專利名稱：：齊墩果酸在制備治療皮膚瘢痕藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，是齊墩果酸在制備治療皮膚瘢痕藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：瘢痕是創(chuàng)傷修復(fù)的必然產(chǎn)物，凡涉及真皮層的傷口幾乎都以瘢痕愈合而告終。過(guò)度增生的瘢痕常會(huì)破壞人體表面的完整性或伴有各種程度的功能障礙，給病人帶來(lái)精神和身體上的雙重痛苦。皮膚瘢痕發(fā)病率高，但目前臨床應(yīng)用的藥物或療效不夠理想，或副作用較多，或有效成分不明確難以大量推廣應(yīng)用。齊墩果酸(Oleanolicacid,OA)為白色針狀結(jié)晶，是中藥女貞子中的主要有效成分。熔點(diǎn)309°C，可溶于甲醇、乙醇、苯、乙醚、丙酮和氯仿，幾乎不溶于水，對(duì)酸堿均不穩(wěn)定。其結(jié)構(gòu)式如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>HsCCHs齊墩果酸齊墩果酸的植物來(lái)源來(lái)源于木樨科植物齊墩果OleaeuropaeaL.葉，女貞LigustrumlucidumAit.果實(shí)，龍膽科植物青葉膽SwertiamileensisT.N.HeetW.L.Shi全草。廣泛分布于自然界中。齊墩果酸具有肝保護(hù)、抗癌、抗突變的作用以及對(duì)免疫系統(tǒng)和心血管的作用。在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，OA可使變性壞死的肝組織恢復(fù)正常來(lái)減輕丙氨酸活力下降、肝組織炎癥反應(yīng)減弱、血中丙種球蛋白下降，并能促進(jìn)肝細(xì)胞再生，使壞死區(qū)迅速修復(fù)，從而抑制膠原纖維增生，使肝硬變難以形成(李志梅，孫志勇，劉華慶.齊墩果酸對(duì)大鼠肝損傷的保護(hù)作用[J]·貴州醫(yī)藥，2004，28(7):582)。有研究認(rèn)為，OA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT15產(chǎn)生影響的作用機(jī)制是通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖(LiJ，GuoWJ,YangQY.EffectsofursolicacidandoleanolicacidonhumancoloncarcinomacelllineHCT15[J],WorldJGastroenterol,2002,8(3):493.)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OA對(duì)II、III、IV型變態(tài)反應(yīng)具有明顯抑制作用(王立新，韓廣軒，劉文庸，等.齊墩果酸的化學(xué)與藥理研究.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2001，19(2):10)。齊墩果酸對(duì)心血管疾病的作用是齊墩果酸藥理作用研究的新發(fā)現(xiàn)。SomowtLO等首次提出OA具抗高血壓及強(qiáng)心活性。研究指出，OA對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血壓大鼠無(wú)直接降壓作用，但有直接的強(qiáng)心作用。當(dāng)大鼠長(zhǎng)期(6wk)服用OA60mg/kg后，能有效抑制嚴(yán)重高血壓的發(fā)展，且OA的降血脂及抗氧化活性比熊果酸高(SomovaL0,NadarA,RammananP，etal.Cardiovascular,antihyperlihpidemicandantioxidanteffectsofoleanolicandursolicacidsinexperimentalhypertension[J].Phytomedicine,2003，10(23):115-121.)。但至今未見(jiàn)有關(guān)齊墩果酸促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明對(duì)齊墩果酸提供一種制備治療瘢痕藥物的新用途。經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，表明齊墩果酸能顯著促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡，抑制兔耳瘢痕增生。所以，齊墩果酸可以用于制備治療瘢痕的藥物。圖1為齊墩果酸對(duì)人增生性瘢痕細(xì)胞活力(0D值)的影響2為齊墩果酸對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的流式二維點(diǎn)3為齊墩果酸對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞caspase-3活性的影響4為齊墩果酸抑制兔耳瘢痕增生的瘢痕指數(shù)5為齊墩果酸抑制兔耳增生性瘢痕組織I型膠原6為齊墩果酸升高兔耳增生性瘢痕組織MMPl7為齊墩果酸抑制兔耳增生性瘢痕組織TGF-β1圖具體實(shí)施例方式齊墩果酸誘導(dǎo)人皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)(一)試劑1.胎牛血清(FBSHyclone)2.磷酸緩沖液(PBSHyclone)3.二甲基亞砜(DMS0Sigma)4.甲基四唑藍(lán)(MTTAmresco)，用PBS配制成0.5%MTT5.0.25%胰酶、0.25%胰酶(不含EDTA)(Sigma)6.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Sigma)7.齊墩果酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110709-200505)8.細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司)9.凱基Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司)10.