專利名稱：結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，特別涉及一種包含了結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá) 載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(tuberculosis，TB)是成人中發(fā)病率和致死亡率最高的慢性傳染性疾病 之一，是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis, MTB)引起的。結(jié)核桿菌主要通過 呼吸道感染，引起人體內(nèi)多種臟器疾病，如肺結(jié)核、腸結(jié)核等。2006年以來全世界每年大約 有9百萬新發(fā)病例，估計(jì)其中有300萬死于結(jié)核病。WHO預(yù)計(jì)，2010-2020年將有約10億人 感染，3500萬人死于結(jié)核病。聯(lián)合國已將TB與瘧疾、艾滋病列為21世紀(jì)重點(diǎn)控制的三大疾 病。我國屬于世界上結(jié)核病感染人數(shù)最多的國家之一，僅次于印度。全國至少5億以 上人口感染了結(jié)核菌，有活動性肺結(jié)核患者約600萬，具有傳染性的約200萬人，其中有 80%在農(nóng)村。每年死于結(jié)核病的人約13萬之多，是我國各類傳染病死亡人數(shù)總和的兩倍 多。而標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)核病治療療程周期長且較為復(fù)雜，耐藥菌株的出現(xiàn)，結(jié)核與艾滋病雙重感 染，使得結(jié)核病的防治工作越發(fā)嚴(yán)峻?？ń槊缡悄壳拔ㄒ坏慕Y(jié)核病防治疫苗。1920年法國科學(xué)家Calmett等經(jīng)歷13年 230此傳代培養(yǎng)，獲得1株減毒株，命名為卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)，并于 1924年全世界推廣應(yīng)用，迄今已經(jīng)超過30億人接種BCG，該疫苗在防治結(jié)核病上發(fā)揮巨大 作用。但由于BCG在傳代和減毒過程中發(fā)生變異，它對防治兒童的結(jié)核病取得比較好的效 果，對于成人在不同地區(qū)的免疫保護(hù)力作用差異很大(0 80%)。此外，BCG在臨床應(yīng)用 過程中，出現(xiàn)其他不良反應(yīng)，如全菌疫苗BCG可引起淋巴結(jié)腫大、化膿等、BCG接種干擾了純 蛋白衍生物(Purified protein derivatives,PPD)診斷MTB感染的價(jià)值、BCG接種免疫缺 陷病人可引起全身播散性感染等。因此，研制一種新型長效多價(jià)、安全、廉價(jià)的結(jié)核疫苗成 為結(jié)核病防治工作中的當(dāng)務(wù)之急。Ag85B是結(jié)核分枝桿菌的主要的早期培養(yǎng)物濾液蛋白之一，是Ag85B復(fù)合物中的 成分。Ag85B 復(fù)合物包括 Ag85A(30kDa)、Ag85B(31kDa)和 Ag85C(31. 5kDa)，其中，對機(jī)體 有保護(hù)作用的主要是Ag85A和Ag85B，約占該復(fù)合物中60%。Ag85B是目前確認(rèn)的結(jié)核桿 菌蛋白中唯一能誘發(fā)保護(hù)性免疫的一類蛋白，能誘導(dǎo)較高水平的特異性抗體應(yīng)答和特異性 Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答，其編碼基因長975bp，前120bp的核酸編碼信號肽。Dietrich等將包 含粘膜佐劑腸桿菌突變脫毒腸毒素(LTK63)和Ag85B-ESAT-6的疫苗通過鼻粘膜給藥，獲得 比BCG更強(qiáng)而持久的特異性Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答。Elvang等證實(shí)Ag85B_TB10. 4亞單位基因 疫苗能促進(jìn)IFN-Y，IL-2，和TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)⑶4+T和⑶8+T cells分化 增殖，獲得較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫。此外，Ag85B蛋白容易結(jié)合人纖維蛋白，促進(jìn)吞噬 細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌，有較強(qiáng)的防止結(jié)核桿菌再感染作用。攻克結(jié)核病關(guān)鍵在于盡快開發(fā)一種安全、廉價(jià)、長效的新型結(jié)核疫苗，亦是各國研究人員共同的使命。迄今為止，結(jié)核病疫苗的研究主要有減毒活疫苗(live attenuated vaccine)BCG、亞單位疫苗(subunit vaccine)、DNA 疫苗(DNA vaccine)等。由于傳統(tǒng) BCG 在應(yīng)用中出現(xiàn)種種問題，研究人員嘗試用重組BCG、改變免疫途徑等辦法，以期盡可能刺激 所有的T細(xì)胞群體，從而得到更強(qiáng)、更持久的免疫保護(hù)力。結(jié)核桿菌生長過程中表達(dá)具有免疫保護(hù)作用的蛋白，主要有熱休克蛋白、分泌性 蛋白等，將這些蛋白分離純化制成菌苗，即亞單位疫苗。