通常，所述其它生物學(xué)活性化合物可以包括神經(jīng)元傳遞(neutron-transmission) 增強(qiáng)劑，精神治療藥物，乙酰膽堿酯酶抑制劑，鈣通道阻滯劑，生物胺，苯并二氮雜罩鎮(zhèn)靜 劑，乙酰膽堿合成、貯存或釋放增強(qiáng)劑，乙酰膽堿突觸后受體激動(dòng)劑，單胺氧化酶-A或-B抑制劑，N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受體拮抗劑，非留體類抗炎藥物，抗氧化劑以及5-羥色 胺能受體拮抗劑。更特別地，本發(fā)明涉及這樣的混合物，其包含至少一種化合物與本發(fā)明的抗體以 及任選的藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑，所述化合物選自有效抗氧化 應(yīng)激的化合物；抗凋亡化合物；金屬螯合劑；DNA修復(fù)抑制劑如哌侖西平和代謝物；3-氨 基-1-丙磺酸(3-APS) ；1,3-丙二磺酸鹽(1，3PDS) ； α -分泌酶激活劑；β -和γ -分泌酶 抑制劑；Tau蛋白；神經(jīng)遞質(zhì)；β-折疊破壞物(/3-sheet breaker)；淀粉樣蛋白β清除/ 耗竭細(xì)胞組分引誘劑；包括焦谷氨酸化淀粉樣蛋白β 3-42在內(nèi)的N末端截短淀粉樣蛋白 β的抑制劑，如谷氨酰胺酰基環(huán)化酶抑制劑；抗炎分子；或者膽堿酯酶抑制劑(ChEI)，如他 克林、利凡斯的明、多奈哌齊和/或加蘭他敏；Ml激動(dòng)劑；以及其它藥物，包括任何淀粉樣蛋 白或tau修飾藥物和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。本發(fā)明還涉及這樣的混合物，其中所述化合物是膽堿酯酶抑制劑(ChEI)，特別是 這樣的混合物，其中所述化合物選自他克林、利凡斯的明、多奈哌齊、加蘭他敏、煙酸和美金 剛。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的混合物可以包含煙酸或美金剛與本發(fā)明的抗體，以 及任選的藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的混合物可以包含谷氨酰胺酰基環(huán)化酶抑制劑與本發(fā) 明的抗體，以及任選的藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形劑。優(yōu)選的谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑描述于WO 2005/075436，特別是第31_40頁(yè) 所示的實(shí)施例1-141。實(shí)施例1-141的合成示于WO 2005/075436的第40-48頁(yè)。WO 2005/075436關(guān)于實(shí)施例1_141、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的用 途的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/055945，特別是第 46-155頁(yè)所示的實(shí)施例1-473。實(shí)施例1-473的合成示于WO 2008/055945的第156-192 頁(yè)。WO 2008/055945關(guān)于實(shí)施例1_473、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制 劑的用途的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/055947，特別是第 53-118頁(yè)所示的實(shí)施例l-345o實(shí)施例1-345的合成示于WO 2008/055947的第119-133 頁(yè)。WO 2008/055947關(guān)于實(shí)施例1_345、它們的合成及它們作為谷氨酰胺酰基環(huán)化酶抑制 劑的用途的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺酰基環(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/055950，特別是第 57-120頁(yè)所示的實(shí)施例1-212。實(shí)施例1-212的合成示于WO 2008/055950的第121-128 頁(yè)。WO 2008/055950關(guān)于實(shí)施例1_212、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制 劑的用途的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/065141，特別是第56_59 頁(yè)所示的實(shí)施例1-25。實(shí)施例1-25的合成示于WO 2008/065141的第60-67頁(yè)。WO 2008/065141關(guān)于實(shí)施例1_25、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的用途 的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/110523，特別是第55_59頁(yè)所示的實(shí)施例1-27。