專(zhuān)利名稱：一種調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微小核糖核酸含量的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微小核糖核酸含量的方法及其用途，具體涉及一種將包含含量經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)的微小核糖核酸的細(xì)胞微粒子導(dǎo)入目標(biāo)生物體內(nèi)，靶向性、高效率地調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微小核糖核酸的含量，從而影響目標(biāo)生物體的生理、病理狀況的方法，以及該方法在治療和/或預(yù)防疾病中的用途。
背景技術(shù)：
細(xì)胞微粒子(microvesicles)是一類(lèi)大小介于10-500nm之間，具有脂質(zhì)雙層膜的生物囊泡結(jié)構(gòu)，其早在1967年就有報(bào)道，當(dāng)時(shí)被稱為“plateletdust”。細(xì)胞微粒子來(lái)源于血小板，其包含囊泡，具有促進(jìn)凝結(jié)的作用。后來(lái)的體外研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞等都能釋放微粒子。根據(jù)微粒子產(chǎn)生的途徑，又可以將微粒子區(qū)分為exosomes和shedding vesicles兩大類(lèi)。Exosomes是細(xì)胞在被刺激的情況下,通過(guò)多囊泡小體(Multivesicular bodies, MVBs)胞吐到細(xì)胞外的，而shedding vesicles則是直接從細(xì)胞表面以出芽的方式分泌出來(lái)的。目前，不同細(xì)胞分泌的shedding vesicles被命名為不同的名稱，比如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的被稱為ectosomes，而血小板分泌的則被稱為mi cropart i c 1 es。已知的產(chǎn)生細(xì)胞微粒子的途徑有兩個(gè)細(xì)胞激活和細(xì)胞凋亡，但是至今尚不清楚這兩條途徑產(chǎn)生的細(xì)胞微粒子在大小、組成和生理功能上是否相似。細(xì)胞微粒子的膜成分取決于其來(lái)源細(xì)胞，主要是由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，但細(xì)胞微粒子的內(nèi)部成分尚不清楚。有人預(yù)測(cè)細(xì)胞釋放微粒子在細(xì)胞間通信、受體傳遞、引發(fā)信號(hào)或細(xì)胞接觸方面起作用，也可能在器官防御系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和組織再生中起作用。然而，細(xì)胞微粒子的明確生理功能至今尚未全部研究清楚。微小核糖核酸(microRNAs，簡(jiǎn)稱miRNA)是近年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，它是一類(lèi)長(zhǎng)約 19-23個(gè)核苷酸的單鏈小核糖核酸分子，位于基因組非編碼區(qū)，進(jìn)化上高度保守，可以通過(guò)抑制靶基因的翻譯過(guò)程對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且與動(dòng)物的許多正常生理活動(dòng)，如生物個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞凋亡以及能量代謝等密切相關(guān)，同時(shí)也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。自參與調(diào)控線蟲(chóng)時(shí)序發(fā)育的lin-4與let-7被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，miRNA已逐漸成為有關(guān)調(diào)控miRNA穩(wěn)定性和蛋白翻譯的研究熱點(diǎn)，并且分別在2002年和2003年兩度入選 Science雜志年度十大科技突破?，F(xiàn)在預(yù)測(cè)miRNA至少能調(diào)控5300個(gè)人類(lèi)基因，也就是所有基因的30%。隨著研究的深入，越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，其中miRNA與腫瘤的關(guān)系越來(lái)越成為研究的重點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干miRNA通過(guò)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)從而與慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌高度相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞性白血病以及Burkitt 淋巴瘤中的幾種微小核糖核酸的表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)；分析比較人肺癌、乳腺癌組織中的微小核糖核酸表達(dá)時(shí)，也發(fā)現(xiàn)有若干組織特異性微小核糖核酸的表達(dá)水平相對(duì)于正常組織發(fā)生了變化。也有研究證明微小核糖核酸影響了心肌肥厚、心衰、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，并且與II型糖尿病等代謝性疾病有密切關(guān)聯(lián)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示微小核糖核酸表達(dá)及特異性變化與疾病的發(fā)生和發(fā)展之間存在著必然聯(lián)系。 由于微小核糖核酸在基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控中起著超乎想象的重要作用，因此它與疾病存在以下的關(guān)聯(lián)性首先，微小核糖核酸的變化可能是疾病的結(jié)果，這是因?yàn)楫?dāng)疾病 (如癌癥)發(fā)生時(shí)，會(huì)導(dǎo)致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇烈擴(kuò)增。若微小核糖核酸正好位于這一變化區(qū)段內(nèi)，那么其表達(dá)量將發(fā)生極其顯著的變化。其次，微小核糖核酸的變化也可能是病因，這是因?yàn)榧膊〉囊种埔蜃右约按龠M(jìn)因子都可能是微小核糖核酸的靶位點(diǎn)。當(dāng)微小核糖核酸本身發(fā)生表達(dá)紊亂時(shí)，比如本來(lái)抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達(dá)量升高了，其最終結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致下游一系列基因表達(dá)的變化以及某些通路的整體紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病發(fā)生。反之，如果抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量增加或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達(dá)量減少也會(huì)導(dǎo)致下游一系列促進(jìn)疾病進(jìn)程的基因表達(dá)的下調(diào)，進(jìn)而抑制疾病發(fā)生或發(fā)展。因此，理論上微小核糖核酸分子不僅可以作為一類(lèi)新的疾病標(biāo)志物，它的特異性變化必然與疾病產(chǎn)生、發(fā)展相關(guān)聯(lián)。同時(shí)微小核糖核酸還可以作為潛在的藥物，通過(guò)減少疾病過(guò)程中表達(dá)上調(diào)的微小核糖核酸或補(bǔ)充表達(dá)下調(diào)的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠調(diào)節(jié)患者體內(nèi)微小核糖核酸的含量以上調(diào)疾病抑制因子或下調(diào)疾病促進(jìn)因子的藥物，對(duì)于多種疾病的預(yù)防和/或治療具有重要的意義。近年來(lái)，微小核糖核酸藥物已經(jīng)成為藥物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。目前研究成果已經(jīng)證明可以通過(guò)調(diào)節(jié)生物體內(nèi)特定的微小核糖核酸的含量來(lái)阻斷或延緩疾病的進(jìn)程。例如， miR-206在骨骼肌中的高表達(dá)可改善運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損傷或喪失，其作用主要是通過(guò)促進(jìn)與激活肌肉與肌肉之間神經(jīng)元聯(lián)系的再生來(lái)實(shí)現(xiàn)的，由此可以治療肌萎縮性側(cè)索硬化(或稱 ALS)；通過(guò)下調(diào)肝臟中的miR-122表達(dá)，能夠?qū)Ρ透窝灼鸬街委熥饔?；miR-15和miR-16 的丟失導(dǎo)致的Bcl-2過(guò)表達(dá)，這是人類(lèi)發(fā)生慢性淋巴性白血病(CLL)的重要機(jī)理，在生物體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-15和miR-16可以起到治療CLL的作用。盡管微小核糖核酸藥物的研究開(kāi)發(fā)已經(jīng)取得了不少成果，但要將其作為藥物真正用于醫(yī)療還面臨著很多問(wèn)題。最關(guān)鍵的問(wèn)題就是要提高藥物傳送的效率和靶向性。目前，運(yùn)送微小核糖核酸藥物的載體主要有脂質(zhì)體、毫微型膠囊(Nanocapsules或 Nanoparticles)、β -環(huán)糊精包含物(β -cyclodextrin inclusion compou jnd 或稱 β-環(huán)糊精膠囊)等，雖然這些載體可以延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的存留時(shí)間并一定程度上提高藥物的吸收率，但是其傳送藥物的靶向性和高效性仍然不足。病毒載體也能提高藥物在體內(nèi)的輸送效率，但其對(duì)生物體潛在的危險(xiǎn)性也限制了其在微小核糖核酸藥物遞送中的應(yīng)用。如何對(duì)人或動(dòng)物進(jìn)行有效給藥，既能確保藥物在靶器官/組織有效釋放，還要具有高度安全性等問(wèn)題都尚需進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
綜上所述，微小核糖核酸作為潛在的藥物手段，目前還存在一些尚未解決的問(wèn)題。 除微小核糖核酸的靶基因還不清楚外，微小核糖核酸的遞送特異性差、效率低以及安全性問(wèn)題是妨礙其應(yīng)用的主要原因。本發(fā)明人在以微小核糖核酸作為疾病標(biāo)志物的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)人體血清/血漿以及細(xì)胞培養(yǎng)液中存在穩(wěn)定的微小核糖核酸，而且鑒于這些微小核糖核酸與人體的病理、生理狀況，包括惡性腫瘤的發(fā)生、免疫缺陷以及炎癥等的形成等有密切關(guān)系，基于對(duì)血清/ 血漿中微小核糖核酸的系統(tǒng)研究，首次提出了以血清/血漿中微小核糖核酸作為全新的疾病檢測(cè)標(biāo)志物。進(jìn)一步研究血清/血漿以及細(xì)胞培養(yǎng)液中微小核糖核酸的來(lái)源，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大部分的血清/血漿以及細(xì)胞培養(yǎng)液中的微小核糖核酸來(lái)自于細(xì)胞微粒子。這些細(xì)胞微粒子大小不一，分布在10-500納米范圍內(nèi)。更值得注意的發(fā)現(xiàn)是，血清中的細(xì)胞微粒子并不僅僅來(lái)自血細(xì)胞，其來(lái)源還包括人體其它組織的細(xì)胞，如血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺、肝等組織細(xì)胞。在病理狀況下，腫瘤細(xì)胞和外侵病源體可以分泌或誘導(dǎo)細(xì)胞分泌微粒子，這些微粒子包載特異微小核糖核酸，并專(zhuān)一結(jié)合免疫細(xì)胞，將微小核糖核酸傳遞給免疫細(xì)胞從而沉默免疫細(xì)胞功能，從而使腫瘤及病源體免受攻擊。本申請(qǐng)通過(guò)研究證實(shí)，不同細(xì)胞釋放的微粒子的膜成分(包括特異性表面受體及膜脂結(jié)構(gòu))與對(duì)應(yīng)細(xì)胞的質(zhì)膜成分相同，而且所包載的微小核糖核酸種類(lèi)也與對(duì)應(yīng)細(xì)胞的微小核糖核酸相關(guān)。因此，細(xì)胞微粒子具有源頭細(xì)胞表面特有的受體蛋白或膜脂結(jié)構(gòu)，與對(duì)應(yīng)的靶細(xì)胞有高親和性，因而可以選擇性地遞送微小核糖核酸到靶細(xì)胞/組織，從而大大提高微小核糖核酸調(diào)控細(xì)胞功能的作用。