專利名稱：Mtdh基因疫苗及其在制備乳腺癌生長抑制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及MTDH基因疫苗，以及MTDH基因疫苗在制備乳腺癌生長抑制劑中的應用。
背景技術：
乳腺癌是女性中非常常見的癌癥類型之一，據(jù)報道，其死亡率在所有腫瘤中為第一位。2009年，在美國約有192370人被診斷出患有乳腺癌，其中40170人死于乳腺癌[1]。 還有報道，超過40%的乳腺癌女性患者被診斷出腫瘤轉移[2]。目前乳腺癌的治療方案包括手術切除原發(fā)病灶，區(qū)域淋巴結清掃術，激素治療以及放化療等等。然而，即使手術成功的切除原發(fā)病灶并輔以化療后，乳腺癌的復發(fā)率和死亡率仍然很高，研究分析認為可能是由于手術未能完全切除轉移灶以及腫瘤對化療藥物產生耐藥性等原因造成。因此，乳腺癌轉移和化療耐藥性是導致乳腺癌發(fā)病和死亡的最主要原因。基于目前已有的治療乳腺癌的手段及效果有限，本領域研究者認為迫切需要開發(fā)新的針對乳腺癌轉移和耐藥的治療策略和藥物。現(xiàn)有技術公開了基因疫苗(DNA vaccine)又稱核酸疫苗或DNA疫苗，是將編碼某種抗原的基因片段克隆到真核表達質粒，再用該質粒免疫動物，抗原編碼基因在宿主體內表達后，刺激機體產生體液免疫和細胞免疫應答?；蛞呙缱钤缡窃谛∈蠹∪饨M織內注射質粒DNA后，質粒及其攜帶的基因被小鼠肌細胞攝取，并在肌細胞內進行表達，小鼠可對此外源蛋白產生專一的免疫反應。之后基因疫苗受到了廣泛的關注并且發(fā)展迅速。最近幾年，基因疫苗在全世界范圍內受到越來越多的重視，成為國內外研究的熱點。與傳統(tǒng)的抗癌免疫治療相比，基因疫苗具有安全、有效、易制備、費用低廉、體內免疫記憶時間持久、保存運輸便捷等優(yōu)點。研究顯示，腫瘤基因疫苗可通過激活T細胞和/或抗體介導的針對腫瘤自身抗原的免疫反應，從而抑制腫瘤的生長[3]。根據(jù)該機制，目前已開發(fā)出若干種針對腫瘤特異性抗原(tumor-specific antigens,TSA)或者腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens, TAA)的基因疫苗[3]。基因疫苗載體表達的腫瘤抗原通常與免疫增強子偶聯(lián)，通過選擇不同的免疫增強子，幫助抗原激活不同類型的免疫反應。針對腫瘤的基因疫苗已經被報道對幾類癌癥有效，包括乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、神經母細胞瘤等等W-7]，也有一些疫苗已進入臨床試驗階段[3]，如針對黑色素瘤、結腸癌和前列腺癌的疫苗等等。然而，目前已知的許多潛在的腫瘤抗原，一般在正常細胞中都有表達。因此，通常針對這些抗原的基因疫苗在體內只能誘導很微弱的免疫反應，或者導致機體產生針對表達這些抗原的正常細胞的自身免疫反應?；谝陨显颍[瘤抗原的選擇對開發(fā)抗腫瘤基因疫苗來說至關重要。MTDH(Metadherin)/AEG-I (Astrocyte Elevated Gene-1)是一種細胞膜表面蛋白。Brown等通過噬菌體掃描技術發(fā)現(xiàn)該基因，并且發(fā)現(xiàn)該基因帶有肺定位區(qū)(Lung Homing Domain)，能夠促進乳腺腫瘤的肺轉移，如圖1所示[8]。乳腺癌組織中高表達該種基因而且能夠特異性的定植于肺，而體內預先應用MTDH抗體后，乳腺癌細胞肺轉移灶顯著減少，提示該基因在乳腺癌的肺轉移中起著重要的作用。
與本發(fā)明相關的現(xiàn)有技術有如下參考文獻1. Jemal A,Siegel R,Ward Ε,Hao Y,Xu J，Thun M J(2009)Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin 59:225-2492.Berkowitz N,Gupta S,Silberman G(2000)Estimates of the lifetime direct costs of treatment for metastatic breast cancer. Value Health 3 :23-303. Rice J, Ottensmeier C H, Stevenson F K(2008)DNA vaccines :precision tools for activating effective immunity against cancer. Nat Rev Cancer 8 108-1204. Xiang R, Lode H N, Chao T H, Ruehlmann J M, Dolman C S, Rodriguez F, Whitton J L, Overwijk W W,Restifo N P, Reisfeld R A(2000)An autologous oral DNA vaccine protects against murine melanoma. Proc Natl Acad Sci U S A 97 :5492-54975. Luo Y, Zhou H, Mizutani M, Mizutani N, Reisfeld R A, Xiang R(2003) Transcription factor Fos-related antigen lis an effective target for a breast cancer vaccine. Proc Natl Acad Sci U S A 100 :8850-88556. Pertl U, Wodrich H, Ruehlmann J M, Gillies S D, Lode H N, Reisfeld R A (2003)Immunotherapy with a posttranscriptionally modified DNA vaccine induces complete protection against metastatic neuroblastoma. Blood 101 :649-6547. Xiang R, Mizutani N, Luo Y, Chiodoni C, Zhou H, Mizutani M, Ba Y, Becker J C,Reisfeld R A(2005)A DNA vaccine targeting survivin combines apoptosis with suppression of angiogenesis in lung tumor eradication. Cancer Res 65 :553-5618. Brown D M, Ruoslahti E(2004)Metadherin, a