專利名稱：白藜蘆醇在制備防治有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及白藜蘆醇的應用，具體地說，涉及白藜蘆醇在制備防治有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的藥物中的應用。
背景技術：
我國是農(nóng)業(yè)大國，也是全球廣泛使用有機磷農(nóng)藥和有機磷污染比較嚴重的國家之一，有機磷(OPs)農(nóng)藥(如對氧磷、三唑磷、辛硫磷、丙溴磷等)依然在我國農(nóng)村地區(qū)大量使用。雖然大多數(shù)農(nóng)民已經(jīng)注意預防急性有機磷中毒，但是并未對長期低劑量接觸有機磷農(nóng)藥對機體產(chǎn)生的損傷引起足夠重視。目前，國外已經(jīng)有研究指出，長期在溫室里噴灑有機磷農(nóng)藥的花工或用有機磷農(nóng)藥浸泡羊毛的牧民，其體內(nèi)對氧磷酶-1(PON1)活性和濃度明顯降低(Mackness B，Durrington P，et al.Paraoxonase and susceptibility to organophosphoruspoisoning in farmers dipping sheep.Pharmacogenetics，2003.)；還有研究指出，長期接觸有機磷農(nóng)藥的人有血壓增高、脂代謝紊亂、血管張力降低和心、腦血管的動脈粥樣硬化早期臨床表現(xiàn)等癥狀(Fokina KV，
VP.Role of chlora and organophosphate pesticide compleses inthe etiology of cerebral atherosclerosis.Vrach Delo，1978.)。
我們研究發(fā)現(xiàn)，有機磷農(nóng)藥能明顯損傷血管內(nèi)皮細胞的功能，血管內(nèi)皮功能的損傷是多種血管性疾病形成的起始因素，能誘發(fā)多種血管性疾病(如大動脈炎、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變等)。因此，探討慢性有機磷農(nóng)藥對機體的損傷機制并尋找有效的干預藥物，對于保護我國農(nóng)民的身體健康至關重要。
白藜蘆醇具有強大的抗氧化、螯合自由基及脂質抗氧化作用，已經(jīng)有研究證實白藜蘆醇是一種有效的羥基、超氧化物和金屬誘導基團的清除劑，且對活性氧(ROS)引起的細胞膜脂質過氧化和DNA損傷具有保護作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供白藜蘆醇在制備防治有機磷農(nóng)藥對機體慢性損傷的藥物方面的新用途。
具體地說，本發(fā)明涉及白藜蘆醇在制備防治有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的藥物中的應用。
此外，還涉及白藜蘆醇在制備預防和治療因有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)的疾病的藥物中的應用。
其中，所述疾病為血管性疾病，如大動脈炎、動脈粥樣硬化、高血壓或糖尿病血管病變等。
本發(fā)明所述有機磷農(nóng)藥為對氧磷、三唑磷、辛硫磷、丙溴磷等常用有機磷農(nóng)藥。
本發(fā)明所述藥物是指以白藜蘆醇為主要活性成分，與可藥用載體制成的醫(yī)療上可接受的制劑，如片劑、丸劑或膠囊劑等。
本發(fā)明所述藥物，其服用量以白藜蘆醇計成人，20～30mg/次，3次/日；兒童，0.15～0.25mg/kg·次，3次/日，即可達到防治有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的效果，特別地，孕婦等特殊人群服用時需遵醫(yī)囑(目前尚未發(fā)現(xiàn)其特殊不良反應)。
本發(fā)明所述白藜蘆醇可以直接通過市售得到。
本發(fā)明人以對氧磷(PARA)為代表，研究了有機磷農(nóng)藥對機體的慢性損傷機制，發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥誘導內(nèi)皮細胞的損傷機制與機體的“氧化應激”反應有關，而“氧化應激”可以促進血管性疾病(如大動脈炎、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變等)的發(fā)生發(fā)展；并且還通過生化指標的檢測，證明了PARA在損傷血管內(nèi)皮功能的同時也抑制了超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加了脂質過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)的水平，近一步證明了PARA損傷內(nèi)皮細胞的作用與觸發(fā)“氧化應激”和引起脂質過氧化反應有關。
本發(fā)明通過體外實驗模型觀察了對氧磷(PARA)對血管內(nèi)皮細胞的損傷作用以及白藜蘆醇抗PARA損傷作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的保護作用與抗氧化劑SOD作用相近，能保護PARA所損傷的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(EDRR)、阻滯PARA所致的內(nèi)皮細胞單層通透性(ECMP)的升高、阻滯血管內(nèi)皮細胞凋亡及形態(tài)學的改變等，且有很好的劑量依賴性。
本發(fā)明的有益效果在于 1、本發(fā)明提供了低劑量有機磷農(nóng)藥對機體產(chǎn)生慢性損傷的直接依據(jù)，并以此尋找有效的干預藥物。
