專利名稱：一種抗血小板溶栓素及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種抗血小板溶栓素及其制備方法。
背景技術：
隨著人口老齡化和不良飲食習慣等危險因素的增加，心腦血管疾病的發(fā)病率和死 亡率日趨上升，每年因心腦血管疾病死亡的人口，接近世界總死亡人口的1/4，嚴重影響人 類的期望壽命和生存質量。心腦血管性疾病的預防和治療，一直是醫(yī)學和藥學的研究熱點?？寡ㄋ幬锎篌w 上分為抗凝藥物、溶栓藥物、抑制血小板聚集藥物三種?？鼓幬锒酁槟割惖囊种苿?， 由于其不能直接溶栓和抗凝效果的非特異性，極易產生出血副作用或 其他毒性；溶栓藥物 的溶栓效果迅速、直接，缺點在于血漿半衰期短，長時間使用往往引起出血，且溶栓后發(fā)生 再梗的幾率較高。血小板聚集是所有血栓形成的最后步驟，抑制血小板聚集可以最有效地 抑制血栓的發(fā)生并預防再梗的形成，且對凝血系統(tǒng)影響小，出血副作用小，因此抑制血小板 聚集的藥物具有良好的發(fā)展前景。抑制血小板聚集的藥物主要作用于血小板膜糖蛋白(GP)，GP是介導血小板聚 集的關鍵成份，也成為抗血栓藥物的重要靶分子。例如，1995年美國FDA批準上市的 Abciximab (阿昔單抗)就是血小板膜糖蛋白GP II b/III α的單克隆抗體，能有效抑制血 小板的聚集，展示了抗血小板聚集藥物在抗栓治療和溶栓后預防再梗形成方面效果好、副 作用小的優(yōu)點。近幾年，隨著對凝血過程中血小板作用的分子機理研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)另一個 十分看好的藥物靶標血小板膜糖蛋白GPIb。GPIb是血小板表面最主要的糖蛋白之一，與GP II b/III α介導的粘附機理不同，它通常只介導在高剪切力作用下的粘附。GPIb與血漿或 血管內皮細胞的vWF在高剪切力條件下相互作用，降低了血小板的流速。GPIb與vWF特異 性結合，使血小板粘附到血管壁上，同時激活了其它受體的反應，包括激活GP II b/III α 受體，使之與纖維蛋白原的結合，導致血小板聚集，從而引起血栓的形成。因此，通過阻斷 GPIb與血漿vWF結合，可阻止血小板粘附在血管內皮細胞壁上，抑制血小板聚集。由于這種 作用不涉及凝血酶類及任何其他凝血因子，對血液凝固的過程沒有直接影響，安全性高，因 而發(fā)展成為特異性更好的抗血栓藥物的新方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種通過介導血小板聚集關鍵成分的血小板膜糖蛋白GPIb 蛋白的安全高效的新型抗血栓藥物，其采用的技術方案如下一種抗血小板溶栓素，具有如下之一(a)由α鏈、β鏈兩條肽鏈組成，α鏈氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，β鏈氨 基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸且具有抗血小板聚集活性的由(a)衍生的蛋白質。
本領域技術人員熟知，本發(fā)明所述抗血小板溶栓素可在溶栓活性不受影響的條件 下對其氨基酸序列進行改進，如將一個或幾個氨基酸分別突變、缺失或往添加一個或幾個 氨基酸有時不影響蛋白質的活性，甚至一些氨基酸改變可能使溶栓特性優(yōu)化，本領域的技 術人員可以用標準做法來達到此目的。更優(yōu)選地，(b)中的蛋白質與(a)中的蛋白質的氨基酸序列至少有95%的一致性。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素比活力大于每毫克蛋白1000個活力單位。1個活力 單位是指在體外測定血小板聚集時，能使350 μ 1富血小板血漿(PRP)在15 μ 1瑞斯托霉素 (60mg/ml)誘導下的血小板聚集抑制百分率達到100士5時所需抗血小板溶栓素量。。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素因其在等電聚集時出現(xiàn)多種空間異構體，不具備單一 等電點。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素與由保藏在武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心、保 藏編號為CCTCC-C200970的雜交瘤細胞株1B9分泌的單克隆抗體特異性結合。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素經非還原SDS-PAGE電泳顯示為一條帶，還原 SDS-PAGE電泳顯示為兩條帶，分別稱之為α鏈、β鏈，分子量分別為16000士5000、 17000士5000 道爾頓。所述抗血小板溶栓素的雙向電泳結果見圖6，經雙向電泳即等電聚集電泳和還原 SDS-PAGE電泳后得到六個條帶，其中α鏈和β鏈對應各有三個條帶，六個條帶經質譜做 ID鑒定后表明，其分別為兩個亞基的異構體形式，即該蛋白在等電聚集條件下因其結構方 面的特異性，會產生異構體，從而導致雙向電泳時會出現(xiàn)六個條帶，不具備單一等電點。