實(shí)施例1-27的合成示于WO 2008/110523的第59-71頁(yè)。WO 2008/110523關(guān)于實(shí)施例1_27、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的用途 的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/U8981，特別是第62_65 頁(yè)所示的實(shí)施例1-18。實(shí)施例1-18的合成示于WO 2008/128981的第65-74頁(yè)。WO 2008/128981關(guān)于實(shí)施例1_18、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的用途 的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/U8982，特別是第61_67 頁(yè)所示的實(shí)施例1-44。實(shí)施例1-44的合成示于WO 2008/U8982的第68-83頁(yè)。WO 2008/128982關(guān)于實(shí)施例1_44、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的用途 的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺酰基環(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/U8983，特別是第64_68 頁(yè)所示的實(shí)施例1-30。實(shí)施例1-30的合成示于WO 2008/U8983的第68-80頁(yè)。WO 2008/128983關(guān)于實(shí)施例1_30、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的用途 的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/128984,特別是第63_69 頁(yè)所示的實(shí)施例1-36。實(shí)施例1-36的合成示于WO 2008/U8984的第69-81頁(yè)。WO 2008/128984關(guān)于實(shí)施例1_36、它們的合成及它們作為谷氨酰胺酰基環(huán)化酶抑制劑的用途 的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺酰基環(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/U8985，特別是第66_76 頁(yè)所示的實(shí)施例1-71。實(shí)施例1-71的合成示于WO 2008/128985的第76-98頁(yè)。WO 2008/128985關(guān)于實(shí)施例1_71、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的用途 的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。其它優(yōu)選的谷氨酰胺酰基環(huán)化酶抑制劑描述于WO 2008/U8986，特別是第 65-66頁(yè)所示的實(shí)施例1-7。實(shí)施例1-7的合成示于WO 2008/128986的第66-73頁(yè)。WO 2008/128986關(guān)于實(shí)施例1_7、它們的合成及它們作為谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑的用途 的公開(kāi)通過(guò)引用并入本文。仍然在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，提供了這樣的混合物，其包含“非典型抗精神病 藥”；和本發(fā)明的抗體、特別是單克隆抗體，但是特別是本發(fā)明及本文前述的嵌合抗體或其 片段，或者人源化抗體或其片段；以及任選的藥學(xué)可接受的載體和/或稀釋劑和/或賦形 劑，所述“非典型抗精神病藥”例如氯氮平、齊拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奧氮平，其用于 治療陽(yáng)性和陰性精神病癥狀，包括幻覺(jué)、妄想、思維障礙(thought disorder)(表現(xiàn)為明顯 的不連貫、出軌(derailment)、言不及義)和怪誕或紊亂的行為，以及快感缺乏、情感障礙 (flattened affect)、情感淡漠和社交退縮(social withdrawal) 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明及本文前述的組合物和混合物包含分別為治 療有效量的抗體和生物學(xué)活性物質(zhì)?？