2、本發(fā)明提供了白藜蘆醇的新用途，其對有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷具有很好的抑制和保護作用。白藜蘆醇能抑制有機磷農(nóng)藥(如對氧磷)所致的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應降低，有較好的劑量依賴性；具有保護血管內(nèi)皮細胞活性、阻滯有機磷農(nóng)藥(如對氧磷)所致血管內(nèi)皮細胞通透性升高和形態(tài)學改變的作用；并且能保護內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮的功能和超氧化物歧化酶的活性、減少脂質過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛的含量。
3、本發(fā)明對長期接觸有機磷農(nóng)藥的人員具有深遠的意義，能起到保護其身體健康、提高生活質量、延長壽命等作用。
具體實施例方式 以下通過具體試驗例來進一步闡述本發(fā)明的白藜蘆醇的新用途及其有益效果，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
試驗例1內(nèi)皮依賴性舒張功能檢測 1、試驗材料 1.1藥品與試劑白藜蘆醇(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，對氧磷(PARA，美國Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD，南京建成生物公司)。
1.2儀器RM6240B/C生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)；全自動定量繪圖酶標儀(美國Bio-Rad公司)。
1.3供試材料及處理方法雄性Sprague Dawley大鼠(河南省實驗動物中心)，體重180-220g。
將大鼠稱重后腹腔注射3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)進行麻醉，切斷雙側頸總動脈放血處死，開胸后快速取出胸主動脈置于4℃的K-H緩沖液(成分為118.3mmol/L NaCl、4.7mmol/L KCl、1.2mmol/LMgSO4·7H2O、1.2mmol/L KH2PO4、2.5mmol/L CaCl2、24.0mmol/LNaHCO3、0.03mmol/L EDTA；pH＝7.4)中，并通以95％O2+5％CO2(均為體積分數(shù))混合氣體；分離并去除血管周圍的脂肪及結締組織，剪成3～4mm長的血管環(huán)，將血管環(huán)移至含有K-H緩沖液的浴槽內(nèi)(恒溫37℃，通以95％O2+5％CO2混合氣體)，環(huán)的一端用不銹鋼鉤固定于浴槽內(nèi)，另一端連生物信號采集處理系統(tǒng)，將血管的收縮與舒張反應通過RM6240B/C生物信號采集處理系統(tǒng)進行記錄。
1.4統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(
)表示。組間差異比較用ANOVA及Newman-Student多重比較；t檢驗分析，由SPSS11.5統(tǒng)計軟件完成，雙側P＜0.05認為差異有顯著性。
1.5試驗分組及給藥將上述血管環(huán)分為7組，每組6個血管環(huán)(分別來自6只大鼠)，分別為正常對照組(A)、白藜蘆醇對照組(B)、PARA對照組(C)、白藜蘆醇低劑量保護組(D)、白藜蘆醇中劑量保護組(E)、白藜蘆醇高劑量保護組(F)、SOD保護組(G)。其中，正常對照組(A)不給藥，白藜蘆醇對照組(B)給予10mg/mL白藜蘆醇，PARA對照組(C)給予3.63μmol/L PARA，白藜蘆醇低劑量保護組(D)給予白藜蘆醇(0.1mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，白藜蘆醇中劑量保護組(E)給予白藜蘆醇(1mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，白藜蘆醇高劑量保護組(F)給予白藜蘆醇(10mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，SOD保護組(G)給予SOD(200U/L)+PARA(3.63μmol/L)。
2、方法與結果 將上述各組藥物加入浴槽，使血管環(huán)與藥物共孵30min，記錄乙酰膽堿(Ach)引起的最大舒張百分率(Emax)及半數(shù)有效量(EC50)，將其作為測定血管環(huán)正常收縮反應和ACh引起的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(EDRR)的檢測指標。結果如表1所示。
表1白藜蘆醇對大鼠胸主動脈血管環(huán)Emax和EC50的影響(
)
注與A組比較**P＜0.01，*P＜0.05；與C組比較##P＜0.01，#P＜0.05(下同) 從表1可以看出大鼠離體胸主動脈血管環(huán)(EVAPVR)與PARA共孵30min后(即PARA對照組)，ACh引起的Emax顯著性降低、EC50顯著性升高；各白藜蘆醇保護組劑量依賴性地抑制PARA引起的EDRR降低，以白藜蘆醇高劑量保護組(白藜蘆醇濃度為10mg/mL)作用最顯著，白藜蘆醇高劑量保護組的Emax值和EC50與PARA對照組比較，存在顯著性差異(P＜0.05)。
