專利名稱：促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及到一種能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的 hNgR-Fc融合蛋白疫苗。
背景技術(shù)：
膠體金(Colloidal gold, CG)是指納米金顆粒的一種存在狀態(tài)，即金粒子粒徑大 小約為1 IOOnm之間，存在于溶液中。膠體金是氯金酸的水溶液，屬懸膠液，為帶負(fù)電的 膠體。膠金粒和其它膠一樣也具有雙層電結(jié)構(gòu)，中心為許多金分子構(gòu)成的膠金核，其外為 AuO2-及部分反離子形成的吸附層，膠金核同吸附層一起組成膠金粒。膠體金如其它納米顆 粒一樣屬單晶和多晶微粒，具有小尺寸效應(yīng)、良好的表面和界面效應(yīng)、靶向作用及緩釋作用 等。目前，膠體金主要應(yīng)用于免疫金標(biāo)記技術(shù)及相關(guān)傳感器技術(shù)，還沒有應(yīng)用于免疫佐劑的 研究報(bào)道。目前人和動(dòng)物用的常規(guī)免疫佐劑主要是乳化的油_水佐劑、金屬鹽類佐劑(如鋁 佐劑)、完全福氏佐劑(Complete Freund's adjuvant,CFA)和不完全福氏佐劑(Incomplete Freund' s adjuvant, IFA)等。但它們對(duì)抗原性較弱的多肽，特別是重組抗原效果不佳，或 存在嚴(yán)重的副作用，注射后在注射部位常引起無菌化膿，有時(shí)還會(huì)形成肉芽腫，且有長(zhǎng)期的 油滯留于組織，易引起過敏反應(yīng)等問題。研究表明，與周圍神經(jīng)損傷后的成功再生相比，中樞神經(jīng)(CNS)再生失敗 的主要原因是由于損傷微環(huán)境中多種再生抑制分子的存在。目前已發(fā)現(xiàn)這種軸突 # ^ Φ ^ ± Jg W H ft :Nogo-A> MAG (Myelin—associated glycoprotein)禾口 OMgp (Oligodendrocyte-myelin glycoprotein)，盡管三者蛋白結(jié)構(gòu)明顯不同，但卻均能通 過一個(gè)共同受體Nogo-66受體(Nogo-66rec印tor，NgR)及其下游可能的信號(hào)通路，參與神 經(jīng)再生的抑制作用。盡管有研究表明采用脊髓組織勻漿或髓鞘提取物免疫動(dòng)物治療脊髓損 傷(Spinal cord injury, SCI)可通過產(chǎn)生抗體封閉其抑制作用，促進(jìn)損傷脊髓的恢復(fù)，但 脊髓組織勻漿或髓鞘提取物成分特別復(fù)雜，誘發(fā)自身免疫病的風(fēng)險(xiǎn)極高。鑒于NgR特殊的 靶分子效應(yīng)，選擇NgR為免疫原既可促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生，對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用，又 可最大程度地降低誘發(fā)自身免疫病的風(fēng)險(xiǎn)性，從而開辟了克服CNS再生失敗的新途徑，為 進(jìn)一步揭示神經(jīng)再生機(jī)制及相關(guān)藥物開發(fā)提供了新的契機(jī)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，以提高其 免疫效果，并減小其毒副作用。本發(fā)明所述促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，是由下述方法制成的組 合物將純化的hNgR-Fc融合蛋白溶解于緩沖液中，所得溶液與等體積的膠體金混合得 混合液，在混合液中加入穩(wěn)定劑。
hNgR-Fc融合蛋白在組合物中的濃度為30 60 μ g/ml。所述緩沖液的pH值為4 9。所述緩沖液為濃度為0. 005 0. 015M的檸檬酸鈉緩沖液。
所述膠體金的粒徑為10 50nm。所述穩(wěn)定劑為聚乙二醇20000，其在組合物中的濃度為200 500 μ g/ml。本發(fā)明以hNgR-Fc (Fragment cristallizable)融合蛋白作為免疫原，并采用膠 體金作為蛋白疫苗的免疫佐劑。受體-Fc融合蛋白已經(jīng)被證實(shí)是除了抗體藥物以外，清 除體內(nèi)多余配體分子的又一有效手段。受體結(jié)構(gòu)域在融合蛋白中執(zhí)行結(jié)合配體的功能， 而Fc部分可有多種作用，如可使用通用的標(biāo)記二抗進(jìn)行檢測(cè)，可通過與protein A的結(jié)合 而使用親和層析方便地純化，大大延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的半衰期，可提供額外的生物學(xué)效應(yīng)， 如補(bǔ)體激活、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(Antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)等免疫調(diào)節(jié)活性。