梢院线m地用于與本發(fā)明的抗體組合的混合物中的其它化合物描述于 W02008/065141 (特別參見(jiàn)第37/38頁(yè))，包括PEP抑制劑(第43/44頁(yè))；LiCl ；二肽基氨 基肽酶的抑制劑，優(yōu)選地DP IV或DP IV樣酶的抑制劑(參見(jiàn)第48/49頁(yè))；乙酰膽堿酯酶(ACE)抑制劑(參見(jiàn)第47頁(yè))；PIMT增強(qiáng)劑；β分泌酶的抑制劑(參見(jiàn)第41頁(yè))；Y分泌酶 的抑制劑(參見(jiàn)第41/42頁(yè))；中性內(nèi)肽酶的抑制劑；磷酸二酯酶-4(PDE-4)的抑制劑(參 見(jiàn)第42/43頁(yè))；TNF α抑制劑；毒蕈堿性Ml受體拮抗劑(參見(jiàn)第46頁(yè))；NMDA受體拮抗劑 (參見(jiàn)第47/48頁(yè))；G -1受體抑制劑；組胺Η3拮抗劑(參見(jiàn)第43頁(yè))；免疫調(diào)節(jié)劑、免疫 抑制劑或者選自antegren (那他珠單抗)、Neurelan (氨吡啶-SR)、campath (阿侖單抗)、 IR 208、NBI 5788/MSP 771 (替利莫肽)、紫杉醇、Anergix. MS (AG 沘4)、SH636、達(dá)芙文(CD 271，阿達(dá)帕林)、BAY 361677(白介素-4)、基質(zhì)-金屬蛋白酶抑制劑(例如BB 76163)、干 擾素-τ (滋養(yǎng)層素(trophoblastin))和SAIK-MS的藥劑；β -淀粉樣蛋白抗體(參見(jiàn)第 44頁(yè))；半胱氨酸蛋白酶抑制劑(參見(jiàn)第44頁(yè))；MCP-I拮抗劑(參見(jiàn)第44/45頁(yè))；淀粉 樣蛋白沉積抑制劑(參見(jiàn)第42頁(yè))以及β淀粉樣蛋白合成抑制劑(參見(jiàn)第42頁(yè))，該文 獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的混合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的抗 體，特別是單克隆抗體，或者本發(fā)明及本文前述的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其 片段，和/或生物學(xué)活性物質(zhì)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體，特別是單克隆抗體，但是特別是本發(fā)明及本文前述 的嵌合抗體或其片段，或者人源化抗體或其片段，和/或它們的功能性部分，和/或包含所 述抗體的藥物組合物或混合物在制備用于治療或緩和淀粉樣變的藥物中的用途，所述淀粉 樣變是一組與淀粉樣斑形成相關(guān)的疾病和病癥，包括繼發(fā)性淀粉樣變和年齡相關(guān)性淀粉樣 變，例如這樣的疾病，包括但不限于神經(jīng)性病癥如阿爾茨海默病(AD)，盧伊體癡呆，唐氏綜 合征，具有淀粉樣變的遺傳性腦出血(Dutch型)；關(guān)島帕金森-癡呆綜合征；以及基于或 者與淀粉樣蛋白相關(guān)的其它疾病，如進(jìn)行性核上麻痹，多發(fā)性硬化癥；克-雅病，帕金森病， HIV-相關(guān)癡呆，ALS (肌萎縮側(cè)索硬化癥)，成人發(fā)病型糖尿病；老年性心臟淀粉樣變；內(nèi)分 泌腫瘤及其它疾病，包括黃斑變性。本發(fā)明還包括這樣的方法，其用于制備用在預(yù)防、治療或緩和淀粉樣變的作用的 方法中的本發(fā)明的抗體，特別是單克隆抗體，但是特別是本發(fā)明及本文前述的嵌合抗體或 其片段，或者人源化抗體或其片段，和/或它們的功能性部分，和/或包含特別是治療有效 量的所述抗體和/或其功能性部分的藥物組合物或混合物，所述淀粉樣變是一組與淀粉 樣斑形成相關(guān)的疾病和病癥，包括繼發(fā)性淀粉樣變和年齡相關(guān)性淀粉樣變，例如這樣的疾 病，包括但不限于神經(jīng)性病癥如輕度認(rèn)知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)，例如散發(fā)性阿爾 茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性 丹麥型癡呆(FDD)，唐氏綜合征中的神經(jīng)變性；盧伊體癡呆，具有淀粉樣變的遺傳性腦出血 (Dutch型)；關(guān)島帕金森-癡呆綜合征；以及基于或者與淀粉樣蛋白相關(guān)的其它疾病，如進(jìn) 行性核上麻痹，多發(fā)性硬化癥；克-雅病，帕金森病，HIV-相關(guān)癡呆，ALS (肌萎縮側(cè)索硬化 癥)，成人發(fā)病型糖尿病；老年性心臟淀粉樣變；內(nèi)分泌腫瘤及其它疾病，包括黃斑變性，所 述方法包括將本發(fā)明的抗體，特別是單克隆抗體，但是特別是本發(fā)明的嵌合抗體或其片段， 或者人源化抗體或其片段配制成藥學(xué)可接受形式。本發(fā)明還包括預(yù)防、治療或緩和淀粉樣變的作用的方法，所述淀粉樣變是一組與 淀粉樣斑形成相關(guān)的疾病和病癥，包括繼發(fā)性淀粉樣變和年齡相關(guān)性淀粉樣變，例如這樣 的疾病，包括但不限于神經(jīng)性病癥如輕度認(rèn)知障礙(MCI)，阿爾茨海默病(AD)例如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家 族性丹麥型癡呆(FDD)，唐氏綜合征中的神經(jīng)變性；盧伊體(Lewy body)癡呆，具有淀粉樣 變的遺傳性腦出血(Dutch型)；關(guān)島帕金森-癡呆綜合征；以及基于或者與淀粉樣蛋白相 關(guān)的其它疾病，如進(jìn)行性核上麻痹，多發(fā)性硬化癥；克-雅病，帕金森病，HIV-相關(guān)癡呆， ALS (肌萎縮側(cè)索硬化癥)，成人發(fā)病型糖尿??