cell surface protein in breast tumors that mediates lung metastasis. Cancer Cell 5 :365-3749. Hu G, Wei Y, Kang Y (2009)The multifaceted role of MTDH/AEG-lin cancer progression. Clin Cancer Res 15 :5615-562010. Hu G，Chong R A,Yang Q, Wei Y, Blanco M A,Li F, Reiss M，Au J L, Haffty B G, Kang Y(2009)MTDH activation by 8q22genomic gain promotes chemoresistance and metastasis of poor-prognosis breast cancer. Cancer Cell 15 :9-2011. Yoo B K, Emdad L, Su Z Z, Villanueva A, Chiang D Y, Mukhopadhyay N D, Mills A S, Waxman S, Fisher R A, Llovet J M, Fisher P B, Sarkar D(2009)Astrocyte elevated gene-lregulates hepatocellular carcinoma development and progression. J Clin Investll9 :465-47712. Yu C, Chen K, Zheng H, Guo X，Jia W, Li M, Zeng M, Li J, Song L (2009) Overexpression of astrocyte elevated gene~l(AEG-I) is associated with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)progression and pathogenesis. Carcinogenesis30 894-90113. Liu H, Song X, Liu C, Xie L, Wei L, Sun R(2009) Knockdown of astrocyte elevated gene-linhibits proliferation and enhancing chemo-sensitivity to cisplatin or doxorubicin in neuroblastoma cells. J Exp Clin Cancer Res 28:1914. Kikuno N,Shiina H,Urakami S,Kawamoto K,Hirata H,Tanaka Y,Place R F,Pookot D,Majid S，Igawa M，Dahiya R(2007)Knockdown of astrocyte-elevated gene-1 inhibits prostate cancer progression through upregulation of F0X03a activity. Oncogene 26 :7647-765515.Emdad L, Sarkar D，Su Z Z, Randolph A, Boukerche H, Valerie K, Fisher P B (2006)Activation of the nuclear factor kappaB pathway by astrocyte elevated gene-1 implications for tumor progression and metastasis.Cancer Res 66 1509-151616. Lee S G，Su Z Z，Emdad L，Sarkar D，F(xiàn)isher P B (2006) Astrocyte elevated gene-1(AEG-I) is a target gene of oncogenic Ha-ras requiring phosphatidyl inositol3-kinase and c-Myc. Proc Natl Acad Sci USA 103 17390-1739517. Lee S G，Su Z ZiEmdad L,Sarkar DiFranke T FiFisher P B (2008)Astrocyte elevated gene—lactivates cell survival pathways through PI3K_Akt signaling. Oncogene 27 :1114-112118. Sarkar DiPark E SiEmdad LiLee S G，Su Z Z，F(xiàn)i sher P B (2008)Molecular basis of nuclear factor-kappaB activation by astrocyte elevated gene-1. Cancer Res68 :1478-148419. Darji A, Guzman C A, Gerstel B, Wachholz P, Timmis K N, Wehland J, Chakraborty T，Weiss S(1997)Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. Cell 91:765-77520. Reisfeld R AiNiethammer A GiLuo YiXiang R(2004)DNA vaccines suppress tumor growth and metastases by the induction of anti-angiogenesis. Immunol Revl99 :181-19021.Xiang R，Luo Y，Niethammer A G，Reisfeld R A(2008)Oral DNA vaccines target the tumor vasculature and microenvironment and suppress tumor growth and metastasis. Immunol Rev 222 :117-12822. Luo Y，0，Hagan DiZhou H, Singh MiUlmer JiRei sfeld R A James Primus F， Xiang R(2003)Plasmid DNA encoding human carcinoembryonic antigen (CEA) adsorbed onto