與抗體藥物相比，受體-Fe融合蛋白可不必進(jìn)行繁 瑣的抗體篩選和人源化過程，并具有親和力高、免疫源性低等優(yōu)勢(shì)。膠體金顆粒標(biāo)記蛋白質(zhì)(抗體、抗原)是通過異性電荷吸引產(chǎn)生的結(jié)合，這種結(jié)合 不影響蛋白質(zhì)生物活性和免疫活性，這為膠體金作為免疫佐劑提供了理論依據(jù)。納米顆粒 均勻性好，以其作為佐劑，可有效避免載體效應(yīng)，延緩抗原的釋放，持久增強(qiáng)機(jī)體體液免疫 和刺激淋巴細(xì)胞增殖，更重要的是它包裹的抗原顆粒是巨噬細(xì)胞(ΜΦ)和樹突狀細(xì)胞(DC) 的首選吞噬目標(biāo)，為實(shí)現(xiàn)機(jī)體的有效免疫反應(yīng)邁出重要一步。納米顆粒還可形成水凝膠，特 別適合做蛋白質(zhì)/多肽類藥物載體，且不需要交聯(lián)別的試劑或佐劑。制備膠體納米金顆粒有多種不同的方法，本發(fā)明采用檸檬酸三鈉還原法制備不同 粒經(jīng)的納米金顆粒。為驗(yàn)證檸檬酸三鈉還原法制備的納米金的可靠性，利用抗壞血酸還原 法制備粒徑相近的納米金作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。通過裸眼觀察、丁達(dá)爾現(xiàn)象、可見光光譜法和掃描電 鏡鑒定制備的納米金顆粒的粒徑大小及均勻度。為觀察納米金顆粒對(duì)大鼠免疫功能的影響，本發(fā)明設(shè)計(jì)了三種均勻度較好的不同 粒徑和三種劑量9個(gè)組合的納米金對(duì)SD(Sprague-DawIey)大鼠進(jìn)行肌肉注射，并設(shè)計(jì)了 一組正常對(duì)照實(shí)驗(yàn)；同時(shí)觀察有無實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Exprerimental allergic encephalomyelitis, EAE)的發(fā)生，以證明用納米金免疫大鼠的安全性。采用噻唑藍(lán) (Thiazolyl blue,MTT)比色法測(cè)定外周血和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況。由于IL-2是T淋 巴細(xì)胞增殖的關(guān)鍵免疫促進(jìn)因子，而活化的T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2能力的強(qiáng)弱又可作為評(píng)價(jià)機(jī)體 免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，本發(fā)明采用ELISA法檢測(cè)外周血分離血清及脾臟淋巴細(xì)胞中的 IL-2水平。結(jié)果表明不同粒徑和劑量的納米金均可不同程度促進(jìn)SD大鼠外周血和脾臟 淋巴細(xì)胞的增殖，其中15nm/0. 6ml劑量組和25nm/0. 4ml劑量組對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞增 殖有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而15nm/0. 6ml劑量組則對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)。與正常 對(duì)照組相比，不同粒徑不同劑量的膠體金均可促進(jìn)外周血和脾臟淋巴細(xì)胞IL-2的分泌，其 中外周血15nm/0. 6ml劑量組促進(jìn)作用最為明顯，脾臟中則15nm/0. 6ml和25nm/0. 6ml劑量 組促進(jìn)作用較強(qiáng)。納米金的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果證實(shí)，納米金作為免疫佐劑具有很強(qiáng)的安全性。為獲得大量天然表達(dá)的hNgR-Fc融合蛋白，本發(fā)明以真核表達(dá)載體 pcDNA-hNgR-Fc質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到hNgR-Fc片段。所用引物如 下
Forward primer 5' GGAATTCCATATGAAGAGGGCGTCCGCTGG 3‘Nde I酶切位點(diǎn)Reverse pr imer 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3'Xho I酶切位點(diǎn)引物兩端分別引入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增的hNgR-Fc片段，經(jīng)Nde I和 Xho I雙酶切后回收純化并將其克隆于同樣雙酶切的pET30a+表達(dá)載體(Invitrogen)中， 獲得pET-hNgR-Fc重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL-2IpLys感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，并通過SDS-PAGE對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行鑒定。