專利名稱：：一種對不同產(chǎn)地穿龍薯蕷及同屬藥材進(jìn)行質(zhì)量檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥材質(zhì)量檢測的領(lǐng)域，尤其涉及一種對不同產(chǎn)地穿龍薯蕷及同屬藥材進(jìn)行質(zhì)量檢測的方法。
背景技術(shù)：
：穿龍薯蕷以根莖入藥，其有效成分主要為甾體皂苷類，包括薯蕷皂苷(dioscin)和延齡草苷(trillin)等異螺甾烷醇類皂苷，原薯蕷皂苷(protodioscin)和原纖細(xì)皂苷(protogracillin)等呋甾烷醇類皂苷?？傇碥账猱a(chǎn)生薯蕷皂苷元(diosgenin，Dio)的平均含量為O.93%2.26%。水溶性成分被分離出對-羥芐基酒石酸(Piscidicacid)，有較強(qiáng)的鎮(zhèn)咳作用。根莖中尚分離出少量2，5-D-螺甾-3，5-二烯(25-D-Spirosta-3，5-diene)，此外，尚含有葡萄糖、鼠李糖、甾醇、尿囊素、樹脂、淀粉和蛋白質(zhì)等成分。穿龍薯蕷具有消炎、祛痰、平喘、增加冠脈流量、降低血脂、改善心血管功能及抗菌和抗病毒等藥理活性，還可減慢心率，增強(qiáng)心肌收縮力，增加每日尿量，改善冠脈循環(huán)，降低動脈血壓，尤其適用于輕度動脈硬化。主治冠心病、風(fēng)濕熱、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、筋骨麻木、跌打損傷和支氣管炎等癥。近年來經(jīng)研究證明，穿龍薯蕷還具有避孕和抗癌等作用，藥用價值很高，是國內(nèi)各大藥廠開發(fā)新藥、特藥和中成藥的主要原料之一，也是我國傳統(tǒng)出口商品?！吨袊幍洹肥蛰d的穿龍薯蕷的鑒別和含量測定項下均是對薯蕷皂苷元的檢測，同屬其它四種藥材均未收載含量測定項，而穿龍薯蕷及同屬藥材中含有的皂苷種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，雖然制備含量測定用對照品比較困難，但它們都具有相同的基本骨架和官能團(tuán)，可以借助骨架的通性或官能團(tuán)的特性，對其進(jìn)行測定，常采用重量法、比色法、旋光法、庫侖法和薄層掃描法，陶莉等采用氣相色譜法測定盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的含量、趙景嬋等采用正相高效液相色譜測定穿龍薯蕷中薯蕷皂苷元的含量、都述虎等采用反相高效液相色譜、二極管陣列檢測器測定穿龍總皂苷中薯蕷皂苷元的含量，唐曉清等采用反相高效液相色譜、蒸發(fā)光散射檢測器測定麥冬中甾體皂苷的含量。但這些定量方法操作繁雜，方法專屬性不強(qiáng)，測定準(zhǔn)確度不高。穿龍薯蕷臨床應(yīng)用廣泛，有著較好的開發(fā)前景。穿龍薯蕷的有效成分主要為甾體皂苷類，而甾體皂苷目前主要是用其苷元作為合成激素類藥物的原料，以皂苷的形式作為藥用的不多。因此對穿龍薯蕷中含有的活性化合物進(jìn)行研究將有著重要的應(yīng)用前景。此外，現(xiàn)有的穿龍薯蕷藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較粗糙，需要建立更完善的質(zhì)量控制方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種對不同產(chǎn)地穿龍薯蕷及同屬藥材進(jìn)行質(zhì)量檢測的方法，包括以下步驟，將待測藥材粉末按樣品溶液制備操作，在一定的色譜條件下測定，以外標(biāo)法計算各樣品中指標(biāo)的含量，其特征在于選取薯蕷皂苷作為含量測定指標(biāo)。其中，樣品溶液是將藥材粉末用810倍量6070%乙醇超聲提取1540min后，過濾制備得到。優(yōu)選提取工藝為10倍量65X乙醇超聲提取30min，可將藥材中薯蕷皂苷提取完全，并且操作簡單，重復(fù)性好。樣品經(jīng)溶劑提取后，可以直接進(jìn)樣、正丁醇萃取后進(jìn)樣、乙酸乙酯-正丁醇兩步萃取后進(jìn)樣，優(yōu)選直接進(jìn)樣，操作簡單，雜質(zhì)無干擾，重復(fù)性好。色譜條件為以0DS為固定相，體積比為55:45的乙腈-水為流動相，檢測波長為203nm，流速為1.OmLmin—、柱溫為35"C，進(jìn)樣量為20yL。理論塔板數(shù)按薯蕷皂苷計算不低于3000;薯蕷皂苷與相鄰峰的分離度大于1.5;對稱因子按薯蕷皂苷計算均在0.951.05之間。按薯蕷皂苷確定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=4.139X106x-7.023X104(r=0.9999)。本發(fā)明提供了另一種對不同產(chǎn)地穿龍薯蕷及同屬藥材進(jìn)行質(zhì)量檢測的方法，包括以下步驟，將待測藥材粉末按樣品溶液制備操作，在一定的色譜條件下測定，以外標(biāo)法計算各樣品中指標(biāo)的含量，其特征在于選取原薯蕷皂苷作為含量測定指標(biāo)。