此類疫苗能刺激特異性T細(xì)胞亞 群，免疫特異性強(qiáng)，無脂多糖，減少毒副作用。但，該疫苗刺激的免疫反應(yīng)較單一，必須添加 佐劑，并與BCG聯(lián)合接種，才能引起更強(qiáng)的免疫應(yīng)答保護(hù)機(jī)體。結(jié)核DNA疫苗是運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，將目的抗原的編碼基因插入到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒 中，再肌肉注射免疫小鼠，可以誘導(dǎo)出很強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫。目前已證實(shí)Ag85A、Ag85B、 ESAT26、MPT-63、MPT-64、MPT-83、HSP65、HSP70和Psts23等編碼基因的質(zhì)粒免疫小鼠可產(chǎn) 生很強(qiáng)的細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答。從20世紀(jì)90年代初提出轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗的概念，隨著基因克隆技術(shù)不斷完 善和發(fā)展，植物基因工程發(fā)展迅猛，對轉(zhuǎn)基因口服疫苗的研究越來越多。具體過程包括將病 原微生物中與機(jī)體保護(hù)性的免疫應(yīng)答相關(guān)的蛋白的編碼基因克隆出來構(gòu)建穿梭質(zhì)粒載體， 然后利用根瘤農(nóng)桿菌或基因槍等方法，將攜帶目的基因的載體轉(zhuǎn)化入植物中，從而用轉(zhuǎn)基 因植物作為生物反應(yīng)器，使與機(jī)體保護(hù)性的免疫應(yīng)答相關(guān)的蛋白在轉(zhuǎn)達(dá)基因植物組織中以 較低的生產(chǎn)成本生產(chǎn)出來，并且以口服形式接種動物以達(dá)到使動物獲得免疫保護(hù)的目的。轉(zhuǎn)基因植物疫苗是將植物分子生物學(xué)技術(shù)與機(jī)體免疫機(jī)理相結(jié)合，使外源基因在 植物中表達(dá)，免疫人體后獲得特異性抗體的新型疫苗，和其他疫苗相比有安全、高效、廉價(jià)、 易運(yùn)輸、易推廣等優(yōu)點(diǎn)。但外源基因在植物中低表達(dá)是研究人員面臨的重大難題之一，開發(fā) 并建立高效表達(dá)體系和高效植物表達(dá)載體的研究是克服該問題的重要途徑。理論上，用于 生產(chǎn)口服疫苗的植物反應(yīng)器要需符合以下條件①表達(dá)蛋白的含量較高，至少能占可溶性 總蛋白0. 01-0. 1%;②抗原蛋白的濃度要穩(wěn)定、一致，以便定量口服；③常溫下長期保存，并 保證抗原蛋白生物活性穩(wěn)定；④轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)抗原蛋白的組織要可口、服用方便；⑤種 植技術(shù)普及，人人可種植。玉米作為植物反應(yīng)器候選之一，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢①表達(dá)外源性蛋白的玉米種 子在常溫下至少保存一年；②抗原蛋白濃度穩(wěn)定；③檢測到在轉(zhuǎn)基因玉米中表達(dá)的LT-B蛋 白占可溶性總蛋白0. 05% 0. 到之間，有的達(dá)到1.8%。Jeffrey和St印hen等在對外 源性基因Lt-B表達(dá)進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白被定位到液泡當(dāng)中蛋白表達(dá)量最高，其次 是在細(xì)胞表面，再次是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而定位到細(xì)胞核或質(zhì)體當(dāng)中，或者不進(jìn)行定位時(shí)蛋白表 達(dá)量最低。相反，Lt-B基因在煙葉中或馬鈴薯莖中表達(dá)時(shí)，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)表達(dá)量 可達(dá)到在細(xì)胞表面的三到四倍；④玉米是全世界三大主食之一，廣受人們的喜愛。正因?yàn)橛?米具備多項(xiàng)優(yōu)勢，已經(jīng)成功表達(dá)外源性基因，并取得較好的效果。1986年Fromm等首次在玉 米中成功表達(dá)除草劑pat基因，經(jīng)過約十年深入研究，1995年后轉(zhuǎn)基因玉米已經(jīng)進(jìn)入商業(yè) 化階段。其中，抗蟲(Bt)轉(zhuǎn)基因玉米和除草劑已經(jīng)被批準(zhǔn)商業(yè)化。到了 2005年，全球轉(zhuǎn)基 因玉米種植面積超過2120萬hm2，轉(zhuǎn)基因玉米市場價(jià)值達(dá)到19. 1億美元。當(dāng)然，玉米真正 成為人類防治傳染病的口服疫苗，還需要進(jìn)一步探索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種包含結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá) 載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法構(gòu)建的玉米表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種包含了結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá)載 體的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)根據(jù)MTB_Ag85B序列設(shè)計(jì)1對引物上游引物序列為Pl5' -TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3'，含 BamH I 酶 切位點(diǎn)和起始密碼子；下游引物序列為P25' -CGCGCT GGATCCTCAAATGTATACCCAAAG-3 ‘，含 XbaI 酶切 位點(diǎn)和終止密碼子；