；老年性心臟淀粉樣變；內(nèi)分泌腫瘤及其它疾 病，包括黃斑變性，所述方法通過(guò)將抗體和/或其功能性部分，但是特別是人源化抗體和/ 或其功能性部分，或者包含這種抗體和/或其功能性部分的組合物或混合物給予患有這種 病癥的動(dòng)物或人來(lái)進(jìn)行，所述方法包括給予治療有效量的抗體。本發(fā)明的另一目的是提供通過(guò)將本發(fā)明及本文所述的抗體，特別是藥物組合物給 予動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物或人來(lái)治療淀粉樣變的方法，所述淀粉樣變是一組與淀粉樣斑形 成相關(guān)的疾病和病癥，包括繼發(fā)性淀粉樣變和年齡相關(guān)性淀粉樣變，包括但不限于神經(jīng)變 性疾病如輕度認(rèn)知障礙(MCI)、阿爾茨海默病(AD)例如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家 族性阿爾茨海默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)、唐氏綜 合征中的神經(jīng)變性；特別是特征在于喪失認(rèn)知記憶能力的疾病或疾病狀況。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了保持或增加患有記憶障礙的動(dòng)物，特別是哺 乳動(dòng)物或人的認(rèn)知記憶能力，但是特別是恢復(fù)認(rèn)知記憶能力的方法，所述方法通過(guò)將本發(fā) 明及本文前述的抗體，特別是藥物組合物給予動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物或人來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的另一目的是提供治療組合物及生產(chǎn)這種組合物的方法，以及利用本發(fā)明 及本文前述的抗體治療淀粉樣變的方法，所述淀粉樣變是一組與淀粉樣斑形成相關(guān)的疾病 和病癥，包括繼發(fā)性淀粉樣變和年齡相關(guān)性淀粉樣變，包括但不限于神經(jīng)變性疾病如輕度 認(rèn)知障礙(MCI)、阿爾茨海默病(AD)例如散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)或者家族性阿爾茨海 默癡呆(FAD)如家族性英國(guó)型癡呆(FBD)和家族性丹麥型癡呆(FDD)、唐氏綜合征中的神經(jīng) 變性；特別是特征在于喪失認(rèn)知記憶能力的疾病或疾病狀況。特別地，本發(fā)明涉及治療動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物或人，其患有特征在于喪失認(rèn)知記 憶能力的淀粉樣變相關(guān)疾病狀況，所述治療使得保留認(rèn)知記憶能力。
實(shí)施例1.材料和方法1. 1抗體的產(chǎn)生小鼠為生產(chǎn)雜交瘤，使用8周齡雌性BALB/C小鼠(Charles River)。骨髓瘤細(xì)胞系為產(chǎn)生雜交瘤，使用來(lái)自 Deutsche Stammsammlung von Mikoorganismen und Zellkulturen 的骨髓瘤細(xì)胞系 SP2/0_Agl4?？乖褂秒膒Glu-6166 (序列 pGlu-FRHDSGC，SEQ ID NO :65)。策略作為免疫原，將所述肽經(jīng)由3種不同連接物的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)偶聯(lián)至牛甲狀腺球 蛋白(thyroglubulin) (BTG，SIGMA)。所用的三種不同長(zhǎng)度的連接物來(lái)自N-[e_馬來(lái)酰亞氨基己酰氧基]琥珀酰亞胺酯(EMCS)、琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞氨基甲基)-環(huán)己 烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LCSMCC)和N-[b-馬來(lái)酰亞氨基丙氧基]琥珀酰亞胺酯 (BMPS)。為檢測(cè)產(chǎn)生的抗體，將相同的肽經(jīng)由琥珀酰亞胺基-6_[(b-馬來(lái)酰亞氨基_丙酰 氨基)己酸酯](SMPH)的馬來(lái)酰亞氨基基團(tuán)偶聯(lián)至牛血清白蛋白(BSA，SIGMA)。方法用于免疫的肽的偶聯(lián)偶聯(lián)經(jīng)由肽的半胱氨酸殘基的SH-基團(tuán)以兩步進(jìn)行。1.載體蛋白的馬來(lái)酰化(Maleoylation)將2至5mg相應(yīng)連接物(50mg/ml于N-甲基吡咯烷酮(NMP)中)加入2ml載體 蛋白溶液(10mg/ml于0. ImM NaHC03, pH 8. O中)中。將反應(yīng)混合物在室溫(RT)下孵育 Ih0然后將反應(yīng)混合物用S印hadex G_50柱(1. 5x14cm)脫鹽，該柱已用50mM磷酸鈉，250mM NaCl，pH 6. 8 平衡。2.馬來(lái)?