專利名稱：構(gòu)象受限的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)新的鍵環(huán)化的構(gòu)象受限的Nα主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物，涉及這些主鏈環(huán)化的肽類似物的制備方法，涉及應(yīng)用這些肽類似物的方法，以及涉及含有該肽類似物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
促生長(zhǎng)素抑制素類似物促生長(zhǎng)素抑制素是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中發(fā)現(xiàn)的環(huán)十四肽。其最早是從哺乳動(dòng)物下丘腦分離的，并且鑒定為生長(zhǎng)激素從垂體前葉分泌的重要的抑制劑。其多生物活性包括對(duì)從胰腺分泌胰高血糖素和胰島素的抑制作用，對(duì)大多數(shù)內(nèi)臟激素的調(diào)節(jié)作用，以及對(duì)貫穿中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)活性和認(rèn)識(shí)過(guò)程所涉及的其它神經(jīng)遞質(zhì)的釋放的調(diào)節(jié)作用(參見(jiàn)綜述Lamberts，內(nèi)分泌研究(Endocrine Rev.,)9:427,1988)。另外，促生長(zhǎng)素抑制素及其類似物是治療各類型腫瘤的潛在的有用的抗增殖劑。
天然的促生長(zhǎng)素抑制素(也稱為促生長(zhǎng)素釋放抑制因子，SRIF)具有下面的結(jié)構(gòu)式H-Ala1-Gly2-Cys3-Lys4-Asn5-Phe6-Phe7-Trp8-Lys9-Thr10-Phe11-Thr12-Ser13-Cys14-OH其最早由Guillemin及其同事分離到(Bruzeau等，科學(xué)，179:78.1973)。其通過(guò)與受體家族的相互作用而顯示其作用。最近已經(jīng)鑒定和克隆了五種受體亞類，稱之為SSTR1-5。促生長(zhǎng)素抑制素以其天然的形式作為治療劑具有有限的用途，因?yàn)槠渚哂袃煞N所不期望的性質(zhì)不好的生物利用率和短的作用持續(xù)時(shí)間。為此原因，在過(guò)去的二十年間已經(jīng)進(jìn)行了很大努力來(lái)發(fā)現(xiàn)有關(guān)對(duì)生長(zhǎng)激素，胰島素或胰高糖素抑制作用的藥效，生物穩(wěn)定性，作用持續(xù)時(shí)間或選擇性具有優(yōu)越性的促生長(zhǎng)素抑制素類似物。
結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)研究，光譜技術(shù)，例如圓二色性和核磁共振，以及分子模型研究出以下結(jié)論天然促生長(zhǎng)素抑制素的環(huán)部分的構(gòu)象很有可能是反向平行的β-片層；Phe6和Phe11通過(guò)兩個(gè)芳香環(huán)之間的疏水性相互作用而在穩(wěn)定藥效團(tuán)構(gòu)象中起重要作用；反向平行的β-片層中β-轉(zhuǎn)角周圍的4個(gè)氨基酸Phe7-Trp9-Lys9-Thr11對(duì)于藥效團(tuán)是基本的；對(duì)于促生長(zhǎng)素抑制素受體亞型2至5的相互作用(D)，Trp8優(yōu)于(L)Trp8。
然而，含有通過(guò)二硫橋連接的該4個(gè)氨基酸的六肽促生長(zhǎng)素抑制素類似物在體外和體內(nèi)幾乎是滅活的
盡管其具有置換天然促生長(zhǎng)素抑制素中Phe6-Phe11疏水性相互作用的共價(jià)二硫橋的優(yōu)點(diǎn)。
為了提高該六肽促生長(zhǎng)素抑制素類似物的活性進(jìn)行了4方面主要研究。(1)通過(guò)促進(jìn)順式-酰胺鍵的環(huán)化作用，或者通過(guò)對(duì)分子進(jìn)行第二環(huán)化作用得到二環(huán)類似物，來(lái)置換二硫化物橋。兩種情況下，得到的類似物具有減小數(shù)值的自由度構(gòu)象度。(2)用其它天然或非天然氨基酸置換Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10序列中原殘基，例如用Thr7置換Phe7和用Val10置換Thr10。(3)插入另外的來(lái)自天然促生長(zhǎng)素抑制素的官能基團(tuán)，注意這些新的元素要對(duì)與受體的相互作用起作用。(4)刪除4個(gè)氨基酸Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10中的一個(gè)，假設(shè)該類似物會(huì)更有選擇性。
促生長(zhǎng)素抑制素類似物，MK-678環(huán)(N-Me-Ala6-Tyr7-(D)Trp8-Lys9-Val10-Phe)是用上述頭三項(xiàng)研究設(shè)計(jì)的強(qiáng)有力的促生長(zhǎng)素抑制素類似物的例子(Veber等，生活科學(xué)(Life Science,)34:371,1984)。在該六肽類似物中，順式-酰胺鍵位于N-Me-Ala和Phe11之間，Tyr7和Val10分別置換Phe7和Tyr10，并且從天然促生長(zhǎng)素抑制素結(jié)合Phe11。
另一組促生長(zhǎng)素抑制素類似物(美國(guó)專利4310518和4235886)包括Octreotide
其是迄今可購(gòu)得的唯一許可的促生長(zhǎng)素抑制素類似物。其是用上述第三項(xiàng)研究開發(fā)出來(lái)的。在這里，假設(shè)(D)Phe5和還原的C-末端Tyr12-CH2OH分別占據(jù)天然Phe6和Tyr12的構(gòu)象空間的一部分?；衔颰T-232
與Octreotide密切相關(guān)，并且是完成上述第四項(xiàng)研究的例子。缺失Tyr10可能是其關(guān)于抗腫瘤活性中高功能選擇性的原因。
這些高效力促生長(zhǎng)素抑制素類似物的例子提示在位置6和11的苯丙氨酸不只是在穩(wěn)定藥效團(tuán)構(gòu)象中起重要作用，而且還在與受體的相互作用中起功能作用。還留有一個(gè)問(wèn)題就是一個(gè)苯丙氨酸(或Phe6或Phe11)對(duì)于與受體的相互作用是否是足夠的或者兩者都是需要的。
現(xiàn)在已經(jīng)知道，促生長(zhǎng)素抑制素受體構(gòu)成五種不同受體亞型族(Bell和Reisine，神經(jīng)科學(xué)動(dòng)態(tài)(Trends Neurosci.),16,34038,1993)，其可以根據(jù)其組織特異性和/或生物活性來(lái)區(qū)分。本領(lǐng)域已知的促生長(zhǎng)素抑制素類似物可能不能提供足夠的選擇性或受體亞型選擇性，特別是作為抗腫瘤劑(Reubi和Laissue,TIPS,16,110-115,1995)。
與轉(zhuǎn)移類癌瘤腫瘤相關(guān)的癥狀(發(fā)燒和腹瀉)和與分泌血管作用腸肽(VIP)的腺癌相關(guān)的癥狀(水樣腹瀉)用促生長(zhǎng)素抑制素類似物治療。也已經(jīng)證明用促生長(zhǎng)素抑制素治療嚴(yán)重的腸胃出血。促生長(zhǎng)素抑制素由于其抗分泌活性也可以用于其它分泌激素腫瘤(例如胰島細(xì)胞腫瘤和肢端肥大癥)和依賴激素的腫瘤(例如軟骨肉瘤和骨肉瘤)的緩和治療。肽模擬物作為有機(jī)化學(xué)和分子生物學(xué)主要研究的結(jié)果，現(xiàn)在很多生物活性肽可以以對(duì)于藥物和臨床應(yīng)用足夠的量制備。因此在最近幾年，對(duì)于處理和治療涉及肽的病狀已經(jīng)建立起新的方法。但是，由于下列原因，肽作為藥物使用是有限的a)其對(duì)于在胃腸道和血清中的蛋白酶解的低的代謝穩(wěn)定性；b)其口服吞下后不好的吸收作用，特別是由于其相對(duì)高的分子量或者缺少特異的運(yùn)送系統(tǒng)，或者兩者兼而有之；c)其通過(guò)肝和腎的快的排泄作用；和d)其在非靶物器官系統(tǒng)中的不期望的副作用，因?yàn)殡氖荏w可以廣泛分布于生物中。