試驗例2體外細胞試驗 1、試驗材料 1.1藥品與試劑白藜蘆醇(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，對氧磷(PARA，美國Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD，南京建成生物公司)，混合醋酸纖維濾膜(直徑25mm、孔徑0.8μm，購自中國上海工業(yè)研究院)，SOD試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒(以上三種試劑盒均購自南京建成生物公司)，Hank’s緩沖溶液、PI染色劑(以上兩種試劑均購自長沙力康生物公司)，0.25％胰蛋白酶、新生小牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素(以上五種試劑均購自天津灝陽生物制品有限公司)。
1.2儀器針頭式濾器，規(guī)格外徑25mm、內(nèi)徑20mm(中國上海工業(yè)研究院)，C6流式細胞儀(托摩根生物科技有限公司)。
1.3供試材料及處理方法HVUECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(HUVEC，長沙力康生物有限公司)。
內(nèi)皮細胞培養(yǎng)HVUECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細胞株用0.25％胰蛋白酶進行消化，用含有15％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基(青霉素，100U/ml；鏈霉素，100U/ml；pH＝7.4)制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于5％(體積)CO2培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液一次。當內(nèi)皮細胞生長至致密融合后，進行傳代培養(yǎng)。取生長良好的第3代內(nèi)皮細胞用消化液消化，棄消化液，加入培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液，對懸液做細胞計數(shù)，準備接種。
濾膜制備將混合醋酸纖維微孔濾膜浸入0.5％(重量)醋酸溶液(溫度為50℃)中20min后，用25℃蒸餾水沖洗兩遍，然后浸入0.5g/L明膠溶液(溫度為50℃)中60min，烘干后經(jīng)高壓蒸汽消毒，備用。
內(nèi)皮細胞接種將上述制備好的濾膜置于直徑30mm的六孔細胞培養(yǎng)板中，用2％(重量)明膠貼于孔內(nèi)底面，室溫下干燥3～4h；然后將計數(shù)的第3代內(nèi)皮細胞接種于濾膜上(接種密度約為2×105/cm2)，繼續(xù)生長8～10天，待濾膜上形成致密的內(nèi)皮細胞單層后，即可用來檢測內(nèi)皮細胞單層通透性。
1.4統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(
)表示。組間差異比較用ANOVA及Newman-Student多重比較；t檢驗分析，由SPSS11.5統(tǒng)計軟件完成，雙側P＜0.05認為差異有顯著性。
1.5試驗分組及給藥將載有致密的內(nèi)皮細胞單層的濾膜分為7組，每組8個濾膜，分別為正常對照組(A)、白藜蘆醇對照組(B)、PARA對照組(C)、白藜蘆醇低劑量保護組(D)、白藜蘆醇中劑量保護組(E)、白藜蘆醇高劑量保護組(F)、SOD保護組(G)；在濾膜上按如下計量加入各組試驗藥物，然后共同孵育一定時間后按下述方法進行測定 正常對照組(A)不給藥，白藜蘆醇對照組(B)給予10mg/mL白藜蘆醇，PARA對照組(C)給予3.63μmol/L PARA，白藜蘆醇低劑量保護組(D)給予白藜蘆醇(0.1mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，白藜蘆醇中劑量保護組(E)給予白藜蘆醇(1mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，白藜蘆醇高劑量保護組(F)給予白藜蘆醇(10mg/mL)+PARA(3.63μmol/L)，SOD保護組(G)給予SOD(200U/L)+PARA(3.63μmol/L)。
2、方法與結果 2.1內(nèi)皮細胞單層通透性(ECMP)的測定 將給藥30min后的濾膜用Hank’s緩沖溶液(HBSS)沖洗2次，置于針頭式濾器內(nèi)(有效濾過面積S＝3.14cm2)。針頭式濾器上孔接長頸儲液瓶(上腔)，下孔接量筒(下腔)。上腔中加入5g/L白蛋白液(液面距離濾膜高度維持在25cm)，蛋白液通過液體流動產(chǎn)生的牽引作用透過濾膜進入下腔，平衡5min后，收集5-10min濾出液，測量濾出液容積，計算濾出液生成速度(Jv)、內(nèi)皮單層濾過系數(shù)(Kf)和滲透壓反射系數(shù)(σ)。
Jv值、Kf值和σ值是反映ECMP的指標。Jv表示單位時間內(nèi)從單位面積內(nèi)皮細胞單層上濾出的液體量，可間接反映內(nèi)皮細胞單層通透性，Jv值越大，通透性越高；Kf是內(nèi)皮細胞單層通透性的參數(shù)，直接反映內(nèi)皮細胞單層通透性，Kf值越大，通透性越高；σ值指滲透壓反射系數(shù)，反映的是內(nèi)皮單層對大分子物質的通透性，σ值越小，通透性越高。結果如表2所示。
表2白藜蘆醇對PARA所致人臍靜脈內(nèi)皮細胞的ECMP增加的保護作用(
)
注與A組比較**P＜0.01，*P＜0.05；與C組比較##P＜0.01，#P＜0.05 從表2可以看出，PARA對照組的ECMP顯著性升高，各白藜蘆醇保護組劑量依賴性地抑制PARA引起的ECMP升高，以白藜蘆醇高劑量保護組(白藜蘆醇濃度為10mg/mL)作用最顯著，白藜蘆醇高劑量保護組的Jv、Kf、σ值與PARA對照組比較，存在顯著性差異(P＜0.05)。