本發(fā)明還提供所述抗血小板溶栓素的純化方法，包括以下步驟步驟1 將尖吻蝮蛇粗毒溶解于緩沖液中，離心取上清；步驟2 將步驟1所得上清液過DEAE陰離子交換層析柱進行層析，取經體外抗血 小板活性檢測對瑞斯托霉素誘導的血小板聚集具有抑制作用的洗脫組分備用；步驟3 將保藏編號為CCTCC-C200970雜交瘤細胞株1Β9分泌的單克隆抗體與親 和層析載體偶聯(lián)，制備免疫親和層析柱；步驟4 用步驟3中制備的免疫親和層析柱層析純化步驟2中所得洗脫組分，以洗 脫緩沖液洗脫，收集取經體外抗血小板活性檢測對瑞斯托霉素誘導的血小板聚集具有抑制 作用的洗脫組分，即為本發(fā)明所述抗血小板溶栓素。本發(fā)明所述純化方法應用現(xiàn)代免疫學原理，結合抗原抗體特異性反應與親和層析 技術，從尖吻蝮蛇粗毒中分離純化抗血小板溶栓素。該方法首先制備初純的抗血小板溶栓 素，以該初純物為抗原，制備針對其的特異性單克隆抗體，再與適宜的親和層析載體偶聯(lián)， 制備成抗體親和層析柱，使用偶聯(lián)得到的抗體親和層析柱，即可對原料粗毒經初步純化得 到的有相應活性的粗溶液進行免疫親和層析，制備高純的抗血小板溶栓素。作為優(yōu)選，步驟1所述緩沖液為ρΗ 7. 0 9. 0的0. 01 0. lmol/L的Tris-HCl 緩沖液。作為優(yōu)選，步驟1所述離心為4000r/min分別離心兩次，每次離心15min。作為優(yōu)選，步驟2用ρΗ 6. 0 9. 0的0. 01 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和 0. 05 0. 6mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫。
作為優(yōu)選，步驟3所述親和層析柱載體為S印harose 4B瓊脂糖凝膠、二乙氨基葡 聚糖凝膠或羧甲基葡聚糖凝膠。步驟3所述雜交瘤于2009年12月23日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大 學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC-C200970的雜交瘤細胞株1B9。在具體實施方式
中，詳細描述了步驟3所述雜交瘤的篩選過程。作為優(yōu)選，步驟4所述洗脫緩沖液為pH 2. 0 4. 0、0. 01 0. 03MGly_HCl緩沖液。本發(fā)明還提供所述抗血小板溶栓素在制備治療血管栓塞性疾病藥物上的應用。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素可應用于血管栓塞性疾病，包括心、腦梗塞性疾病如 腦梗塞、急性ST段抬高的心肌梗死、非ST段抬高的急性冠狀動脈綜合征；肺血栓栓塞癥 (PTE)；靜脈血栓癥；外周血管栓塞性疾病如閉塞性周圍動脈粥樣硬 化、靜脈動脈化術后血 管再栓塞；以及經皮冠狀動脈介入(PCI)的抗栓治療和治療手術后或創(chuàng)傷后的靜脈血栓形 成。本發(fā)明還提供一種用于治療血管栓塞性疾病的藥物組合物，由所述的抗血小板溶 栓素與藥學上可接受的輔料組成。本發(fā)明還提供所述藥物組合物的注射劑，包含抗血小板溶栓素以及藥學上可接受 的賦形劑、穩(wěn)定劑。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述抗血小板溶栓素的注射劑型，按照每毫升含有10個活力單 位的抗血小板聚集活性，常規(guī)加工直接或間接加入藥學上可接受的賦形劑、穩(wěn)定劑制成注 射劑。更優(yōu)選地，每毫升含有至少10 μ g的抗血小板溶栓素。本發(fā)明還提供所述藥物組合物的注射劑的配方，即每ml包含抗血小板溶栓素 16-24 μ g、右旋糖酐32-48mg、海藻糖1. 6-2. 4mg，余量為水。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素作用于介導血小板聚集關鍵成分的血小板膜糖蛋白 GPIb蛋白，通過阻斷其與血漿vWF結合，阻止血小板粘附在血管內皮細胞壁上，從而抑制血 小板聚集。經藥效學試驗表明，與其它抗血小板聚集的藥物相比，作用部位較為專一，出血 傾向相對較小，且抗血小板作用較持久。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素采用瑞斯托霉素誘導的血小板聚集法進行活性測定， 其對瑞斯托霉素誘導的血小板聚集具有明顯抑制作用，并呈現(xiàn)劑量依賴關系，而對ADP、II 型膠原誘導的血小板聚集作用不明顯。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素經動物藥效學試驗表明，對瑞斯托霉素誘導的血小板 聚集作用效果明顯，出血作用小；在不穩(wěn)定性心絞痛血栓模型中，可明顯縮短凝血酶時間和 活化部分凝血活酶時間，顯著地抑制血小板聚集，可明顯降低循環(huán)性的血流下降的頻率和 幅度，臨床可用于不穩(wěn)定性心絞痛治療。本發(fā)明所述純化方法在傳統(tǒng)常規(guī)陰陽離子交換層析基礎上，結合具有高度專一性 的免疫親和層析法，具有高度專一性、高通量、高分辨率的特點，該方法特異性強、得率高、 周期短，具有良好的工業(yè)應用前景