然后通 過Protein A親和柱來富集并純化破菌上清中的目標(biāo)蛋白hNgR-Fc，并進(jìn)行SDS-PAGE分析 禾口 Western blot 鑒定。以獲得的hNgR-Fc融合蛋白作為疫苗的主要組分，以15nm膠體金作為免疫佐劑制 備hNgR-Fc融合蛋白疫苗，并通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步對(duì)獲得的疫苗進(jìn)行效應(yīng)學(xué)觀察。


現(xiàn)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖IA是粒徑為15nm膠體金的電鏡掃描圖片；圖IB是粒徑為50nm膠體金的電鏡掃描圖片；圖2是納米金溶膠的光譜掃描曲線圖，檸檬酸三鈉還原法制備的直徑10、15、25、 50、60、70、98、147、160nm的膠體金顆粒與抗壞血酸還原法制備的直徑8 13nm的膠體金顆 粒紫外_可見吸收光譜檢測(cè)；圖3A是外周血淋巴細(xì)胞增殖與納米金顆粒直徑之間的關(guān)系圖(與正常對(duì)照組比 氺氺，P < 0. 01 ;氺，P < 0. 05)；圖3B是脾臟淋巴細(xì)胞增殖與納米金顆粒直徑之間的關(guān)系圖(與正常對(duì)照組比較， 氺氺，ρ < 0. 01 ;氺，ρ < 0. 05)；圖4A是血清中IL-2水平與納米金顆粒直徑之間的關(guān)系圖(與正常對(duì)照組比較， **，ρ < 0. 01)；圖4B是脾臟淋巴細(xì)胞中IL-2水平與納米金顆粒直徑之間的關(guān)系圖(與正常對(duì)照 組比較，**，P < 0.01)；圖5A是重組質(zhì)粒pET-hNgR-Fc的PCR鑒定結(jié)果圖，其中1、2分別為假陽(yáng)性和陽(yáng)性 克隆，M 為 Wide Range DNA Marker (500-15000)；圖5B是重組質(zhì)粒pET-hNgR-Fc酶切鑒定結(jié)果圖，其中M :DNA MarkerLamda-Hind III Digest ;1 :pET-30a(+) ;2 :pET-hNgR-Fc ;3 :pET-hNgR-Fc XhoI 單酶切；4 pET-hNgR-Fc Nde I+Xho I 雙酶切；圖5C是重組hNgR-Fc融合蛋白的原核表達(dá)和純化的SDS-PAGE結(jié)果圖，其中 1 誘導(dǎo)的菌體破菌上清；2 誘導(dǎo)的全菌裂解液；3 未誘導(dǎo)的全菌裂解液；4 純化的重組 hNgR-Fc融合蛋白；圖5D是重組hNgR-Fc融合蛋白的Western blot鑒定結(jié)果圖，其中1 未誘導(dǎo)的全 菌裂解液；2 誘導(dǎo)的全菌裂解液；3 未誘導(dǎo)的菌體破菌上清；4 誘導(dǎo)的菌體破菌上清；圖6是疫苗穩(wěn)定性的光譜掃描檢測(cè)曲線圖7是ELISA法檢測(cè)免疫大鼠血清中的抗NgR抗體滴度的結(jié)果圖；圖8A是hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和抑制分子MAG對(duì)神經(jīng)突起的抑制 作用，在預(yù)先用MAG處理的培養(yǎng)液中培養(yǎng)新生大鼠背根節(jié)神經(jīng)元(Dorsalroot ganglia, DRG)，分別加入未經(jīng)hNgR-Fc疫苗免疫的對(duì)照血清、hNgR-Fc疫苗免疫血清及NgR抗體培養(yǎng) 24h后，神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)情況圖，標(biāo)尺25 μ m ；圖8B是hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和抑制分子MAG對(duì)神經(jīng)突起的抑制 作用，各組神經(jīng)元平均突起長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)分析圖，其中數(shù)據(jù)表示為均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤(與MAG+ 對(duì)照血清組相比，#，P < 0. 