2.2細胞培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶(SOD)、脂質過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)及NO含量的測定 取不同處理組給藥30min后的細胞培養(yǎng)液(含有15％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基及各組藥物)100μL，按試劑盒說明分別檢測SOD活性、MDA及NO的含量。結果如表3所示。
表3白藜蘆醇對細胞培養(yǎng)液中生化指標的影響(
)
注與A組比較**P＜0.01，*P＜0.05；與C組比較##P＜0.01，#P＜0.05 從表3可以看出，PARA導致了細胞培養(yǎng)液中MDA含量顯著性升高，SOD活性和NO含量顯著降低，且與正常對照組比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；各白藜蘆醇保護組劑量依賴性地抑制PARA的損傷作用，以白藜蘆醇高劑量保護組(白藜蘆醇濃度為10mg/mL)作用最顯著，白藜蘆醇高劑量保護組的MDA、SOD、NO值與PARA對照組比較，存在顯著性差異(P＜0.05)。
2.3白藜蘆醇對內(nèi)皮細胞凋亡率的影響 將106個內(nèi)皮細胞與各組藥物共孵12h后，棄去培養(yǎng)液，收集106個細胞，生理鹽水洗2遍，加入100％的冰乙醇固定24h，PBS洗2遍，1％RNA酶37℃消化30min，50mg/L PI染色，流式細胞儀檢測，以低于G1期DNA含量主峰(亞G1期峰)的細胞為凋亡細胞。結果如表4所示。
表4.流式細胞儀檢測白藜蘆醇對內(nèi)皮細胞凋亡率的影響(
)
注與A組比較**P＜0.01，*P＜0.05；與C組比較##P＜0.01，#P＜0.05 從表4可以看出，PARA對照組明顯導致了內(nèi)皮細胞凋亡；各白藜蘆醇保護組明顯抑制PARA導致的內(nèi)皮細胞凋亡，以白藜蘆醇高劑量保護組(白藜蘆醇濃度為10mg/mL)作用最顯著。
從以上各試驗例可以看出，白藜蘆醇能抑制有機磷農(nóng)藥(如對氧磷)所致的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應降低，有較好的劑量依賴性；還能保護血管內(nèi)皮細胞的活性、阻滯有機磷農(nóng)藥(如對氧磷)所致血管內(nèi)皮細胞通透性的升高和形態(tài)學的改變、減少細胞凋亡。白藜蘆醇對有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷具有很好的抑制和保護作用，用于制備防治有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的藥物；還可以用于制備預防和治療由有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)的疾病的藥物。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明、具體實施方案以及試驗例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，所屬領域的普通技術人員可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.白藜蘆醇在制備防治有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的藥物中的應用。
2.白藜蘆醇在制備預防和治療因有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)的疾病的藥物中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述疾病為血管性疾病。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的應用，其特征在于，所述血管性疾病為大動脈炎、動脈粥樣硬化、高血壓或糖尿病血管病變。
全文摘要
本發(fā)明提供了白藜蘆醇在制備防治有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的藥物中的應用，還提供了白藜蘆醇在制備預防和治療因有機磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)的疾病的藥物中的應用。本發(fā)明經(jīng)藥理試驗驗證，白藜蘆醇能抑制有機磷農(nóng)藥所致的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應降低，有較好的劑量依賴性；具有保護血管內(nèi)皮細胞活性、阻滯對氧磷所致血管內(nèi)皮細胞通透性升高和形態(tài)學改變的作用；并且能保護內(nèi)皮細胞釋放NO的功能和超氧化物歧化酶的活性、減少脂質過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛的含量。
文檔編號A61P3/10GK101810599SQ20101014867
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權日2010年4月16日
發(fā)明者李鵬, 尹雅玲, 詹合琴, 盧光洲, 梁金英, 朱茉莉, 趙繁榮, 張玉林 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學院