專利名稱：一種藥物組合物在制備保護(hù)胰島β細(xì)胞功能藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種藥物組合物在制備保護(hù)胰島β細(xì)胞功能藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2型糖尿病(T2DM)是嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。國際糖尿病聯(lián)合會(IDF) 2006發(fā)表的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在過去20年，全球糖尿病患者人數(shù)從3000萬劇增到 2. 3億。世界衛(wèi)生組織專家預(yù)計(jì)，到2025年全球糖尿病患者將達(dá)到3. 5億。印度、中國、美國依次為全球糖尿病患者數(shù)量最多的三個國家，估計(jì)中國糖尿病患者總?cè)藬?shù)近4000萬，僅次于印度，居世界第二位，占世界的四.63%。T2DM的防治在可預(yù)見的相當(dāng)長時(shí)期內(nèi)都將是人類面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。2型糖尿病也叫成人發(fā)病型糖尿病，多在35 40歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90% 以上。2型糖尿病病友體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并非完全喪失，有的患者體內(nèi)胰島素甚至產(chǎn)生過多，但胰島素的作用效果卻大打折扣，因此患者體內(nèi)的胰島素可能處于一種相對缺乏的狀態(tài)。可以通過某些口服藥物刺激體內(nèi)胰島素的分泌。但到后期仍有部分病人需要像1型糖尿病那樣進(jìn)行胰島素治療。2型糖尿病大致具有以下3個特點(diǎn)第一個特點(diǎn)，2型糖尿病好發(fā)于成年人，尤其以中老年人為多。多次糖尿病流行病學(xué)研究結(jié)果都表明，2型糖尿病發(fā)病的年齡多在40-60歲，從40歲起，患病率逐漸增加，到老年期達(dá)到高峰。青年發(fā)病的成年型糖尿病相對來說，還是十分少見的。第二個特點(diǎn)是病情一般比較緩和、隱蔽，也就是說與1 型糖尿病相比，不那么來勢洶洶。2型糖尿病病人癥狀不明顯，不見得每個患者都有喝得多、 尿得多、吃得多的表現(xiàn)，多數(shù)人也沒有顯著的消瘦，當(dāng)然體力和體重不同程度地下降還是比較常見的。第三個特點(diǎn)就是患者往往不需要靠胰島素治療來維持生命。也就是說，患者不打胰島素也不至于很快就發(fā)生酮癥酸中毒而危及生命。所以，2型糖尿病原來又叫非胰島素依賴型糖尿病。2型糖尿病病人有時(shí)也需要使用胰島素治療，但多數(shù)是因?yàn)檠强刂撇焕硐耄?或者是因?yàn)榘l(fā)生了急性并發(fā)癥或者糖尿病的慢性并發(fā)癥較重，而不像1型糖尿病病人那樣是為了維持生命。2型糖尿病是比1型糖尿病更為復(fù)雜的疾病，特別是在早期體內(nèi)胰島素仍然能自我產(chǎn)生時(shí)卻更容易治療。由于早期癥狀輕微(如無酮癥酸中毒和昏迷等)且多散發(fā)，因此 2型糖尿病多在病情進(jìn)展多年后方被診斷。然而，2型糖尿病的控制不當(dāng)會導(dǎo)致諸如腎衰、 失明、傷口愈合慢、動脈病(包括冠狀動脈疾病)等嚴(yán)重的并發(fā)癥。2型糖尿病患者其主要特征為胰島素抵抗，相對胰島素缺乏和高血糖；肝臟葡萄糖產(chǎn)量的增加(如來源于肝糖原的降解)，特別是在不當(dāng)時(shí)機(jī)的增加(典型的原因是胰島素水平紊亂，而胰島素的作用之一正是調(diào)控肝臟此功能)；肌肉和脂肪組織(主要)中胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的減少(受體和受體后途徑缺陷)；胰島β細(xì)胞功能受損——缺失了高血糖水平刺激時(shí)早期胰島素釋放的功能。
胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的控制機(jī)體能量平衡的最重要激素。胰島β細(xì)胞能感應(yīng)血糖濃度的高低及變化，并通過迅速釋放胰島素將血糖濃度控制在適當(dāng)范圍。胰島β 細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性。它的功能除了隨著誘導(dǎo)物的本質(zhì)、量及攝入途徑而變化外，還隨胰島素敏感性而改變。胰島β細(xì)胞功能保護(hù)的臨床與基礎(chǔ)研究為2型糖尿病的防治提供了新的思路。有效中藥保護(hù)β細(xì)胞功能對于延緩糖尿病的發(fā)生和控制糖尿病病程的進(jìn)展有十分重要的意義。