其中，樣品溶液是將藥材粉末用810倍量2050%乙醇超聲提取1540min后，過濾，乙酸乙酯_正丁醇兩步萃取后制備得到。優(yōu)選10倍量35%乙醇超聲提取30min。當(dāng)以35%乙醇作為提取溶劑時，原薯蕷皂苷提取效率高，干擾峰較少，分離度較好。樣品經(jīng)溶劑提取后，可以直接進(jìn)樣、正丁醇一步萃取后進(jìn)樣、乙酸乙酯-正丁醇兩步萃取后進(jìn)樣，優(yōu)選乙酸乙酯_正丁醇兩步萃取后進(jìn)樣，雜質(zhì)無干擾，重復(fù)性好。色譜條件是以0DS為固定相，體積比為27:73的乙腈-水為流動相，檢測波長為203nm，流速為1.OmLmin—、柱溫為35。C，進(jìn)樣量為20yL。理論塔板數(shù)按原薯蕷皂苷計算不低于1800;原薯蕷皂苷與相鄰峰的分離度大于1.5;對稱因子按原薯蕷皂苷計算均在0.951.05之間。按原薯蕷皂苷確定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=4.462X106x-l.428X104(r=0.9999)。該屬藥材中所含甾體皂苷類成分種類繁多，結(jié)構(gòu)相似，在紫外區(qū)處于末端吸收，分離難度較大。但是對于原薯蕷皂苷和薯蕷皂苷的檢測限和分析方法的精密度、重現(xiàn)性來說，紫外檢測器可以達(dá)到藥典對方法學(xué)的要求，考慮到紫外檢測器較為常用，故選擇其作為檢測器。對于液相色譜條件，曾考察了不同填料的色譜柱，不同比例的甲醇-水，乙腈-水，乙腈_醋酸水溶液，乙腈_甲醇_水等流動相，結(jié)果表明以XterraODS為固定相，乙腈_水為流動相，分離效果最好，靈敏度高。通過二極管陣列檢測器檢測，色譜峰純度高，分析方法具有專屬性。薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷是薯蕷屬藥材中的主要皂苷類成分，為穿龍薯蕷降血脂作用的有效成分，因此用薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷作為含量測定指標(biāo)，對控制藥材和制劑的質(zhì)量非常必要。本發(fā)明采用RP-HPLC分析方法測定所收集的27個不同來源的穿龍薯蕷及薯蕷屬藥材中薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷的含量，該方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬，可用于藥材、提取物及其制劑的質(zhì)量控制。具體實施例方式下面結(jié)合附圖及具體實施例詳細(xì)介紹本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。實驗材料2695型高效液相色譜儀美國Waters公司2996型二級管陣列檢測器美國Waters公司Empower工作站美國Waters公司BP210S電子天平德國Sartorius公司RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠HH-2數(shù)字顯示恒溫水浴鍋常州國華儀器有限公司甲醇(色譜純)天津康科德科技有限公司乙腈(色譜純)天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司無水乙醇(分析純)廣州化學(xué)試劑廠重蒸水自制原薯蕷皂苷對照品(純度99.5%)自制薯蕷皂苷對照品(純度99.5%)自制樣品收集本研究收集了不同產(chǎn)地穿龍薯蕷及同屬藥材黃山藥、山藥、粉蓽蘚、綿蓽蘚樣S5共27個。樣品預(yù)處理將干燥樣品粉碎，過40目篩，置廣口瓶中，密閉保存。一、薯蕷皂苷含y=4.139X106x_7.023X104(r=0.9999)，6、儀器精密度試驗精密吸取薯蕷皂苷對照品溶液20L，重復(fù)進(jìn)樣6次，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按上述色譜條件測定色譜峰面積，計算薯蕷皂苷色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD=0.2%(n=6)。7、重復(fù)性試驗稱取同一批穿龍薯蕷樣品(河南新鄉(xiāng))6份，精密稱定，按"樣品溶液的制備"項下方法操作，在上述色譜條件下，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計算含量，計算薯蕷皂苷含量的相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD=0.4%(n=6)。8、回收率試驗采用加樣回收法，稱取已知含量的穿龍薯蕷樣品(河南新鄉(xiāng))9份，每份約0.25g，精密稱定，分別精密加入低、中、高三種濃度薯蕷皂苷對照品溶液，按"樣品溶液制備"項下操作。在上述色譜條件下測定，計算方法平均回收率。結(jié)果見表l。