cationic microparticles induces protective immunity against colon cancer in CEA-transgenic mice. Vaccine 21 :1938-194723. Luo Y，Zhou HiMizutani MiMizutani NiLiu CiXiang R，Reisfeld R A(2005)A DNA vaccine targeting Fos-related antigen lenhanced by IL_18induces long-lived T—cell memory against tumor recurrence.Cancer Res 65:3419—342724. Luo Y，Zhou H，Krueger J，Kaplan C，Lee S H，Dolman C，Markowitz D，Wu W, Liu C，Reisfeld R A，Xiang R(2006)Targeting tumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cancer. J Clin Invest 116 :2132-214125. Cefai D， Morrison B W， Sckell A， Favre L, Balli M， Leunig M， Gimmi C D (1999)Targeting HER-2/neu for active-specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. Int J Cancer 83 :393-400
5
26. Esserman L JiLopez TiMontes RiBald L NiFendly B MiCampbell M J(1999) Vaccination with the extracellular domain of pl85neu prevents mammary tumor development in neu transgenic mice. Cancer Immunol Immunother 47 :337-34227.Granziero L,Krajewski S，F(xiàn)arness P，Yuan L, Courtney M K，Jackson M R， Peterson P A， Vitiello A(1999)Adoptive immunotherapy prevents prostate cancer in a transgenic animal model. Eur J Immunol 29:1127—113828. Niethammer A G， Xiang R， Becker J C， Wodrich H， Pertl U，Karsten G， Eliceiri B P，Reisfeld R A(2002)A DNA vaccine against VEGF receptor 2prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth. Nat Med 8:1369—137529. Loeffler M，Kruger J A，Niethammer A G，Reisfeld R A(2006)Targeting tumor-associated fibroblasts improves cancer chemotherapy by increasing intratumoral drug uptake. J Clin Invest 116 :1955-196230. Al-Hajj M, Wicha M S, Benito-Hernandez A, Morri son S J, Clarke M F(2003)Prospective identification of tumorigenie breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A 100 :3983-398831. Singh S KiHawkins CiClarke I D,Squire J AiBayani JiHide TiHenkelman R M，Cusimano M D，Dirks P B(2004)Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 432:396-40132.Croker A K，Goodale D，Chu J，Postenka C，Hedley B D，Hess D A，Allan A L(2008)High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. J Cell Mol Med 33.Ginestier C, Hur M H, Charafe-Jauffret E, Monville F, Dutcher J, Brown M，Jacquemier J，Viens P，Kleer C G，Liu S，Schott A,Hayes D，Birnbaum D，Wicha M S， Dontu G(2007)ALDHl is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell 1 :555-56734. Pappa A，Chen C，Koutalos Y，Townsend A J，Vasil iou V(2003) Aldh3alprotects human corneal epithelial cells from ultraviolet-and4-hydroxy-2 -nonenal-induced oxidative damage. Free Radic Biol Med 34:1178—118935. Sreerama L,Sladek N E(2001)Primary breast tumor levels of suspected molecular determinants of cellular sensitivity to cyclophosphamide,ifosfamide, and certain other anticancer agents as predictors of paired metastatic tumor levels of these determinants. Rational individualization of cancer chemotherapeutic regimens. Cancer Chemother Pharmacol 47 :255-262.