動物實(shí)驗(yàn)和人體研究均發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞凋亡增加可能是T2DM胰島B細(xì)胞分泌胰島素功能不足的主要原因，提示胰島β細(xì)胞凋亡增加同樣可能在糖脂毒性導(dǎo)致胰島B胞功能障礙的過程中發(fā)揮著重要作用，新近的研究表明，胰島細(xì)胞凋亡增加確實(shí)在糖脂毒性導(dǎo)致高脂肥胖大鼠胰島β細(xì)胞分泌功能不足中起著重要作用。近年來，隨著對細(xì)胞凋亡發(fā)病機(jī)制研究的深入，越來越多的研究證實(shí)，線粒體不僅是細(xì)胞能量代謝的調(diào)控中心，而且在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，多種促凋亡因素可以引起線粒體損傷，啟動細(xì)胞凋亡的線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在線粒體凋亡通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道(permeability transitionpore, PTP)開放，使水和溶質(zhì)由胞質(zhì)進(jìn)入線粒體基質(zhì)，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹。腫脹的線粒體基質(zhì)使內(nèi)膜膨脹，內(nèi)膜的皺褶被展開，加之線粒體外膜表面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于內(nèi)膜，線粒體外膜因此而破裂，釋放出線粒體膜間隙中的各種促凋亡蛋白。發(fā)明人通過對糖敏靈深入的研究，意外的發(fā)現(xiàn)糖敏靈可以保護(hù)胰島β細(xì)胞功能， 為糖敏靈新的治療用途提供了依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種藥物組合物在制備保護(hù)胰島β細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的藥物組合物(又稱為糖敏靈制劑，開郁清熱制劑)，由下列重量份的中藥原料藥為組方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳實(shí)3-15份、生大黃1_6份， 半夏1-12份、黃芩3-15份、黃連1-12份、白芍3-15份、烏梅5-20份。上述組方中還可以加入中藥山楂，得到的配方為天花粉10-30份、柴胡10-30份、 枳實(shí)3-15份、生大黃1-6份，半夏1-12份、黃芩3-15份、黃連1_12份、白芍3-15份、烏梅 5-20份、山楂3-15份。上述組方中還可以加入中藥山楂，黃精，人參和苦瓜，得到的配方為天花粉 10-30份、柴胡10-30份、枳實(shí)3-15份、生大黃，1-6份，半夏1-12份、黃芩3-15份、黃連1_12 份、白芍3-15份、烏梅5-20份、山楂3-15份、黃精3_15份、人參3_15份、苦瓜3_15份。優(yōu)選的本發(fā)明的配方為天花粉9份、柴胡12份、枳實(shí)9份、生大黃3份，半夏6份、 黃芩9份、黃連6份、白芍9份、烏梅9份。或天花粉30份、柴胡12份、枳實(shí)9份、生大黃3份，半夏6份、黃芩9份、黃連6份、 白芍9份、烏梅15份、山楂9份?；蛱旎ǚ?0份、柴胡12份、枳實(shí)9份、生大黃3份，半夏6份、黃芩9份、黃連6份、 白芍9份、烏梅15份、山楂9份、黃精9份、人參9份、苦瓜9份。
以上組成中，重量是以生藥計(jì)算的，份為重量份，若以克為單位，以上組成可制成藥物制劑5-50個制劑單位，所述制劑單位指，制成的成品藥物制劑，如制成固體制劑5-50 單位，口服液5-50ml等。以上組成可制成1-6次服用劑量的制劑，如作為片劑，制成18片，每次服用劑量可以是3-18片，共可服用1-6次。如作為顆粒劑，制成6袋，每次服用1-2袋，共可服用3-6次。以上組成是按重量份作為配比的，在生產(chǎn)時(shí)可按照相應(yīng)比例增大或減少，如大規(guī)模生產(chǎn)可以以公斤為單位，或以噸為單位，小規(guī)模生產(chǎn)也可以以毫克為單位，重量可以增大或者減小，但各組成之間的生藥材重量配比的比例不變。以上重量配比的比例是經(jīng)過科學(xué)篩選得到的，對于特殊病人，如重癥或輕癥，肥胖或瘦小的病人，可以相應(yīng)調(diào)整組成的量的配比，增加或減少不超過300%，藥效不變。以上組成中的單味中藥，尤其是臣藥和佐藥，也可以被適當(dāng)?shù)木哂邢嗤幮缘闹兴幪鎿Q，替換后的中藥制劑其藥物作用不變。本發(fā)明的中藥組合物，是通過將上述配方組成的中藥原料經(jīng)過提取或其他方式加工，制成藥物活性物質(zhì)，隨后，以該物質(zhì)為原料，需要時(shí)加入藥物可接受的載體，按照制劑學(xué)的常規(guī)技術(shù)制成的。