01)；圖9A是脊髓半橫切損傷模型行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，BBB評(píng)分結(jié)果圖，(與單純損傷 (SCI)組相比，*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)圖9B是脊髓半橫切損傷模型行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，網(wǎng)格步行結(jié)果圖，(與SCI組相比， *，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 01)圖9C是脊髓半橫斷模型行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，足跡試驗(yàn)結(jié)果圖(紅色標(biāo)記大鼠前掌， 藍(lán)色標(biāo)記后掌)；圖9D是脊髓半橫切損傷模型行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果，足跡法結(jié)果圖，(與SCI組相比，**， ρ < 0. 01)；圖IOA是核黃(Nuclear yellow, NY)逆行示蹤標(biāo)記SCI組和SCI+hNgR-Fc免疫 組損傷部位頭側(cè)(距損傷部位中心上游約5mm處)脊髓冠狀(橫切)和縱切切片圖，結(jié) 果顯示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接種可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生，標(biāo)尺分別為300μπι和 149. 82ym ；圖IOB是核黃(Nuclear yellow,NY)逆行示蹤結(jié)果顯示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接 種可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生，以脊髓內(nèi)的逆行標(biāo)記的再生軸突纖維的熒光強(qiáng)度表示軸 突的再生情況(與SCI組相比，**，P <0. 01)；圖11是組織學(xué)觀察hNgR-Fc融合蛋白疫苗接種對(duì)損傷脊髓神經(jīng)元影響的結(jié)果 圖，結(jié)果顯示hNgR-Fc融合蛋白疫苗接種對(duì)損傷脊髓神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用，標(biāo)尺 100 μ m0具體實(shí)施方法實(shí)施例1 檸檬酸三鈉還原法制備納米金先將0. lg/Ι的HAuCl4水溶液50ml加熱至沸騰，隨即迅速在攪拌下加入10g/l檸 檬酸三鈉水溶液，根據(jù)加入檸檬酸三鈉水溶液量的不同可分別制備不同粒徑的納米金。為進(jìn)一步驗(yàn)證檸檬酸三鈉還原法制備納米金的可靠性，本發(fā)明設(shè)計(jì)用抗壞血 酸還原法制備納米金作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將在4°C預(yù)冷的HAuCl4水溶液lml、0. 2mol/l K2CO3L 5ml、雙蒸水25ml混勻。在攪拌下加入Iml 0. 7%抗壞血酸水溶液，立即呈現(xiàn)紫紅色。 加雙蒸水至100ml，加熱至溶液變?yōu)橥该骷t色為止，膠體金顆粒直徑為8 13nm。通過裸眼觀察、丁達(dá)爾現(xiàn)象、可見光光譜法和掃描電鏡鑒定制備的納米金顆粒的 粒徑大小及均勻度。結(jié)果表明制備的納米金顆粒的粒徑大小及均勻度均符合要求。實(shí)施例2 免疫動(dòng)物本發(fā)明選取8 10周齡正常成年SD大鼠60只，體重200 220g，雌雄不拘。采 用三種粒徑均勻度較好納米金，每種粒徑三種劑量，共9個(gè)組合，外加一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，共10個(gè)處理。處理1 3組合分別注射直徑為IOnm的納米金0. 2ml、0. 4ml和0. 6ml三種劑 量組，處理4 6組合分別為15nm的0. 2ml,0. 4ml和0. 6ml三種劑量組，處理7 9組合 分別為25nm的0. 2ml,0. 4ml和0. 6ml三種劑量組。處理10為正常對(duì)照組，不做任何處理。 每組6只，飼喂普通塊狀飼料，自由飲食進(jìn)水。免疫方式為后肢肌肉多點(diǎn)注射，每?jī)商熳⑸?1次，共注射4次，在第四次注射后7d進(jìn)行處理。實(shí)施例3 納米金的安全性評(píng)價(jià)考慮到納米金有可能會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腦脊髓正常組織的自身免疫反應(yīng)，誘發(fā) 大鼠變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimnetal allergic Enc印halomyelitis，EAE)，從而發(fā)生 一系列的毒副作用癥狀，本發(fā)明同時(shí)觀察了大鼠EAE的發(fā)生情況。結(jié)果表明，所有大鼠在免 疫后第二天均出現(xiàn)活動(dòng)、飲食減少，維持一天后逐步緩解，此后體重逐漸增加，無死亡大鼠。 首次免疫至免疫全過程均未出現(xiàn)EAE癥狀及表現(xiàn)。證實(shí)納米金未誘導(dǎo)出大鼠EAE，具有較好 的生物安全性。