由于細(xì)胞微粒子(包括所有具有微粒子特征的膜脂囊泡結(jié)構(gòu)，如exosome和shedding vesicles 以及針對(duì)各種細(xì)胞分泌的shedding vesicles的特稱)本身具有與特定組織及細(xì)胞結(jié)合的特異性，其所包載微小核糖核酸也呈現(xiàn)較強(qiáng)的靶向性、穩(wěn)定性及高效率，它在疾病機(jī)制的研究及治療方面有重大應(yīng)用前景。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠特異性、高效性將微小核糖核酸遞送進(jìn)入生物體從而改變生物體內(nèi)微小核糖核酸含量方法。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微小核糖核酸含量的方法，該方法包括以下步驟(1)調(diào)節(jié)供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的含量；(2)分離供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子；(3)將分離的細(xì)胞微粒子引入生物體內(nèi)。在上述方法中，供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子的來(lái)源可以選自體液，優(yōu)選為血液；細(xì)胞培養(yǎng)物；和組織中的一種或多種。在上述方法中，調(diào)節(jié)供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的含量步驟 為增加或減少供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的表達(dá)量。其中，增加供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的表達(dá)量的方法可以為施加外源性刺激和/或?qū)胛⑿『颂呛怂崆绑w。優(yōu)選地，施加外源性刺激包括以下步驟在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中加入一種或多種能夠影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、代謝情況、生活周期和功能的外源性刺激物，例如激素、細(xì)胞因子、脂多糖、自由脂肪酸、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和過(guò)氧化氫，然后孵育。優(yōu)選地，導(dǎo)入微小核糖核酸前體包括以下步驟采用脂質(zhì)體載體(invitrogen公司Lipofectamine 2000)將相應(yīng)的微小核糖核酸前體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，然后孵育。其中，減少供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的表達(dá)量的方法為施加外源性刺激和/或?qū)胛⑿『颂呛怂岬姆戳xRNA。優(yōu)選地，施加外源性刺激包括以下步驟在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中加入一種或多種能夠影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、代謝情況、生活周期和功能的外源性刺激物，例如激素、細(xì)胞因子、脂多糖、自由脂肪酸、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和過(guò)氧化氫，然后孵育。優(yōu)選地，導(dǎo)入微小核糖核酸的反義RNA包括以下步驟采用脂質(zhì)體載體(invitrogen公司Lipofectamine 2000)將相應(yīng)的微小核糖核酸的反義RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，然后孵育。在上述方法中，分離供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子的方法可以選自差速離心法、免疫吸附法和超濾法中的一種或多種。具體地，差速離心法可以包括以下步驟(1)將細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，或者體液以300g的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，取上清；(2)將上清以1500g的轉(zhuǎn) 速離心20分鐘，取上清；(3)將上清以IOOOOg的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，取上清；(4)將上清以IlOOOOg的轉(zhuǎn)速離心70分鐘，沉淀即供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子。具體地，免疫吸附法可以包括以下步驟(1)將細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，或者體液以3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，取上清；(2)將上清置于吸附細(xì)胞特異性抗體或免疫磁珠的組織培養(yǎng)皿上溫育30 60分鐘，回收被吸附的細(xì)胞微粒子。具體地，超濾法可以包括以下步驟(1)將細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，或者體液以3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，取上清；(2)將上清置于帶有100KD濾膜的濃縮離心管中，以4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心、濃
縮即得。在上述方法中，生物體可以選自人；動(dòng)物，例如軟骨魚(yú)、硬骨魚(yú)、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)；微生物，例如細(xì)菌、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體、放線菌和病毒中的一種或多種。具體地，病毒可以選自DNA病毒和RNA病毒，例如乙肝病毒、天花病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、SARS病毒和流感病毒中的一種或多種。本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療疾病的方法，該方法包括采用上述的調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微小核糖核酸含量的方法來(lái)調(diào)節(jié)人或動(dòng)物體內(nèi)與疾病相關(guān)的微小核糖核酸的含量。 其中，微小核糖核酸的含量增加或減少與疾病發(fā)生和/或發(fā)展相關(guān)。上述疾病可以選自腫瘤；急、慢性傳染病，例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病和 SARS等病毒性疾病，例如肺結(jié)核、細(xì)菌性肺炎等細(xì)菌性疾病，以及其它病原微生物導(dǎo)致的急、慢性傳染?。缓粑到y(tǒng)疾?。幻庖呦到y(tǒng)疾?。谎号c造血系統(tǒng)疾?。谎h(huán)系統(tǒng)疾病，例如心腦血管疾??；內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。幌到y(tǒng)疾??；神經(jīng)系統(tǒng)疾??；泌尿系統(tǒng)疾病；生殖系統(tǒng)疾病以及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病中的一種或多種。具體地，上述疾病選自動(dòng)脈粥樣硬化，血管損傷導(dǎo)致的肥胖、高血糖和慢性炎癥中的一種或多種。上述與疾病相關(guān)的微小核糖核酸選自let_7b、let_7c、let-7d、let_7e、let-7f、 let-7g> let-7i> miR-1、miR-100、miR-10U miR-103、miR-105、miR-106a> miR-106b> miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122a、miR-124a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126*、 miR-127> miR-128a> miR-128b> miR-129> miR-130a> miR—130b、miR-132> miR-133a> miR-133b、miR-134、miR_135a、miR_135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、 miR-141、miR-142-3p、miR-142_5p、miR-143、miR-144、miR-145、miR_146a、miR_146b、 miR-147、miR_148a、miR_148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、 miR-154*> miR-155> miR-15a> miR-15b> miR—16、miR-17-3p> miR-17-5p> miR-181a> miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、 miR-187、miR-188、miR-189、miR_18a、miR-18a*. miR_18b、miR-190、miR-191、miR_19r、miR-192, miR-193a, miR-193b, miR-194, miR-195, miR-196a, miR-196b, miR-197, miR-198> miR-199a> miR-199a*> miR-199b> miR-19a> miR_19b、miR-200a> miR-200a*> miR-200b> miR-200c> miR-202> miR-202*> miR-203> miR-204> miR-205> miR-206> miR-208> miR-20a、miR_20b、miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、 miR-216、miR-217、miR-218、miR-219、miR-22、miR-220、miR-221、miR-222、miR-223、 miR-224> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-26a> miR-26b> miR-27a> miR-27b> miR-28> miR-296> miR-299-3p> miR-299-5p> miR-29a> miR-29b> miR-29c> miR—301、 miR-302a、miR_302a*、miR_302b、miR_302b*、miR_302c、miR_302c*、miR_302d、miR-30a_3p、 miR-30a_5p、miR_30b、miR_30c、miR_30d、miR-30e_3p、miR-30e_5p、miR-31、miR-32、 miR-320、miR-323、miR-324-3p、miR-324-5p、miR-325、miR-326、miR-328、miR-329、miR-33、 miR-330、miR-331> miR-335> miR-337> miR-338> miR-339> miR-33b> miR-340、miR-342> miR-345> miR-346> miR-34a> miR-34b> miR-34c> miR-36U miR-362> miR-363> miR-363*> miR-365> miR-367> miR-368> miR-369-3p> miR-369-5p> miR-370> miR-371> miR-372> miR-373,miR-373*,miR-374,miR-375,miR-376a,miR-376a*,miR-376b,miR-377,miR-378, miR-379> miR-380-3p> miR-380-5p> miR-38U miR-382> miR-383> miR-384> miR-409-3p> miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、 miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、 miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、 miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485_3p、 miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、miR-489、miR-490、miR-491、miR-492、 miR-493> miR-493-3p> miR-494> miR-495> miR-496> miR-497> miR-498> miR-499> miR—500、 miR-50U