所述活性物質(zhì)可以通過分別提取中藥原料得到，也可以通過共同提取中藥原料得到，也可以通過其他方式得到，如通過粉碎、壓榨、煅燒、研磨、過篩、滲漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、層析等方法得到、這些活性物質(zhì)可以是浸膏形式的物質(zhì)，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根據(jù)制劑的不同需要決定制成不同的濃度。本發(fā)明的中藥組合物中的藥物活性物質(zhì)，其在制劑中所占重量百分比可以是 0. 1-99.9%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每衣寸。本發(fā)明的中藥組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、 薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制劑，優(yōu)選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、
丹劑、膏劑等。本發(fā)明的中藥組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時(shí)可對片劑進(jìn)行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合可使活性物質(zhì)分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑， 或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉齊U、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的中藥組合物，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA 二鈉、EDTA鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、 麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的組合物在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次 1-20劑，如1-20袋或?；蚱?。本發(fā)明的組合物是經(jīng)過以下方法制備，具體步驟如下本發(fā)明所述糖敏靈制劑的制備方法為(1)按比例取上述原料，( 加入4倍量 70-90%的乙醇，50-80°C減壓回收乙醇，70-90°C真空干燥，粉碎過80目篩，得藥物提取物； 加入輔料制成任意種藥劑學(xué)上可以接受的劑型。本發(fā)明的藥物組合物及其制備方法可參考中國專利CN1M6929。通過以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明的藥物組合物的治療效果。1.材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)動物以自發(fā)性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠和其同系非糖尿病對照鼠LETO鼠為實(shí)驗(yàn)對象。大鼠皆為雄性，OLETF 40只，LETO大鼠10只，四周齡，由日本大冢制藥株式會社德島研究所引進(jìn)。大鼠在無特定病原體級(SPF級，specific pathogen-free)條件下單籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料。環(huán)境溫度控制在22-25°C，濕度為55士5%，12/12小時(shí)光照黑暗循環(huán)(光照時(shí)間7:00-19:00)，自由獲取食物和飲水。飼養(yǎng)地點(diǎn)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物飼養(yǎng)房。1. 2分組及給藥1. 2. 10LETF糖尿病診斷分組標(biāo)準(zhǔn)大鼠定期行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。試驗(yàn)前隔夜禁食15小時(shí)、不禁水，按2g/ kg予30 %葡萄糖溶液灌胃(取葡萄糖粉82. 5g，加蒸餾水定容至250ml，加熱溶解為清亮液體，得到濃度為30%葡萄糖溶液)。于空腹及糖負(fù)荷后30、60、90和120min取血，以德國內(nèi)卡BI0SEN5030快速葡萄糖分析儀測定血糖值。血糖峰值> 16. 7mmol/L和負(fù)荷后120min血糖> 11. lmmol/L診為糖