圖1為本發(fā)明所述抗血小板溶栓素制備工藝中陰離子交換柱層析紫外吸收(280nm)圖譜；圖2為本發(fā)明所述抗血小板溶栓素制備工藝中陽離子交換柱層析紫外吸收(280nm)圖譜；圖3為本發(fā)明所述抗血小板溶栓素制備工藝中凝膠S-100柱層析紫外吸收 (280nm)圖譜；圖4為本發(fā)明所述抗血小板溶栓素制備工藝中親和層析柱層析紫外吸收(280nm) 圖譜；圖5為本發(fā)明中抗血小板溶栓素還原性、非還原性SDS-PAGE及與其抗體雜交后電 泳圖譜；泳道1為蛋白分子量Marker，泳道2和泳道3為還原后的抗血小板溶栓素，泳道4 為抗血小板溶栓素非還原SDS-PAGE電泳圖，泳道5為與抗體雜交后的抗血小板溶栓素。圖6為本發(fā)明中抗血小板溶栓素雙向電泳圖譜；圖7為FACS法測抗血小板溶栓素與血小板表面Gp I b的結合的流式細胞儀檢測 圖；1.血小板；2.血小板+無關抗體；3.血小板+Gp I b抗體；4.血小板+無關蛋白+Gp I b抗體；5.血小板+本發(fā)明所述抗血小板溶栓素+Gp I b抗體。圖8為注射高劑量和低劑量抗血小板溶栓素后犬尿排泄曲線圖。
具體實施例方式下面的實施例將對本發(fā)明作進一步的解釋，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施 例，這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領域的技術人員在權利要求的范圍內 所作出的某些改變和調整也應認為屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述純化方法在傳統(tǒng)常規(guī)陰陽離子交換層析基礎上，結合具有高度專一性 的免疫親和層析法，具有高度專一性、高通量、高分辨率的特點。在具體實施方式
中，詳細描述了免疫親和層析所用單克隆抗體的制備過程，其過 程概述如下(1)將尖吻蝮蛇蛇毒用PH 7. 0 9. 0的0. 01 0. lmol/L的Tris-HCl緩沖 液溶解，離心去除沉淀。(2)將上述粗毒分別以才常規(guī)陰離子交換DEAE柱和陽離子交換層析CM柱層析純 化，用pH 6. 0 9. 0的0. 01 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和NaCl溶液線性梯度洗脫， 純化得到具有抑制血小板聚集的初步溶液；(3)將上述初溶液再以凝膠層析S-100柱純化，用pH 7. 5 8. 5、濃度為0. 01 0. 10mol/L的Tris-HCl緩沖液和NaCl溶液洗脫，純化得到具有抑制血小板聚集的純溶液；(4)以上述所得純溶液作為抗原，免疫小鼠，取免疫小鼠，取脾細胞懸液和骨髓瘤 細胞以1 5的比例在聚乙二醇作用下按常規(guī)法融合，篩選陽性克隆并鑒定，所篩選的雜交 瘤分泌的即為針對該物質的特異性單克隆抗體。實施例1 高純度抗血小板溶栓素的制備1、蛇毒粗毒的處理準確稱取購自黃山市徽州毒蛇研究所的尖吻蝮蛇蛇毒5g，用0.02mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液將置4°C冰箱內其溶解，溶解時間6 12h，然后以4000r/min離心，分別離心兩次，每次離心15min，收集上清液待用。2、初步純化得到用于制備單抗的抗原(1)陰離子交換層析取步驟1粗毒溶解離心所得上清液以流速3. Oml/min上樣于已平衡的陰離子交換 層析DEAE柱中，上樣后先以0.02mol/L pH 8. 5的Tris-HCl緩沖液洗脫不能被層析介質吸 附的雜蛋白，洗脫時間360min，洗脫流速3ml/min ；然后再以0. 02mol/L pH 6. 5的Tris-HCl 緩沖液加入0. 5mol/L的NaCl進行梯度洗脫，洗脫流速5ml/min，收集具有抑制血小板聚集 的組分(活性檢測方法見后面部分內容)，即抗血小板溶栓素粗溶液，蛋白檢測用純化系統(tǒng) AKTA prime plus自帶紫外檢測器在280nm處檢測，其紫外吸收圖譜如圖1所示，收集以系 統(tǒng)所帶分部收集器收集，收集設置為4min/管。(2)陽離子交換層析將步驟2中陰離子交換層析所收集的抗血小板溶栓素粗溶液用截留分子量為1萬 的濾膜進行超濾，濃縮至體積為30 80毫升，轉入已煮過的透析袋中，置4°C冰箱內透析 6 12h。將透析后所得樣品以流速3. Oml/min上樣于已平衡的陽離子交換層析CM柱中， 上樣后先以0.02mol/L pH 6. 5的Tris-HCl緩沖液洗脫不能被層析介質吸附的雜蛋白，洗 脫時間360min，洗脫流速3ml/min ；然后再以0. 02mol/L pH 8. 5的Tris-HCl緩沖液加入 0. 5mol/L的NaCl進行梯度洗脫，洗脫流速5ml/min，收集具有抑制血小板聚集的組分(活 性檢測方法見實施例分內容)，即抗血小板溶栓素初品，蛋白檢測用純化系統(tǒng)AKTAprime plus自帶紫外檢測器在280nm處檢測，其紫外吸收圖譜如圖2所示，收集以系統(tǒng)所帶分部收 集器收集，收集設置為4min/管。(3)凝膠層析將步驟2中陽離子交換層析所收集的抗血小板溶栓素初品溶液用截留分子量為1 萬的濾膜進行超濾，濃縮至體積為30 80毫升，再以millopore ultra系列離心超濾管與 4°C下低溫離心超濾濃縮，濃縮體積到5 15ml。