實(shí)施例4 =MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖1、取材(1)將SD大鼠用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，75%酒精消毒后，打開腹腔；注射 器快速抽取心臟血液3 4ml。其中Iml轉(zhuǎn)移到有抗凝劑肝素鈉的EP管中，保存在4°C冰 箱中；Iml轉(zhuǎn)移到不加抗凝劑的EP管中，常溫放置，凝集后2000rpm離心20min，吸取血清于 EP管中-20°C保存?zhèn)溆谩?2)快速取大鼠的脾臟，立即于PBS液中清洗。隨后快速取0. Ig于Iml EP管中并 于液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-70°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?3)另稱取脾臟0. lg，用Hank' s液繼續(xù)清洗后轉(zhuǎn)入5ml離心管中，加RPMI1640 培養(yǎng)液，4°C保存待取脾臟淋巴細(xì)胞時(shí)用。2、外周血淋巴細(xì)胞的MTT檢測(cè)(1)取抗凝血Iml與Hank' s液1 1混勻于5ml離心管中后，小心加入盛有2ml 細(xì)胞分離液的5ml離心管中，以2000rpm離心15min，收集上清；(2)放入含Hank' s液的5ml離心管中，充分混勻后，以1500 2000rpm離心 IOmin0吸去上清液，沉淀經(jīng)反復(fù)洗2次即得到所需細(xì)胞；(3)加Iml RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)懸浮細(xì)胞；(4)于96孔無菌培養(yǎng)板內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μ 1(設(shè)復(fù)孔)，每孔加MTT溶液15 μ 1。 輕輕振蕩后，37 °C溫育3h ；(5)每孔加入二甲基亞砜(DMSO)IOOy 1，輕輕振蕩。待甲膊顆粒完全溶解后，用酶 標(biāo)儀于590nm波長(zhǎng)測(cè)量OD值。3、脾臟淋巴細(xì)胞的MTT檢測(cè)(1)在超凈工作臺(tái)中將培養(yǎng)液中的脾臟取出后置于培養(yǎng)皿中，剔除脾臟周圍組織， 用剪刀反復(fù)剪切至糊狀，置于200目的細(xì)胞篩上用注射器芯輕研脾臟，培養(yǎng)液沖洗濾過細(xì) 胞篩于另一培養(yǎng)皿中，收集于離心管中；(2) 1500rpm離心lOmin，棄上清，加入少許滅菌的氯化銨溶液以溶解紅細(xì)胞，5min 后，同樣離心棄上清，細(xì)胞用無血清的1640液洗滌一遍；(3)用Iml RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清)懸浮細(xì)胞，于96孔無菌培養(yǎng)板內(nèi)加入細(xì)胞懸液200 μ 1 (設(shè)復(fù)孔)，每孔加MTT溶液12 μ 1，輕輕振蕩后，37°C溫育3h ； (4) 每管加入適量二甲基亞砜100 μ 1，輕輕振蕩，待甲膊顆粒完全溶解后，用酶標(biāo)儀于590nm波 長(zhǎng)測(cè)量OD值。結(jié)果表明，不同直徑和劑量的納米金對(duì)SD大鼠外周血和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖均 有不同程度的影響，其中15nm/0. 6ml劑量組和25nm/0. 4ml劑量組對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞 增殖有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而15nm/0. 6ml劑量組則對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最強(qiáng)。實(shí)施例5 IL-2水平的檢測(cè)膠體金免疫大鼠后，無菌條件下通過心臟取血分離血清，同時(shí)取脾臟，分離淋巴細(xì) 胞。采用IOml含5% FBS的PRMI 1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，離心lOmin。經(jīng)0. 17M的NH4Cl 裂解紅細(xì)胞，PRMI 1640培養(yǎng)液洗滌，以臺(tái)盼蘭液檢測(cè)細(xì)胞活性，確定活細(xì)胞超過90%。用 10% FBS的PRMI 1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至5X 106/ml，接種于48孔培養(yǎng)板中，置37°C 5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。室溫離心lOmin，收集上清。ELISA法檢測(cè)血清和細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-2的含量。