；腂TG與肽的偶聯(lián)將250 μ 1肽溶液(10mg/ml于重蒸餾水(Aqua bidest)中)與2ml含有50mM磷 酸鈉，250ml NaCl,pH 6. 8中的馬來(lái)?；妮d體蛋白(2. 5mg/ml)的溶液混合，在4°C下孵育 2h，再在RT下孵育4h。未反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)通過(guò)加入2-巰基乙醇直至濃度為IOmM并 在4°C下過(guò)夜孵育而封閉。將所得偶聯(lián)物對(duì)IOmM磷酸鈉，150mM NaCl, pH 7. 5在4°C下滲 析(更換緩沖液3次，MW截?cái)嘀?0. 000)。用于ELISA的肽的偶聯(lián)偶聯(lián)經(jīng)由肽的半胱氨酸殘基的SH-基團(tuán)以兩步進(jìn)行。1.載體蛋白的馬來(lái)酰化將2mg SMPH(50mg/ml于N-甲基吡咯烷酮，NMP中)加入2ml載體蛋白溶液(BSA， 10mg/ml于0. ImM NaHC03, pH 8. O中)中。將反應(yīng)混合物在室溫(RT)下孵育lh。然后將 反應(yīng)混合物用S印hadex G-50柱(1. 5x14cm)脫鹽，該柱已用50mM磷酸鈉，250mM NaCl, pH 6. 8平衡。2.馬來(lái)?；腂TG與肽的偶聯(lián)將100 μ 1 肽溶液(10mg/ml 于 50mM 磷酸鈉，250mM NaCl，pH 6. 8 中)與 Iml 含 有50mM磷酸鈉，250ml NaCl,pH 6. 8中的馬來(lái)?；妮d體蛋白(2. 5mg/ml)的溶液混合，在 4°C下孵育2h，再在RT下孵育4h。未反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)通過(guò)加入2-巰基乙醇直至濃 度為IOmM并在4°C下過(guò)夜孵育而封閉。將所得偶聯(lián)物對(duì)IOmM磷酸鈉，150mM NaCl,pH 7. 5 在4°C下滲析(更換緩沖液3次，MW截?cái)嘀?0. 000)。將5只小鼠腹膜內(nèi)免疫39天。對(duì)于免疫，使用油包水乳液，該乳液由等份的抗原 溶液(由等份的三種不同肽-BTG-偶聯(lián)物組成)和完全或不完全弗氏佐劑組成。MA將3只免疫的小鼠通過(guò)C02培育(incubation)處死。取出脾并在無(wú)菌條件下勻漿。將脾細(xì)胞和骨髓瘤SP2/0細(xì)胞在達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM, SIGMA)中洗滌幾次，并以2，3脾細(xì)胞1 SP2/0細(xì)胞的比率，用聚乙二醇3350(lml 50% (w/v))融合。融合雜交瘤的進(jìn)一步操作根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)進(jìn)行。ELISA將針對(duì)IgG的ELISA用于篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清。測(cè)試在96孔聚苯乙烯(polystyrol) 微量滴定板(Greiner，編號(hào)655061)中進(jìn)行。將板用BSA-pGlu_6166肽包被。將100 μ 1未 稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清加入每孔中，并在RT下孵育1小時(shí)。將來(lái)自SP2/0細(xì)胞的上清用作陰 性對(duì)照。將來(lái)自脾細(xì)胞的上清用作陽(yáng)性對(duì)照。利用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG來(lái)檢測(cè)陽(yáng)性孔。在DynexOpsys MR酶標(biāo) 儀(Dynex Opsys MR Microplate Reader)中于 405nm 處測(cè)量光密度(OD)0詵擇產(chǎn)牛穩(wěn)定抗體的雜交瘤細(xì)胞將來(lái)自陽(yáng)性孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到M孔板中，并培養(yǎng)幾天。將細(xì)胞再次轉(zhuǎn)移，并在ELISA 中測(cè)試BSA-pGlu-6199結(jié)合及交叉反應(yīng)性。將陽(yáng)性孔用于雜交瘤細(xì)胞系的低溫保存。經(jīng)有限稀釋克降進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)克隆步驟以將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與不產(chǎn)生抗體的細(xì)胞分離，并且保證 所選擇的細(xì)胞是單克隆的。兩個(gè)克隆步驟均根據(jù)有限稀釋方法進(jìn)行。低溫保存所選擇的雜交瘤使用DMSO和標(biāo)準(zhǔn)方法低溫保存。1.2. ELISA 測(cè)定A β Ν3ρΕ_40 的捕獲利用來(lái)自 TGC (The GENETICS Company ；Switzerland) ^ hAi3 (x-40) ELISA (HS)基本上根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行。