將濃縮后所得樣品以流速1. Oml/min上樣 于已平衡的凝膠層析S-100柱中，以0. 02mol/L pH 7. 6的Tris-HCl緩沖液加入0. 15mol/ L的NaCl進行洗脫，洗脫流速0. 3ml/min，收集具有抑制血小板聚集的組分，檢測方法同上， 蛋白檢測用純化系統(tǒng)AKTA prime plus自帶紫外檢測器在280nm處檢測，其紫外吸收圖譜 如圖3所示，收集以系統(tǒng)所帶分部收集器收集，收集設置為IOmin/管，所得樣品即為抗血小 板溶栓素初純溶液。3、抗血小板溶栓素特異性單抗的制備(1)抗原鑒定上述步驟2中凝膠層析所得到的抗血小板溶栓素初純溶液經SDS-PAGE電泳鑒定， 其純度不低于85 %，顯示為一條主帶，活性檢測有抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集作用 后，方可用于制備單抗。(2)抗原的動物免疫選用6-12周齡Balb/c小鼠免疫抗原，分為三次免疫，即第 一次以每支小鼠0. Img(約0. 2ml)加等量弗氏完全佐劑注射小鼠腹腔免疫，2_4周后加強免 疫，量減半，改用不完全佐劑，第三次沖擊免疫在融合前3天進行，每只小鼠0. 03mg，融合成 功的標志是在融合時脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細胞，并以間接ELISA法檢測血清中抗體效價。(3)雜交瘤細胞株建立取免疫小鼠脾細胞懸液和骨髓瘤細胞以1 5的比例在 聚乙二醇作用下按常規(guī)法融合。以間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，篩選陽性克隆 后，再進行亞克隆化，并進行擴增凍存。經過3次有限稀釋克隆化，將分泌特異性抗體的雜 交瘤細胞系大量擴增并凍存，長期傳代培養(yǎng)后，以相同的方法再次克隆化鑒定之，建立的雜 交瘤細胞株已于2009年12月23日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學的中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC-C200970，分類命名為雜交瘤細胞株1B9。(4)單克隆抗體的制備與純化上述所得的雜交瘤細胞株以無血清培養(yǎng)基在體外 進行增量培養(yǎng)，獲得的培養(yǎng)液過以ProteinA偶聯(lián)的親和層析柱，親和層析純化得到抗抗血 小板溶栓素的特異性單克隆抗體。4、抗血小板溶栓素特異性單克隆抗體親和層析柱的制備上述純化得到的抗血小板溶栓素單克隆抗體以0. lmol/L檸檬酸鈉緩沖液于4°C 透 析過夜后，加IOml CNBr-Sepharose 4B到IOml抗體溶液中，放在搖床或振蕩器上，4°C輕 輕振搖過夜。再加入Iml 2mol/L乙醇胺溶液封閉CNBr-S印harose 4B殘余的活性基團，4°C 繼續(xù)振搖1小時。將偶聯(lián)好抗體的S印harose 4B柱裝到適當?shù)膶游鲋?。?. lmol/L檸 檬酸鈉緩沖液洗柱，接著用兩倍柱體積0. lmol/L、pH6. 5、含lmol/L的NaCl檸檬酸鈉緩沖 液洗脫，最后用兩倍柱體積的PBS洗。凝膠在使用和保存時，須始終保持在液面以下，不得 干燥。5、高純度抗血小板溶栓素的制備將上述步驟2中經陰離子交換層析得到的抗血小板溶栓素粗溶液用親和層析平 衡緩沖液(0.02M Tris-HCl緩沖液，pH 7. 8、含0. 25M NaCl)透析，上抗體親和層析柱，用 上述親和層析平衡緩沖液平衡至洗脫液洗脫曲線在紫外檢測上顯示為基線后，用PH 4. 0、 0. 02M Gly-HCl緩沖液親和層析洗脫液洗脫，收集活性峰即為高純度抗血小板溶栓素。實施例2 本發(fā)明所述抗血小板溶栓素的藥效評價1、活性測定抗血小板溶栓素一個活力單位定義為能使瑞斯托霉素誘導的血小板聚集的抑制 百分率達到100士5時的抗血小板溶栓素的量。其效價測定方法采用血小板聚集法，具體如下(1)富血小板血漿PRP和貧血小板血漿PPP的來源取血小板數(shù)正常的獻血員的 抗凝血，抗凝劑為3. 8%枸櫞酸鈉，與全血的比例為1 9。以800r/min離心5min，吸取上 清液，得到富血小板血漿(PRP)，再以3500r/min離心lOmin，吸取上清液，得到貧血小板血 漿(PPP)，將PRP的血小板數(shù)調至(150 200) X IO90(2)空白管測定取硅化比濁管，將空白管置于37°C測量孔中，精密加入貧血小板 血漿(PPP)O. 5ml，調血小板聚集率為100%。取硅化比濁管，將測量管置于37°C測量孔中， 精密加入富血小板血漿0. 5ml，再加入一枚攪拌子，調血小板聚集率為0，同時計時，在37°C 孵育3分鐘，然后加入瑞斯托霉素(Ristocetin) 0. 025ml，立即記錄聚集曲線，讀取5分鐘內 的聚集曲線。(3)樣品管測定取硅化比濁管，將測量管置于37°C測量孔中，精密加入富血 小板血漿0. 5ml，各種稀釋倍數(shù)的注射用抗血小板溶栓素樣品溶液0. 025ml，再加入一枚攪拌子，調血小板聚集率為0，同時計時，在37°C孵育3分鐘，然后精密加入Ristocetin 0. 025ml，立即記錄聚集曲線，讀取5分鐘內的聚集率線。(4)樣品抑制率及相應活性單位的計算計算樣品抑制率血小板聚集的抑制率=(對照管的最大聚集率_測量管的最大聚集率)/對照管 的最大聚集率。以所測定的半數(shù)抑制率時對應蛋白含量與其濃度關系，即可算出其比活力(即每 毫克蛋白含有多少活力單位)，本發(fā)明所述抗血小板溶栓素比活力大于每毫克蛋白1000單 位以上。2、純度鑒定SDS-PAGE電泳如圖5所示，顯示為一條帶，分子量為35000 40000道爾頓；等電 點電泳顯示為一條帶，等電點為5. 5 6. 5。