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制腫瘤，尤其是乳腺癌細胞生長的基因疫苗。具體涉及MTDH基因疫苗及其在制備乳腺癌生長抑制劑中的應用。目前已經有多種生物療法用于乳腺癌的臨床治療，例如細胞疫苗[25]，重組蛋白疫苗[26]，細胞移植免疫治療[27]以及基因疫苗[28]。費用低廉和體內記憶時間長是基因疫苗與其他生物療法相比具有的明顯優(yōu)勢?？谷巳轭^狀瘤病毒基因疫苗Gardasil在2006 年被美國FDA批準。也有一些針對其他癌癥的基因疫苗目前已經進入臨床研究[3]。然而， 基因疫苗仍面臨著諸如腫瘤特異性抗原的選擇，有效佐劑的選擇，免疫原性的提高以及體內所引起的副作用等等一系列的挑戰(zhàn)。此外，疫苗通常應用于預防疾病，目前大多數(shù)腫瘤疫苗應用于臨床治療腫瘤患者尚未成功。因此，治療型疫苗是將來基因疫苗的一個很有臨床應用價值的研究方向。另外，腫瘤疫苗與化療藥物聯(lián)合應用之前已有報道[29]。腫瘤的復發(fā)和對化療藥物的耐受是目前乳腺癌復發(fā)和死亡的重要原因?，F(xiàn)在普遍認為，腫瘤干細胞是腫瘤復發(fā)與廣泛耐藥的重要原因之一。到目前為止，已經有一系列的腫瘤干細胞特異性標志物被鑒定出來。CD44+CD24-細胞亞群屬于人乳腺癌的腫瘤干細胞 [30]。CD133+細胞亞群在人腦腫瘤中具有腫瘤干細胞的性質[31]。醛脫氫酶(ALDH)是參與干細胞自我保護的一類酶，也被認為屬于腫瘤干細胞標記物，能夠提高腫瘤細胞的化療耐藥性[32，33]。ALDH3A1編碼的醛脫氫酶具有保護細胞免受氧化損傷和清除自由基的能力[34]。它已作為一種臨床上確定腫瘤對環(huán)磷酰胺(在乳腺癌治療中傳統(tǒng)的化療藥物之一)的敏感性的重要指標[35]。胡國宏等人認為，MTDH上調ALDH3A1和MET在乳腺癌細胞中的表達；將ALDH3A1基因表達沉默后，能夠抑制MTDH介導的耐藥能力[10]。由于MTDH上調ALDH3A1的表達，而ALDH3A1是腫瘤干細胞的標志物，因此靶向MTDH可能可以消除癌癥患者體內的腫瘤干細胞。2009年，胡國宏等人的結果表明，MTDH基因在乳腺癌轉化、侵襲、轉移和耐藥等過程中具有重要作用，提示該基因是一個極有潛力的腫瘤治療的靶點[9]。已經證實，MTDH基因在乳腺癌、前列腺癌、神經母細胞瘤、肝癌、食管鱗狀細胞癌等腫瘤中高表達，并與其不良預后密切相關[10-14]。MTDH基因定位于人染色體8q22區(qū)，編碼蛋白為582個氨基酸，富含賴氨酸和絲氨酸殘基，翻譯后可被其他蛋白修飾，如賴氨酸殘基的乙酰化、泛素化修飾和絲氨酸、蘇氨酸殘基的磷酸化修飾。通過PII-Akt信號通路，原癌基因Ha-Ras能夠增強MTDH 基因的表達，這種調節(jié)主要是通過GSK3 β的磷酸化失活而穩(wěn)定c-Myc基因的表達并促進其結合到MTDH的啟動子上而實現(xiàn)的(Hu et al.，Clinical Cancer Research，2009)。在此基礎之上MTDH基因參與多條信號通路的調節(jié)，包括PII-Akt、NF- κ B、ffnt/ β -catenin等等信號通路，因而MTDH能夠調控細胞增殖、細胞存活、細胞浸潤以及增加細胞對化療藥物的耐受能力等[9，11，15-18]。NF-κ B通路的激活是通過MTDH蛋白與p65和轉錄激活因子 CBP的相互作用來實現(xiàn)的。MTDH通過增強MAPK家族的ERK和p38的活性，磷酸化GSK3 β 并穩(wěn)定β-catenin，從而激活Wnt/β-catenin信號通路；同時，MTDH能夠增強β-catenin 的轉錄輔助因子LEF-I的表達。另外，MTDH通過與一種未知內皮細胞受體相結合，增強腫瘤細胞粘附在內皮細胞上的能力，從而促進腫瘤的轉移。而且，MTDH通過調控一系列下游耐藥基因如ALDH3A1與MET，能夠增強腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性。本發(fā)明提供了一種抑制腫瘤生長的基因疫苗，該基因疫苗表達細胞膜表面蛋白Metadherin。