6尿病，具備上述一條者為糖耐量減低。1.2.2實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥至30周時(shí)，共有成模OLETF鼠27只，隨機(jī)分為模型組、羅格列酮組、糖敏靈組， LETO為空白對照組。羅格列酮組羅格列酮(文迪雅)史克必成天津有限公司產(chǎn)品每片含馬來酸羅格列酮細(xì)g，購自由美國葛蘭素史克(中國)投資有限公司，臨用前攪拌至完全溶解，以蒸餾水稀釋，給藥劑量為ang/kg/cf1。糖敏靈組(即開郁清熱組)，采用本發(fā)明實(shí)施例1的配方配制成浸膏，4°C冰箱保存，以蒸餾水稀釋，灌胃劑量為tog/kg/cf1 (按所含原藥材量計(jì)算)。模型組與空白組以等量蒸餾水灌胃，各組均灌胃給藥12周，每日1次。2指標(biāo)與檢測2. 10GTT同步胰島素釋放大鼠隔夜禁食，不禁水，稱重后以2%的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，麻醉顯效后，切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織及肌肉，分離暴露右側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸內(nèi)或頸外靜脈，進(jìn)行右側(cè)頸總動脈和左側(cè)頸內(nèi)或頸外靜脈插管，穿線結(jié)扎，固定(美國產(chǎn)硬膜外麻醉用硅膠導(dǎo)管，內(nèi)徑0. 6mm，外徑Imm)，并用含肝素50U/ml的生理鹽水充滿導(dǎo)管， 保持其通暢。動脈插管以取血測血糖，靜脈插管連接小三通管，出口端與靜脈相連，兩進(jìn)口端分別與微電腦數(shù)字式微量注射泵連接以輸注胰島素及葡萄糖。插管完畢后，將大鼠靜置 30分鐘后測定血糖。并同時(shí)對其進(jìn)行保溫。胰島素、20%葡萄糖分別用2個微電腦數(shù)字式微量注射泵由頸靜脈泵入，血液標(biāo)本由頸動脈導(dǎo)管獲取。將靜置30分鐘的插管大鼠頸動脈導(dǎo)管所接的注射器取下，取血一滴，用微型血糖儀在30s內(nèi)測定基礎(chǔ)血糖值。開始時(shí)先恒定輸注短效豬胰島素(輸注速率為8mU/kg · mirT1，臨用時(shí)胰島素用 0. 5%牛血清白蛋白稀釋)。每10分鐘測定血糖一次，當(dāng)血糖值超出基礎(chǔ)值士0. 5mmol/L的范圍時(shí)，即開始輸注濃度為20%葡萄糖，調(diào)整葡萄糖輸注速度(即葡萄糖輸注率，GIR)，使血糖值控制在基礎(chǔ)值士0. 5mmol/L的范圍左右，如果血糖值超出基礎(chǔ)值士0. 5mmol/L的范圍，即可繼續(xù)輸注葡萄糖。輸注葡萄糖后仍每10分鐘測一次血糖，并根據(jù)血糖值在最短的時(shí)間內(nèi)調(diào)整葡萄糖輸注率，使血糖恢復(fù)到基礎(chǔ)值士0. 5mmol/L的范圍內(nèi)。如此反復(fù)進(jìn)行，當(dāng)連續(xù)三次血糖值均穩(wěn)定在上述范圍內(nèi)，即達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。將鉗夾的處于穩(wěn)態(tài)的三個(HR值 (單位為mg · kg"1 · mirT1)求平均值。該指標(biāo)用于判斷是否存在頂及頂?shù)某潭取?. 2糖敏靈對實(shí)驗(yàn)大鼠胰島細(xì)胞胰島素表達(dá)的影響選用各組大鼠胰腺組織常規(guī)石蠟包埋，用SAKURA石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)石蠟切片， 厚度4微米連續(xù)取四張鄰片進(jìn)行展片，分別用于HE染色、免疫組化檢測。取胰腺組織切片，用豚鼠抗豬胰島素抗體1 100，胰高糖素抗體1 100進(jìn)行β 細(xì)胞，α細(xì)胞染色。二抗EnVisionTM系統(tǒng)，DAB顯色液(所有試劑均為DAKO公司產(chǎn)品)Envision 操作程序脫蠟，水化組織切片。蒸餾水漂洗，置于TBS中。滴加0. 3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵育15分鐘。
蒸餾水漂洗，置于TBS中5分鐘Χ3次。
一抗孵育2小時(shí)
TBS漂洗TBS中5分鐘Χ3次
滴加EnvisionTM孵育60分鐘。
TBS漂洗5分鐘Χ3次。
色源DAB溶液顯色3分鐘，蒸餾水終止顯色。
梯度酒精脫水，封片膠封片。
顯微鏡下觀察結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)時(shí)同時(shí)設(shè)陰性對照，采用TBS代替一抗作為空白陰性對照。
結(jié)果判定胰島細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。
圖像分析北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部圖像分析中心。
2. 3糖敏靈對實(shí)驗(yàn)大鼠胰島B細(xì)胞凋亡率的影響
胰島B細(xì)胞凋亡原位術(shù)端標(biāo)記法(TUNEL)檢測凋亡細(xì)胞(Roche公司)。凋亡細(xì)胞核 染深棕色，同時(shí)對照連續(xù)切片中胰島素染色陽性的細(xì)胞定為凋亡的B細(xì)胞。每個胰