兔I型膠原酶聯(lián)免疫試分析試劑盒(上海朗頓生物技術(shù)有限公司)11.兔基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMPl)酶聯(lián)免疫試分析試劑盒(上海朗頓生物技術(shù)有限公司)12.兔轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海朗頓生物技術(shù)有限公司)(二)制備人皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞取16-30歲病人皮膚增生性瘢痕，在無(wú)菌條件下，去除表皮和皮下組織，生理鹽水反復(fù)沖洗后剪切成0.5-1.Omm3的組織塊，接種于一次性培養(yǎng)瓶壁上，組織塊間距0.3-0.5mm，加入FBS適量，按常規(guī)在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)2h后，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液(含青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)5ml繼續(xù)培養(yǎng)，每周換液2次。待原代細(xì)胞生長(zhǎng)基本融合成片時(shí)，吸除培養(yǎng)液，PBS液漂洗2次后加入0.25%胰酶消化約lmin，倒置顯微鏡下見(jiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸棄胰酶，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕吹打瓶壁細(xì)胞使呈細(xì)胞懸液，按13比例分裝傳代，使用第3-6代細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。(三)齊墩果酸對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞活力影響實(shí)驗(yàn)MTT比色實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀所測(cè)得的光吸收值間接地反映了細(xì)胞活力。本實(shí)驗(yàn)將齊墩果酸用DMEM配制成濃度分別為0、10、20、40、80μg/ml溶液。其中0μg/ml組即為空白對(duì)照組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘢痕成纖維細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成5XIO4個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以每孔100μ1分別接種于3塊96孔培養(yǎng)板，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，加入DMEM100μ1，做細(xì)胞饑餓處理12h。然后，吸棄DMEM，每塊板分別加入上述配制的不同濃度的齊墩果酸溶液100μ1/孔，每組10個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)，3塊板分別于12h、24h加入0.5%MTT20μ1染色，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加DMSO150μ1，振蕩10-15min，自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定OD值(波長(zhǎng)570nm)，分別測(cè)得不同濃度齊墩果酸培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞活力(細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組吸收值/空白對(duì)照組吸收值X100%)，重復(fù)做三批細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，在12h、24h不同的時(shí)間點(diǎn)，齊墩果酸各劑量組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞活力均有顯著下降，且呈明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。特別是>20μg/ml劑量組對(duì)成纖維細(xì)胞增殖抑制非常明顯，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異。說(shuō)明齊墩果酸能明顯抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖。(四)齊墩果酸對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)可以研究細(xì)胞的各種功能狀態(tài)，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等。本實(shí)驗(yàn)將齊墩果酸用DMEM配制成濃度分別為0和40μg/ml溶液。其中0μg/ml組即為空白對(duì)照組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘢痕成纖維細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成1.5XIO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以每孔2ml分別接種于1塊6孔培養(yǎng)板，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，加入2ml的DMEM培養(yǎng)液，饑餓12h。