miR-502> miR-503> miR-504> miR-505> miR-506> miR-507> miR-508> miR-509> miR-510>miR-51UmiR-512-3p>miR-512-5p>miR-513>miR-514>miR-515-3p>miR-515-5p> miR-516-3p> miR-516_5p、miR-517*、miR_517a、miR_517b、miR_517c、miR-518a> miR-518a-2*. miR_518b、miR_518c、miR-518c\ miR_518d、miR_518e、miR_518f、miR-518f*. miR-519a> miR-519b> miR-519c> miR-519d> miR-519e> miR-519e*> miR-520a> miR-520a*> miR-520b> miR-520c> miR-520d> miR-520d*> miR-520e> miR-520f> miR-520g> miR-520h> miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*. miR-525、miR-525*. miR_526a、miR_526b、 miR-526b*> miR-526c> miR-527> miR-532> miR-542-3p> miR-542-5p> miR-544> miR-545> miR-548a>miR-548b>miR-548c>miR-548d>miR-549>miR-550>miR-551a>miR-552>miR-553> miR-554> miR-555> miR-556> miR-557> miR-558> miR-559> miR-560> miR-561> miR-562> miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、 miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、 miR-58U miR-582> miR-583> miR-584> miR-585> miR-586> miR-587> miR-588> miR-589> miR-590> miR-59U miR-592> miR-593> miR-594> miR-595> miR-596> miR-597> miR-598> miR-599> miR-600、miR-60U miR-602> miR-603> miR-604> miR-605> miR-606> miR-607> miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、 miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、 miR-626> miR-627> miR-628> miR-629> miR-630> miR-63U miR-632> miR-633> miR-634> miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、miR-644> miR-645> miR-646> miR-647> miR-648> miR-649> miR-650> miR-65U miR-652> miR-653> miR-654> miR-655> miR-656> miR-657> miR-658> miR-659> miR-660> miR-66U miR-662、miR-663、miR-7、miR-9、miR-9*、miR-92、miR-93、miR-95、miR-96、miR-98、miR-99a 和 miR-99b 中的一種或多種。例如，miR-16、miR_26a、miR_29a、miR_30c、miR_125b、 miR-138、miR-142_3p、miR-150、miR_181a、miR_181b、miR-136、miR_146a、miR-222 和 miR-451 中的一種或多種。具體的例子選自 miR_125b、miR-16、miR-142_3p、miR-451 和 miR-150中的一種或多種。更具體的例子為miR-451和miR-150，或者miR-150。 上述預(yù)防和/或治療疾病的方法通過(guò)首先調(diào)節(jié)供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中能夠影響疾病的發(fā)生、發(fā)展的miRNA的含量，再分離制備經(jīng)過(guò)這樣處理的細(xì)胞微粒子并將其導(dǎo)入受體細(xì)胞或注入病人體內(nèi)，細(xì)胞微粒子攜帶miRNA進(jìn)入受體細(xì)胞或病人組織，通過(guò)與其靶基因的相互作用，引起靶基因蛋白質(zhì)含量的改變，從而影響細(xì)胞功能，起到預(yù)防和/或治療疾病的作用。為了體外檢測(cè)攜帶miRNA的細(xì)胞微粒子對(duì)于細(xì)胞與細(xì)胞、或者組織與組織之間的生理作用及其作用方式的影響，本發(fā)明采用了以下檢測(cè)手段共聚焦熒光顯微鏡法、 Real-time PCR方法、細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法、WesternBloting方法以及細(xì)胞遷移方法。其中，共聚焦熒光顯微鏡方法包括以下步驟diI-C16#記細(xì)胞；PBS洗滌細(xì)胞；采用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37°C過(guò)夜；離心去掉細(xì)胞上清獲得細(xì)胞微粒子；獲得的細(xì)胞微粒子重懸在另一種細(xì)胞中并設(shè)置不同的時(shí)間梯度進(jìn)行孵育；洗滌細(xì)胞、固定、共聚焦顯微鏡觀察。細(xì)胞遷移方法包括以下步驟將Transwell Boyden Chamber(6. 5mm, Costar, Cambridge, MA, USA)的上面小室底部的聚碳酸酯膜(8 μ m孔徑)用0. 的明膠覆蓋；細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基懸起，濃度控制在(1-10) X IO5細(xì)胞/mL ；細(xì)胞用或者不用來(lái)源于另一種細(xì)胞的細(xì)胞微粒子孵育2小時(shí)，然后將細(xì)胞加入上面的小室，同時(shí)向下面的小室加入 0. 5mL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基；在5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4小時(shí)；遷移到下層的細(xì)胞用90%乙醇在室溫下固定15分鐘；洗滌；用0. 的結(jié)晶紫室溫染色15分鐘；將留在濾膜上的細(xì)胞小心地刮下；拍照(Olympus，BX51，Japan)；細(xì)胞計(jì)數(shù)。為了體內(nèi)檢測(cè)攜帶miRNA的細(xì)胞微粒子對(duì)于細(xì)胞與細(xì)胞，或者組織與組織之間的生理作用及其作用方式的影響，本發(fā)明采用了以下手段向小鼠尾靜脈注射細(xì)胞微粒子并檢測(cè)其中包裹的miRNA在小鼠血管壁上的含量，以及在顯微鏡下檢查通過(guò)小鼠尾靜脈注射的熒光標(biāo)記的細(xì)胞微粒子影響小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的情況。其中，向小鼠尾靜脈注射細(xì)胞微粒子并檢測(cè)其中包裹的miRNA在小鼠血管壁上的含量的方法包括以下步驟(1)分離一種細(xì)胞的細(xì)胞微粒子；(2)注射到小鼠尾靜脈；(3)取小鼠血管，提取RNA ；(4) Real-time PCR方法檢測(cè)正常小鼠的血管組織與注射其他細(xì)胞細(xì)胞微粒子的小鼠血管組織中miRNA的變化。其中，在顯微鏡下檢查通過(guò)小鼠尾靜脈注射的熒光標(biāo)記的細(xì)胞微粒子影響小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的情況的方法包括以下步驟
(1)用熒光標(biāo)記細(xì)胞微粒子； (2)將細(xì)胞微粒子通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)；(3)分離小鼠血管內(nèi)皮層；(4)熒光顯微鏡下觀察。目前，激素和細(xì)胞因子作為經(jīng)典的信號(hào)分子與靶細(xì)胞上的受體分子結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通信，但它們只作用于一些特定的細(xì)胞，因?yàn)閮H有一些特定的細(xì)胞能夠分泌激素和細(xì)胞因子，而目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)適用于所有細(xì)胞的細(xì)胞間通信方式，也還沒(méi)有細(xì)胞將細(xì)胞微粒子主動(dòng)地、選擇性地分泌的miRNA作為一種新的、能用于所有細(xì)胞的信號(hào)分子家族的任何報(bào)道?；诩?xì)胞微粒子載有微小核糖核酸這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人將研究目光鎖定在(或類(lèi)似微粒子的膜脂囊泡結(jié)構(gòu))攜載微小核糖核酸的細(xì)胞微粒子的靶向性、穩(wěn)定性及高效率以及它在生物學(xué)信號(hào)機(jī)制的研究、新的疾病機(jī)制的發(fā)現(xiàn)和新的疾病治療方法的發(fā)展等方面的重大應(yīng)用前景。由于微小核糖核酸分子是一類(lèi)新型疾病標(biāo)志物，因此希望通過(guò)對(duì)血清/血漿以及組織/細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸是否存在，能否被檢測(cè)，及其與靶細(xì)胞和疾病的相關(guān)性的研究，建立一種利用血清/血漿以及細(xì)胞培養(yǎng)液中穩(wěn)定存在的細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸來(lái)進(jìn)行新的細(xì)胞間信號(hào)通路、疾病機(jī)制、疾病治療方法等方面研究的新技術(shù)。因此，本發(fā)明的目的是提供調(diào)節(jié)細(xì)胞微粒子內(nèi)微小核糖核酸的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)展了以細(xì)胞微粒子作為載體運(yùn)送微小核糖核酸(miRNA)進(jìn)入靶細(xì)胞的研究。由于細(xì)胞微粒子是細(xì)胞自身分泌的物質(zhì)，具有生物親和性，不會(huì)對(duì)生物體本身造成傷害；同時(shí)，由于細(xì)胞微粒子表面攜帶了來(lái)源細(xì)胞表面特異的表面分子，能夠通過(guò)與靶細(xì)胞表面的受體/配體結(jié)合而高效、特異地將其攜帶的微小核糖核酸藥物遞送到靶細(xì)胞/ 組織。進(jìn)入靶細(xì)胞/組織的微小核糖核酸可以發(fā)揮其功能，通過(guò)與靶基因信使核糖核酸特定序列的結(jié)合，阻斷靶基因蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，從而起到特異性阻斷基因表達(dá)的作用。通過(guò)上述一系列的研究，本發(fā)明提供了一種具有較高靶向性、穩(wěn)定性及高效率并在疾病機(jī)制的研究和治療方面有重大應(yīng)用前景的微小核糖核酸細(xì)胞微粒子(或類(lèi)似微粒子的膜脂囊泡結(jié)構(gòu))所載微小核糖核酸。并證明，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸的含量，可以對(duì)疾病的預(yù)防和治療起到一定的作用。本發(fā)明需要解決的問(wèn)題包括(1)研究各種臨床疾病(包括各種腫瘤；各種急慢性傳染病，以及其它各種病原微生物導(dǎo)致的急慢性傳染??；其它急慢性疾病，如呼吸系統(tǒng)疾病，免疫系統(tǒng)疾病，血液與造血系統(tǒng)疾病，例如心腦血管疾病的循環(huán)系統(tǒng)疾病，內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)疾病，消化系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，泌尿系統(tǒng)疾病，生殖系統(tǒng)疾病和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病) 與細(xì)胞微粒子所載的微小核糖核酸的相關(guān)性；(2)調(diào)節(jié)細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸的含量，在體外制備載有特異微小核糖核酸的細(xì)胞微粒子，然后將其導(dǎo)入體內(nèi)，利用細(xì)胞微粒子的穩(wěn)定性及靶向能力將特定的微小核糖核酸傳遞到特定細(xì)胞/組織，從而達(dá)到組織功能改善或疾病治療的效果。細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸用于疾病治療的具有以下幾方面的有益效果(1)細(xì)胞微粒子有宿主細(xì)胞的特征，細(xì)胞微粒子種類(lèi)及其所包含微小核糖核酸的變化可以直接確認(rèn)病源細(xì)胞。(2)細(xì)胞微粒子作為一種全新的、穩(wěn)定、高特異的微小核糖核酸傳遞工具，可有效地將特定微小核糖核酸導(dǎo)入靶細(xì) 胞/組織，從而改善細(xì)胞狀況和治療疾病?？傊?