(2)提取人結(jié)核分支桿菌H37Rv基因組DNA作為模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物Pl 和P2進(jìn)行常規(guī) 鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增結(jié)核Ag85B基因；(3)pCRG_Ag85B 載體的構(gòu)建用BamH I和XbaI分別雙酶切步驟(2)所得結(jié)核Ag85B基因和 pCR-G(pCR-Globulin)載體，經(jīng)瓊脂糖電泳分離，純化后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒 pCRG-Ag85B ；(4)重組載體pCAMG_Ag85B的克隆與構(gòu)建將重組載體pCRG_Ag85B用Hindi 11和Xba I雙酶切，經(jīng)過瓊脂糖電泳分離、純化， 得到G-Ag85B片段；將植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300-N0S分別用HindIII和Xba I雙酶切， 再將酶切產(chǎn)物與上述G-Ag85B片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化篩選獲得重組載體pCAMG-Ag85B。步驟(2)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在94°C預(yù)變性5min， 然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、45S，52°C、45S，72°C、60S，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延伸 lOmin，擴(kuò)增完畢后置4°C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為lOumol/1的上游引物Pl 1 μ 1濃度為IOumo 1/1的下游引物Ρ2 1 μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的濃度各為2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1H37Rv 基因組 DNA4 μ 1Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液 5 μ 1Ex耐熱性DNA聚合酶0. 25 μ 1滅菌水34. 75 μ 1。上述方法構(gòu)建的結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá)載體作為制備疫苗的用途。該載體是 植物雙元表達(dá)載體，可以攜帶結(jié)核Ag85B基因被轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米幼胚，繼而 獲得玉米轉(zhuǎn)基因植株，也可以將結(jié)核Ag85B基因整合到植物基因組中，使抗原基因在植物 中正常表達(dá)出含有結(jié)核Ag85B基因的表達(dá)蛋白質(zhì)作為口服疫苗。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果本發(fā)明選擇具有驅(qū)動外 源性基因在組織或器官表達(dá)特異性和高水平表達(dá)的雙重優(yōu)勢的玉米種子特異性啟動子 Globulin-Ι，構(gòu)建了由玉米種子特異表達(dá)啟動子Globulin-I調(diào)控的結(jié)核優(yōu)勢結(jié)核Ag85B基因，使其特異、高效地在玉米種子中表達(dá)，可以克服組成型啟動子在應(yīng)用中的缺陷，這一研 究在國內(nèi)外鮮有報(bào)道；目前，發(fā)明人已經(jīng)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米幼胚，獲得部分轉(zhuǎn)基因植 株，為進(jìn)一步研究利用轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)結(jié)核Ag85B基因口服疫苗的免疫效果奠定基礎(chǔ)。