產(chǎn)生了用于Αβ N3pE(pGlu-6166)的生物素化的檢測(cè)抗體。當(dāng)提到時(shí)，將IBL HRP 偶聯(lián)的Αβ Ν3ρΕ抗體用作陽(yáng)性對(duì)照(僅與IBL ELISA人淀粉樣蛋白β (Ν3ρΕ)測(cè)定試劑 盒組合時(shí)可用)。合成相應(yīng)的A β Ν3ρΕ-40肽(50 μ g等份于六氟異丙醇(HFIP)中，儲(chǔ)存 在_80°C )。在即將使用之前，將HFIP蒸發(fā)，將肽用IOOmM Tris/HCl pH 10，4稀釋至1 μ g/ μ 。將這個(gè)儲(chǔ)存溶液進(jìn)一步用TGC抗體稀釋劑稀釋。隨后的捕獲和檢測(cè)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn) 行。1. 3. P印Spot 分析Aβ Ν3ρΕ抗體和細(xì)胞培養(yǎng)上清的特異性和生物學(xué)完整性用JPT P印tide Technologies GmbH, Volmerstrasse 5 (UTZ), 12489 Berlin, Germany ^ PepSpot i^i^M 定。相應(yīng)的P印Spot 膜在JPT制備。該方法的原理由Kramer et al. 1997Cell 91， 799-809介紹和描述。對(duì)于分析，將膜用TBST-M(10mM Tris-Hcl, pH 7. 5,150mM NaCl，0. 005 % 吐溫 20+5%脫脂乳)在室溫下溫和振蕩封閉2小時(shí)。在搖動(dòng)平臺(tái)上，于4°C下，將膜用在等體積 TBST-M中稀釋的各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育過(guò)夜。利用與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠二抗根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)程序進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。1.4.斑點(diǎn)印跡分析進(jìn)行簡(jiǎn)單的斑點(diǎn)印跡方案以獲得A β Ν3ρΕ抗體和細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)各自天然肽的 敏感性的信息。為此，將遞減濃度的A βΝ3ρΕ-40肽(IOOOng-Sng)點(diǎn)印在小塊硝酸纖維素 膜上，隨后進(jìn)行與P印Spot 膜一樣的實(shí)驗(yàn)程序。
1. 5. SDS PAGE將12% SDS聚丙烯酰胺凝膠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案成型。將15 μ 1細(xì)胞培養(yǎng)上清和10 μ g 生物素化的抗體在12% SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離。電泳在100V恒壓下進(jìn)行2小時(shí)。1. 6. BIAC0RE 分析將A β Ν3ρΕ-40肽(陽(yáng)性對(duì)照)和A β Ν3Ε-40肽(陰性對(duì)照)偶聯(lián)在Biacore CM5芯片上。使用未修飾的芯片以確定空白值。監(jiān)測(cè)在TGC稀釋劑中從20 μ g/ml稀釋至 1 μ g/ml的生物素化的抗體的締合與解離，以允許隨后確定各個(gè)KD值。以此方式，還確定了 各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)上清的結(jié)合特征。1. 6. 1 A β Ν3ρΕ特異性抗體克隆6-1-6和的親和力將純化的抗體克隆6-1-6在HBS-EP緩沖液(Biacore)中向下稀釋至100、50、30、 20、15、10、7、4、2、lnM。親和力使用帶有固定了 Aβ ρΕ3_40 的 CM5-芯片的 Biacore 3000 來(lái) 確定。系統(tǒng)以30μ1/π η運(yùn)行。測(cè)量的體效應(yīng)和與芯片表面的非特異性結(jié)合通過(guò)減去固定 了 Αβ ρΕ3-40的流動(dòng)池4的信號(hào)和空白流動(dòng)池3的信號(hào)而校正。締合(IOmin)通過(guò)注射 300 μ 1每種濃度而獲得。觀察解離IOmin以上。剩余的抗體分子通過(guò)注射5 μ 1 0. IM HCL 而除去。對(duì)于每種抗體濃度，記錄締合和解離。利用“二價(jià)分析物”模型，通過(guò)全局同時(shí)擬 合所有記錄的抗體濃度的締合和解離階段來(lái)確定締合和解離速率及解離常數(shù)。1. 7.測(cè)序抗體可變區(qū)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)使雜交瘤細(xì)胞在添加了 15% FBSU % MEM-NEA(非必需氨基酸，Gibco) ,50 μ g/ml 慶大霉素(Gibco)和50 μ M β-巰基乙醇的D-MEM (+L-谷氨酰胺，+丙酮酸鈉，4，5g/l葡萄 糖，Gibco)中，于37°C下和5%0)2中生長(zhǎng)。