實(shí)驗(yàn)方法按試劑盒說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前20min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室 溫；按試劑盒說明將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，設(shè)空白對(duì)照，同時(shí)將待測(cè)樣品按1 50稀釋； 除空白孔外，分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋樣品ΙΟΟμ 1/孔加入相應(yīng)孔中，封板膠封住反 應(yīng)孔，37°C孵育90min ；用洗滌液充分洗滌酶標(biāo)板4 6次，濾紙上印干；除空白孔外，每孔 加入生物素化一抗工作液ΙΟΟμ 1 ；充分混勻后封板膠封住反應(yīng)孔，37°C孵育60min ；按上述 方法洗板4 6次；除空白孔外，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μ 1，封板膠封住反應(yīng)孔，37°C 孵育30min ；洗板同前；加入顯色劑100μ 1/孔，避光37°C孵育10 15min ；加入終止液 100μ 1/孔，混勻后即刻(5min內(nèi))測(cè)量450nm處吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值及相應(yīng)的濃 度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)樣品的吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取IL-2對(duì)應(yīng)的濃度。結(jié)果表明，與正 常對(duì)照組相比，不同粒徑不同劑量的膠體金均可促進(jìn)外周血和脾臟淋巴細(xì)胞IL-2的分泌， 其中15nm/0. 6ml劑量組對(duì)大鼠外周血淋巴細(xì)胞IL-2的分泌促進(jìn)作用最強(qiáng)，而15nm/0. 6ml 劑量組和25nm/0. 6ml劑量組則對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞IL-2的分泌均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。實(shí)施例6 人NgR-Fc原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定為獲得大量天然表達(dá)的人NgR-Fc融合蛋白，本發(fā)明以真核表達(dá)載體 pcDNA-hNgR-Fc質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室保存)為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到hNgR-Fc片段。所用引物如 下Forward pr imer 5' GGAATTCCATATGAAGAGGGCGTCCGCTGG 3'Nde I酶切位點(diǎn)Reverse primer 5' CCGCTCGAGTTACCCCGGGGACAGGGAGAG 3‘Xho I酶切位點(diǎn)引物兩端分別引入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增的hNgR-Fc片段，經(jīng)Nde I 和Xho I雙酶切后回收純化并將其克隆于同樣雙酶切的pET30a+表達(dá)載體(Invitrogen) 中，獲得pET-hNgR-Fc重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行PCR、酶切和測(cè)序鑒定驗(yàn)證構(gòu)建載體的正確性。實(shí)施例7 人NgR-Fc可溶性融合蛋白的表達(dá)、純化及鑒定將經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL_21pLys感受態(tài)細(xì)胞中，用 LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，并在0D_達(dá)到0. 8左右時(shí)加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3h， 通過SDS-PAGE初步檢測(cè)目標(biāo)蛋白hNgR-Fc的表達(dá)情況。然后通過Protein A親和柱來富集并純化破菌上清中的目標(biāo)蛋白hNgR-Fc，并進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western-blot (用抗人 Fc的抗體作為一抗)鑒定。最終獲得了純度較高的人NgR-Fc融合蛋白。實(shí)施例8 hNgR-Fc融合蛋白的疫苗化將純化的hNgR-Fc融合蛋白與15nm膠體金混合形成hNgR-Fc融合蛋白疫苗?？?