圖1為重組載體pCAMG_Ag85B的構(gòu)建示意圖。圖2是PCR擴(kuò)增的結(jié)核Ag85B基因，其中，Ml為 DNA marker DL_1200(bp) ； 1 2 為結(jié)核 Ag85B 基因的 PCR 產(chǎn)物；M2 為 DNA marker DL-10000(bp)。圖3為重組載體pCAMG_Ag85B雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，Ml為 DNA markerDL-1200 (bp) ；1 為 pCAMG_Ag85B 的 BamH I 和 Xba I 雙酶 切產(chǎn)物；M2 為 DNA marker DL-10000 (bp)。圖4為在農(nóng)桿菌中提取出的pCAMG_Ag85B重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定圖，其中，Ml為 DNA marker DL_1200(bp) ；1 為 pCAMG-L 的 BamH I 和 Xbal 雙酶切產(chǎn) 物。圖5為載體pCRG構(gòu)建示意圖。圖6為載體pCRG示意圖。圖7為載體pCAMBIA-1300-N0S構(gòu)建示意圖。圖 8 為載體 pCAMBIA-1300-N0S 示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。在下面實(shí)施中所要用到的材料為質(zhì)粒pUC18購于華美生物工程公司；PCR2. 1與pCAMBIA1300均購于上海二醫(yī)新 生基因科技有限公司；PBI 121購于北京天恩澤基因公司；Globulin-1基因根據(jù)Genbank 上登錄號(M24845. 1 GI =168480)，由大連寶生物公司合成；Bar基因根據(jù)Genbank上登錄號 (X05822. 1 GI 47126)由上海英駿生物有限公司合成。人結(jié)核分支桿菌H37Rv購自中科院微生物菌種保藏中心；大腸桿菌E. coli T0P10購自天津天有利科技有限公司。試劑Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(HindIII、Xba I和BamH I)和DL-lkb Ladder購自大連寶生物公司；試劑盒(質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物清潔試劑 盒，DNA膠回收純化試劑盒)購自O(shè)MEGA公司；PCR引物合成和重組質(zhì)粒上目的基因的序列 測定均由上海生工生物工程公司完成。農(nóng)桿菌菌株LBA4404購自Invitrogen公司。培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌 的培養(yǎng)。YEB培養(yǎng)基用于農(nóng)桿菌的培養(yǎng)。實(shí)施例1 包含了結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá)載體pCAMG_Ag85B的構(gòu)建示意圖如 圖1所示(1)克隆基因引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)MTB_Ag85B序列設(shè)計(jì)1對引物上游引物序列為P15' -TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3'，含 BamHI 酶 切位點(diǎn)和起始密碼子；下游引物序列為P25' -CGCGCT GGATCCTCAAATGTATACCCAAAG-3 ‘，含 Xbal 酶切 位點(diǎn)和終止密碼子。(2)PCR反應(yīng)與克隆人結(jié)核分支桿菌H37Rv基因組DNA的提取與純化將MTB H37Rv接種于改良羅氏 培養(yǎng)基，器皿口加橡皮塞于37°C培養(yǎng)，每周觀察1次；結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，一般需2 4 周長成肉眼可見的菌落；培養(yǎng)2-4周后，刮取少量細(xì)菌于生理鹽水中磨菌，用OMEGA細(xì)菌基 因組DNA抽提試劑盒提取純化基因組DNA ；以上述方法提取的基因組DNA為模板，用引物P1和P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)， 擴(kuò)增Ag85B基因，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小約為860bp ；所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如 下將混合液在94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、45s，52°C、45s，72°C、60s，共進(jìn) 行30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，擴(kuò)增完畢后置4°C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為10umol/l的上游引物PI 1 Pi濃度為10umol/l的下游引物P2 lu 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的濃度各為2. 5mM的dNTP混合物4 u 1H37Rv 基因組 DNA4 u 1Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液 5 u 1Ex耐熱性DNA聚合酶0. 25 ii 1滅菌水34. 75u 1 ；將擴(kuò)增產(chǎn)物分離純化后，用1XTAE電泳緩沖液制備質(zhì)量百分比濃度為1. 