島中B細(xì)胞的凋亡率=每個胰島中B細(xì)胞的凋亡數(shù)/該胰島中B細(xì)胞的總數(shù)X 100%，每張切片選取5個胰島，分別計(jì)算凋亡率后取平均值作為該樣本胰島B細(xì)胞的凋亡率。2. 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測大鼠胰腺caseaspe3 mRNA表達(dá)的影響主要儀器GeneAmp 5700TaqMAN PCR 儀美國 Applied Biosystems 公司凝膠圖像分析儀ImageMaster VDS 美國 pharmacia Biotech 公司高速冷凍離心機(jī)德國BACKMAN 公司 Allagra. 21R Centrifcige紫外線分光光度計(jì)德國BACKMAN公司而640型電泳儀北京六一儀器廠OYY-II1-5型主要試劑Trizol (Invitrogen)RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)引物采用primer premier5. 0設(shè)計(jì)，由賽百盛公司合成。2. 4. 1從組織中提取總RNA 取約IOOmg組織加Iml Trizol后，研磨至組織完全破碎、液體粘稠，室溫放置5 分鐘，使其充分裂解。 按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，搖勻15秒，室溫放置15分鐘?！?4"C 12000g 離心 15 分鐘。 吸取上層水相，至另一個預(yù)冷的離心管中。 按0. 5ml異丙醇/ml Trizol加入異丙醇(預(yù)冷)混勻，室溫放置5-lOmin。· 4°C 12000g離心lOmin，棄上清，RNA沉于管底。 按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇(預(yù)冷)，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀。· 4"C 7500g離心5min，盡量棄上清。
室溫晾干 5-10min。 用 50 μ 1 RNase-free H2O,溶解 RNA 樣品，55_60°C IOmin0 測0. D值定量RNA濃度。2. 4. 2分光光度法測定核酸的濃度帶氬燈的分光光度計(jì)，使用前預(yù)熱穩(wěn)定15分鐘。 吸取6 μ 1 RNA樣品，加水至1. 5ml混勻后，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。 分光光度計(jì)先用Iml水校正零點(diǎn)。 在260nm和280nm分別讀出光密度，RNA樣品的濃度為0擬60*核酸稀釋倍數(shù) *40/1000 ；濃度單位為μ g/μ 1。2. 4. 3RNA樣品反轉(zhuǎn)錄 取出RNA模板、試劑，于室溫融化后，立即放在冰浴中，混旋器上混勻，短暫離心。眷模板變性Template RANχ ul (5. Oug)Oligo(dT)18primer 0. 5ug/ul 1. OulDEPC處理過的水至12. Oul混勻，短暫離心，70°C溫浴10分鐘，立即放在冰浴中至少1分鐘。 配制反應(yīng)混合液(每管按下述量配制)5Xreaction buffer4. OulIOmMdNTPMix2. OulRNase Inhibitor (20U/ul) 1.Oul混合液配制量為樣品數(shù)N+2。 每管加7. OuL的上述混合液混勻。37°C溫浴5分鐘。 每管加入 1. OuL M-MuLV Reverse Transciptase (200u/uL)，42°C溫浴 60 分鐘， 70°C溫浴10分鐘。_20°C保存?zhèn)溆谩?. 4. 4熒光定量PCR檢測 引物及試劑SYBR Green PCR Master Mix :ABI(Applied Biosystems)，Catalog No. 43049155 引物序列β -actin-FP :5，-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3，β -actin-RP :5，-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CC-3，擴(kuò)增片段為 ^3bp。Casepase3上游5'-AAT TCAAGG GAC GGG TCATG-3'下游5'-GCT TGC GCG TAC AGT TTC-3'擴(kuò)增片段為 475bp 引物稀釋將引物按終濃度lOpmol/ul進(jìn)行稀釋，具體方法為V (ul)= 0. D.值X33ug/10M(V =所需DEPC處理水體積，M =引物分子量) 反應(yīng)混合液的配制取出2 X Buffer，RNase-free water, cDNA放在室溫中，融化，立即放在冰浴中，混旋器上混勻，短暫離心。0131 ]每人份混合液(反應(yīng)體系V = 25!