，使用細(xì)胞微粒子及其所包含的微小核糖核酸不僅為人們?cè)诜肿铀缴先媪私饧?xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路和組織病變的機(jī)理提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，也將加速臨床疾病診斷學(xué)和治療學(xué)的進(jìn)步。當(dāng)然，早期研究疾病機(jī)制、檢測(cè)和治療疾病的絕大多數(shù)分子技術(shù)還正處于初步的實(shí)驗(yàn)階段，其有效性有待進(jìn)一步的驗(yàn)證和提高。但是，基于細(xì)胞微粒子及其所包含微小核糖核酸的優(yōu)越性，相信不久的將來(lái)，利用細(xì)胞微粒子及其所包含微小核糖核酸對(duì)重癥疾病如癌癥的發(fā)病機(jī)制及其特異性治療將會(huì)成為現(xiàn)實(shí)。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例，其中圖IA顯示腫瘤特異性miRNAs在非小細(xì)胞肺癌病人和正常人的血清和血細(xì)胞中表達(dá)水平的比較；圖IB顯示腫瘤特異性miRNAs在結(jié)直腸癌病人和正常人的血清和組織間表達(dá)水平的比較；圖2顯示正常人血清/血漿細(xì)胞微粒子的透射電鏡圖；圖3顯示正常人血清細(xì)胞微粒子中miRNAs的凝膠電泳結(jié)果圖；圖4顯示在動(dòng)脈粥樣硬化病人與正常人情況下微粒子所載miRNAs表達(dá)水平的比較；圖5A顯示正常人全血經(jīng)LPS處理與未經(jīng)處理的細(xì)胞微粒子中miRNAs表達(dá)水平的比較；圖5B顯示THP-I細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后與未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞微粒子中miRNA表達(dá)水平的比較；圖5C顯示THP-I細(xì)胞經(jīng)AGE處理后與未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞微粒子中miRNA表達(dá)水平的比較；圖5D顯示THP-I細(xì)胞經(jīng)FFAs處理后與未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞微粒子中miRNA表達(dá)水平的比較；圖6A顯示通過(guò)導(dǎo)入微小核糖核酸前體升高細(xì)胞微粒子中微小核糖核酸含量結(jié)果；圖6B顯示通過(guò)導(dǎo)入微小核糖核酸反義RNA降低細(xì)胞微粒子中微小核糖核酸的含
量結(jié)果；圖7A顯示THP-I細(xì)胞微粒子與HMEC-I細(xì)胞之間的特異性相互作用；圖7B顯示miRNA在HMEC-I細(xì)胞、THP-I細(xì)胞和293T細(xì)胞中的表達(dá)水平；圖7C顯示miRNA在HMEC-I細(xì)胞、分別經(jīng)AGEs處理的THP-I和293T細(xì)胞微粒子溫育的HMEC-I細(xì)胞中的表達(dá)水平；圖7D顯示轉(zhuǎn)入THP-I細(xì)胞微粒子的HMEC-1細(xì)胞中c_Myb蛋白的western blot 結(jié)果圖；圖7E和圖7F分別顯示未經(jīng)THP-I細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I細(xì)胞和經(jīng)THP-I細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I細(xì)胞的遷移照片；圖7G顯示未經(jīng)THP-I細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I細(xì)胞和經(jīng)THP-I細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I細(xì)胞的遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果圖；圖7H顯示尾靜脈注射熒光標(biāo)記的THP-I細(xì)胞微粒子進(jìn)入小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞；圖71顯示靜脈注射THP-I或293T細(xì)胞微粒子對(duì)C57BL/6小鼠血管miRNAs表達(dá)水平的影響；圖8A-圖8C分別顯示未經(jīng)細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I細(xì)胞、經(jīng)正常人或動(dòng)脈硬化癥病人血清/血漿細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I細(xì)胞的遷移照片；圖8D顯示未經(jīng)細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I細(xì)胞、經(jīng)正常人或動(dòng)脈硬化癥病人血清 /血漿細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I細(xì)胞的的遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果圖；圖8E顯示調(diào)節(jié)THP-I細(xì)胞微粒子中miRNA含量能影響靶細(xì)胞HEMC-I蛋白表達(dá)；圖8F顯示調(diào)節(jié)THP-I細(xì)胞微粒子中miRNA含量能影響靶HMEC-I細(xì)胞遷移功能。
具體實(shí)施例方式可以理解的是，在此描述的特定實(shí)施方式通過(guò)舉例的方式來(lái)表示，其并不作為對(duì)本發(fā)明的限制。在不偏離于本發(fā)明范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到或能夠確認(rèn)，僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，許多等同物都能應(yīng)用于本文所描述的特定步驟中。這些等同物被認(rèn)為處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且被權(quán)利要求所覆蓋。實(shí)施例1血清和血細(xì)胞/組織的Solexa測(cè)序本實(shí)施例使用Solexa測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)血清與血細(xì)胞/組織中的miRNA呈負(fù)相關(guān)。血清和血細(xì)胞的Solexa測(cè)序包括以下步驟(1)收集正常人和非小細(xì)胞肺癌病人的血樣；(2)離心分離出血清和血細(xì)胞；(3)分別提取總RNA。提取用于Solexa測(cè)序的細(xì)胞RNA采用Trizol試劑 (Invitrogen公司)；用于Solexa測(cè)序的血清RNA提取方法包括以下具體步驟取100 μ 1 樣品加入酸性酚，劇烈震蕩混勻后加入氯仿，再次充分震蕩混勻，12000g室溫離心10分鐘。 小心吸取上清液加入到1000 μ 1乙醇中，再加入醋酸鈉40 μ 1，充分混勻后室溫靜置10分鐘后，16000g下4°C離心20分鐘。充分棄上清后，加入75%乙醇1ml，輕柔顛倒數(shù)次，16000g 下4°C離心10分鐘。充分棄上清，室溫干燥后，加入20 μ 1 DEPC水溶解沉淀。將重復(fù)樣品混合后，加入等體積異丙醇混勻，16000g下4°C離心20分鐘。充分棄上清，室溫干燥后溶于 100 μ 1 DEPC水中。取少許樣品通過(guò)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。(4)進(jìn)行Solexa測(cè)序，具體步驟參照illumina公司操作說(shuō)明書(shū)。對(duì)Solexa測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常人，非小細(xì)胞肺癌病人有16個(gè)腫瘤特異性的miRNAs在血細(xì)胞中表達(dá)下降而在血清中上升，具體結(jié)果見(jiàn)圖1A。血清和組織的Solexa測(cè)序包括以下步驟(1)搜集正常人和結(jié)腸癌病人的結(jié)腸組織和血清；(2)分別提取總RNA。提取用于Solexa測(cè)序的結(jié)腸組織RNA采用Trizol試劑 (Invitrogen公司)；用于Solexa測(cè)序的血清RNA提取方法與實(shí)施例1中血清和血細(xì)胞的 Solexa測(cè)序步驟中用于Solexa測(cè)序的血清RNA的提取方法相同。(3)進(jìn)行Solexa測(cè)序，具體步驟參照illumina公司操作說(shuō)明書(shū)。
對(duì)Solexa測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常人，結(jié)腸癌病人有8個(gè)腫瘤特異性的miRNAs在結(jié)腸組織中下降而在血清中上升，具體結(jié)果見(jiàn)圖1B。以上結(jié)果證明，腫瘤特異性的miRNAs在上述兩種癌癥的組織/細(xì)胞中的表達(dá)與血清存在差異(呈負(fù)相關(guān))，表明血清中miRNA并不僅是體內(nèi)破碎細(xì)胞隨機(jī)釋放的，而是由細(xì)胞主動(dòng)分泌并主動(dòng)參與疾病發(fā)生發(fā)展的一種方式。因此提示，可以通過(guò)調(diào)節(jié)血清中miRNA 的含量起到干預(yù)疾病發(fā)生發(fā)展的作用。實(shí)施例2血清/血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞微粒子的分離及觀測(cè)本實(shí)施例分別采用以下方法分離出血清/血漿和細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞微粒子(1)差速離心法先將血清/血漿或培養(yǎng)細(xì)胞依次通過(guò)300g、1500g及IOOOOg離心，除去各類(lèi)細(xì)胞及碎片，然后將上清超速離心(1 IOOOOg/) 70分鐘，取沉淀便是血清/血漿或細(xì)胞總的細(xì)胞微粒子。(2)免疫吸附法將細(xì)胞特異性的抗體吸附在組織培養(yǎng)皿上或直接用免疫磁珠， 將除去各類(lèi)細(xì)胞及碎片后的血清/血漿或細(xì)胞培養(yǎng)液直接和培養(yǎng)皿或免疫磁珠溫育(30分鐘或1小時(shí))，不同細(xì)胞的細(xì)胞微粒子可直接被吸附和回收。(3)過(guò)濾法將除去各類(lèi)細(xì)胞及碎片后的血清/血漿或細(xì)胞培養(yǎng)液直接放在帶有 100KD濾膜的濃縮離心管，在4000轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行離心，細(xì)胞微粒子將留在離心管內(nèi)被濃縮獲得。將分離得到的細(xì)胞微粒子在透射電鏡(FEI Tecnai T20透射電子顯微鏡)下觀察。細(xì)胞微粒子電鏡標(biāo)本的制備及觀察包括細(xì)胞微粒子沉淀用2. 5%戊二醛固定液在 4°C固定過(guò)夜，PBS漂洗三遍，每遍10分鐘。之后用的四氧化鋨室溫固定60分鐘。固定后的樣品用10%的明膠包埋，然后在4°C下用戊二醛再固定后，將樣品切成小塊(體積小于1立方毫米)。樣品用依次增高濃度的乙醇溶液脫水(30%、50%、70%、90%、95%和 100% X3)。用環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋后，用Leica UC6超薄切片機(jī)切片，最后在120kV條件下透射電子顯微鏡觀察。采用差速離心法分離得到細(xì)胞微粒子的透射電鏡圖如圖2所示，顯示從正常人血清/血漿中分離到的細(xì)胞微粒子大小不一，分布在10-500nm范圍內(nèi)。實(shí)施例3血清/血漿中細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸的RT-PCR實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例使用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)并證明人血清/血漿中細(xì)胞微粒子載有各種微小核糖核酸，且量上存在顯著的差異，具體步驟為(1)收集正常人的血清/血漿；(2)采用實(shí)施例2中所描述的差速離心法分離血清/血漿中細(xì)胞微粒子。(3)分離制備cDNA樣品用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取細(xì)胞微粒子的總RNA，然后通過(guò)RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4 μ 1 5XAMV緩沖液、2 μ 1 IOmM 各 dNTP 混合物(Takara 公司)、0· 5 μ 1 Rnase 抑制劑(Takara 公司)、2 μ 1 AMV(Takara公司)以及1. 5 μ 1需要檢測(cè)的miRNA的特異性反向引物混合物，反應(yīng)步驟為 16°C孵育15分鐘，42°C反應(yīng)1小時(shí)，85°C孵育5分鐘；(4) 0 反應(yīng)將00嫩按1/50稀釋?zhuān)?4 1稀釋后的00嫩，加入0.34 1 Taq酶 (Takara 公司)，0. 25 μ 1 10 μ M 正向引物，0. 25 μ 1 10 μ M 通用反向引物，1. 2 μ 1 25mM MgCl2,1. 6μ 1 2. 5mM 各 dNTP 混合物(Takara 公司)，2 μ 1 10XPCR 緩沖液，13. 4 μ IH2O,