0%的瓊 脂糖凝膠，取其中5 yl進(jìn)行電泳，以DNAmarker DLlkb分子量參照，在紫外透射分析儀下觀 察PCR產(chǎn)物片段大小，并拍照；結(jié)果如圖2所示，產(chǎn)物片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。(3) pCRG-Ag85B 載體的構(gòu)建用BamH I和Xbal分別雙酶切步驟(2)所得結(jié)核Ag85B基因和 pCR-G(pCR-Globulin)載體，酶切后用10g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，并經(jīng)過DNA凝膠回 收純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物，將上述酶切純化的產(chǎn)物按照3 1的摩爾比混合，用T4DNA 連接酶連接過夜；轉(zhuǎn)化至低溫CaC12制備的大腸桿菌E. coli ToplO感受態(tài)中，然后涂布含 50 u g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中；次日，隨機(jī)挑取多個單菌落，分別接種于3mL含 卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C下130r/min振蕩培養(yǎng)過夜；先取少量菌液煮沸作為模板進(jìn)行 菌液PCR檢測是否有Ag85B的存在，再將菌液PCR篩選呈陽性的菌落用質(zhì)粒小量提取試劑 盒抽提質(zhì)粒DNA ；將提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定，將篩選出的陽性克隆產(chǎn)物的菌液進(jìn)行 測序鑒定；測序采用Sanger雙脫氧鏈終止法，對插入序列的兩端進(jìn)行測定，測序工作由上 海生物工程有限公司完成；所述pCR-G載體的構(gòu)建方法(構(gòu)建示意圖見5)如下用Hindlll和BamHI分別 雙酶切Globulin-1和pCR2. 1，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 8%的瓊脂糖分離，用膠回收試劑盒回收酶 切產(chǎn)物，將兩個回收片段用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，酶切鑒定獲得pCR-G載體(示意圖見7)。(4)重組載體pCAMG_Ag85B的克隆與構(gòu)建將測序正確的重組載體pCRG_Ag85B用HindiII和Xba I雙酶切，經(jīng)過瓊 脂糖電泳分離、純化，得到G-Ag85B片段；將植物表達(dá)載體pCAMBIA-1300-N0S (載體 PCAMBIA-1300-N0S示意圖如圖7所示)用Hindlll和Xba I雙酶切；用膠回收試劑盒純化 回收上述酶切產(chǎn)物，并以3 1的摩爾比混合，用T4DNA連接酶連接過夜；轉(zhuǎn)化至低溫CaC12 制備的E. coliToplO感受態(tài)中，然后涂布50ii g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中；次日，隨 機(jī)挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中，37°C下振蕩培養(yǎng)過夜；首先進(jìn)行菌液PCR鑒定，抽提質(zhì)粒 DNA，進(jìn)行雙酶切鑒定(見圖3)，獲得重組載體pCAMG-Ag85B ；所述pCAMBIA-1300-N0S載體的構(gòu)建方法(見圖6)如下通過per技術(shù)以PBI 121 為模板擴(kuò)增N0S終止子，用SacI和EcoRI完全雙酶切N0S和pUC18，經(jīng)1 %瓊脂糖分離后用 膠回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物，將二者以T4連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，酶切鑒定 重組質(zhì)粒，命名為PUC18-N0S ；再用Xbal和EcoRI酶切pUC18_N0S，回收含有N0S及部分多 克隆位點(diǎn)的DNA片段，與經(jīng)Xbal和EcoRI酶切的質(zhì)粒pCAMBIA_130連接、轉(zhuǎn)化，獲得的重組 質(zhì)粒命名為pCAMBIA-1300-N0S ；用Xho I切除質(zhì)粒pCAMBIA-1300_N0S內(nèi)潮霉素抗性基因， 回收并進(jìn)行末端脫磷酸；將含有bar基因片段的DNA與pCAMBIA-1300_N0S連接，轉(zhuǎn)化獲得 的重組質(zhì)粒，測序鑒定，將構(gòu)建的質(zhì)粒的命名為pCAMBIA-1300-N0S-Bar (見圖8)。實(shí)施例2提取篩選實(shí)施例1所得重組表達(dá)載體pCAMG_Ag85B，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 預(yù)先制 備農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)，儲存于_80°C冰箱備用；取200 u L感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30min ； 將1 ii gDNA加入感受態(tài)細(xì)胞中，液氮中速凍5min以上；37°C水浴快速解凍小于5min ；加入 800 uL LB培養(yǎng)基；28°C搖床低速培養(yǎng)3h ；取200 u L涂布于含50 u g/mL卡那霉素的平板， 28°C搖床培養(yǎng)2d 3d ；經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證，挑選陽性克隆子搖菌，提取質(zhì)粒后用Hindlll和 Xba I雙酶切進(jìn)行雙酶切鑒定，最終確定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到了 LBA4404中，_80°C保存菌株。