3、神經毒、出血毒、內毒素檢測抗血小板溶栓素出血毒檢驗標準取本發(fā)明所述抗血小板溶栓素用氯化鈉注射液 制成每Iml中含20單位的溶液，取體重為18 22g的小白鼠5只，背部皮下注射器0. 2ml， 注射后24小時處死動物，剝皮觀察，小鼠背部未見出血現(xiàn)象。實測三批樣品均符合規(guī)定。抗血小板溶栓素神經毒檢驗標準取取本發(fā)明所述抗血小板溶栓素適量，用氯化 鈉注射液制成每毫升中含有20單位溶液，取體重300 500g鴿子3只，劑量按每公斤注射 0. 5ml，靜脈給藥，觀察24小時，動物不得出現(xiàn)抽搐、死亡，如3只中有一只出現(xiàn)抽搐或死亡， 應另取5只復試，均未出現(xiàn)死亡。抗血小板溶栓素內毒素檢測標準取本品，依中國藥典2005年版二部附錄XIE檢 查，每單位樣品中內毒素含量不高于20EU。實施例3 高純度抗血小板溶栓素原料藥含量檢測方法為檢測血清中抗血小板溶栓素含量，以便用于藥代動力學試驗，建立了一套采用 雙抗體夾心法檢測抗血小板溶栓素原料藥含量的方法，該方法檢測靈敏度能夠達到Ing/ ml ο具體檢測方法如下1、包被一個單抗用0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液將本發(fā)明實施例1中所制備的單 抗作適當稀釋，在每個聚苯乙烯酶標板的反應孔中加0. lml，4°C過夜或保持18-24小時。次 日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘(簡稱洗滌，下同)。2、加樣加入待檢樣品或作適當稀釋的標準參考品于反應孔中，同時作空白孔，陰 性和陽性孔對照。37°C孵育1小時，洗滌。3、加HRP標記的另一個單抗將已作適當稀釋的HRP標記的另一個自行制備的抗 血小板溶栓素單抗，加于酶標板中，每孔0. lml，37°C孵育30 60分鐘，洗滌。4、底物顯色于上述各反應孔中加入臨時配制的或OPD底物應溶液0. 1ml，于37°C 下反應10 30分鐘，再加2M H2S04 0. 05ml以終止反應。6、結果判定上述酶標板置于酶標儀上于450nm處測OD值。根據(jù)相應已知濃度對 照品的OD值與濃度關系，繪制標準曲線。再由待測樣品所測OD值，代入標準曲線中，求得 相應樣品中抗血小板溶栓素濃度。本方法檢測靈敏度能夠達到lng/ml。
實施例4 注射用抗血小板溶栓素制備方法注射制劑配方如下抗血小板溶栓素10 士 2mg 右旋糖酐20 士 4g海藻糖1 士 0. 2g補水至500ml總體積500ml按照0. 5ml/支分裝，共分裝1000支。在局部百級潔凈區(qū)內將按照配方將本發(fā)明前述實施例制備并經各項檢測合格的 抗血小板溶栓素原料藥與右旋糖酐等輔料準確稱量在配液容器內，加注射用水充分溶解或 稀釋，使右旋糖苷濃度為1%，攪拌混勻后，得到制劑中間體；除菌過濾，其中過濾前后應對 除菌過濾系統(tǒng)進行完整性測試。然后，將過濾后的中間體按裝量裝入西林瓶中，在分裝過 程中應進行至少4次裝量檢查，保證每一只瓶內裝入的藥量準確。最后，將裝入藥品的西林 瓶凍干，然后抽真空，在真空狀態(tài)下緩慢升溫至35 40°C，保持一定時間，再降至室溫后取 出。壓塞、軋蓋得成品。成品經檢驗，符合注射用抗血小板溶栓素質量標準后，入庫存放。實施例5 抗血小板溶栓素與GPIb蛋白的結合力測定本實驗采用流式細胞儀法測定抗血小板溶栓素與GPIb蛋白的結合，方法如下(I)GPIb蛋白的純化取新鮮受試者血液，制備富血小板血清(PRP)，用草酸銨溶 液和Triton X-100制備出血小板膜糖蛋白混合溶液。將GPIb單抗用固體雙功能試劑DMP 共價偶聯(lián)于S印harose 4B-ProteinA膠上，親和純化GPIb。(2)將5 μ 1 2mg/ml抗血小板溶栓素與35 μ 1 TEN緩沖液于37°C溫育20min ；(3)上述反應體系中再加入20 μ 1鼠抗GPIb —抗，陰性對照在上述反應體系中加 入20 μ 1 —個鼠源無關單抗(即非GPIb單抗)；(4)室溫靜置30mi后，1500g離心lOmin，棄上清；(5) TEN洗兩次；加入40 μ 1 GPIb蛋白后，再加10 μ 1 FITC標記的羊抗鼠二抗；(6)室溫避光30min后，1500g離心lOmin，棄上清，TEN洗兩次；(7) 500 μ 1 PBS懸浮后，以流式細胞儀檢測。結果如圖7所示，1.血小板；2.血小板+無關抗體；3.血小板+Gp I b抗體；4.血 小板+無關蛋白+Gp I b抗體；5.血小板+本發(fā)明所述抗血小板溶栓素+Gp Ib抗體。從圖中可以看出，只有血小板和血小板加無關抗體時，幾乎沒有熒光；使用GPIb 單抗時有熒光產生，而血小板先與抗血小板溶栓素孵育以后再加GPIb單抗，熒光減弱，血 小板與無關蛋白孵育后加GPIb單抗熒光未減弱。