1420 μ 1體系進(jìn)行PCR。PCR的反應(yīng)條件是95°C、5分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)一95°C、15秒，60°C、1 分鐘進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。(5)電泳觀察PCR產(chǎn)物取10 μ 1進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在紫外燈下觀察。圖3是以正常人血清為研究對(duì)象，從將血清中通過(guò)超高速離心分離總的細(xì)胞微粒子， 然后直接進(jìn)行RT-PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用人全部五百多個(gè)微小核糖核酸成熟體進(jìn)行PCR反應(yīng)，圖 3 為其中的 23 種微小核糖核酸let-7a、miR-101、miR-21、miR-22、miR-20a、miR-25、 miR-26a>miR-106a>miR-24>miR-103>miR-107>miR-16>miR-UmiR-15a>miR-17>miR-18a> miR-146a、miR-451、miR-181a、miR-142-3p、miR-155、miR-150 和 miR-233。其中，miR-150、 miR-21、miR-142-5p和miR-181a是血細(xì)胞特有的微小核糖核酸，let-7a是血細(xì)胞富集的 miRNA。由以上結(jié)果可知，細(xì)胞微粒子中確實(shí)攜帶有微小核糖核酸，并且各種微小核糖核酸的含量存在差異。實(shí)施例4不同牛理狀杰下血清/血漿和細(xì)胞中細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸的 Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例通過(guò)Real-time PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)并證明了動(dòng)脈粥樣硬化病人和正常人血清 /血漿中細(xì)胞微粒子中miRNA表達(dá)量不同，具體步驟如下(1)抽取正常人和動(dòng)脈粥樣硬化病人的全血(抗凝)；(2)參照實(shí)施例2中的差速離心法獲得細(xì)胞微粒子。(3)參照實(shí)施例3中的方法制備cDNA樣品；(3)Real-time PCR反應(yīng)選取血清/血漿細(xì)胞微粒子表達(dá)量較高的miR_125b、 miR-16、miR-451、miR-142_3p及miR-150對(duì)正常人及動(dòng)脈粥樣硬化病人血清/血漿細(xì)胞微粒子中微小核糖核酸的表達(dá)量差異進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證。將cDNA按1/50稀釋?zhuān)?1μ 1稀釋后的cDNA，加入 0. 3μ 1 Taq 酶(Takara 公司)，0. 25μ 1 10 μ M 正向引物，0. 25 μ 1 ΙΟμΜ 通用反向引物，1. 2μ 1 25mM MgCl2,1. 6μ 1 2. 5mM 各種 dNTP 混合物(Takara 公司)， 1 μ 1 20XEVA GREEN, 2 μ 1 10XPCR 緩沖液，12. 4 μ IH2O, 20 μ 1 體系進(jìn)行 PCR。儀器使用的是ABI Prism 7300熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為95°C、5分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)一95°C、15秒， 60°C、1分鐘進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；(4)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理方法為ACt法，Δ Ct設(shè)為反應(yīng)達(dá)到域值時(shí)的循環(huán)數(shù)，則兩組樣品微小核糖核酸的比較可以用方程表示，其中ACt = CTlai_CTla2。結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，血清/血漿細(xì)胞微粒子中的部分miRNA，如 miR-125b、miR-16、miR-142-3p，特別是miR-451及miR-150的表達(dá)量在正常人和動(dòng)脈粥樣硬化病人之間有明顯差別。提示在疾病狀況下細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的表達(dá)與正常情況下不同，即細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸與疾病相關(guān)。微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因?yàn)榧膊〉囊种埔蜃右约按龠M(jìn)因子都可能是微小核糖核酸的靶位點(diǎn)，當(dāng)微小核糖核酸本身先發(fā)生了紊亂表達(dá)，比如本來(lái)抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量降低了， 或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達(dá)量升高了，其最終結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致下游一系列基因表達(dá)的變化以及某些通路的整體紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病發(fā)生。反之，如果抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量增加或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達(dá)量減少都會(huì)導(dǎo)致下游一系列促進(jìn)疾病進(jìn)程的基因表達(dá)的下降，進(jìn)而抑制疾病發(fā)生或發(fā)展。因此，微小核糖核酸還可以作為潛在的藥物作用靶點(diǎn)，通過(guò)抑制疾病過(guò)程中上調(diào)的微小核糖核酸和過(guò)表達(dá)下調(diào)的微小核糖核酸，將有可能極大地緩解疾病的發(fā)生和發(fā)展。提示可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞微粒子微小核糖核酸的含量，起到預(yù)防/治療疾病的作用。實(shí)施例5通過(guò)加入刺激物的方法調(diào)節(jié)細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸含量本實(shí)施例通過(guò)向正常人全血中加入刺激物，證明刺激物作用下血細(xì)胞分泌的細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的含量發(fā)生改變。具體步驟如下(1)抽取人全血(抗凝)，將全血平均分成兩份，在其中一份加入lOOng/mL脂多糖 (LPS)，于37°C溫育1小時(shí)，另一份不加LPS作為對(duì)照；(2)參照實(shí)施例2中的差速離心法，分別將上述兩份全血差速離心得到脂多糖 (LPS)處理的細(xì)胞微粒子(LPS處理)和未經(jīng)脂多糖處理的細(xì)胞微粒子(對(duì)照)；(3)參照實(shí)施例3中的方法制備cDNA樣品；(4)參照實(shí)施例4中的方法進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)；(5)參照實(shí)施例4的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果如圖5A所示。從圖5A中可以看出，對(duì)正常人全血進(jìn)行處理后，細(xì)胞微粒子中的部分miRNA上升，比較明顯的是與免疫相關(guān)的miRNA，例如miR_181a、miR_146a、miR-150寸。另外，本實(shí)施例還證明了在其他刺激因子的作用下也能引發(fā)培養(yǎng)的細(xì)胞分泌的細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的含量發(fā)生改變。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下(1)選擇在炎癥反應(yīng)中起重要作用的人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系THP-I作為研究對(duì)象，THP-I細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清(Gibco，USA)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco， USA)中，5%C02、37°C下培養(yǎng)。分別用自由脂肪酸(FFAs，終濃度400 μ M)、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物(AGEs，終濃度100 μ g/mL)和H2O2 (終濃度100 μ Μ)刺激THP-I，BSA處理作為對(duì)照；(2)將培養(yǎng)細(xì)胞1000轉(zhuǎn)/分鐘離心，收集細(xì)胞沉淀，其上清參照實(shí)施例3中的差速離心法，分別分離細(xì)胞微粒子； (3)參照實(shí)施例3中的方法制備cDNA樣品；(4)參照實(shí)施例4中的方法進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，采用miR_16作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(5)通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，得出所檢測(cè)各種miRNA的絕對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果見(jiàn)圖5B-D。從圖可以看出，THP-I經(jīng)過(guò)FFAs (即油酸(OA)/軟脂酸(PA)處理，圖5D)、AGEs (圖5C)和H2O2 (圖5B)刺激后，細(xì)胞微粒子中微小核糖核酸的含量與刺激前完全不同。例如在H2O2的刺激下，細(xì)胞微粒子中miR-26a、miR-29a、miR-222表達(dá)量急劇下降，而miR-150、miR-181b含量上升。提示可以通過(guò)加入刺激改變細(xì)胞微粒中微小核糖核
酸的含量。實(shí)施例6通過(guò)導(dǎo)入微小核糖核酸前體(pre-miRNA)和反義核糖核酸(antisence RNA)改變細(xì)胞微粒子中微小核糖核酸含量。本實(shí)施例通過(guò)人工在體外導(dǎo)入miR-150的pre_miRNA，升高細(xì)胞微粒中miR-150的含量。具體包括以下步驟首先，通過(guò)采用脂質(zhì)體(invetrogen公司 Lipofectamine 2000)將 pre-miRNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)入THP-I細(xì)胞，具體方法如下(I)THP-I細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清(Gibco，USA)的RPMI1640培養(yǎng)基 (Gibco, USA)中，5% C02、37°C培養(yǎng)。(2)將 30 μ Ilipofectamine 2000 和 600pmol 的陰性對(duì)照 pre-RNA 分別與 Iml OPTI-MEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)混合，形成混合物A和混合物B，室溫下放置5min。(3)將 30 μ 1 Iipofectamine 2000 和 600pmol 的 miR-150 前體(pre-miR-150)分別與Iml OPTI-MEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)混合，形成混合物C和混合物D，室溫下放置5min。(4)將混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。(5)將混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。(6)將混合物E和F分別加入對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，補(bǔ)足OPTI-MEM培養(yǎng)基到 15ml。5% C02、37°C培養(yǎng)。(7)6小時(shí)后更換成正常培養(yǎng)液。(8) 24h 48h后轉(zhuǎn)染結(jié)束，收集細(xì)胞，參照實(shí)施例2分離制備微小核糖核酸的方法分離制備導(dǎo)入pre-miR-150后的細(xì)胞微粒子。其次，參照實(shí)例4中Real time-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞微粒中miR-150的含量。