該基因疫苗含有Metadherin編碼基因。MTDH(Metadherin)/ AEG-I (AstrocyteElevated Gene-I)是一種細胞膜表面蛋白。本發(fā)明的基因疫苗可以采用MTDH基因及其同源度70%以上具備且相同同功能的核酸序列。由于密碼子的簡并性，因此同源度85甚至70%以上的DNA序列會編碼同樣的多肽。例如，本發(fā)明的基因疫苗可以采用NCBI數(shù)據(jù)庫中Gene ID 92140的序列。本發(fā)明的基因疫苗可以減毒沙門氏菌為減毒菌株載體。本發(fā)明開發(fā)了一種新的基因疫苗，通過口服攜帶有MTDH基因的減毒沙門氏菌 (Salmonellatyphimurium, danTand AroAO達到抑制乳腺癌轉移的效果。該減毒沙門氏菌的dam—與AroA-基因突變，導致其毒性大大降低，利用它作為載體原核表達各種外源抗原已得到廣泛的研究并取得良好的免疫效果，已成為新型疫苗的重要免疫介質之一。該減毒沙門氏菌通過口服免疫小鼠后，可通過腸上皮細胞屏障，定位于派伊爾淋巴集結(Peyer patches)中。通過減毒沙門氏菌介導的EGFP基因疫苗可以定位到小鼠派伊爾淋巴集結 (Peyer patches) 0小鼠口服免疫攜帶EGFP基因的沙門氏菌后，在派伊爾淋巴集結(Peyer patches)中可觀察到綠色熒光(Reisfeld et al. , Immunological Reviews, 2004)。一般情況下，減毒沙門氏菌到達派伊爾淋巴集結后，聚集在此的(antigen presenting cells, APCs)吞噬侵入的沙門氏菌后被激活，活化的APC遷移至脾臟等淋巴組織，此時載體菌裂解，表達抗原基因的DNA載體進入胞液，然后進入抗原遞呈細胞的細胞核，表達目的抗原。之后，特異的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphcocyte, CTL) 被激活，裂解表達抗原的抗原遞呈細胞，抗原遞呈細胞內的抗原激活輔助T細胞并誘導抗體反應，至此細胞免疫和體液免疫均被激活(Reisfeld et al.，Immunological Reviews, 2004)。此外，減毒沙門氏載體菌的成分如脂多糖和DNA疫苗載體上的免疫刺激序列還可作為佐劑加強免疫應答。另外有報道證實，選擇泛素作為DNA疫苗載體上的免疫刺激序列時， 可以特異性地激活CD8+細胞毒性T淋巴細胞介導的免疫反應。實驗結果表明，MTDH基因疫苗能夠誘導機體產生⑶8+細胞毒性T淋巴細胞介導的針對乳腺癌的免疫反應。該疫苗不僅能有效預防乳腺癌肺轉移，而且給已移植乳腺腫瘤的小鼠接種后，能夠增強腫瘤對化療藥物阿霉素的敏感性；在該疫苗與化療相結合治療荷瘤小鼠后，可以顯著延長小鼠的生存期。值得注意的是，MTDH基因在小鼠肝中高表達，因而 MTDH基因疫苗可能造成肝臟的損傷。然而眾所周知，肝的再生能力很強，在末次免疫1周后，肝臟可能已經完成自我修復，所以沒有觀察到MTDH疫苗治療組的小鼠肝臟較對照組相比有明顯損傷。因此，MTDH基因疫苗有希望在將來可以作為預防和治療乳腺癌的新的選擇。綜上所述，MTDH基因疫苗與化療相結合可以作為預防和治療乳腺癌的一種新的策略和手段。本發(fā)明提供了上述MTDH基因疫苗的制備方法，首先將Metadherin基因編碼序列克隆到表達載體；然后，用重組表達載體轉化減毒菌株，篩選獲得所述的基因疫苗。具體操作方法可以采用本領域常規(guī)的操作或者按照實施例進行。所述的表達載體可以采用原核表達載體，例如pcDNA3. l/W3-MyC。所述的減毒菌株可以是減毒沙門氏菌株 S. typhimurium(dam-and AroA-) RE88。本發(fā)明的疫苗可用于制備抑制腫瘤生長藥劑，尤其是針對乳腺癌及乳腺腫瘤的肺轉移。本發(fā)明還提供了一種抑制腫瘤生長的組合物，該組合物包括上述MTDH基因疫苗和阿霉素。MTDH基因疫苗和阿霉素聯(lián)用以抑制乳腺癌肺轉移，也可以用于抑制乳腺腫瘤的生長，延長個體生存期。本發(fā)明提供了 MTDH基因疫苗，小鼠在預先接種MTDH基因疫苗后，能顯著抑制4T1