然后，吸棄DMEM，分別加入上述配制的不同濃度的齊墩果酸溶液2ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，吸棄培養(yǎng)液，0.25%胰酶(不含EDTA)消化，1500rpm離心5min,PBS緩沖液洗滌2次，分別加入500μ1的BindingBuffer懸浮細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC和PropidiumIodide各5μ1，混勻；室溫避光反應(yīng)5-15min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。其凋亡二維點(diǎn)圖可分為四個(gè)象限，左上為死亡細(xì)胞；左下為活細(xì)胞；右上為晚期凋亡和死亡細(xì)胞；右下為早期凋亡細(xì)胞；凋亡率為右上部分與右下部分凋亡和死亡細(xì)胞百分率之和；結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，齊墩果酸作用12小時(shí)后，細(xì)胞凋亡明顯，隨給藥濃度增加，凋亡率顯著增加。給藥組早期和晚期凋亡率分別為71.09%和19.28%，顯著高于空白對(duì)照組的6.08%和5.56%。說(shuō)明齊墩果酸能顯著抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖且能誘導(dǎo)其凋亡。(五)齊墩果酸對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞caspase-3活性的影響Caspase(Cysteine-requiringAspartateProtease)是一個(gè)在細(xì)胞調(diào)亡過(guò)禾呈中起重要作用的蛋白酶家族。本實(shí)驗(yàn)將齊墩果酸用DMEM配制成濃度分別為0、10、20、40μg/ml溶液。其中Oyg/ml組即為空白對(duì)照組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘢痕成纖維細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配制成1.5XIO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，以每孔2ml分別接種于1塊6孔培養(yǎng)板，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，加入2ml的DMEM培養(yǎng)液，饑餓12h。然后，吸棄DMEM，分別加入上述配制的不同濃度的齊墩果酸溶液2ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)12h后，吸收細(xì)胞培養(yǎng)基，用胰酶消化并收集細(xì)胞；用PBS洗滌細(xì)胞兩次(離心2000rpm，5min)收集35XIO6個(gè)細(xì)胞，盡量去除PBS上清；在收集的沉淀細(xì)胞中加入50μ1冰冷LysisBuffer(注意使用前每50μ1LysisBuffer加入0.5μ1DTT)，吹打均勻；置冰上裂解20min，其間渦旋振蕩34次，每次IOs；4°C，離心(10，OOOrpm)Imin；小心吸取上清(含裂解的蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上待用；取少量上清(12μ1)，按常規(guī)方法(Braford法)測(cè)定其中的蛋白濃度。再吸取50μ1含100200μg蛋白的細(xì)胞或組織裂解上清；如體積不足50μ1，則用LysisBuffer補(bǔ)足至總體積50μ1(各組均采用同樣的蛋白量進(jìn)行測(cè)定禾口比較)；力口入50μ1的2XReactionBuffer；力口入5μ1Caspase-3Substrate并于37°C避光孵育4小時(shí)；用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)(100μ1的比色皿)在λ=405nm測(cè)定其吸光值。通過(guò)計(jì)算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照(50μ1LysisBuffer+50μ12XReactionBuffer)的倍數(shù)來(lái)確定凋亡誘導(dǎo)劑組Caspase-3活化程度。結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，齊墩果酸作用12小時(shí)后，caspase-3顯著高于空白對(duì)照組。說(shuō)明齊墩果酸能夠明顯誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡。齊墩果酸對(duì)兔耳增生性瘢痕的抑制實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)分成4組(1)模型對(duì)照組，(2)齊墩果酸低劑量組，(3)齊墩果酸中劑量組，(4)齊墩果酸高劑量組。上述藥物均為膏劑，其第1-4組的藥物組成及其重量百分比如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取新西蘭兔4只，雌雄不拘，清潔級(jí)，兔齡3-4個(gè)月，體重2.2-2.6kg。由中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)室溫度18-22°C，相對(duì)濕度60%-75%，人工混合飼料喂養(yǎng)。動(dòng)物分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，按常規(guī)用藥25%烏拉坦靜注，麻醉。兔耳75%酒精消毒后，用圓形鉆刀在兔耳腹側(cè)面中線沿長(zhǎng)軸避開(kāi)血管兩側(cè)作直徑為7mm的圓形切口，完整切除全層皮膚，去除軟骨膜，保留軟骨。每耳6處，間隔2cm。術(shù)后創(chuàng)面涂抹金霉素軟膏防止感染。術(shù)后第7天，將48個(gè)瘢痕創(chuàng)面隨機(jī)分成4組，即齊墩果酸軟膏高、中、低劑量組和模型對(duì)照組，每組12個(gè)創(chuàng)面，分別外涂相應(yīng)的藥物軟膏，并輕揉直到藥物吸收。每天1次，每處瘢痕給藥約50mg，造模后第5天開(kāi)始連續(xù)外用給藥24天。第29天，用游標(biāo)卡尺測(cè)量兔耳瘢痕厚度和瘢痕邊沿正常耳厚度，瘢痕指數(shù)=(瘢痕厚度+正常耳厚度)/正常耳厚度。