此外，除少數(shù)例外外，小至中等大小(少于30個(gè)氨基酸)的天然肽在稀釋的水溶液中在多構(gòu)象時(shí)在可以導(dǎo)致受體選擇性缺乏，代謝不穩(wěn)定性和對(duì)測(cè)定生物活性構(gòu)象努力的阻礙的動(dòng)態(tài)平衡方面顯示出不規(guī)則性。如果肽本身具有生物活性構(gòu)象，即受體結(jié)合構(gòu)象，則預(yù)期有提高的對(duì)受體的親和性，因?yàn)榻Y(jié)合熵的減小比結(jié)合揉性肽更小。因此其對(duì)于努力和開發(fā)有序的，均勻的，且生物活性的肽是重要的。
最近幾年，已經(jīng)進(jìn)行了大量研究來(lái)開發(fā)比其原型天然肽具有更好的藥物性能的肽模擬物或肽類似物。藥物性能已經(jīng)是最優(yōu)化的天然肽本身一般作為開發(fā)這些肽模擬物的前導(dǎo)。但是，開發(fā)這些藥劑的主要問(wèn)題在于測(cè)定生物活性肽的活性區(qū)。例如，常常只有少數(shù)氨基酸(通常4-8個(gè))負(fù)責(zé)受體對(duì)肽配體的識(shí)別。一旦測(cè)定了該生物活性位點(diǎn)，則可以將用于開發(fā)肽模擬物的前導(dǎo)結(jié)構(gòu)最優(yōu)化，例如，通過(guò)結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究。
這里所使用的“肽模擬物”是作為受體配體的化合物，其可以在受體水平上模擬(激動(dòng)劑)或阻斷(拮抗劑)肽的生物作用。應(yīng)該考慮下面的因素來(lái)完成最好的可能的激動(dòng)劑肽模擬物a)代謝穩(wěn)定性，b)好的生物利用率，c)高受體親和性和受體選擇性，和d)最小的副作用。
最近已經(jīng)研究出開發(fā)盡可能近地模擬內(nèi)源肽的受體結(jié)合構(gòu)象的受限肽模擬物的一般性可應(yīng)用和成功的方法(Rizo和Gierasch，生物化學(xué)年度評(píng)述(Ann.Rev.Biochem.),61:387,1992)。對(duì)這些類型類似物的研究表明其具有提高的對(duì)蛋白酶的抗性，即代謝穩(wěn)定性的提高，以及提高的選擇性，從而更少的副作用(Veber和Friedinger，神經(jīng)科學(xué)動(dòng)態(tài)，p.392，1985)。
一旦制備出具有穩(wěn)固構(gòu)象的這些肽模擬物化合物，則通過(guò)研究結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系選擇最有活性的結(jié)構(gòu)。這樣的構(gòu)象受限物可包括結(jié)構(gòu)的局部修飾或整體構(gòu)象受限物(有關(guān)綜述參見(jiàn)Giannis和Kolter,Angeu.Chem.Int.Ed.Engl.32:1244,1993)。構(gòu)象受限肽類似物肽中兩個(gè)相鄰氨基酸之間成橋?qū)е戮植繕?gòu)象修飾，與正常二肽相比，其揉性(flexibility)受限。生成這樣的橋的一些可能性包括插入內(nèi)酰胺和哌嗪酮。γ-內(nèi)酰胺和δ-內(nèi)酰胺在某種程度上被設(shè)計(jì)成“反轉(zhuǎn)模擬”；在一些情況下，將這樣的結(jié)構(gòu)插入到肽中，產(chǎn)生生物活性化合物。
通過(guò)環(huán)化來(lái)限制肽鏈的揉性，肽構(gòu)象中的整體受限是可能的(Hruby等，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.).268:249,1990)。不僅僅是生物活性肽的環(huán)化作用改善其代謝穩(wěn)定性和受體選擇性，環(huán)化作用還對(duì)增強(qiáng)構(gòu)象均勻性的受限施加影響，而有利于構(gòu)象分析。環(huán)化的一般模式與自然存在的環(huán)肽所發(fā)現(xiàn)的相同。這包括側(cè)鏈與側(cè)鏈的環(huán)化作用或者支鏈與終端基團(tuán)的環(huán)化作用。為此目的，受體識(shí)別中所沒(méi)有涉及的氨基酸側(cè)鏈相互連接或者與肽主鏈連接。另一種常見(jiàn)的環(huán)化作用是終端與終端的環(huán)化作用。
這些環(huán)化作用經(jīng)典模式的主要限制是他們?yōu)榱藢?shí)現(xiàn)環(huán)化而需要氨基酸側(cè)鏈的取代作用。
另一種關(guān)于肽構(gòu)象受限的概念性探討是由Gilon等介紹的(生物聚合物(Bio-polymer)31:745,1991)，其提議肽主鏈與主鏈環(huán)化。該策略理論上的優(yōu)點(diǎn)包括通過(guò)肽主鏈的碳或氮影響環(huán)化而不干擾對(duì)與給定肽的特異受體的相互作用是關(guān)鍵的側(cè)鏈的能力。盡管該概念設(shè)想是應(yīng)用于所有感興趣的線性肽，但是，事實(shí)是建議的方案中的限制因素是必須用來(lái)置換通過(guò)橋基連接的氨基酸的合適的結(jié)構(gòu)單元的可用性。實(shí)施主鏈環(huán)化該概念的實(shí)際的還原作用被不能設(shè)計(jì)任何制備除甘氨酸以外的氨基酸結(jié)構(gòu)單元的實(shí)際方法所阻礙(Gilon等有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem),587:5687,1992)。
在Gilon,EPO申請(qǐng)No.564739A2；和有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem)，57:5687,1992中，描述了兩種合成結(jié)構(gòu)單元的基礎(chǔ)方法。第一種用二胺與溴酸反應(yīng)開始。選擇性保護(hù)ω胺，并且進(jìn)一步修飾保護(hù)基團(tuán)，得到適合Boc化學(xué)肽合成的結(jié)構(gòu)單元。第二種方法從選擇性保護(hù)二胺，并且產(chǎn)物與氯乙酸反應(yīng)開始，得到適合Fmoc肽合成的保護(hù)的甘氨酸衍生物。
應(yīng)用主鏈環(huán)化肽類似物概念的其它模式公開于WO95/33765，其也提供了合成除甘氨酸以外的結(jié)構(gòu)單元的新的方法。WO95/33765公開的肽類似物組是不同的促生長(zhǎng)素抑制素類似物。該申請(qǐng)中公開的類似物組中沒(méi)有一個(gè)表明對(duì)結(jié)合受體亞型有獨(dú)特的貢獻(xiàn)或意料不到的好處。主鏈環(huán)化肽類似物庫(kù)如上所述，線性肽作為有效力的藥物具有一些嚴(yán)重的不足，如其在體內(nèi)的眾所周知的不穩(wěn)定性，經(jīng)常缺乏結(jié)合其受體的高親和性，常常缺乏對(duì)一種受體的選擇性，并且通常具有不好的口服生物利用率，如此之多。為了克服這些問(wèn)題，也可以應(yīng)用與合成的肽庫(kù)相關(guān)研究出的方法來(lái)產(chǎn)生環(huán)肽，新的生物聚合物，還有新的支化的低聚物化合物的集合(Zuckermann的綜述，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新觀點(diǎn)(Current Opinion in Structural Biology)3,580-584,1993)。