8乳腺癌在原發(fā)部位的生長，并且能顯著抑制肺轉移；給荷瘤小鼠接種MTDH基因疫苗后，可以增強腫瘤對阿霉素的藥物敏感性，從而抑制腫瘤的生長以及肺轉移，并能提高化療后小鼠的存活時間。綜上所述，本發(fā)明提供了一種通過口服免疫的MTDH基因疫苗，并檢測其抑制乳腺癌轉移的效果。該疫苗可激活CD8+細胞毒性T細胞對表達MTDH抗原的乳腺癌細胞4T1的免疫反應。而且，MTDH基因疫苗在預先接種后，能抑制乳腺腫瘤的生長和肺轉移。更重要的是，MTDH基因疫苗與阿霉素聯(lián)用后，能抑制乳腺腫瘤的肺轉移，起到治療的效果，并能延長荷瘤小鼠的壽命。因此，免疫療法與化學療法相結合可以為改進目前乳腺癌的治療方法提供新的思路與途徑。


圖1 :MTDH的肺定位序列。圖2-圖3 :MTDH基因在小鼠各器官和小鼠乳腺癌細胞系4T1中的表達譜分析。圖 2:蛋白免疫印跡分析MTDH基因在小鼠器官和4T1細胞中的表達譜(上)，β-actin作為內參對照(下)。圖3:實時定量PCR分析MTDH基因在小鼠器官和4T1細胞中的表達譜，與圖 2相對應。圖4-圖5 :MTDH基因疫苗載體的構建及其蛋白表達情況的檢測。圖4:以 pcDNA3. l/W3-MyC載體作為MTDH基因疫苗表達載體的圖譜。圖5 :MTDH疫苗質粒轉染 HEK293T細胞后，裂解細胞，通過抗c-myc的抗體免疫印跡檢測MTDH表達情況。圖6-圖8 :MTDH基因疫苗在預防接種后對4T1乳腺腫瘤的生長與肺轉移具有抑制作用。雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)分為兩組(n = 6)，每隔一周用IO8的pW^-MTDH或者 PUb疫苗口服免疫，一共免疫3次。第3次免疫結束一個星期后，給小鼠乳房的脂肪墊內注射104T1乳腺癌細胞，誘發(fā)乳腺癌自發(fā)性肺轉移。接種觀天后，處死實驗組和對照組小鼠， 取肺，統(tǒng)計腫瘤細胞肺轉移的節(jié)點數(shù)目。圖6:實驗操作流程圖。圖7:原位腫瘤重量統(tǒng)計， 以克為單位。圖8 對兩組小鼠肺轉移節(jié)點的數(shù)目統(tǒng)計結果。圖9-圖12 :MTDH基因疫苗與阿霉素聯(lián)合使用能夠增強阿霉素對4T1荷瘤小鼠的乳腺癌肺轉移的療效。雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)隨機分為4個實驗組(n = 6)，將 1054Τ1細胞接種到雌性BALB/c小鼠的脂肪墊內，記為第0天。之后，小鼠于第3、7、11天分別口服沙門氏菌疫苗免疫3次；于第4、8、12天按5毫克/公斤體重的劑量尾靜脈注射阿霉素；第13天切除乳腺原位腫瘤。第37天處死小鼠，統(tǒng)計乳腺癌肺轉移的節(jié)點數(shù)目。圖9: 實驗操作流程圖。圖10 小鼠原位腫瘤切除后的重量統(tǒng)計。圖11 各組老鼠的肺標本照片。 圖12 對各組小鼠肺轉移節(jié)點的數(shù)目統(tǒng)計的結果。圖13-圖14 :MTDH基因疫苗與阿霉素聯(lián)合使用可以延長4T1荷瘤小鼠的壽命。雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)隨機分為4個實驗組(n = 6)，將ΙΟΜΤΙ細胞接種到雌性BALB/c 小鼠的脂肪墊內，記為第0天。之后，小鼠于第3、7、11天分別口服沙門氏菌疫苗免疫3次； 于第4、8、12天按5毫克/公斤體重的劑量尾靜脈注射阿霉素；第13天切除乳腺原位腫瘤。 圖13 實驗操作流程圖。圖14 各組小鼠生存曲線統(tǒng)計(*P < 0. 05)。圖15-19 =MTDH基因疫苗通過⑶8+的細胞毒性T細胞介導抗腫瘤免疫反應。圖 15 :MTDH疫苗免疫小鼠分離出的脾細胞與對照組相比可以顯著裂解4T1細胞。圖16 抗⑶4抗體預孵育后，T細胞的細胞毒性未受明顯影響。圖17 抗CD8抗體預孵育后顯著抑制了 T 細胞對4T1細胞的細胞毒性作用。圖18 抗CD8抗體檢測原發(fā)腫瘤內CD8+T細胞的浸潤情況。圖19 =TUNEL染色檢測細胞毒性T細胞誘導的原位腫瘤細胞凋亡。圖20 :MTDH基因疫苗在小鼠體內沒有引起明顯的副作用。雌性BALB/c小鼠用 PUb-MTDH或者pWd疫苗免疫3次。第3次免疫結束1周后，取出小鼠下列組織和器官，包括心臟(a)，小腸(b)，腎(c)，肝臟(d)肺(e)和脾臟(f)，用石蠟包埋，切片后做蘇木素-伊紅(H組)染色。