測(cè)得各組瘢痕指數(shù)，進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，中、高劑量組藥效明顯，與模型對(duì)照組相比，兔耳瘢痕指數(shù)明顯減小，具有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，齊墩果酸能顯著抑制皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，能減小瘢痕指數(shù)，因此，可用于制備治療皮膚瘢痕的藥物。齊墩果酸對(duì)兔耳增生性瘢痕I型膠原、MMPl和TGF-β1表達(dá)影響實(shí)驗(yàn)將測(cè)定完瘢痕指數(shù)的兔耳增生性瘢痕組織切下，加入一定量的PBS，ΡΗ7.4。用液氮迅速冷凍保存，標(biāo)本融化后保持2-8°C的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用勻漿器將標(biāo)本充分勻漿。離心20分鐘(2000-3000rpm)。仔細(xì)收集上清。I型膠原檢測(cè)1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋在包被有兔I型膠原抗體的酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，先在第一、第二孔中各取出標(biāo)準(zhǔn)品100μ1，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ1，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μ1分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μ1棄掉，再各取50μ1分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ1，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μ1分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ1，混勻后從第七、第八孔中分別取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μ1，混勻后從第九、第十孔中各取50μ1棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μ1，濃度分別為30μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L)。2.加樣分別設(shè)空白對(duì)照孔、待測(cè)樣品孔，空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作同待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μ1，然后再加待測(cè)樣品10μ1(樣品最終稀釋濃度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3.溫育用封版膜封版后置37°C溫育30分鐘。4.配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。5.洗滌小心揭掉封版膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶每孔加入兔I型膠原酶標(biāo)試劑50μ1，空白對(duì)照孔除外。7.溫育操作同3。8.洗滌操作同5。9.顯色每孔先加入顯色劑A50μ1，再加入顯色劑B50μ1，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘。10.終止每孔加終止液50μ1，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色)。11.測(cè)定以空白對(duì)照孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(0D值)。結(jié)果見(jiàn)圖5。兔MMPl和TGF-β1的測(cè)定方法如上，僅將標(biāo)準(zhǔn)品和酶標(biāo)試劑換為相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和酶標(biāo)試劑。結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)用藥28天，齊敦果酸劑量依賴地顯著降低兔耳瘢痕組織I型膠原含量和TGF-β1水平，升高M(jìn)MPl水平。權(quán)利要求齊墩果酸在制備治療皮膚瘢痕藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
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，是齊墩果酸用于制備治療皮膚瘢痕藥物的新用途。經(jīng)體外人皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和兔耳增生性瘢痕的抑制實(shí)驗(yàn)，齊墩果酸能顯著抑制皮膚瘢痕細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡，并能減小瘢痕增生指數(shù)，因此，可用于制備治療皮膚瘢痕的藥物。齊墩果酸來(lái)源廣泛、制備方法簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，本發(fā)明為皮膚瘢痕的治療提供了新的藥物來(lái)源。文檔編號(hào)A61K31/56GK101797256SQ20101011034公開(kāi)日2010年8月11日申請(qǐng)日期2010年2月10日優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日發(fā)明者吳建國(guó),張宏,張巧艷,杜漸,秦路平,韓婷,魏艷潔,黃寶康申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)