環(huán)肽庫(kù)的產(chǎn)生除了所有上述考慮外，要求環(huán)化反應(yīng)要以高產(chǎn)率進(jìn)行，并且要有最少的附加操作。令人遺憾的是，經(jīng)典的環(huán)化反應(yīng)從期望的產(chǎn)率來(lái)考慮是高度序列依賴性的，使得肽混合物的不均勻環(huán)化是不可靠的。
直接在固體載體上的肽環(huán)化的最新研究改良了合成方法，甚至以已知的環(huán)化方案為基礎(chǔ)使環(huán)化反應(yīng)自動(dòng)完成。過(guò)去，環(huán)化作用一般在溶液中在高度稀釋條件下進(jìn)行。聚合物作載體的環(huán)化作用即避免潛在的副作用，例如低聚合作用，又有利于產(chǎn)物的純化。例如，在樹脂上的環(huán)化方法最近已經(jīng)被用來(lái)制備帶有兩個(gè)側(cè)鏈之間硫醚，二硫化物，或內(nèi)酰胺，氨基末端和側(cè)鏈之間的內(nèi)酰胺，和氨基和羧基末端之間的內(nèi)酰胺生成的橋的環(huán)肽(Zuckermann的綜述，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的最新觀點(diǎn)(Current Opinion inStructural Biology)3，上文)。
組合庫(kù)中樹脂結(jié)合環(huán)肽和游離環(huán)肽的應(yīng)用公開于WO92/00091。但是，這些環(huán)肽不包含任何構(gòu)象受限元素，而且實(shí)現(xiàn)環(huán)化的情況下，這些肽仍然選定一定數(shù)目構(gòu)象，仍然有線性肽的相同的缺點(diǎn)。
WO95/01800公開的環(huán)半無(wú)規(guī)肽庫(kù)全部是含有一個(gè)或幾個(gè)無(wú)規(guī)氨基酸和固定相鄰氨基酸殘基的β-反轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基例如脯氨酸形式的構(gòu)象受限元素的環(huán)五肽和六肽庫(kù)。這項(xiàng)研究的發(fā)明者強(qiáng)調(diào)了這些構(gòu)象受限元素的優(yōu)點(diǎn)。但是，通過(guò)向肽序列插入特定的氨基酸殘基而包含這樣的元素對(duì)受體識(shí)別或其它生物活性所必需的那些殘基有不利的影響。此外，在該說(shuō)明書中(WO95/01800)，環(huán)化反應(yīng)只是另一種偶聯(lián)反應(yīng)，其中線性鏈肽的末端氨基與該肽的末端羧基偶聯(lián)。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，制備出新的肽模擬化合物，其特征在于插入與α-氨基酸的α氮連接的帶有橋基的新的結(jié)構(gòu)單元。
該項(xiàng)研究最引人注目的優(yōu)點(diǎn)是
1)該方法成就肽序列的環(huán)化作用而不影向肽的任何側(cè)鏈，從而減少了損失生物識(shí)別和功能所必需的功能基的機(jī)會(huì)。2)該方法通過(guò)使變更橋長(zhǎng)度，取向，和鍵的類型(例如酰胺鍵，二硫鍵，硫醚鍵，硫酯鍵等)和環(huán)中鍵的位置使優(yōu)化肽構(gòu)象。3)當(dāng)應(yīng)用于已知活性線性肽的環(huán)化作用時(shí)，可以以這樣方式設(shè)計(jì)橋以將肽活性區(qū)和其相應(yīng)受體的相互作用最小。這減少了環(huán)化臂干擾識(shí)別和功能的機(jī)會(huì)，并且也產(chǎn)生了適合連接標(biāo)記物的位點(diǎn)，所述標(biāo)記物例如放射性示蹤劑，細(xì)胞毒性藥物，光捕獲物質(zhì)，或者任何其它期望的標(biāo)記物。
本發(fā)明所公開的最新產(chǎn)生的庫(kù)為了發(fā)現(xiàn)完成其作為激動(dòng)劑或拮抗劑的作用的最適宜的肽主鏈構(gòu)象而改變構(gòu)象及揉性(受限)水平。這通過(guò)變化橋頭的位置(即要環(huán)化的殘基線性序列的位置)，以及改變這些單元之間橋的長(zhǎng)度，取向和鍵型來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物，包括含有與橋基連接的肽主鏈的一個(gè)氮原子的肽序列，如下所述。在本發(fā)明中，一對(duì)或幾對(duì)結(jié)構(gòu)單元相互連接，形成環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供具有下面通式(Ⅰ)的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
其中a-c各自獨(dú)立地代表1-8或0的整數(shù)；(AA)代表氨基酸殘基，其中每條鏈中的氨基酸殘基可以相同或不同；Q代表H或?；籈代表羥基，羧基保護(hù)基或氨基，或者末端羧基可以還原為CH2-OH；R1和R2各自代表任選與特定保護(hù)基團(tuán)鍵合的氨基酸側(cè)鏈；線代表下式橋基(ⅰ)-X-M-Y-W-Z-；或(ⅱ)-X-M-Z-，其中M和W獨(dú)立地選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；X,Y和Z各自獨(dú)立地選自亞烷基，取代的亞烷基，亞芳基，同型-或雜-環(huán)烯和取代的環(huán)烯。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，式(Ⅰ)末端羧基被羧基末端酰胺置換或者被還原為CH2OH基團(tuán)。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案包括通式(Ⅱ)N-主鏈與側(cè)鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
式(Ⅱ)其中d-f各自獨(dú)立地代表1-8或0的整數(shù)；(AA)代表氨基酸殘基，其中每條鏈中的氨基酸殘基可以相同或不同；Q代表H或?；?；E代表羥基，羧基保護(hù)基或氨基，或者末端羧基可以還原為CH2-OH；R1代表任選與特定保護(hù)基團(tuán)鍵合的氨基酸側(cè)鏈；線代表下式橋基(ⅰ)-X-M-Y-W-Z-；或(ⅱ)-X-M-Z-，其中M和W獨(dú)立地選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；X,Y和Z各自獨(dú)立地選自亞烷基，取代的亞烷基，亞芳基，同型-或雜-環(huán)烯和取代的環(huán)烯。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案包括式Ⅰ或Ⅱ主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物，其中線代表式-(CH2)x-M-(CH2)v-橋基；M選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；x和y各自獨(dú)立地代表1-10的整數(shù)。