因此，可推斷抗血小板溶栓素阻斷了 GPIb單抗與血小板的結合，即抗血小板溶栓 素通過與GPIb結合，從而阻斷了 GPIb蛋白與其單抗的結合。通過FACS法測定抗血小板溶栓素與GPIb結合實驗表明抗血小板溶栓素競爭性地 抑制GPIb單克隆抗體與血小板膜上GPIb受體結合，屬于GPIb結合蛋白，通過競爭性地阻 斷vWF與GPIb的結合，使血小板不能通過vWF粘附于受損而暴露的血管壁的膠原上，從而 抑制血小板粘附，防止了血栓的形成。即抗血小板溶栓素為一種以GPIb為靶標的、特異性 很好的抗血小板聚集的新型多肽類藥物，與其它抗血小板聚集的藥物相比，本物質作用部位較為專一，出血傾向相對較小，且抗血小板作用較持久。實施例6、抗血小板溶栓素的藥動學參數(shù)及排泄規(guī)律測定.將比格(Beagle)犬背位固定在手術臺上，不麻醉，預先將導尿用的導管浸泡在石 蠟油中，將導尿管插入膀胱，并將導尿袋固定以收集尿液。插好導尿管后，將犬放籠內，限制 犬頭的活動范圍，防止其咬斷導尿管。每5小時收集尿液1次，糞便則采用隨時收集的辦法。高劑量和低劑量組分別經耳緣靜脈注射30 μ g/kg和10 μ g/kg抗血小板溶栓素， 高劑量組于注射后第5，10，30，60，120，240，480，720，960，1440，2160min由大隱靜脈取血 1. 5—2ml，低劑量組于注射后第 5，10，30，60，120，240，480，720，960，1440min 采血，每次取 血后補足等量生理鹽水，對照組每次同時抽血檢查。將各試管離心(3000rpm，5min)分別取血清0. 2ml轉移于另一試管中待測，其余盛 Eppendorf 管中-20°CC存。用ELISA方法測定標本中藥物濃度，其分析方法與標準曲線建立的方法一致，只 是在測定標準曲線的同時測定末知樣品。血清和尿液標本直接用樣品測定，糞便標本則取30克新鮮糞便標本加30毫升生 理鹽水攪勻，離心3000rpm，20min后取上清測定。實驗結果靜注APT后血液中藥物濃度的測定，見表1-4。表1高劑量樣品檢測結果 表2標準曲線 以對數(shù)濃度與OD值作標準曲線，其線性回歸方程為Υ = -0. 7943Χ+3. 0966r = -0. 9967，測得OD值，查反對數(shù)求出藥物濃度。表3低劑量樣品檢測結果 將上述表中數(shù)據(jù)用SPSS10. O 統(tǒng)計軟件和 DAS verl. 0(Drug AndStatistics for Windows)軟件計算APT動力學參數(shù)，結果如下表所示。表4藥物代謝動力學智能分析最佳計算結果 由表中可以看出，靜脈注射后，tl/2i3分別為488min (高劑量)和451min (低劑量)；AUC分別109851 μ g/L*min和40309 μ g/L*min，基本上與劑量成正比。各犬每隔5小時收集1次尿液，測出每5h的尿液APT濃度后，乘以該時間段的尿 量，得出各犬每5h的APT排泄量。用該排泄量除于每犬的總注藥量，計算出排泄的百分比， 按高劑量和低劑量組計算出累積百分比作圖，見圖8。實施例7抗血小板溶栓素對犬不穩(wěn)定性心絞痛血栓模型的影響試驗方法參見 Folts (1982)，F(xiàn)olts et al. (1976) and Bertha andFolts (1984)。 用戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉狗，插入有囊氣管插管，用呼吸機通入室內空氣。左右前肢頭 靜脈分別插管灌注戊巴比妥鈉(0. lmg/kg)進行全身麻醉和APT的給藥。右股動脈插管檢 測血壓。在左側第五肋間開胸暴露心臟，懸掛于心包支架中。暴露1. 5cm的左旋支冠狀動 脈并分離周圍組織。將電磁流量探頭置于冠狀動脈上，測量冠脈平均血流。并測量II導聯(lián) 心電圖和心率。經過30分鐘的穩(wěn)定后，用止血鉗輕度地擠壓使左旋支冠狀動脈損傷。將一 支硬制柱形壓縮器置于左旋支冠狀動脈損傷部位，通過形成富血小板血栓使動脈血流逐漸 下降。當血流降至O時，輕幅震蕩縮窄器機械地移走血小板以恢復血流。如此重復的減少 血流隨后機械地恢復血流的形式稱為循環(huán)性的血流下降。重復進行外加的內皮損傷或壓縮 器選擇直到循環(huán)性血流下降達到穩(wěn)定。經過60分鐘的可重復循環(huán)性血流下降控制期后(t =-60至O分鐘)，抗栓作用通過給藥前和給藥后30、60、120、240分鐘的CFR頻率和CFR幅 度的比較來進行評估。出血時間的測定在給藥前和給藥后15min用自動彈簧承載裝置(Simplate R，Organon Teknika) 在上唇內表面測定模板出血時間，直至觀察到濾紙上出血的停止。分別于用藥前、用藥后30min、60min、120min和240min各取血8ml，以3. 8%枸櫞 酸鈉抗凝(全血與抗凝劑之比為9 1)，將血樣在500rpm離心3分鐘得到富血小板血漿； 在3000rpm離心15分鐘得到貧血小板血漿。用貧血小板血漿稀釋富血小板血漿將其血 小板計數(shù)調至150，000-250，00/μ 1(留取Iml貧血小板血漿測定TT、ΡΤ、ΑΡΤΤ)。測量對 RistocetinA co4引起的血小板聚集的影響。