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種包含了結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)根據(jù)MTB-Ag85B序列設(shè)計(jì)1對引物上游引物序列為P1 5′-TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3′，含BamH I酶切位點(diǎn)和起始密碼子；下游引物序列為P2 5′-CGCGCT GGATCCTCAAATGTATACCCAAAG-3′，含XbaI酶切位點(diǎn)和終止密碼子；(2)提取人結(jié)核分支桿菌H37Rv基因組DNA作為模板，用步驟(1)設(shè)計(jì)的引物P1和P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增結(jié)核Ag85B基因；(3)pCRG-Ag85B載體的構(gòu)建用BamH I和XbaI分別雙酶切步驟(2)所得結(jié)核Ag85B基因和pCR-G載體，經(jīng)瓊脂糖電泳分離，純化后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化獲得重組質(zhì)粒pCRG-Ag85B；(4)重組載體pCAMG-Ag85B的克隆與構(gòu)建將重組載體pCRG-Ag85B用HindIII和Xba I雙酶切，經(jīng)過瓊脂糖電泳分離、純化，得到G-Ag85B片段；將植物表達(dá)載體pCAMBIA1300用HindIII和Xba I雙酶切，再將酶切產(chǎn)物與上述G-Ag85B片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化篩選獲得重組載體pCAMG-Ag85B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包含了結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá)載體的構(gòu)建方法， 其特征在于步驟(2)所述常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)具體步驟如下將混合液在94°C預(yù)變性 5min,然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C、45s，52°C、45s，72°C、60s，共進(jìn)行30個循環(huán)，最后72°C延伸 lOmin，擴(kuò)增完畢后置4°C終止反應(yīng)；所述混合液組成如下濃度為lOumol/1的上游引物PI1 yl濃度為lOumol/1的下游引物P21 ill dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的濃度各為2. 5mM的dNTP混合物4 u 1H37Rv 基因組 DNA4 u 1Ex耐熱性DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5 u 1Ex耐熱性DNA聚合酶0. 25 ill滅菌水34. 75 ill。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的玉米表達(dá)載體作為制備疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包含了結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá)載體及其應(yīng)用。該載體的構(gòu)建方法是(1)根據(jù)結(jié)核Ag85B基因的編碼序列設(shè)計(jì)1對引物P1和P2；(2)用引物P1和P2進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增結(jié)核Ag85B基因；(3)pCRG-Ag85B載體的構(gòu)建；(4)重組載體pCRG-Ag85B的構(gòu)建，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。本發(fā)明選擇具有驅(qū)動外源性基因在組織或器官表達(dá)特異性和高水平表達(dá)的雙重優(yōu)勢的玉米種子特異性啟動子Globulin-1，構(gòu)建了由玉米種子特異表達(dá)啟動子Globulin-1調(diào)控的結(jié)核優(yōu)勢結(jié)核Ag85B基因，使其特異、高效地在玉米種子中表達(dá)。本發(fā)明結(jié)核Ag85B基因的玉米表達(dá)載體可用于制備疫苗。
文檔編號A61P31/06GK101845456SQ20101014085
公開日2010年9月29日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者李君武 申請人:暨南大學(xué)