此外優(yōu)選的是式Ⅰ或Ⅱ主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物，其中R1和R2不是氫，例如CH3,(CH3)2CH-,(CH3)2CHCH2-,CH3CH2CH(CH3)-,CH3S(CH2)2-,HOCH2-,CH3CH(OH),HSCH2-,NH2C(=O)CH2-,NH2C(=O)(CH2)2-,NH2(CH2)3-,HOC(=O)CH2-,HOC(=O)(CH2)2-,NH2(CH2)4-,C(NH2)2NH(CH2)3-,HO-苯基-CH2-，芐基，甲基吲哚和甲基咪唑。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選方面是涉及產(chǎn)生位置6和11之間連接，留有未連接苯丙氨酸側(cè)鏈的新的促生長(zhǎng)素抑制素類似物的主鏈環(huán)化作用。該構(gòu)象穩(wěn)定作用比天然促生長(zhǎng)素抑制素中Phe6,Phe11疏水性相互作用穩(wěn)定得多，并且對(duì)于還原-氧化反應(yīng)比Cys-Cys二硫橋更穩(wěn)定。換句話說(shuō)，第一次實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的共價(jià)鍵橋，同時(shí)保留了原Phe6和Phe11之一或兩者。
此外，主鏈環(huán)化作用還可以用來(lái)固定β-轉(zhuǎn)角，不只是在位置6和11，而且還在Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10的活性反應(yīng)中，得到具有優(yōu)選構(gòu)象的單環(huán)類似物或者非常剛性的二環(huán)類似物。在這里，藥物活性氨基酸的側(cè)鏈保持不連接，并且唯一的變化是在限制的構(gòu)象空間。
如這里和下面的權(quán)利要求書中所使用的，更優(yōu)選的主鏈環(huán)化的肽類似物中，氨基酸后面的上腳注指其在天然促生長(zhǎng)素抑制素中的位置數(shù)。
更優(yōu)選的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物是式(Ⅴa)
式(Ⅴa)最優(yōu)選的類似物具有式(Ⅴb)
式(Ⅴb)其中m和n是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是Gly,(D)-或(L)-Ala,(D)-或(L)-Phe,Nal和β-Asp(Ind)；R6和R11獨(dú)立地是Gly或(D)-或(L)-Phe；R7是Phe或Tyr；R10不存在或者是Gly,Abu,Thr或Val；R12不存在或者是Val,Thr或Nal，和Y2選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。在這些單環(huán)促生長(zhǎng)素抑制素類似物中，主鏈環(huán)化取代了Cys6-Cys11二硫橋，留下和在天然促生長(zhǎng)素抑制素中一樣的苯丙氨酸側(cè)鏈。還更優(yōu)選的是其中Phe7被Tyr7置換和Thr10被Val10置換的類似物。
除了在位置6和11之外在活性區(qū)中的位置中固定分子的另一種優(yōu)選的單環(huán)類似物是式Ⅵ(a和b)和Ⅶ(a-c)
式(Ⅵa)
式(Ⅵb)
式(Ⅶa)
式(Ⅶb)
式(Ⅶc)其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是(D)-或(L)-Phe,Nal和β-Asp(Ind)；R6是(D)-或(L)-Phe；R10不存在或者是Gly,Abu，或Thr；R11是(D)-或(L)-Phe；R12不存在或者是Thr或Nal，和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
還有其它優(yōu)選的類似物如在式Ⅴ中在位置6和11加入主鏈環(huán)化，與如式Ⅵ和Ⅶ中的主鏈環(huán)化一起，得到剛性二環(huán)類似物。其它更優(yōu)選的二環(huán)類似物與式Ⅴ-Ⅶ的不同在于形成二硫鍵的半胱氨酸取代了位置6和11的氨基酸，在式Ⅷ(a和b)和Ⅸ(a和b)中只留下一個(gè)主鏈環(huán)化
式(Ⅷa)
式(Ⅷb)
式(Ⅸa)，和
式(Ⅸb)其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是(D)-或(L)-Phe,Nal和β-Asp(Ind)；R6和R11獨(dú)立地是Gly或Phe；R10不存在或者是Gly,Abu，或Thr；R12不存在或者是Thr或Nal；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案是
(即，環(huán)[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X記為PTR 3046)
(即，環(huán)[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X記為PTR 3040)其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。這兩種類似物顯示出由于其對(duì)特定的促生長(zhǎng)素抑制素受體亞型的選擇性而具有出人意料的有用的性能。
更優(yōu)選的單環(huán)促生長(zhǎng)素抑制素類似物也可以制備成活性類似物庫(kù)，其特別用于篩選最適宜的構(gòu)象體。
根據(jù)本發(fā)明的還更優(yōu)選的促生長(zhǎng)素抑制素類似物包括式Ⅹ至ⅩⅣ的組成
式Ⅹ其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是(D)-Phe或2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是Tyr或pClPhe；R10是Thr,Ser或Abu；R11是Phe,Gly或Ala；R12是Thr Val,2-Nal或(D)-2-Nal；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
式Ⅺ
其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是(D)-Phe或(L)-Phe,Ala或Lys；R6不存在或者是Phe；R7是Tyr或Phe；R10不存在或者是Thr,Val,Ser或Abu；R11是Phe,Gly或Ala；R12是Trp,Thr,Val,2-Nal或(D)-2-Nal；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
式Ⅻ
其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是Phe,(L)2-Nal或(D)-2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是(D)Phe,pCl(D)Phe,pNH2Phe或(D)Tyr；R10是(D)Thr,(D)Val(D)Ala,(D)Leu或(D)Glu；R11是Phe,Gly或Ala；R12不存在或者是Thr或Val；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
式ⅩⅢ
其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是(D)Phe或2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是(D)Phe,pCl(D)Phe,pNH2Phe或(D)Tyr；R8是(D)或(L)Trp；R10是(D)Thr,(D)Val,(D)Ala,(D)Leu或(D)Glu；R11是Phe,Gly或Ala；R12是Thr,Val,Ala,β-Ala,(L)2-Nal或(D)2-Nal；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
式ⅩⅣ
其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R1是Ala或(D)-2-Nal；R3是Phe,Gly,Ala或Lys；R4是Lys或Arg；R5是(L)Asn或(D)Asn；R7是Phe,Gly,Ala或Lys；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