凝血酶時間TT、凝血酶原時間PT和活化部分凝血活酶時間APTT測定按試劑盒說明書所提供的方法進行，分別取取37°C預溫待測血漿0.2ml，加入 37°C預溫的相應試劑溶液，混勻，放入MPG-3E-多能雙通道血液凝聚儀中測定凝固時間。統(tǒng) 計學數(shù)據(jù)處理，結果用又± S表示，計量資料采用t檢驗。結果對家犬出血時間(S)的影響結果如表5所示，與用藥前相比較，所給劑量均可明顯 縮短出血時間。對循環(huán)性的血流下降(CFR)的影響在穩(wěn)定的循環(huán)性血流減少中，冠脈血流達到0時可觀察到暫時性的血壓和ST-段 的升高。APT 12ug. kg—1劑量顯著地抑制了循環(huán)性血流減少頻率的發(fā)生結果見表6。表5對犬出血時間(S)的影響(χ 士 S, η = 8 ) 用藥前比較P < 0. 05，**P < 0. 01。表6 APT對犬冠狀動脈血栓形成的影響 與給藥前比較:**Ρ< 0. 01 ；*P < 0. 05。對Ristocetin A co4作為誘導劑引起的血小板聚集的影響，APT能顯著地抑制血 小板聚集，12ug. kg"1劑量的抑制作用持續(xù)了 120分鐘以上。結果見表7。表7 APT對犬體外RA誘導血小板聚集的抑制作用(η = 8) 血小板聚集率與對照組比較廣P < 0. 01 ；*P < 0. 05。對犬TT的影響結果如表8所示，與用藥前相比較，可顯著縮短TT。表 8 對犬TT(S)的影響(X 士 S, η= 8) 與用藥前比較*P < 0. 05，**P < 0. 01。對犬PT的影響結果如表9所示，與用藥前相比較，12ug. kg—1劑量對PT無明顯影 響。表 9 對犬 PT(S)的影響(ζ 士 S,n=8) 與用藥前比較，無顯著性差異，P >0.05。對犬APTT的影響結果如表10所示，與用藥前相比較，12ug.. kg1可明顯縮短APTT。表 10 對犬 APTT (s)的影響(Z 士 S,η = 8 ) 與用藥前比較*P < 0. 05，**P < 0. 01。SEQUENCE LISTING<110>兆科藥業(yè)(合肥)有限公司<120> 一種抗血小板溶栓素及其制備方法<130>MP090838<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>130<212>PRT<213>本發(fā)明所述抗血小板溶栓素α鏈序列<400>1
Asp Val Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ala Tyr Asp Gln Ser Cys Tyr151015Arg Val Phe Lys Leu Leu Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys202530Thr Glu Arg Pro Lys Gly Gly His Leu Val Ser lie Glu Ser Ala Gly354045 Glu Arg Asp Phe Val Ala Gln Leu Val Ser Glu Asn Lys Gln Thr Asp505560Asn Val Trp Leu Gly Leu Lys lie Gln Ser Lys Gly Gln Gln Cys Ser65707580Thr Glu Trp Thr Asp Gly Ser Ser Val Ser Tyr Glu Asn Phe Ser Glu859095Tyr Gln Ser Lys Lys Cys Phe Val Glu Lys Asn Thr Gly Phe Arg Thr
100105110Trp Leu Asn Leu Asn Cys Gly Ser Glu Tyr Ala Phe Val Cys Lys Ser115120125Pro Pro130<210>2<211>125<212>PRT<213>本發(fā)明所述抗血小板溶栓素β鏈序列<400>2Gly Phe Cys Cys Pro LeuArg Trp Ser Ser Tyr Glu Gly His Cys Tyr151015Leu Val Val Lys Glu Lys Lys Thr Trp Asp Asp Ala Glu Lys Phe Cys202530Thr Glu Gln Arg Lys Gly Gly His Leu Val Ser Val His Ser Arg Glu354045Glu Ala Asp Phe Leu Val His Leu Ala Tyr Pro lie Leu Asp Leu Ser505560Leu lie Trp Met Gly Leu Ser Asn Met Trp Asn Asp Cys Lys Arg Glu65707580Trp Ser Asp Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Ala Trp Ala Lys Thr Ser859095Asp Cys Leu lie Gly Lys Thr Asp Asp Asn Gln Trp Leu Asn Met Asp100105110Cys Ser Lys Lys His Tyr Phe Val Cys Lys Phe Lys Leu11512012權利要求