慮到膠體金的穩(wěn)定性，選用0. OlM檸檬酸鈉緩沖液(pH = 6. 0)溶解hNgR-Fc抗原，并在與 15nm膠體金混合等體積混合后加入穩(wěn)定劑聚乙二醇20000 (PEG20000)至終濃度500 μ g/ ml。選用0. OlM檸檬酸鈉緩沖液(pH = 6. 0)原因如下一、制備膠體金時(shí)采用檸檬酸三鈉 還原法，該緩沖液主要成分為檸檬酸三鈉，沒有引入新離子，對(duì)膠體金穩(wěn)定性干擾小；二、檸 檬酸三鈉作為一種臨床用抗凝劑，無毒性；三、膠體金的PH與該緩沖液pH相近。hNgR-Fc融合蛋白疫苗化過程及組分如下取50 μ g純化的hNgR-Fc融合蛋白溶 解于0. 6ml的0. OlM檸檬酸鈉緩沖液(pH = 6)后，與0. 6ml 15nm膠體金(含0. 05% PEG) 等體積混合，最后加入穩(wěn)定劑PEG20000至終濃度500 μ g/ml。實(shí)施例9 動(dòng)物免疫及抗體滴度檢測(cè)用純化的50 μ g hNgR-Fc融合蛋白作為抗原按上述方法制備蛋白疫苗，并采用后 肢肌肉多點(diǎn)注射法免疫SD大鼠(n = 6只)。首次免疫2周后，加強(qiáng)免疫一次，1周后再加 強(qiáng)免疫一次。同時(shí)設(shè)弗氏佐劑(Freund' s adjuvant,FA)和膠體金(Colloidal gold,CG) 對(duì)照。弗氏佐劑初次免疫時(shí)采用50 μ g hNgR-Fc與完全弗氏佐劑(CFA)，加強(qiáng)免疫時(shí)用不完 全弗氏佐劑(IFA)，免疫方法相同。加強(qiáng)免疫2次后，通過心臟取血分離血清并采用ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)。方法 如下預(yù)先包被酶標(biāo)板，用包被緩沖液(0. 05M碳酸鹽緩沖液，pH9. 6)將抗原NgR其稀釋 為lyg/ml，每孔100μ 1，空白對(duì)照不包被，4°C過夜。棄液體后用洗滌液(PBS_T，0.05% Tween-20)將包被好的酶標(biāo)板洗滌3次，每次2min。每孔加入100 μ 1 1 %的BSA封閉液， 37°C封閉lh。棄去封閉液，洗滌3次。加入不同稀釋度的抗血清，每孔100 μ 1，37°C孵育 lh。洗滌3次后加入1 10000稀釋的羊抗大鼠IgG-HRP(北京中杉)，每孔100μ 1，37°C 孵育lh，洗滌4次后，每孔加入100 μ 1 11^顯色液，371顯色201^11后，每孔加入5(^1終 止液(2Μ濃硫酸)終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值(0D值)。OD值大于 陰性孔3倍以上判斷為陽(yáng)性。以免疫前血清為陰性對(duì)照。結(jié)果表明，所有經(jīng)hNgR-Fc融合 蛋白免疫的大鼠均產(chǎn)生抗NgR抗體，效價(jià)均大于1 6400且納米金免疫佐劑明顯優(yōu)于弗氏 佐劑；膠體金對(duì)照組大鼠血清中NgR抗體檢測(cè)呈陰性。實(shí)施例10 抗血清對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的影響在解剖顯微鏡下，于無菌預(yù)冷的D-Hank' s液中逐個(gè)摘取新生SD大鼠背根神經(jīng) 節(jié)(Dorsal root ganglia，DRG)，轉(zhuǎn)入2ml 0. 25%胰蛋白酶消化液中，37°C培養(yǎng)箱中作用 20min ；IOOOrpm離心5min，吸去胰酶消化液，加入FBS終止消化；IOOOrpm離心5min，吸去 FBS，加入DMEM/F12培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)制成單細(xì)胞懸液，接種在未包被的35mm Corning 培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37°C培養(yǎng)箱中孵育50min ；收集未貼壁的細(xì)胞懸液，IOOOrpm離心5min，換入 Neurobasal (NB)培養(yǎng)基吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以IO6個(gè)/ml細(xì)胞密度接種在多聚賴氨酸包 被的24孔培養(yǎng)板中。預(yù)先用PBS將MAG蛋白濃度調(diào)至IOOng/ μ 1。待上述培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元貼壁后換 液，每孔400 μ 1 ΝΒ。隨機(jī)分為3組，每組重復(fù)2次。第一組加入1 μ 1 MAG與未經(jīng)hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫的對(duì)照血清(1 100)；第二組加入1 μ 1 MAG與hNgR-Fc融合蛋白疫苗 免疫血清(1 100)；第三組加入Iyl MAG與NgR抗體(1 1000)。