本發(fā)明另一方面是制備通式(Ⅰ)環(huán)肽的方法
式(Ⅰ)其中a-c各自獨(dú)立地代表1-8或0的整數(shù)；(AA)代表氨基酸殘基，其中每條鏈中的氨基酸殘基可以相同或不同；Q代表H或?；籈代表羥基，羧基保護(hù)基或氨基，或者末端羧基可以還原為CH2-OH；R1至R4各自代表任選與特定保護(hù)基團(tuán)鍵合的氨基酸側(cè)鏈；線代表下式橋基(ⅰ)-X-M-Y-W-Z-；或(ⅱ)-X-M-Z-，其中M和W獨(dú)立地選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；X,Y和Z各自獨(dú)立地選自亞烷基，取代的亞烷基，亞芳基，同型-或雜-環(huán)烯和取代的環(huán)烯。
該方法包括插入至少一個(gè)式(Ⅲ)氨基酸的Nα-ω-功能化衍生物步驟
式(Ⅲ)其中X是選自亞烷基，取代的亞烷基，亞芳基，環(huán)烯和取代的環(huán)烯的間隔基團(tuán)；R1是任選與特定保護(hù)基團(tuán)鍵合的氨基酸側(cè)鏈；B是選自烷基氧基，取代的烷基氧基或芳基羰基的保護(hù)基團(tuán)；和G是選自胺，硫醇，醇，羧酸和酯，醛，醇和烷基鹵化物的官能團(tuán)；和A是G的特定保護(hù)基團(tuán)；進(jìn)入肽序列并且順序地將官能團(tuán)與所述肽序列中氨基酸的側(cè)鏈之一或者與另一個(gè)ω-官能化氨基酸衍生物環(huán)化。
優(yōu)選的結(jié)構(gòu)單元是共-官能化氨基酸衍生物，其中X是亞烷基；G是硫醇基團(tuán)，胺基或羧基；R是苯基，甲基或異丁基；前提是當(dāng)G是胺基時(shí)，R不是H。
另外優(yōu)選的是ω-官能化氨基酸衍生物，其中R用特定保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。
更優(yōu)選的是式(Ⅲ)ω-官能化氨基酸衍生物，其中G是氨基，羧基或硫醇基
其中X,R,A和B如上定義。
本發(fā)明另一方面是提供制備新的主鏈環(huán)化促生長(zhǎng)素抑制素類似物的方法，包括插入至少一種氨基酸的Nα-ω-官能化衍生物，進(jìn)入肽序列并且順序地將官能團(tuán)與所述肽序列中氨基酸的側(cè)鏈之一或者與另一個(gè)ω-官能化氨基酸衍生物環(huán)化。本發(fā)明主鏈環(huán)化的類似物可以用作藥物組合物和治療疾病的方法，所述疾病包括術(shù)后疼痛，所有類型的炎癥，特別是胰腺炎，癌癥，內(nèi)分泌失調(diào)和腸胃失調(diào)。
因此，本發(fā)明另一個(gè)目的涉及含有根據(jù)這里所公開的方法制備的藥物活性主鏈環(huán)化肽激動(dòng)劑和拮抗劑和藥學(xué)可接受載體或稀釋劑的藥物組合物；和用其治療炎癥，癌癥或內(nèi)分泌失調(diào)和腸胃失調(diào)的方法。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1圖示作為主鏈環(huán)化促生長(zhǎng)素抑制素類似物PTR3046的濃度的函數(shù)的對(duì)促生長(zhǎng)素抑制素(SRIF-14)結(jié)合不同SSTR亞型的抑制作用。
圖2圖示作為主鏈環(huán)化促生長(zhǎng)素抑制素類似物PTR3046和PTR3040的濃度的函數(shù)的對(duì)促生長(zhǎng)素抑制素(SRIF-14)結(jié)合小鼠垂體AtT細(xì)胞系上促生長(zhǎng)素抑制素受體的抑制作用。
圖3是Octreotide和主鏈環(huán)化促生長(zhǎng)素抑制素類似物PTR3046對(duì)大鼠生長(zhǎng)激素釋放的影響的圖示比較。
圖4是Octreotide和主鏈環(huán)化促生長(zhǎng)素抑制素類似物PTR3046對(duì)大鼠胰島素釋放的影響的圖示比較。
圖5是Octreotide和主鏈環(huán)化促生長(zhǎng)素抑制素類似物PTR3046對(duì)鈴蟾肽誘導(dǎo)后胰腺內(nèi)分泌釋放的影響的圖示比較。
圖6是PTR3046和Octreotide對(duì)MiaPaca-2細(xì)胞抗增殖效果的圖示比較。
發(fā)明的詳細(xì)描述這里所描述化合物具有不對(duì)稱中心。本發(fā)明包括所有的手性，非對(duì)映異構(gòu)，和外消旋形式。這里所描述的化合物中還存在很多烴的幾何異構(gòu)體等，本發(fā)明包括所有這樣穩(wěn)定的異構(gòu)體。
這里“穩(wěn)定化合物”或“穩(wěn)定結(jié)構(gòu)”指足以穩(wěn)定存在以從反應(yīng)混合物中分離至有用程度的純度，和配制成有效治療藥劑。
如這里和權(quán)利要求書中使用的，“烷基”或“亞烷基”意指包括具有1-10個(gè)碳原子的支鏈和直鏈飽和的脂肪烴基團(tuán)；“鏈烯基”意指包括具有2-10個(gè)碳原子和沿鏈任何穩(wěn)定位點(diǎn)存在的一個(gè)或多個(gè)不飽和的碳-碳鍵的直鏈或支鏈的構(gòu)型的烴鏈，例如乙烯基，丙烯基等；“炔烴基”意指包括具有2-10個(gè)碳原子和沿鏈任何穩(wěn)定位點(diǎn)存在的一個(gè)或多個(gè)碳-碳三鍵的直鏈或支鏈的構(gòu)型的烴鏈，例如乙炔基，丙炔基等。
如這里和權(quán)利要求書中使用的，“芳基”意指任何穩(wěn)定的5-至7-元單環(huán)或二環(huán)或7-至14-元二環(huán)或三環(huán)碳環(huán)，所有的環(huán)可以是飽和的，部分飽和的或芳香的，例如苯基，萘基，2,3-二氫化茚基，或十氫化萘,四氫化萘等。
如這里和權(quán)利要求書中使用的，“烷基鹵”意指包括具有1-10個(gè)碳原子，其中1-3個(gè)氫原子被鹵原子例如Cl,F,Br和I置換的支鏈和直鏈飽和的脂肪烴基團(tuán)。
如這里和權(quán)利要求書中使用的，詞組“治療有效量”指對(duì)受者施用新的主鏈環(huán)化的肽類似物或含有該類似物的組合物以達(dá)到對(duì)于這里所描述的病癥的期望的效果的量，所述病癥例如但不限于炎癥，癌癥，內(nèi)分泌失調(diào)和腸胃失調(diào)。
如這里和權(quán)利要求書中使用的，術(shù)語(yǔ)“取代的”指指定原子上的任何一個(gè)或幾個(gè)氫原子被選出的指定基團(tuán)置換，前提是指定原子正常價(jià)態(tài)不過(guò)剩，并且取代結(jié)果產(chǎn)生穩(wěn)定化合物。
當(dāng)任何變數(shù)(例如R,X,Z等)在任何組成或在任何結(jié)構(gòu)式中存在一次以上時(shí)，各存在情況下其定義獨(dú)立于任一其它存在情況下的其定義。而且只有如果組合產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物時(shí)才允許取代基和/或變數(shù)的組合。
如這里所使用的“肽”指肽鍵連接的氨基酸序列。本發(fā)明促生長(zhǎng)素抑制素肽類似物包括4-24個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，優(yōu)選6-14個(gè)殘基，每個(gè)殘基的特征在于具有一個(gè)氨基和一個(gè)羧基末端。
“結(jié)構(gòu)單元”指通式Ⅳ Nα-衍生的α氨基酸
式(Ⅳ)其中X是選自亞烷基，取代的亞烷基，亞芳基，環(huán)烯和取代的環(huán)烯的間隔基團(tuán)；R1是任選與特定保護(hù)基團(tuán)鍵合的氨基酸側(cè)鏈；和G是選自胺，硫醇，醇，羧酸和酯，和烷基鹵化物的官能團(tuán)；其結(jié)合到肽序列中并且順序地通過(guò)官能團(tuán)G與所述肽序列中氨基酸的側(cè)鏈之一或者與另一個(gè)ω-官能化氨基酸衍生物選擇性環(huán)化。