結(jié)果如圖6A所示，轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞微粒子中的miR-150的含量顯著提高，提示可以通過(guò)在體外導(dǎo)入微小核糖核酸前體的方式提高某種特異微小核糖核酸的含量。通過(guò)導(dǎo)入miR-150 antisence RNA，降低細(xì)胞微粒子中miR-150含量的方法具體包括以下步驟首先，通過(guò)采用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)將 miR-150 antisenceRNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)入THP-I細(xì)胞，具體方法如下(I)THP-I細(xì)胞培養(yǎng)在添加了 10%胎牛血清(Gibco，USA)的RPMI1640培養(yǎng)基 (Gibco, USA)中，5% C02、37°C培養(yǎng)。(2)將 30 μ 1 Iipofectamine 2000 和 600pmol 的陰性對(duì)照 antisence RNA 分別與 Iml OPTI-MEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)混合，形成混合物A和混合物B，室溫下放置5min。(3)將 30μ1 Iipofectamine 2000 禾口 600pmol 的 miR-150 antisence RNA 分別與 Iml OPTI-MEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)混合，形成混合物C和混合物D，室溫下放置5min。(4)將混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。(5)將混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。(6)將混合物E和F分別加入對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，補(bǔ)足OPTI-MEM培養(yǎng)基到 15ml。5% C02、37°C培養(yǎng)。(7)6小時(shí)后更換成正常培養(yǎng)液。(8) 24h 48h后轉(zhuǎn)染結(jié)束，收集細(xì)胞參照實(shí)施例2的方法分離制備微小核糖核酸。其次，參照實(shí)例4中Real time-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞微粒中miR-150的含量。結(jié)果如圖6B所示，轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞微粒子中的miR-150含量顯著降低，提示可以通過(guò)在體外導(dǎo)入某種特異微小核糖核酸的antisence RNA,降低其含量。
^MMl細(xì)胞微粒子及其所載微小核糖核酸與靶細(xì)胞的相互作用。本實(shí)施例利用共聚焦顯微鏡技術(shù)、Real-time PCR技術(shù)、western blot技術(shù)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并證明細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸可以在不相鄰細(xì)胞間靶向、高效地傳遞，并對(duì)靶細(xì)胞的功能產(chǎn)生一定的影響。首先，利用染料diI_C16(lh，37°C )將THP-I細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記(紅色)，用AGEs 刺激THP-I (6h，37°C )，離心分離THP-I細(xì)胞分泌的微粒子，將THP-I細(xì)胞分泌的微粒子加入毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-I) 37°C溫育6h HMEC-I培養(yǎng)在添加了 lOng/mL表皮生長(zhǎng)因子 (Becton-Dickinson，USA)、10ng/mL 氫化可的松(Sigma)和 10%胎牛血清(Gibco，USA)的 MCDB-131培養(yǎng)基中，5% C02、37°C下培養(yǎng)。共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus)下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖7A，藍(lán)色為HMEC-I細(xì)胞的細(xì)胞核染色。從圖7A中可以發(fā)現(xiàn)，THP-I細(xì)胞微粒子能夠進(jìn)入毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-I中和HMEC-I細(xì)胞發(fā)生特異性相互作用。其次，細(xì)胞微粒子所載的miRNAs能夠提高靶細(xì)胞中相應(yīng)的miRNAs水平，例如 miR-150。具體步驟為(1)篩選THP-1、293T和HMEC-I細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，結(jié)果如圖7B所示。與HMEC-I 細(xì)胞相比，THP-I細(xì)胞中各種miRNA的表達(dá)量有很大不同。特別是mir_150，其在THP-I中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HMEC-I細(xì)胞，因此可以將其作為研究對(duì)象，研究細(xì)胞微粒子攜帶的miRNA 與其靶細(xì)胞的相互作用。(2)用 100 μ g/mL AGEs 刺激 THP-I 和 293T 細(xì)胞；(3)參照實(shí)施例2中的差速離心法，分別離心分離THP-I和293T細(xì)胞的細(xì)胞微粒子；(4)將分離到的細(xì)胞微粒子分別與HMEC-I在37°C溫育6小時(shí)。(5)分別提取未經(jīng)細(xì)胞微粒子處理的的HMEC-I細(xì)胞和經(jīng)THP-I和293T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞微粒子溫育的HMEC-I細(xì)胞的總RNA，參照實(shí)施例3中的方法制備cDNA樣品；(6)參照實(shí)施例4中的方法進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)；(7)參照實(shí)施例4中的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果見(jiàn)圖7C，從圖中可以看出，高表達(dá)miR-150的THP-I的細(xì)胞微粒子處理 HMEC-I,能使原先低表達(dá)miR-150的HMEC-I中的miR-150升高十多倍，而相對(duì)低表達(dá) miR-150的293T細(xì)胞的細(xì)胞微粒子處理HMEC-I不能明顯提高HMEC-I中miR-150的含量， 這表明HMEC-I的miR-150水平升高是由THP-I的細(xì)胞微粒子所載的高豐度的miR-150引起的，而不是由細(xì)胞微粒子轉(zhuǎn)入引起miR-150的內(nèi)源性升高引起的。再次，通過(guò)細(xì)胞微粒子轉(zhuǎn)入HMEC-I的miR-150能夠下調(diào)HMEC-I中靶蛋白c_Myb 的表達(dá)，從而增強(qiáng)HMEC-I的遷移能力。具體實(shí)驗(yàn)步驟為(1) 100 μ g/mL AGEs 刺激 THP-I 細(xì)胞；(2)參照實(shí)施例2中的差速離心法，分離THP-I細(xì)胞微粒子；(3)將 THP-I 細(xì)胞微粒子加入 HMEC-I，37°C溫育 3h、6h、12h ；(4)分別提取總蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)，以未用THP-1細(xì)胞微粒子溫育的 HMEC-I的總蛋白為對(duì)照，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果見(jiàn)圖7D。從該圖中可以看出，轉(zhuǎn)入THP-I細(xì)胞微粒子的HMEC-I的c-Myb蛋白明顯下調(diào)，由于微小核糖核酸主要是通過(guò)阻斷其靶基因蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，因此檢測(cè)c-Myb蛋白含量就能間接證明細(xì)胞微粒子攜帶的miR-150在靶細(xì)胞中發(fā)揮作用。由于c-Myb蛋白在細(xì)胞增殖、分化和遷移中起重要作用，因此還檢測(cè)了經(jīng)THP-I細(xì)胞微粒子溫育的HMEC-I遷移能力的變化情況，具體步驟如下(1)將 Transwell 小室(Transwell Boyden Chamber, 6. 5mm, Costar, Cambridge, MA, USA)的上面小室底部的聚碳酸酯膜(8μπι孔徑)用0.1%的明膠覆蓋；(2)HMEC-I細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基懸起，濃度控制在(1-10) X 105/mL ；用THP-I 細(xì)胞微粒子孵育細(xì)胞2小時(shí)，以未THP-I細(xì)胞微粒子孵育的細(xì)胞為對(duì)照，然后將細(xì)胞加入上面的小室，同時(shí)在下面的小室中加入0. 5mL的含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4h ；(3)將遷移到下層的細(xì)胞用90%乙醇在室溫下固定15分鐘，洗滌，用0. 1 %的結(jié)晶紫室溫染色15分鐘，將留在濾膜上的細(xì)胞小心地刮下，拍照(Olympus，BX51, Japan)，結(jié)果見(jiàn)圖7E(未經(jīng)THP-I細(xì)胞微粒子孵育的對(duì)照)和圖7F(經(jīng)THP-I細(xì)胞微粒子孵育)，顯微鏡下計(jì)數(shù)隨機(jī)選擇的5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果見(jiàn)圖7G。從拍照和計(jì)數(shù)的結(jié)果都可以看出，經(jīng)過(guò)THP-I細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I的遷移能力由于c-Myb蛋白的下調(diào)而明顯增強(qiáng)。通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，不同的細(xì)胞可以分泌miRNAs到細(xì)胞微粒子中，通過(guò)細(xì)胞微粒子將miRNAs傳遞給其受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中發(fā)揮功能。提示可以將微粒子中的miRNA作為藥物，利用微粒子與靶細(xì)胞的高親和性特異性的遞送到靶細(xì)胞中，通過(guò)影響參與疾病發(fā)病的靶細(xì)胞的功能，達(dá)到藥物預(yù)防/治療的目的。另外，THP-I的細(xì)胞微粒子也傳遞其它miRNAs，如miR-136、miR_30c、miR-26a到 HMEC-I中，同時(shí)，HMEC-I和293T細(xì)胞之間也有miRNAs的交換。因此，除了研究miR-150， 研究THP-IMPs中其他miRNAs被遞送到HMEC-I中所發(fā)揮的生物學(xué)功能以及THP-1、HMEC_1 和293T細(xì)胞在各種病理生理?xiàng)l件下相互間的通信機(jī)制也很有意義。本實(shí)施例還檢測(cè)了細(xì)胞微粒子所載的微小核糖核酸在體內(nèi)進(jìn)入其靶細(xì)胞的能力。首先，用熒光標(biāo)記THP-I細(xì)胞微粒子，具體步驟包括利用染料diI_C16(lh，37°C ) 將THP-I細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記(紅色)，培養(yǎng)12小時(shí)，離心分離被熒光標(biāo)記的THP-I細(xì)胞微粒子并靜脈注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)，6h后，分離小鼠血管內(nèi)皮層，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖7H-I所示，與注射沒(méi)有熒光標(biāo)記的細(xì)胞微粒子(圖7H左)的對(duì)照相比，注射過(guò)熒光標(biāo)記的THP-I細(xì)胞微粒子(圖7H右)的小鼠血管內(nèi)皮層明顯被熒光標(biāo)記。說(shuō)明，細(xì)胞微粒子在體內(nèi)可以通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入生物體，并高效進(jìn)入其靶細(xì)胞中。同時(shí)參照實(shí)施例4中的方法使用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠血管組織中miRNAs 的表達(dá)形式和水平，結(jié)果見(jiàn)圖71。從該圖可以看出，miR-150、miR-138和miR-181a在小鼠靜脈注射細(xì)胞微粒子6h后升高，表明細(xì)胞微粒子所包載的miRNAs在體內(nèi)可以被遞送到靶細(xì)胞或組織。以上結(jié)果說(shuō)明，細(xì)胞微粒子是一種優(yōu)良的細(xì)胞間傳遞媒介。在體外和體內(nèi)情況下， 其都可以在細(xì)胞之間高效特異性的傳遞微小核糖核酸。依靠微小核糖核酸對(duì)其靶基因蛋白表達(dá)的抑制作用，特異性的影響細(xì)胞功能。因此，如果依靠細(xì)胞微粒子所載微小核糖核酸特意性地降低在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起作用的基因的表達(dá)，就能在一定程度上起到預(yù)防/治療疾病的作用。從而，載有微小核糖核酸的細(xì)胞微粒子就可以作為藥物，在疾病的預(yù)防/治療中發(fā)揮作用。