表1、穿龍薯蕷樣品的薯蕷皂苷的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>9、穩(wěn)定性取同一對照品溶液，在室溫下放置，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h和72h在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，每次20L，記錄色譜峰面積，計算薯蕷皂苷峰面積的RSD=1.7%，結(jié)果表明薯蕷皂苷對照品溶液在72h內(nèi)穩(wěn)定。10、樣品測定取所收集的穿龍薯蕷及其薯蕷屬干燥藥材粉末，按"樣品溶液制備"項下操作，在上述色譜條件下測定，以外標(biāo)法計算各樣品中薯蕷皂苷的含量，結(jié)果見表3。二、原薯蕷皂苷含量的測定1、色譜條件色譜柱Xterra0DS(250mmX4.6mmi.d.，5iim)美國Waters公司流動相乙腈_水(27:73，v/v)檢測波長203nm流速1.OmLmin—1柱溫35°C進(jìn)樣量20iiL2、系統(tǒng)適用性試驗取供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，理論塔板數(shù)按原薯蕷皂苷計算不低于1800;原薯蕷皂苷與相鄰峰的分離度大于1.5;對稱因子按原薯蕷皂苷計算均在0.951.05之間；重復(fù)性好。3、檢測波長選擇取適量原薯蕷皂苷對照品，用流動相溶解配成溶液，繪制紫外吸收光譜，原薯蕷皂苷的最大吸收波長為203nm，本研究選擇203nm為檢測波長。4、樣品溶液制備取藥材粉末約0.5g，精密稱定，置具塞100mL錐形瓶中，加入10倍量35%乙醇，密塞，超聲處理30min。提取液濾過后蒸干，殘渣加水20mL溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并水層，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，減壓揮干溶劑，殘渣加水溶解并定量轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，用0.45iim微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。此作為樣品溶液。5、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取原薯蕷皂苷對照品約100mg，精密稱定，置lOOmL量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，制成每lmL含原薯蕷皂苷1.Omg的對照品溶液，搖勻。分別精密量取對照品溶液0.2mL，0.5mL，1.OmL，2.OmL，3.OmL，6.OmL置于10mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，分另Uf尋0.02mgmL—、0.05mgmL—、0.lmgmL—、0.2mgmL—、0.3mgmL—、0.6mgmL—1系歹廿對照品溶液。分別精密吸取各系列對照品溶液20yL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以對照品溶液濃度(mg*mL—0為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明原薯蕷皂苷在0.020.6mgmL—1范圍內(nèi)線性良好。所得回歸曲線方程為y=4.462X106x_l.428X104(r=0.9999)。6、儀器精密度試驗精密吸取原薯蕷皂苷對照品溶液20iiL，重復(fù)進(jìn)樣6次，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按上述色譜條件測定色譜峰面積，計算原薯蕷皂苷色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD7=0.2%(n=6)。7、重復(fù)性試驗稱取同一批穿龍薯蕷樣品(河南新鄉(xiāng))6份，精密稱定，按"樣品溶液制備"項下方法操作，在上述色譜條件下，記錄色譜圖，以外標(biāo)法計算含量，計算原薯蕷皂苷的含量相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD=2.4%(n=6)。8、回收率試驗采用加樣回收法，稱取已知含量的穿龍薯蕷樣品(河南新鄉(xiāng))9份，每份約0.25g，精密稱定，分別精密加入低、中、高三種濃度原薯蕷皂苷對照品溶液，按"樣品溶液制備"項下操作。在上述色譜條件下測定，計算方法平均回收率。結(jié)果見表2。表2、穿龍薯蕷樣品的原薯蕷皂苷回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>9、穩(wěn)定性取同一對照品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24、48和72h在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，每次20iiL，記錄色譜峰面積，計算原薯蕷皂苷峰面積的RSD=1.0%，結(jié)果表明原薯蕷皂苷對照品溶液在72h內(nèi)穩(wěn)定。