制備結(jié)構(gòu)單元的方法公開于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/IB95/00455，其在這里全文引作參考。結(jié)構(gòu)單元縮寫為相應(yīng)的修飾過(guò)的氨基酸的三字母碼，其后接反應(yīng)類型(N對(duì)于胺，C對(duì)于羧基)，和間隔亞甲基基團(tuán)數(shù)的指出。例如Gly-C2指用羧基反應(yīng)基和一個(gè)兩個(gè)碳的亞甲基間隔修飾的Gly殘基，Phe-N3指用氨基反應(yīng)基和一個(gè)三個(gè)碳的亞甲基間隔修飾的苯丙氨酸基團(tuán)。
這里所使用的“線性肽”指只由氨基酸殘基構(gòu)成的并且沒(méi)有任何結(jié)構(gòu)單元的肽序列。
這里所使用的“主鏈環(huán)化的肽”指含有至少一個(gè)可能已經(jīng)通過(guò)肽主鏈的α氮與另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元或者與序列中另一個(gè)氨基酸形成橋的結(jié)構(gòu)單元的線性肽的類似物。這里所使用的“成環(huán)前的肽”指除了保留在非環(huán)化形式中以作為生物或其它篩選測(cè)試期間的對(duì)照物外和環(huán)類似物相同的類似物。術(shù)語(yǔ)非環(huán)的可以與術(shù)語(yǔ)成環(huán)前的互換使用。這里使用一些縮寫來(lái)描述本發(fā)明和其制備和使用的方法。例如，AcOH指乙酸，Ada指金剛烷乙?；?，Adac指金剛烷羰基，Alloc指烯丙基氧基羰基，Boc指叔丁氧羰基，BOP指苯并三唑-1-基氧基-三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽，BSA指牛血清白蛋白，Cbz指芐氧羰基，DCC指二環(huán)己基碳化二亞胺，DCM指二氯甲烷，Dde指1-(4,4-二甲基-2,6-二氧環(huán)己基-1-亞基-乙基)，DIEA指二異丙基-乙基胺，DMF指二甲基甲酰胺，DPPA指二苯基磷?；B氮化物，Dtc指5,5-二甲基噻唑烷-4-羧酸，EDC指N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺，EDT指乙二硫醇，F(xiàn)moc指芴基甲氧羰基，GPI指豚鼠回腸，HATU指[O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓六氟磷酸鹽，HBTU指1-羥基苯并三唑基四甲基-尿鎓六氟磷酸鹽，HF指氫氟酸，HOBT指1-羥基苯并三唑，HPLC指高壓液相色譜，MALDI-TOF MS指基質(zhì)輻助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜，Mts指4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺?；?，NBT指氮藍(lán)四唑鎓，NMM指N-甲基嗎啉，NMP指1-甲基-2-吡咯烷酮，PBS指磷酸鹽緩沖鹽水，Pmc指五甲基苯并二氫吡喃-6-磺?；?，PNPP指磷酸對(duì)-硝基苯酯，PPA指1-丙磷酸環(huán)酐，PyBOP指苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸鹽，PyBrOP指溴-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸鹽，RT指室溫，SMPS指同時(shí)發(fā)生的多肽合成，SRIF指促生長(zhǎng)素釋放抑制因子，TBTU指2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓四氟硼酸鹽，t-Bu指叔丁基，TFA指三氟乙酸，TIS指三異丙基甲硅烷，Tpr指噻唑烷-4-羧酸，Trt指三苯甲游基，Ts指甲苯磺酰基。
本發(fā)明中所使用的氨基酸是商售的或者通過(guò)常規(guī)合成方法可得到的。一些殘基可能需要結(jié)合到肽中的特定方法，肽序列的按順序的，零散的和會(huì)聚性合成方法在本發(fā)明中是有用的。天然編碼氨基酸及其衍生物用根據(jù)IUPAC慣例的三字母碼代表。沒(méi)有指明時(shí)，用的是L異構(gòu)體。D異構(gòu)體用殘基縮寫前的“D”表示。列出非編碼氨基酸Abu指2-氨基丁酸，Aib指2-氨基-異丁酸，Cha指環(huán)己基丙氨酸，Hcys指高半胱氨酸，Hyp指S-順式-4-羥基脯氨酸，1Nal指1-萘基丙氨酸，2Nal指2-萘基丙氨酸，Nva指正纈氨酸，Oic指八氫吲哚羧酸，Phg指苯基甘氨酸，pClPhe指對(duì)-氯-苯丙氨酸，pFPhe指對(duì)-氟-苯丙氨酸，pNO2Phe指對(duì)-硝基-苯丙氨酸，Thi指噻吩基丙氨酸。合成途徑根據(jù)本發(fā)明，肽類似物是通過(guò)與允許新的非肽鍵的氨基酸的α氮連接的橋基而環(huán)化的。一般情況下，用來(lái)從其結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建這樣的肽類似物的方法依據(jù)已知的肽合成理論；最方便的是，根據(jù)已知的固相肽合成理論進(jìn)行該方法。該新方法需要用下面通式的新的結(jié)構(gòu)單元來(lái)置換肽序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸
其中R是氨基酸側(cè)鏈，X是間隔基團(tuán)，G是終端官能團(tuán)，通過(guò)該官能團(tuán)進(jìn)行環(huán)化作用。側(cè)鏈R是選擇來(lái)結(jié)合到選擇的肽序列中的任何天然的或合成的氨基酸的側(cè)鏈。X是為了實(shí)現(xiàn)肽類似物合適的構(gòu)象受限而選擇來(lái)提供更大或更小揉性度的間隔基團(tuán)。這樣的間隔基團(tuán)包括亞烷基鏈，取代的，支鏈的和不飽和的亞烷基，亞芳基，環(huán)烯，和不飽和的和取代的環(huán)烯。此外X和R可以結(jié)合生成雜環(huán)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案使用含有2-10個(gè)碳原子的亞烷基鏈。
要用于肽類似物環(huán)化作用的末端(ω)官能團(tuán)包括但不限于a．胺，用于與親電子試劑例如活化的羧基，醛和酮(有或沒(méi)有接下來(lái)的還原作用)，和烷基或取代的烷基鹵的反應(yīng)。b．醇，用于與親電子試劑例如活化的羧基的反應(yīng)。c．硫醇，用于生成二硫鍵和與親電子試劑例如活化的羧基，和烷基或取代的烷基鹵的反應(yīng)。d．1,2和1,3二醇，用于生成縮醛和縮酮。e．炔或取代的炔，用于與親核試劑例如胺，硫醇或陰碳離子；自由基；親電子試劑例如醛和酮，和烷基或取代的烷基鹵；或者有機(jī)金屬配合物反應(yīng)。f. 羧酸和酯，用于與親核試劑(有或沒(méi)有事先的活化)例如胺，醇，和硫醇的反應(yīng)。g．烷基或取代的烷基鹵或酯，用于與親核試劑例如胺，醇，硫醇和陰碳離子(來(lái)自活化的亞甲基，例如乙酰乙酸酯或丙二酸酯)反應(yīng)；和生成用于接下來(lái)的與烯烴或取代的烯烴和炔或取代的炔的反應(yīng)的游離基。h．烷基或芳基醛和酮，用于與親核試劑例如胺(有或沒(méi)有接下來(lái)的還原作用)，陰碳離子(來(lái)自活化的亞甲基，例如乙酰乙酸酯或丙二酸酯)，二硫醇(用于生成縮醛和縮酮)的反應(yīng)。i．烯或取代的烯，用于與親核試劑例如胺，硫醇，陰碳離子，游離基，或有機(jī)金屬配合物反應(yīng)。j．活化的亞甲基，例如丙二酸酯，乙酰乙酸酯，和其它，用于與親電子試劑例如醛和酮，烷基或取代的烷基鹵的反應(yīng)。