傳代培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞密度在3-4天后進(jìn)行。將細(xì) 胞以0. 5xl06細(xì)胞/ml接種，分瓶(splitting)在2_切106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度時(shí)進(jìn)行。cDNA合成和逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)NucleospinRNA分離試劑盒(Macherey-Nagel)的手冊(cè)從MlO6個(gè)細(xì)胞分離總 RNA。利用寡(dT)15 引物(Promega)和 Superscript III 逆轉(zhuǎn)錄酶 Qnvitrogen)，將 IOOng RNA用于cDNA合成。重鏈和輕鏈可變區(qū)的PCR擴(kuò)增利用Phusion 高保真 DNA 聚合酶(NEW ENGLAND BioLabs)，使用與引物 MHV1-12 組合的引物MHCGl (在克隆5-5-6和6-1-6的情況下)和MHCG2b (克隆7-4-3和24-2-3) 從模板cDNA中擴(kuò)增重鏈可變區(qū)。為了擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)，使用與引物MKV1-MKV11組合的引 物MKC。引物序列示于表1。PCR產(chǎn)物克隆于pJETl. 2中將PCR擴(kuò)增的重鏈和輕鏈可變區(qū)根據(jù)Clone JET PCR克隆試劑盒(i^rmentas)的 方案克隆入PJET1. 2/平端(blunt)載體。使用pJETl. 2測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。表1 用于重鏈和輕鏈可變區(qū)PCR擴(kuò)增的引物序列
權(quán)利要求
1.抗體，特征在于其與A肽或其變體結(jié)合，優(yōu)選以高親和力結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述高親和力是指解離常數(shù)(Kd)值為ΙΟΙ或更好。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有選自SEQID NO 49、53、57和61的核苷酸序列或者選自SEQ ID NO =50,54,58和62的氨基酸序列。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體的重鏈的可變部分具有選自SEQID NO 51、55、59和63的核苷酸序列或者選自SEQ ID NO 52、56、60和64的氨基酸序列。
6.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQID NO 49 的核苷酸序列或者SEQ ID NO :50的氨基酸序列，并且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有 SEQ ID NO 51的核苷酸序列或者SEQ ID NO 52的氨基酸序列。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQID N0:53 的核苷酸序列或者SEQ ID NO力4的氨基酸序列，并且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有 SEQ ID NO 55的核苷酸序列或者SEQ ID NO 56的氨基酸序列。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQID N0:57 的核苷酸序列或者SEQ ID NO :58的氨基酸序列，并且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有 SEQ ID NO 59的核苷酸序列或者SEQ ID NO 60的氨基酸序列。
9.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體的輕鏈的可變部分具有SEQID NO 61 的核苷酸序列或者SEQ ID NO :62的氨基酸序列，并且其中所述抗體的重鏈的可變部分具有 SEQ ID NO 63的核苷酸序列或者SEQ ID NO 64的氨基酸序列。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體選自下組或其功能性變體 A β 5-5-6 (保藏號(hào) DSM ACC 2923)A β 6-1-6 (保藏號(hào) DSM ACC 2924) A β 17-4-3 (保藏號(hào) DSM ACC 2925) A β 24-2-3 (保藏號(hào) DSM ACC 2926)。
11.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體是Aβ 6-1-6(保藏號(hào)DSM ACC 2924) 0
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體是Αβ24-2-3(保藏號(hào)DSM ACC 2926)。
13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其中所述抗體是保留高親和力的人源化或嵌合抗體 或者抗體片段。