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實(shí)施例8通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞微粒子內(nèi)微小核糖核酸含量起到預(yù)防/治療疾病的作用。本實(shí)施例通過(guò)調(diào)節(jié)供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中微小核糖核酸的含量，檢測(cè)其對(duì)受體細(xì)胞功能的影響，從而證明調(diào)節(jié)細(xì)胞微粒子中微小核糖核酸的含量能夠起到阻礙疾病發(fā)生發(fā)展的作用。本實(shí)施例以動(dòng)脈粥樣硬化疾病狀況下的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，研究攜帶微小核糖核酸的細(xì)胞微粒子對(duì)疾病發(fā)展的緩解作用。由于在慢性炎癥狀態(tài)下細(xì)胞微粒子的種類(lèi)和數(shù)量都會(huì)增高，并且血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化癥的主要過(guò)程，因此首先研究了嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化癥病人血清/血漿中細(xì)胞微粒子中的miRNA表達(dá)量是否發(fā)生改變以及能否增強(qiáng)HMEC-I細(xì)胞的遷移能力，具體包括以下兩方面的內(nèi)容一方面，比較正常人和動(dòng)脈硬化癥病人血清/血漿細(xì)胞微粒子中miR-150和其他 miRNAs的表達(dá)水平，具體方法如下(1)參照實(shí)施例2中的差速離心法，分別分離正常人和動(dòng)脈粥樣硬化癥病人血清/ 血漿中的細(xì)胞微粒子；(2)參照實(shí)施例2中的方法制備cDNA樣品；(3)參照實(shí)施例4中的方法進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)；(4)參照實(shí)施例4中的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4中可以看出，相對(duì)于正常人血清/血漿細(xì)胞微粒子，動(dòng)脈硬化癥病人血清/血漿細(xì)胞微粒子中的miR-150以及miR-451顯著的升高。另一方面，研究動(dòng)脈粥樣硬化癥病人血清/血漿中細(xì)胞微粒子對(duì)HMEC-I細(xì)胞遷移能力的影響，以不加血清/血漿細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖8A-C，其中圖 8A為對(duì)照的細(xì)胞遷移照片(對(duì)照)，圖8B為正常人血清/血漿細(xì)胞微粒子處理的細(xì)胞遷移照片(正常人MV處理)，圖8C為動(dòng)脈粥樣硬化癥病人血清/血漿細(xì)胞微粒子處理的細(xì)胞遷移照片(病人MV處理)，對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖8D所示。從該圖中可以看出，相對(duì)于沒(méi)有經(jīng)過(guò)細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I，經(jīng)過(guò)動(dòng)脈粥樣硬化癥病人血清/血漿細(xì)胞微粒子處理的HMEC-I遷移能力有顯著增強(qiáng)，而正常人血清/血漿細(xì)胞微粒子對(duì)HMEC-I的遷移能力沒(méi)有影響。以上結(jié)果表明在各種生理病理?xiàng)l件下，巨噬細(xì)胞中miR-150的升高加速了血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化及血管損傷導(dǎo)致的肥胖、高血糖和慢性炎癥。因此提示，如果降低巨噬細(xì)胞微粒子中miR-150的含量，就可以減少其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用，進(jìn)而延緩上述疾病的發(fā)生發(fā)展，從而對(duì)疾病起到治療作用。本實(shí)施例通過(guò)導(dǎo)入miR-150反義核糖核酸的方法，降低巨噬細(xì)胞系THP-I細(xì)胞微粒子中miR-150的含量，檢測(cè)該微粒子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。具體包括以下步驟(1)參照實(shí)施例6，通過(guò)導(dǎo)入反義核糖核酸的方法降低THP-I微粒子中miR-150的含量。(2)參考實(shí)施例2分離制備THP-I細(xì)胞微粒子。(3) THP-I細(xì)胞微粒子孵育HMEC-I細(xì)胞6小時(shí)。(4)參考實(shí)施例7檢測(cè)c-myb蛋白含量及HMEC-I遷移能力。
HMEC-I中C_myb蛋白的表達(dá)量如圖8E所示，可見(jiàn)與正常的THP-I微粒子(對(duì)照) 相比降低了 miR-150含量的THP-I微粒子(反義RNA)能顯著提高HMEC-I細(xì)胞中c-myb蛋白的表達(dá)。HMCE-I細(xì)胞的遷移能力如圖8F所示，與正常的THP-I微粒子相比(對(duì)照)降低了 miR-150含量的THP-I微粒子(反義RNA)能明顯抑制HMEC-I細(xì)胞的遷移能力。由于在粥樣動(dòng)脈硬化過(guò)程中，巨噬細(xì)胞微粒中miR-150的升高加速了血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及血管損傷導(dǎo)致的肥胖、高血糖和慢性炎癥。 因此理論上，如果能降低巨噬細(xì)胞微粒子中miR-150的含量，就能阻礙動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展從而起到對(duì)疾病的預(yù)防和治療作用。我們選擇了巨噬細(xì)胞系THP-I和內(nèi)皮細(xì)胞系 HMEC-I細(xì)胞模擬體內(nèi)巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，從結(jié)果可見(jiàn)，通過(guò)降低THP-I細(xì)胞中miR-150的含量，可以降低其靶細(xì)胞HMEC-I的遷移能力。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)(升高或降低)細(xì)胞微粒子中特定微小核糖核酸的含量，起到預(yù)防治療疾病的作用。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微小核糖核酸含量的方法，該方法包括以下步驟(1)調(diào)節(jié)供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的含量；(2)分離供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子；(3)將分離的細(xì)胞微粒子引入生物體內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子的來(lái)源選自體液，優(yōu)選為血液；細(xì)胞培養(yǎng)物；和組織中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的含量步驟為增加或減少供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的表達(dá)量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述增加供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的表達(dá)量的方法為施加外源性刺激和/或?qū)胛⑿『颂呛怂崆绑w。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述施加外源性刺激包括以下步驟在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中加入一種或多種能夠影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、代謝情況、生活周期和功能的外源性刺激物，例如激素、細(xì)胞因子、脂多糖、自由脂肪酸、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和過(guò)氧化氫， 然后孵育。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述導(dǎo)入微小核糖核酸前體包括以下步驟采用脂質(zhì)體載體將相應(yīng)的微小核糖核酸前體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，然后孵育。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述減少供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子中的微小核糖核酸的表達(dá)量的方法為施加外源性刺激和/或?qū)胛⑿『颂呛怂岬姆戳xRNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述施加外源性刺激包括以下步驟在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中加入一種或多種能夠影響細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、代謝情況、生活周期和功能的外源性刺激物，例如激素、細(xì)胞因子、脂多糖、自由脂肪酸、高級(jí)糖基化終產(chǎn)物和過(guò)氧化氫， 然后孵育。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述導(dǎo)入微小核糖核酸的反義RNA包括以下步驟采用脂質(zhì)體載體將相應(yīng)的微小核糖核酸的反義RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，然后孵育。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分離供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子的方法選自差速離心法、免疫吸附法和超濾法中的一種或多種。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述差速離心法包括以下步驟(1)將細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，或者體液以300g的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，取上清；(2)將上清以1500g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取上清；(3)將上清以IOOOOg的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，取上清；(4)將上清以IlOOOOg的轉(zhuǎn)速離心70分鐘，沉淀即供體細(xì)胞細(xì)胞微粒子。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述免疫吸附法包括以下步驟(1)將細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，或者體液以3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，取上清；(2)將上清置于吸附細(xì)胞特異性抗體或免疫磁珠的組織培養(yǎng)皿上溫育30 60分鐘，回收被吸附的細(xì)胞微粒子。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述超濾法包括以下步驟(1)將細(xì)胞培養(yǎng)物或組織，或者體液以3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，取上清；(2)將上清置于帶有100KD濾膜的濃縮離心管中，在4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心、濃縮即得。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物體選自人；動(dòng)物，例如軟骨魚(yú)、硬骨魚(yú)、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)；微生物，例如細(xì)菌、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體、放線菌和病毒中的一種或多種。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒選自DNA病毒和RNA病毒，例如乙肝病毒、天花病毒、炭疽病毒、艾滋病病毒、SARS病毒和流感病毒中的一種或多種。