應(yīng)該理解，在肽的合成中，這些末端活性基團(tuán)，以及任何反應(yīng)性側(cè)鏈必須用合適的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。
用于胺的合適的保護(hù)基團(tuán)是烷基氧基，取代的烷基氧基，和芳基氧基羰基，包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)，芴基甲氧羰基(Fmoc)，烯丙基氧羰基(Alloc)和芐氧羰基(Z)。
用于環(huán)化作用的末端羧基可以被保護(hù)成其烷基酯或取代的烷基酯或硫酯或芳基酯或取代的芳基酯或硫酯。例子包括但不限于叔丁酯，烯丙酯，苯甲酯，2-(三甲基甲硅烷基)乙酯和9-甲基芴酯。
用于環(huán)化作用的硫醇基團(tuán)可以被保護(hù)成其烷基硫醚或取代的烷基硫醚或二硫化物或芳基硫醚或取代的芳基硫醚或二硫化物。這樣的基團(tuán)的例子包括但不限于叔丁基，三苯甲游基(三苯基甲基)，芐基，2-(三甲基甲硅烷基)乙基，pixyl(9-苯基咕噸-9-基)，乙酰胺基甲基，羧基甲基，2-硫-4-硝基吡啶。
另外技術(shù)人員還要理解各種反應(yīng)部分要通過(guò)不同的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，使其選擇性去除。因此，當(dāng)Nα被例如保護(hù)基團(tuán)A保護(hù)時(shí)，特定的氨基酸將與其肽序列中相鄰氨基酸偶聯(lián)。如果胺要被用作反應(yīng)方案中的環(huán)化作用的末端基團(tuán)時(shí)，Nω將會(huì)被保護(hù)基團(tuán)B保護(hù)，或者序列中所有的賴氨酸的ε氨基要用保護(hù)基團(tuán)C保護(hù)等。
正如肽合成領(lǐng)域所公知的，氨基酸相互偶聯(lián)是作為一系列反應(yīng)進(jìn)行的。本發(fā)明新的結(jié)構(gòu)單元，也就是Nα-ω官能化氨基酸衍生物結(jié)合到肽序列中來(lái)置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸。如果只選擇一個(gè)Nα-ω官能化氨基酸衍生物，則其將與序列中另一個(gè)氨基酸側(cè)鏈環(huán)化。例如(a)Nα-(ω-氨基亞烷基)氨基酸可以連接天冬氨酸或谷氨酸殘基的羧基；(b)Nα-(ω-羧基亞烷基)氨基酸可以連接賴氨酸殘基的ε-氨基；(c)Nα-(ω-硫代亞烷基)氨基酸可以連接半胱氨酸殘基的硫醇基；等等。本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案插入兩個(gè)這樣的可以相互連接生成N-主鏈與N-主鏈環(huán)肽類似物的Nα-ω官能化氨基酸衍生物。三個(gè)或多個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)單元可以插入到肽序列中，產(chǎn)生下面將利用的二環(huán)肽類似物。因此，肽類似物可以用兩個(gè)或多個(gè)環(huán)化作用構(gòu)建肽類似物，包括N-主鏈與N-主鏈，還有主鏈與側(cè)鏈或者任何其它肽環(huán)化作用。
如上所述，用來(lái)從新的結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建本發(fā)明促生長(zhǎng)素抑制素類似物的方法一般依據(jù)已知的肽合成理論。但是，應(yīng)該理解可能需要供應(yīng)本發(fā)明較大結(jié)構(gòu)單元的方法。固相肽化學(xué)中氨基酸的偶聯(lián)可以通過(guò)利用偶聯(lián)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，偶聯(lián)劑例如但不限于二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，雙(2-氧代-3-噁唑烷基)氯化膦(BOP-Cl)，苯并三唑基-N-氧三二甲基-氨基磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)，1-氧代-1-氯磷烷(Cpt-Cl)，羥基苯并三唑(HOBT)，或其混合物。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將下面的氨基酸偶聯(lián)到本發(fā)明大結(jié)構(gòu)單元上可能需要使用另外的偶聯(lián)劑，包括但不限于偶聯(lián)劑，例如PYBOp(苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸鹽)，PyBrOP(溴-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸鹽)，HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓六氟磷酸鹽)，TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓六氟硼酸鹽)。
可以使用新的偶聯(lián)化學(xué)試劑，例如預(yù)先生成的氨基甲酸乙酯保護(hù)的N-酸酐(UNCA’S)和預(yù)先形成的?；u最優(yōu)選酰氯。這樣的偶聯(lián)可以在室溫下發(fā)生，也可以在高溫下，在溶劑中，例如甲苯，DCM(二氯甲烷)，DMF(二甲基甲酰胺)，DMA(二甲基乙酰胺)，NMP(N-甲基吡咯烷酮)或上述溶劑的混合物。
本發(fā)明的一個(gè)目的是制備通式(Ⅰ)主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物的方法
式(Ⅰ)其中取代基如上定義；包括插入至少兩個(gè)式(Ⅲ)氨基酸的Nα-ω官能化衍生物步驟
式(Ⅲ)其中X是選自亞烷基，取代的亞烷基，亞芳基，環(huán)烯和取代的環(huán)烯的間隔基團(tuán)；R′是任選與特定保護(hù)基團(tuán)鍵合的氨基酸側(cè)鏈例如H,CH3等；B是選自烷基氧基，取代的烷基氧基或芳基羰基的保護(hù)基團(tuán)；和G是選自胺，硫醇，醇，羧酸和酯，醛，醇和烷基鹵化物的官能團(tuán)；和A是G的特定保護(hù)基團(tuán)；進(jìn)入肽序列，得到下式化合物
式(Ⅳ)(ⅱ)選擇性去除保護(hù)基A和A′，并且與末端基團(tuán)G和G′反應(yīng)生成下式化合物
式(Ⅰ)其中d,e和f各自獨(dú)立地是1-10的整數(shù)；(AA)是氨基酸殘基，其中每條鏈中的氨基酸殘基可以相同或不同；E是羥基，羧基保護(hù)基或氨基；R和R′各自是氨基酸側(cè)鏈，例如H,CH3等；線代表下式橋基-X-M-Y-W-Z-其中M和W獨(dú)立地選自二硫化物，酰胺，硫醚，亞胺，醚，和鏈烯烴；X,Y和Z各自獨(dú)立地選自亞烷基，取代的亞烷基，亞芳基，環(huán)烯和取代的環(huán)烯；(ⅲ)去除所有的剩余的保護(hù)基團(tuán)，得到式(Ⅰa)化合物。
以相同方法制備二環(huán)類似物，就是通過(guò)重復(fù)步驟(ⅱ)和(ⅲ)。通過(guò)選擇保護(hù)基來(lái)進(jìn)行確定哪一個(gè)殘基是與其它殘基環(huán)化的測(cè)定。各種各樣的保護(hù)基可以選擇性去除，從而露出用于環(huán)化的選擇的反應(yīng)基。