上述各組細(xì)胞在培 養(yǎng)24h后用4%多聚甲醛固定，采用Image-ProPlus 5. 0軟件測(cè)量培養(yǎng)24h后的突起長(zhǎng)度， 進(jìn)行神經(jīng)元突起生長(zhǎng)分析(Neuriteoutgrowth assay)。為減少誤差，每次實(shí)驗(yàn)在200倍倒 置顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行測(cè)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次復(fù)孔檢測(cè)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析。結(jié)果表明，hNgR-Fc融合蛋白疫苗免疫血清可中和MAG對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的抑制作 用。實(shí)施例11 在體觀察疫苗接種對(duì)損傷脊髓的修復(fù)作用用制備的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，接種大鼠，接種方法同前。免疫2周后，制備大鼠 脊髓半橫切損傷模型，結(jié)合束路追蹤、組織學(xué)觀察和行為學(xué)檢測(cè)技術(shù)，于6周后盲法觀察損 傷脊髓頭側(cè)神經(jīng)纖維的再生情況、神經(jīng)元存活情況及脊髓損傷后的功能恢復(fù)情況。詳細(xì)操 作過程如下脊髓背柱損傷后，各組動(dòng)物在灌注前16 18h，在坐骨神經(jīng)注射核黃(Nuclear yellow, NY)，以脊髓內(nèi)的逆行標(biāo)記的再生軸突纖維的熒光強(qiáng)度表示軸突的再生情況。組 織學(xué)觀察則分別采用HE和尼氏染色法觀察損傷神經(jīng)元的存活情況。同時(shí)采用行為學(xué)方法 (BBB評(píng)分、網(wǎng)格步行、足跡試驗(yàn))檢測(cè)傷側(cè)后肢功能的恢復(fù)情況。結(jié)果表明，hNgR-Fc融合 蛋白疫苗既可促進(jìn)脊髓損傷后軸突的再生，又對(duì)神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用，還可促進(jìn)脊 髓損傷后功能的恢復(fù)。
權(quán)利要求
促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR Fc融合蛋白疫苗，其特征在于，是由下述方法制成的組合物將純化的hNgR Fc融合蛋白溶解于緩沖液中，所得溶液與等體積的膠體金混合得混合液，在混合液中加入穩(wěn)定劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于hNgR-Fc融合蛋白在組合物中的濃度為30 60 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述緩沖液的pH值為4 9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗， 其特征在于所述緩沖液為檸檬酸鈉緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述緩沖液為濃度為0. 005 0. 015M的檸檬酸鈉緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述膠體金的粒徑為10 50nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述穩(wěn)定劑為聚乙二醇20000。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，其特 征在于所述穩(wěn)定劑為聚乙二醇20000，其在組合物中的濃度為200 500 μ g/ml。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及到一種能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的hNgR-Fc融合蛋白疫苗，是將純化的hNgR-Fc融合蛋白溶解于緩沖液中，所得溶液與等體積的膠體金混合得混合液，在混合液中加入穩(wěn)定劑所得到的組合物。該疫苗具有較好的免疫效果，能促進(jìn)中樞神經(jīng)再生與功能恢復(fù)，且毒副作用小。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101897960SQ20101014665
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日
發(fā)明者伍亞民, 周新富, 曾琳, 朱楓, 李紅運(yùn), 王永堂, 魯秀敏, 龍?jiān)谠?申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所