0132]Component Volnme
0133]2 X SYBR Green PCR Master Mix,
0134]χχχ-F primer(lOpmol/ul)
0135]xxx-R primer(lOpmol/ul)
0136]Nuclease-free H2O
0137]Total Volume
25ul)所含試劑見下表
12. 5ul Iul Iul 8. 5ul 23ul
0138]配好混合液后，每個反應(yīng)管中加入23ul混合液。
0139] 加樣每個反應(yīng)管加入2. Oul cDNA模板，混旋器上混勻，短暫離心(小于kec)。
0140] 在GeneAmp 5700熒光定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件如下
0141]95. O0C =IOmin
0142]72. O0C :50sec72. 0°C :5min以上反應(yīng)設(shè)定均在與PCR儀相連的計(jì)算機(jī)上進(jìn)行，每個循環(huán)電腦自動記錄反應(yīng)管中的熒光信號值，并描繪曲線。反應(yīng)結(jié)束由PE 5700軟件分析結(jié)果，自動計(jì)算定量數(shù)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以內(nèi)參基因與目的基因的Ct值比值作為目的基因的mRNA相對表達(dá)量，(因?yàn)镃t值與實(shí)際表達(dá)量成反比關(guān)系，為了直觀，我們在分析數(shù)據(jù)時(shí)將目的基因與 Beta-actin的Ct值比值取倒數(shù)，也就是Beta_actin與目標(biāo)基因的Ct值比值作為其mRNA 的相對表達(dá)量)2. 5胰腺組織石蠟切片細(xì)胞色素C免疫組化染色石蠟切片二甲苯I、II脫蠟各15分鐘，梯度酒精即出即入至水；流水浸洗5分鐘；0. 3 %的H2O2溶液氧化15分鐘；流水浸洗5分鐘，PBS洗5分鐘X 3次；滴加適當(dāng)稀釋的1 100細(xì)胞色素C 一抗，4°C冰箱孵育過夜；PBS 洗 5 分鐘 X3 次；滴加1 400生物素標(biāo)記二抗，濕盒中留置1. 5小時(shí)(室溫)；PBS 洗 5 中 X3 次；DAB溶液顯色2分鐘；流水浸洗5分鐘；梯度酒精脫水，二甲苯I、II透明各15分鐘；DPX 封片；2. 6糖敏靈對實(shí)驗(yàn)大鼠胰島B細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 取大鼠新鮮胰腺組織各5塊，立即固定于2. 5 % (體積分?jǐn)?shù))戊二醛溶液，再用1 % (體積分?jǐn)?shù))鋨酸固定。丙酮梯度脫水，Epon812包埋。半薄切片定位胰島后做超薄切片色。JBVI-1230型透射電鏡觀察。2. 7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS16. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(無土表
示，服從正態(tài)分布的兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，多組間比較采用方差分析。3 結(jié)果OGTT胰島素同步釋放試驗(yàn)見表1，大鼠口服糖耐量試驗(yàn)同步測胰島素分泌及曲線下面積的變化，模型組 OGTT同步胰島素曲線下面積大于LETO組，結(jié)合正糖鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示模型組存在著較明顯的胰島素抵抗，經(jīng)開郁清熱中藥以及羅格列酮治療后，兩組胰島素曲線下面積顯著增加，提示兩組對胰島B細(xì)胞胰島素分泌功能有較好的改善作用。表142W各組OGTT各時(shí)點(diǎn)胰島素(ng/ml)及AUC (ng · min/ml)變化
0306090120AUC OF Ins1,08 士3.25士3.51士2.81 士1.88土10.98 +LETO0.230.760.530.690.441.932.29士3.77士4.57土4.33 士3.09士15.21士模型組2.2產(chǎn)0.460.691.210.841.111.83士4.97士5.49土4.26 士2.82士19.11士開郁清熱0.760.771.211.110.992.98**2.03 士4.67士5.22士4.51 士3.02土17.95土羅格列酮0.871.620.771.510.792.57*表M2W實(shí)驗(yàn)各組胰島素分泌指數(shù)比較(ng/mmol)
LETO模型組幵郁清熱羅格列酮例數(shù)(N)88910Λ 130/ Δ G30367.7±66.398.6±16.9##330.5±54.5", Η<氺 264.1 ±47.7注與正常組比較##P<0. 01，#P< 0.05 ；與模型組比較 **P < 0. 01，*P < 0. 05 ；42W時(shí)通過OGTT同步的胰島素釋放試驗(yàn)，我們計(jì)算了胰島素分泌指數(shù)(ΔΙ30/ Δ G30)，結(jié)果見表2，顯示模型組較LETO明顯下降，而開郁清熱與羅格列酮組較模型組明顯上調(diào)，開郁清熱組優(yōu)于羅格列酮糖敏靈對實(shí)驗(yàn)大鼠胰島形態(tài)的影響胰腺在LETO組胰島數(shù)目較多，胰島分布均勻，大小一致。呈著色淺淡的細(xì)胞團(tuán)，輪廓清楚，胰島細(xì)胞排列整齊、大小一致，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，胞漿豐富呈淡粉色，胰島內(nèi)末見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤。模型組胰腺，胰島萎縮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞大小不等，排列不規(guī)則，大鼠胰島體積明顯增加，多數(shù)胰島增生并纖維化，胰島呈不規(guī)則圓形，纖維組織增殖穿插生長于胰島細(xì)胞團(tuán)之間。中藥組和西藥組與模型相比均有明顯改觀。糖敏靈對實(shí)驗(yàn)大鼠胰島細(xì)胞胰島素表達(dá)的影響胰島素免疫組化染色結(jié)果顯示表達(dá)胰島素的免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒， 存在β細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。LETO組胰島素染色陽性β細(xì)胞位于胰島中央部，染色較深，模型組胰島素染色陽性β細(xì)胞數(shù)量明顯減少，染色較淺，且散在分布。開郁清熱組和羅格列酮組胰島素染色陽性β細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，但仍然較正常組減少(見

圖1)。定量分析結(jié)果顯示與LETO組相比，模型組(Ρ<0.01)胰島素染色陽性的細(xì)胞面積和積分下吸光度顯著低于正常組，開郁清熱組與羅格列酮組均有不同程度改善。(見圖 2)表3糖敏靈對OLETF大鼠胰島素表達(dá)的影響(0D F 士 S )
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物在制備保護(hù)胰島β細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物組合物山下列重量份的中藥原料藥為組方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳實(shí)3-15份、生大黃1-6份，半夏1-12份、黃芩3-15份、黃連1-12份、白芍3_15份、烏梅5_20份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，藥物組合物組方中還可以加入中藥山楂， 得到的配方為天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳實(shí)3-15份、生大黃1_6份，半夏1_12份、 黃芩3-15份、黃連1-12份、白芍3-15份、烏梅5_20份、山楂3_15份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，藥物組合物組方中還可以加入中藥山楂， 黃精，人參和苦瓜，得到的配方為天花粉10-30份、柴胡10-30份、枳實(shí)3-15份、生大黃， 1-6份，半夏1-12份、黃芩3-15份、黃連1-12份、白芍3_15份、烏梅5_20份、山楂3_15份、 黃精3-15份、人參3-15份、苦瓜3-15份。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，藥物組合物組方為天花粉9份、柴胡12 份、枳實(shí)9份、生大黃3份，半夏6份、黃芩9份、黃連6份、白芍9份、烏梅9份。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，藥物組合物組方為天花粉30份、柴胡12 份、枳實(shí)9份、生大黃3份，半夏6份、黃芩9份、黃連6份、白芍9份、烏梅15份、山楂9份。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，藥物組合物組方為天花粉30份、柴胡12 份、枳實(shí)9份、生大黃3份，半夏6份、黃芩9份、黃連6份、白芍9份、烏梅15份、山楂9份、 黃精9份、人參9份、苦瓜9份。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物對胰島β細(xì)胞的保護(hù)表現(xiàn)在對胰島素分泌的量和分泌的模式上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物通過對胰島素分泌模式的保護(hù)，進(jìn)而改善糖耐量，并且具有提示胰島功能的變化趨勢。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物對胰島β細(xì)胞保護(hù)作用與保護(hù)、修復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)以及功能有關(guān)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物通過保護(hù)胰島β細(xì)胞，治療和預(yù)防2型糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種藥物組合物在制備保護(hù)胰島β細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物組合物由下列重量份的中藥原料藥為組方配制而成天花粉5-40份、柴胡10-30份、枳實(shí)3-15份、生大黃1-6份，半夏1-12份、黃芩3-15份、黃連1-12份、白芍3-15份、烏梅5-20份。
文檔編號A61P3/10GK102233074SQ20101015631
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者仝小林, 周水平, 常柏, 甄重 申請人:天津天士力制藥股份有限公司