10、樣品測定取所收集的穿龍薯蕷及其薯蕷屬干燥樣品粉末，按"樣品溶液制備"項下操作，在上述色譜條件下測定，以外標(biāo)法計算各樣品中原薯蕷皂苷的含量，結(jié)果見表3。表3、外標(biāo)法計算各樣品中薯蕷皂苷和原薯蕷皂苷的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>i:批號是121378-200401，ii:批號是121137-200402"nd"意思是未檢測到結(jié)果表明，在5種薯蕷藥材中穿龍薯蕷富含原薯蕷皂苷(含量范圍為11.2427.05mg*g—0，黃山藥中含量次之，山藥中含量較少，粉萆蘚、綿萆蘚中檢測不到。在5種薯蕷藥材中穿龍薯蕷中薯蕷皂苷含量較高(含量范圍為17.3128.59mgg—0，黃山藥中含量較少，而山藥、粉萆蘚、綿萆蘚中檢測不到。原因可能與藥材的采收季節(jié)或藥材的種屬有關(guān)。權(quán)利要求一種對不同產(chǎn)地穿龍薯蕷及同屬藥材進(jìn)行質(zhì)量檢測的方法，包括以下步驟，將待測藥材粉末按樣品溶液制備操作，在一定的色譜條件下測定，以外標(biāo)法計算各樣品中指標(biāo)的含量，其特征在于選取薯蕷皂苷作為含量測定指標(biāo)。2.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述樣品溶液是將藥材粉末用810倍量6070%乙醇超聲提取1540min后，過濾制備得到。3.如權(quán)利要求l所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述色譜條件為，以O(shè)DS為固定相，體積比為55:45的乙腈-水為流動相，檢測波長為203nm。4.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述理論塔板數(shù)按薯蕷皂苷計算不低于3000。5.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，按薯蕷皂苷確定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.139X106x-7.023X104(r=0.9999)。6.—種對不同產(chǎn)地穿龍薯蕷及同屬藥材進(jìn)行質(zhì)量檢測的方法，包括以下步驟，將待測藥材粉末按樣品溶液制備操作，在一定的色譜條件下測定，以外標(biāo)法計算各樣品中指標(biāo)的含量，其特征在于選取原薯蕷皂苷作為含量測定指標(biāo)。7.如權(quán)利要求6所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述樣品溶液是將藥材粉末用810倍量2050%乙醇超聲提取1540min后過濾，乙酸乙酯_正丁醇兩步萃取后制備得到。8.如權(quán)利要求6所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述色譜條件是以O(shè)DS為固定相，體積比為27:73的乙腈-水為流動相，檢測波長為203nm。9.如權(quán)利要求6所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述理論塔板數(shù)按原薯蕷皂苷計算不低于1800。10.如權(quán)利要求6所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，按原薯蕷皂苷確定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.462X106x-l.428X104(r=0.9999)。全文摘要本發(fā)明提供了一種對不同產(chǎn)地穿龍薯蕷及同屬藥材進(jìn)行質(zhì)量檢測的方法，包括以下步驟，將待測藥材粉末按樣品溶液制備操作，在一定的色譜條件下測定，以外標(biāo)法計算各樣品中指標(biāo)的含量，其特征在于選取薯蕷皂苷和原薯蕷皂苷作為含量測定指標(biāo)。薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷是薯蕷屬藥材中的主要皂苷類成分，為穿龍薯蕷降血脂作用的有效成分，對控制藥材和制劑的質(zhì)量非常必要。本發(fā)明采用RP-HPLC分析方法檢測所收集不同來源的穿龍薯蕷及薯蕷屬藥材中薯蕷皂苷和原薯蕷皂苷的含量，該方法靈敏、準(zhǔn)確、專屬，可用于藥材、提取物及其制劑的質(zhì)量控制。文檔編號A61K36/8945GK101791366SQ201010121589公開日2010年8月4日申請日期2010年3月10日優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日發(fā)明者劉中博,文屏,李軍,梁智淵,梁立娟,畢開順,王鐵杰,肖麗和,魯藝申請人:深圳市藥品檢驗所