具體實施例方式實施例1材料與方法一、動物、細菌株與細胞系來源6-8周雌性BALB/c小鼠購于上海實驗動物中心。小鼠的飼養(yǎng)依據(jù)上海交通大學醫(yī)學院關于實驗動物使用的準則操作。減毒沙門氏菌株(Salmonella typhimurium, dam^and AroAO RE88 和小鼠 4T1 乳腺癌細胞系由 Ralph A. Reisfeld 教授(The Scripps Research Institute, La Jolla, CA)惠貝曾。二、細胞培養(yǎng)小鼠乳腺癌細胞系4T1用RMPI-1640培養(yǎng)基(HyClone，Logan，UT)添加10%胎牛血清(HyClone)，100 單位 / 毫升青霉素和 100ug/mL 鏈霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA) 培養(yǎng)。人胚胎腎細胞系HEK293T用DMEM(HyClone)添加10%胎牛血清，青霉素和鏈霉素在 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三、基因疫苗載體構建、蛋白表達驗證編碼全長小鼠MTDH基因的質粒由Erkki Ruoslahti教授(The Burnham Institute, La Jolla, CA)惠贈。將該基因按PCR方法擴增后，克隆到pcDNA3. 1/Ub-Myc載體中W，7]，空載體作為對照。將該表達MTDH蛋白的疫苗質粒轉染HEK293T細胞，收細胞蛋白做蛋白免疫印跡分析，用抗c-myc標簽的抗體(Beyotime，Haimen, Jiangsu，China)檢測 MTDH 蛋白表達情況，以 β-actin(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)作為內參對照。四、減毒沙門氏菌的轉化按文獻報道的方法，將基因疫苗質粒電轉化到減毒沙門氏菌株 S. typhimurium (dam-and AroA-) RE88 中[4，5]。具體步驟如下(1)從長有沙門氏菌的LB板上挑單克隆，接到:3ml LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長期。(2)用冰的 ddH20 洗 2 次，用 200ul ddH20 重懸。(3)取IOOul菌與2ug DNA混合后轉入電轉杯，冰上10分鐘。(4)電轉2. 5kV, 25uF, 200 Ω。(5)加200ul培養(yǎng)基，37°C復蘇30分鐘，涂板培養(yǎng)。五、預防模式疫苗與腫瘤接種在預防模式中，雌性BALB/c小鼠(6_8周齡)分為兩個實驗組(n = 6)，每隔一周用IO8帶有pWD-MTDH或者PWD質粒的減毒沙門氏菌疫苗灌胃，一共免疫3次。第3次免疫結束一個星期后，給所有小鼠乳房的脂肪墊內接種1054T1乳腺癌細胞，誘發(fā)乳腺癌自發(fā)性肺轉移。接種觀天后，處死實驗組和對照組小鼠，取肺，用波恩氏溶液(Bouin's solution) 浸泡，之后在解剖顯微鏡下統(tǒng)計腫瘤細胞肺轉移的節(jié)點數(shù)目。波恩氏溶液配制方法苦味酸飽和水溶液75ml ；福爾馬林(40%甲醛)25ml ；冰醋酸5ml。六、治療模式腫瘤與疫苗接種以及化療藥物聯(lián)合使用在治療模式中，雌性BALB/c小鼠隨機分為4個實驗組(n = 14)，然后將10 !!細胞接種到所有小鼠的脂肪墊內，記為第0天。之后，小鼠于第3、7、11天分別口服沙門氏菌疫苗免疫3次；于第4、8、12天按5毫克/公斤體重的劑量尾靜脈注射阿霉素；第13天切除乳腺原位腫瘤。