16.一種預(yù)防和/或治療疾病的方法，該方法包括采用根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法來(lái)調(diào)節(jié)人或動(dòng)物體內(nèi)與疾病相關(guān)的微小核糖核酸的含量。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述微小核糖核酸的含量增加或減少與疾病發(fā)生和/或發(fā)展相關(guān)。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述疾病選自腫瘤；急、慢性傳染病，例如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病和SARS等病毒性疾病，例如肺結(jié)核、細(xì)菌性肺炎等細(xì)菌性疾病，以及其它病原微生物導(dǎo)致的急、慢性傳染??；呼吸系統(tǒng)疾?。幻庖呦到y(tǒng)疾?。谎号c造血系統(tǒng)疾??；循環(huán)系統(tǒng)疾病，例如心腦血管疾病；內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；消化系統(tǒng)疾?。簧窠?jīng)系統(tǒng)疾??；泌尿系統(tǒng)疾病；生殖系統(tǒng)疾病以及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病中的一種或多種。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述疾病選自動(dòng)脈粥樣硬化，血管損傷導(dǎo)致的肥胖、高血糖和慢性炎癥中的一種或多種。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述與疾病相關(guān)的微小核糖核酸選自 let-7b、let-7c、let_7d、let_7e、let_7f、let_7g、let_7i、miR-1、 miR-100、miR-101、miR-103、miR-105、miR_106a、miR_106b、miR-107、miR-10a、miR-10b、 miR-122a> miR-124a> miR-125a> miR-125b> miR-126> miR-126*> miR-127> miR-128a> miR-128b, miR-129, miR-130a, miR—130b、miR-132, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-135a、miR-135b、miR-136、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-142-3p、 miR-142-5p, miR-143, miR-144, miR-145, miR-146a, miR-146b, miR-147, miR-148a, miR-148b、miR-149、miR-150、miR-151、miR-152、miR-153、miR-154、miR-154*、miR-155、 miR-15a> miR-15b> miR-16、miR-17-3p> miR-17-5p> miR-181a> miR-181b> mil —181c、 miR-181d、miR-182、miR-182*、miR-183、miR-184、miR-185、miR-186、miR-187、miR-188、 miR-189> miR-18a> miR-18a*> miR-18b> miR—190、miR—191、miR—191*、miR-192> miR-193a> miR-193b, miR-194, miR-195, miR-196a, miR-196b, miR-197, miR-198, miR-199a, miR-199a*> miR-199b> miR-19a> miR-19b> miR-200a> miR-200a*> miR-200b> miR-200c> miR-202> miR-202*> miR-203> miR-204> miR-205> miR-206> miR-208> miR-20a> miR-20b> miR-21、miR-210、miR-211、miR-212、miR-213、miR-214、miR-215、miR-216、miR-217、 miR-218> miR-219> miR-22> miR-220> miR-221> miR-222> miR-223> miR-224> miR-23a> miR-23b> miR-24> miR-25> miR-26a> miR-26b> miR-27a> miR-27b> miR-28> miR-296> miR-299-3p> miR-299-5p> miR-29a> miR-29b> miR-29c> miR—301、miR-302a> miR-302a*> miR-302b> miR-302b*> miR-302c> miR-302c*> miR-302d> miR-30a-3p> miR-30a-5p> miR-30b> miR-30c> miR-30d>miR-30e-3p> miR-30e-5p> miR-3UmiR-32>miR-320>miR-323> miR-324-3p> miR-324-5p> miR-325> miR-326> miR-328> miR-329> miR-33> miR—330、 miR-331、miR-335、miR-337、miR-338、miR-339、miR_33b、miR-340、miR-342、miR-345、 miR-346> miR-34a> miR-34b> miR-34c> miR-361> miR-362> miR-363> miR-363*> miR-365>miR-367> miR-368> miR-369-3p> miR-369-5p> miR-370> miR-37U miR-372> miR-373> miR-373*. miR-374, miR-375, miR-376a, miR-376a*. miR-376b, miR-377, miR-378, miR-379> miR-380-3p> miR-380-5p> miR-38U miR-382> miR-383> miR-384> miR-409-3p> miR-409-5p、miR-410、miR-411、miR-412、miR-421、miR-422a、miR-422b、miR-423、miR-424、 miR-425、miR-425-5p、miR-429、miR-431、miR-432、miR-432*、miR-433、miR-448、miR-449、 miR-450、miR-451、miR-452、miR-452*、miR-453、miR-455、miR-483、miR-484、miR-485-3p、 miR-485-5p、miR-486、miR-487a、miR-487b、miR-488、 mi R-489、miR-490、miR-491、miR-492、 miR-493> miR-493-3p> miR-494> miR-495> miR-496> miR-497> miR-498> miR-499> miR—500、 miR-50U miR-50 2> miR-503> miR-504> miR-505> miR-506> miR-507> miR-508> miR-509> miR-510>miR-51UmiR-512-3p>miR-512-5p>miR-513>miR-514>miR-515-3p> miR-515-5p> miR-516-3p> miR-516-5p> miR-517*> miR-517a> miR-517b> miR-517c> miR-518a> miR-518a-2*>miR-518b>miR-518c>miR-518c*>miR-518d>miR-518e>m iR-518f>miR-518f*> miR-519a> miR-519b> miR-519c> miR-519d> miR-519e> miR-519e*> miR-520a> miR-520a*> miR-520b> miR-520c> miR-520d> m iR-52 0d*> miR-520e> miR-520f> miR-520g> miR-520h> miR-521、miR-522、miR-523、miR-524、miR-524*、miR-525、miR-525*、miR-526a、miR-526b、 miR-526b*> miR-526c> miR-527> miR-532> miR-542-3p> miR-542-5p> miR-544> miR-545> miR-548a>miR-548b>miR-548c>miR-548d>miR-549>miR-550>miR-551a>miR-552>miR-553> miR-554> miR-555> miR-556> miR-557> miR-558> miR-559> miR-560> miR-56U miR-562> miR-563、miR-564、miR-565、miR-566、miR-567、miR-568、miR-569、miR-570、miR-571、 miR-572、miR-573、miR-574、miR-575、miR-576、miR-577、miR-578、miR-579、miR-580、 miR-58U miR-582> miR-583> miR-584> miR-585> miR-586> miR-587> miR-588> miR-589> miR-590> miR-591> miR-592> miR-593> miR-594> miR-595> miR-596> miR-597> miR-598> miR-599> miR-600、miR-601> miR-602> miR-603> miR-604> miR-605> miR-606> miR-607> miR-608、miR-609、miR-610、miR-611、miR-612、miR-613、miR-614、miR-615、miR-616、 miR-617、miR-618、miR-619、miR-620、miR-621、miR-622、miR-623、miR-624、miR-625、 miR-626> miR-627> miR-628> miR-629> miR-630> miR-631> miR-632> miR-633> miR-634> miR-635、miR-636、miR-637、miR-638、miR-639、miR-640、miR-641、miR-642、miR-643、 miR-644> miR-645> miR-646> miR-647> miR-648> miR-649> miR-650> miR-65U miR-652> miR-653> miR-654> miR-655> miR-656> miR-657> miR-658> miR-659> miR-660> miR-66U miR-662> miR-663> miR-7> miR-9> miR-9*> miR-92> miR-93> miR-95> miR-96> miR-98> miR-99a 和 miR_99b 中的一種或多種，例如，miR-16、miR-26a、miR-29a、miR-30c、miR-125b、 miR-138、miR-142_3p、miR-150、miR_181a、miR_181b、miR-136、miR_146a、miR-222 和 miR-451中的一種或多種。
21.根據(jù)權(quán)利要求16至20中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述與疾病相關(guān)的微小核糖核酸選自選自miR-125b、miR-16、miR-142_3p、miR-451和miR-150中的一種或多種， 例如 miR-451 和 miR-150，再如 miR-150。
全文摘要
本發(fā)明一種調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微小核糖核酸含量的方法及其用途。微小核糖核酸(miRNAs)通過(guò)細(xì)胞微粒子(microparticles/microvesicles/exosomes)被細(xì)胞主動(dòng)地、選擇性地分泌到循環(huán)系統(tǒng)和靶細(xì)胞/組織中發(fā)揮作用。本發(fā)明提供了一種全新的介導(dǎo)細(xì)胞間通信的信號(hào)分子家族細(xì)胞通過(guò)微粒子分泌的miRNAs。同時(shí)提供了制備含有特定微小核糖核酸的細(xì)胞微粒子的方法，并利用該類(lèi)包載微小核糖核酸的細(xì)胞微粒子對(duì)細(xì)胞及組織進(jìn)行基因水平調(diào)控及修飾，以此提供了一種新的、強(qiáng)有效的、能夠適用于所有細(xì)胞的調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微小核糖核酸含量的方法。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102218144SQ201010146339
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2010年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者張峻峰, 張辰宇, 曾科, 李海進(jìn) 申請(qǐng)人:江蘇命碼生物科技有限公司