14.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其用于檢測(cè)Aβ肽或其變體。
15.權(quán)利要求14的抗體，其中所述變體選自下組 PGIU-A β 3-38pGlu-A β 3-40 pGlu-Αβ 3_42，及 pGlu-A03_x 變體，其中χ為10至42的整數(shù)，優(yōu)選18至42、更優(yōu)選30至42的整數(shù)。
16.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其是人的。
17.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其是保留高親和力的雙抗體或單鏈抗體。
18.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其與由權(quán)利要求15所定義的抗體結(jié)合的表位結(jié)合。
19.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其具有權(quán)利要求15所定義的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)。
20.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其是標(biāo)記的。
21.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的抗體，其固定在固相上。
22.抗體，其得自雜交瘤細(xì)胞系DSM ACC 2923、DSM ACC 2924、DSM ACC 2925、DSM ACC 2926的任意一種。
23.組合物，其包含前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所定義的抗體。
24.權(quán)利要求23的組合物，其用于治療、預(yù)防或者延緩淀粉樣變。
25.權(quán)利要求23或M的組合物，其中所述淀粉樣變是選自輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默 病和唐氏綜合征中的神經(jīng)變性的神經(jīng)變性疾病。
26.權(quán)利要求23或M的組合物，其中所述淀粉樣變是散發(fā)性阿爾茨海默病或者家族性 阿爾茨海默癡呆。
27.權(quán)利要求沈的組合物，其中所述家族性阿爾茨海默癡呆是家族性英國(guó)型癡呆或者 家族性丹麥型癡呆。
28.雜交瘤細(xì)胞系DSMACC四23。
29.雜交瘤細(xì)胞系DSMACC 2924。
30.雜交瘤細(xì)胞系DSMACC四25。
31.雜交瘤細(xì)胞系DSMACC四沈。
32.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所定義的抗體或者權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)所定義的組合 物在診斷或者治療方法中的用途。
33.權(quán)利要求32的用途，其用于診斷淀粉樣變相關(guān)疾病或疾病狀況。
34.權(quán)利要求33的用途，其中所述淀粉樣變是選自輕度認(rèn)知障礙、阿爾茨海默病和唐 氏綜合征中的神經(jīng)變性的神經(jīng)變性疾病。
35.權(quán)利要求33的用途，其中所述淀粉樣變是散發(fā)性阿爾茨海默病或者家族性阿爾茨 海默癡呆。
36.權(quán)利要求35的用途，其中所述家族性阿爾茨海默癡呆是家族性英國(guó)型癡呆或者家 族性丹麥型癡呆。
37.診斷淀粉樣變相關(guān)疾病或疾病狀況，特別是阿爾茨海默病的體外診斷方法，包括如 下步驟使權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的抗體與疑似患有所述疾病或疾病狀況的個(gè)體的樣品接 觸，以及檢測(cè)所述抗體與來(lái)自所述樣品的PGlu-淀粉樣蛋白、優(yōu)選pGlu-Αβ肽的結(jié)合。
38.診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所定義的抗體和使用說(shuō)明書(shū)，以及任 選存在的其它生物學(xué)活性物質(zhì)。
39.權(quán)利要求32的診斷試劑盒，其中所述其它生物學(xué)物質(zhì)是谷氨酰胺?；h(huán)化酶抑制劑。
40.寡核苷酸，其選自SEQID No :23-48。
全文摘要
本發(fā)明涉及新診斷測(cè)定，其用于診斷淀粉樣變，特別是阿爾茨海默病及相關(guān)方面。特別地，本發(fā)明提供了單克隆抗體及抗體測(cè)定。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102131519SQ200980132674
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月21日
發(fā)明者A·賴澤瑙爾-紹普, H-U·德穆特, J-U·拉費(fèi)爾德, K·甘斯, M·克萊因施密特, S·席林, S·肯普弗 申請(qǐng)人:前體生物藥物股份公司