第37天，每組處死6只小鼠，統(tǒng)計乳腺癌肺轉移的節(jié)點數(shù)目；統(tǒng)計其余小鼠 (每組8只)的生存時間。七、制備小鼠脾細胞(1)雌性BALB/c小鼠(6_8周齡)分為兩個實驗組，每隔一周用IO8帶有pWD-MTDH 或者pWD質粒的減毒沙門氏菌疫苗灌胃，一共免疫3次。(2)第3次免疫結束五天后，尾靜脈注射4T1細胞以進一步激活免疫系統(tǒng)。(3)頸椎脫位處死小鼠，置70%乙醇中浸泡5分鐘，取脾臟剪碎。(4)70ym cell strainer置于含RPMI-1640的平皿中，用注射器芯研磨脾，至脾呈白色絮狀，RPMI-1640沖洗過濾的脾細胞，收集細胞懸液于無菌離心管中，1500rpm，離心10 分鐘。(5)用RPMI-1640洗1次，再用Iml紅細胞裂解液重懸，室溫1分鐘。(6)加入10倍以上體積的RPMI-1640，混勻，1500rpm離心10分鐘，棄上清，共洗3次。(7)用 RMPI-1640 培養(yǎng)基(HyClone)添加 10 % 胎牛血清(HyClone)，100 單位 / 毫升青霉素、100ug/mL鏈霉素(Invitrogen)和100活力單位/毫升白細胞介素-2 (R&D Systems, Inc. , Minneapolis, MN)培養(yǎng)。(8)同時，細胞培養(yǎng)皿底面鋪有用毫升絲裂霉素C(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)預處理20分鐘的4T1細胞，與分離出的脾細胞在37°C，含5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱共培養(yǎng)5天。八、T細胞毒性檢測按文獻所述[22]，用CytoToxe%非放射性細胞毒性檢測試劑盒(ftOmega，Madi son, WI)檢測脾細胞對4T1細胞的細胞毒性，具體操作步驟如下(1) 96孔分析板設置(IOOul/孔)
權利要求
1.一種MTDH基因疫苗，其特征在于，該基因疫苗表達細胞膜表面蛋白Metadherin。
2.如權利要求1所述的基因疫苗，其特征在于，該基因疫苗含有Metadherin編碼基因。
3.如權利要求1所述的基因疫苗，其特征在于，該基因疫苗以減毒沙門氏菌為減毒菌株載體。
4.權利要求1所述基因疫苗的制備方法，其特征在于，其包括步驟首先將Metadherin 基因編碼序列克隆到表達載體；然后，用重組表達載體轉化減毒菌株，篩選獲得權利要求1 所述的基因疫苗。
5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的減毒菌株是減毒沙門氏菌株 S. typhimurium(dam-and AroA-)RE88。
6.權利要求1所述基因疫苗在制備乳腺腫瘤生長抑制劑中的應用。
7 權利要求1所述基因疫苗在制備乳腺腫瘤肺轉移抑制劑中的應用。
8.一種抑制腫瘤生長的組合物，其特征在于，該組合物包括權利要求1所述的基因疫苗和阿霉素。
9.權利要求8所述的組合物在制備抑制乳腺癌肺轉移藥物中的應用。
10.權利要求8所述的組合物在制備抑制乳腺腫瘤的生長藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種抑制腫瘤生長的基因疫苗。該基因疫苗表達細胞膜表面蛋白Metadherin，稱為MTDH基因疫苗。該疫苗通過口服免疫，可激活CD8+細胞毒性T細胞對表達MTDH抗原的乳腺癌細胞4T1的免疫反應。而且，MTDH基因疫苗能抑制乳腺腫瘤的生長和肺轉移。而且，MTDH基因疫苗與阿霉素聯(lián)用后，能增強阿霉素抑制乳腺腫瘤生長和肺轉移的作用，并能延長荷瘤小鼠的壽命。更重要的是，MTDH基因疫苗對機體主要器官沒有明顯損傷。因此，本發(fā)明為改進目前乳腺癌的治療方法提供新的途徑。
文檔編號A61K31/704GK102335437SQ20101023309
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月21日 優(yōu)先權日2010年7月21日
發(fā)明者朱晗, 郭方 申請人:上海宜諾迪生物科技有限公司