一種抗血小板溶栓素，具有如下之一(a)由α鏈、β鏈兩條肽鏈組成，α鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸且具有抗血小板聚集活性的由(a)衍生的蛋白質。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗血小板溶栓素，其特征在于，其比活力大于每毫克蛋白 1000個活力單位。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗血小板溶栓素，其特征在于，(b)中的蛋白質與(a)中的蛋 白質的氨基酸序列至少有95%的一致性。
4.根據(jù)權利要求1所述的抗血小板溶栓素，其特征在于，與由保藏在武漢大學的中國 典型培養(yǎng)物保藏中心、保藏編號為CCTCC-C200970的雜交瘤細胞株1B9分泌的單克隆抗體 特異性結合。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項所述抗血小板溶栓素的純化方法，包括以下步驟步驟1 將尖吻蝮蛇粗毒溶解于緩沖液中，離心取上清；步驟2 將步驟1所得上清液過DEAE陰離子交換層析柱進行層析，取經體外抗血小板 活性檢測對瑞斯托霉素誘導的血小板聚集具有抑制作用的洗脫組分備用；步驟3 將保藏編號為CCTCC-C200970雜交瘤細胞株1B9分泌的單克隆抗體與親和層 析載體偶聯(lián)，制備免疫親和層析柱；步驟4 用步驟3中制備的免疫親和層析柱層析純化步驟2中所得洗脫組分，以洗脫緩 沖液洗脫，收集取經體外抗血小板活性檢測對瑞斯托霉素誘導的血小板聚集具有抑制作用 的洗脫組分，即為本發(fā)明所述抗血小板溶栓素。
6.根據(jù)權利要求5所述的純化方法，其特征在于，步驟1所述緩沖液為pH7.0 9.0 的 0. 01 0. lmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液。
7.根據(jù)權利要求5所述的純化方法，其特征在于，步驟1所述離心為4000r/min分別離 心兩次，每次離心15min。
8.根據(jù)權利要求5所述的純化方法，其特征在于，步驟2用pH6. 0 9. 0的0. 01 0. 05mol/L的Tris-HCl緩沖液和0. 05 0. 6mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫。
9.根據(jù)權利要求5所述的純化方法，其特征在于，步驟3所述親和層析柱載體為 Sepharose 4B瓊脂糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或羧甲基葡聚糖凝膠。
10.根據(jù)權利要求5所述的純化方法，其特征在于，步驟4所述洗脫緩沖液為pH2.0 4. 0、0. 01 0. 03M Gly-HCl 緩沖液。
11.根據(jù)權利要求1-4任一項所述抗血小板溶栓素在制備治療血管栓塞性疾病藥物上 的應用。
12.根據(jù)權利要求11所述的應用，其特征在于，所述血管栓塞性疾病包括腦梗塞、急性 ST段抬高的心肌梗死、非ST段抬高的急性冠狀動脈綜合征、肺血栓栓塞癥PTE、靜脈血栓 癥、閉塞性周圍動脈粥樣硬化、靜脈動脈化術后血管再栓塞以及經皮冠狀動脈介入PCI的 血栓形成和治療手術后或創(chuàng)傷后的靜脈血栓形成。
13.一種用于治療血管栓塞性疾病的藥物組合物，由權利要求1至4任一項所述的抗血 小板溶栓素與藥學上可接受的輔料組成。
14.根據(jù)權利要求13所述藥物組合物的注射劑，包含抗血小板溶栓素以及藥學上可接 受的賦形劑、穩(wěn)定劑。
15.根據(jù)權利要求14所述的注射劑，其特征在于，每毫升含有至少10個活力單位的抗 血小板溶栓素。
16.根據(jù)權利要求14所述的注射劑，其特征在于，每毫升含有至少10μ g的抗血小板溶栓素。
17.根據(jù)權利要求14-16任一項所述的注射劑，其特征在于，每ml包含抗血小板溶栓素 16-24 μ g、右旋糖酐 32-48mg、海藻糖 1. 6-2. 4mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體提供一種抗血小板溶栓素。本發(fā)明所述抗血小板溶栓素由α鏈、β鏈兩條肽鏈組成，α鏈氨基酸序列如SEQID NO.1所示，β鏈氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其比活力大于每毫克蛋白1000個活力單位。主要通過介導血小板聚集關鍵成分的血小板膜糖蛋白GPIb蛋白，通過阻斷其與血漿vWF結合，阻止血小板粘附在血管內皮細胞壁上，從而抑制血小板聚集。本發(fā)明還提供所述抗血小板溶栓素的純化方法，該方法特異性強、得率高、周期短。經藥理、毒理、藥效、藥代試驗表明，本發(fā)明所述抗血小板溶栓素是一種安全、高效的抑制血小板聚集藥物，具有廣泛的臨床應用前景。
文檔編號A61K38/17GK101838323SQ201010110288
公開日2010年9月22日 申請日期2010年2月3日 優(yōu)先權日2010年2月3日
發(fā)明者張國輝, 戴向榮, 方麗, 李小羿, 楊中強, 許貞玉, 錢芳 申請人:兆科藥業(yè)(合肥)有限公司