優(yōu)選的是制備式(Ⅰ)主鏈環(huán)化的肽類似物的方法，其中G是胺，硫醇或羧基；R和R1各自不是H，例如CH3,(CH3)2CH-,(CH3)2CHCH2-,CH3CH2CH(CH3)-,CH3S(CH2)2-,HOCH2-,CH3CH(OH),HSCH2-,NH2C(=O)CH2-,NH2C(=O)(CH2)2-,HOC(=O)CH2-,HOC(=O)(CH2)2-,NH2(CH2)4-,C(NH2)2NH(CH2)3-,HO-苯基-CH2-，芐基，甲基吲哚，和甲基咪唑，和其中E共價(jià)連接于不溶的聚合物載體。
本發(fā)明另一個(gè)目的是制備通式(Ⅱ)主鏈環(huán)化的肽類似物的方法H(AA)d-N-CH(R1)-CO-(AA)e-NH-CH-CO-(AA)f-E式(Ⅱ)其中取代基如上定義；包括插入至少一個(gè)通式(Ⅲ)ω官能化氨基酸衍生物步驟
式(Ⅲ)其中X是選自亞烷基，取代的亞烷基，亞芳基，環(huán)烯和取代的環(huán)烯的間隔基團(tuán)；R是氨基酸側(cè)鏈例如H,CH3等；B是選自烷基氧基，取代的烷基氧基或芳基氧基羰基的保護(hù)基團(tuán)；和G是選自胺，硫醇，醇，羧酸和酯或烷基鹵化物的官能團(tuán)；和A是其保護(hù)基團(tuán)；進(jìn)入肽序列，并且順序地與所述肽序列中氨基酸側(cè)鏈中的一個(gè)選擇性環(huán)化官能團(tuán)。
優(yōu)選的是制備式(II)主鏈環(huán)化的肽類似物的方法，其中G是羧基或硫醇基；R是CH3,(CH3)2CH-,(CH3)2CHCH2-,CH3CH2CH(CH3)-,CH3S(CH2)2-,HOCH2-,CH3CH(OH),HSCH2-,NH2C(=O)CH2-,NH2C(=O)(CH2)2-,HOC(=O)CH2-,HOC(=O)(CH2)2-,NH2(CH2)4-,C(NH2)2NH(CH2)3-,HO-苯基-CH2-，芐基，甲基吲哚，和甲基咪唑，和其中E共價(jià)連接于不溶的聚合物載體。制備主鏈與側(cè)鏈環(huán)化肽制備期望的主鏈環(huán)化的肽的優(yōu)選的方法包括在固相載體上逐步合成線性肽和在固體載體上或者在從載體上脫離下來(lái)以后將肽主鏈環(huán)化。C-末端氨基酸通過(guò)羧酸酯或者其它鍵例如酰胺共價(jià)鍵合不溶性聚合物載體。這樣的載體的例子是聚苯乙烯-共-二乙烯基苯樹脂。使用的聚合物載體是與象Fmoc和Boc這樣的化學(xué)部分相容的那些，包括例如PAM樹脂，HMP樹脂和氯甲基化樹脂。樹脂鍵合的氨基酸例如用TFA去保護(hù)，并且用偶聯(lián)劑象BOP向其上偶聯(lián)第二個(gè)在Nα上例如被Fmoc保護(hù)的氨基酸。第二個(gè)氨基酸用例如20％吡啶的DMF溶液去保護(hù)。然后可以偶聯(lián)下面的保護(hù)的氨基酸并且在室溫下去保護(hù)。數(shù)個(gè)偶聯(lián)和去保護(hù)循環(huán)后得到肽，向期望的肽偶聯(lián)具有例如羧基側(cè)鏈的氨基酸。一種這樣的氨基酸是Fmoc-天冬氨酸叔丁酯。將NαFmoc保護(hù)基去保護(hù)后，再次通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法將肽延長(zhǎng)。去保護(hù)后，用例如偶聯(lián)劑BOP向肽樹脂偶聯(lián)用于主鏈環(huán)化的結(jié)構(gòu)單元。一種這樣的結(jié)構(gòu)單元是例如Fmoc-Nα-(ω-Boc-氨基亞烷基)氨基酸。去保護(hù)后通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法將肽延長(zhǎng)至期望的長(zhǎng)度。用這樣的偶聯(lián)劑例如PyBrOP進(jìn)行接著該結(jié)構(gòu)單元的保護(hù)的氨基酸的偶聯(lián)以保證高產(chǎn)率。制備了線性，樹脂結(jié)合的肽后，通過(guò)弱酸例如TFA去除共-亞烷基保護(hù)基團(tuán)，例如Boc和t-Bu。然后將樹脂鍵合的肽分成幾份。使一部分用例如TBTU為環(huán)化劑在DMF中在樹脂上進(jìn)行環(huán)化作用以保證環(huán)化作用的高產(chǎn)率，得到N-主鏈與側(cè)鏈環(huán)肽樹脂。在樹脂上環(huán)化后，通過(guò)試劑例如哌啶去除末端氨基保護(hù)基，用強(qiáng)酸例如HF處理后得到主鏈與側(cè)鏈環(huán)肽。或者，在從樹脂上去除主鏈環(huán)肽之前，用試劑例如乙酸酐，苯甲酸酐或任何其它酸例如偶聯(lián)劑例如BOP活化的金剛烷羧酸，通過(guò)酰化來(lái)保護(hù)末端氨基。
肽-樹脂的另一部分進(jìn)行用于環(huán)化的側(cè)鏈保護(hù)，例如ω-氨基和羧基。這通過(guò)使ω-氨基和例如Ac2O和DMAP在DMF中反應(yīng)，并且通過(guò)例如DIC和HOBT活化游離的ω-羧基，得到活性酯，其然后與例如CH3NH2反應(yīng)，得到環(huán)肽的非環(huán)類似物來(lái)進(jìn)行。從樹脂上去除肽，接著通過(guò)強(qiáng)酸例如HF去除側(cè)鏈保護(hù)基，得到主鏈與側(cè)鏈環(huán)化的肽的非環(huán)類似物。
線性和/或非環(huán)的類似物被用作其相應(yīng)的環(huán)化合物的生物活性的參照化合物。產(chǎn)生主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素庫(kù)的合成方法制備本發(fā)明環(huán)肽庫(kù)的一般方法包括應(yīng)用正交保護(hù)方案的固相肽合成，其使鏈延長(zhǎng)，選擇性去除保護(hù)基，環(huán)化保護(hù)的肽和在從樹脂上裂解下來(lái)或未裂解下來(lái)時(shí)去除所有的側(cè)鏈保護(hù)基。期望以基本上相同的量在庫(kù)中存在不同的肽序列。
偶聯(lián)反應(yīng)通過(guò)產(chǎn)生酰胺鍵或酯鍵的方法進(jìn)行，并且通過(guò)如這里所述本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。典型的偶聯(lián)劑是碳化二亞胺，活化的酸酐和酯和酰鹵。試劑例如EDC,DCC,DPPA,PPA,BOP,PyBOP,PyBrOP,HATU,TBTU,HOBT和N-羥基琥珀酰亞胺是典型的。
完成固相肽延長(zhǎng)后，通過(guò)任何方案，肽的部分通過(guò)與結(jié)構(gòu)單元的主鏈胺鍵合的氮連接的橋基環(huán)化。優(yōu)選非環(huán)化形式中保留的部分用作生物或其它篩選測(cè)試中的對(duì)照。含有與主鏈環(huán)化的庫(kù)相同但是避免后者構(gòu)象受限的結(jié)構(gòu)單元的肽類似物庫(kù)的這部分稱之為“成環(huán)前的”。或者，在任何合成方案中，可以進(jìn)行主鏈環(huán)化步驟，然后另外進(jìn)行氨基酸殘基的偶聯(lián)循環(huán)。
肽部分可以從樹脂上裂解下來(lái)，并且去除保護(hù)基，這在生物活性測(cè)試之前是必須的。通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法從樹脂載體上裂解肽，具體方法取決于樹脂的特性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解去除某些保護(hù)基可以和從樹脂上裂解肽同時(shí)進(jìn)行。
一般情況下，樹脂和第一個(gè)氨基酸之間的偶聯(lián)會(huì)生成酯鍵，當(dāng)其從樹脂上裂解時(shí)會(huì)在肽上得到羧酸基團(tuán)。例舉的是HMPB,Rink,PAM,Hycram和羥甲基樹脂。另外，羧基末端氨基酸基團(tuán)可以轉(zhuǎn)化成酰胺，酯，或者還原為末端醇。
每個(gè)氨基酸或肽的側(cè)鏈的反應(yīng)官能團(tuán)如肽領(lǐng)域公知的合適地保護(hù)。例如Boc,Cbz或Fmoc基團(tuán)可以用來(lái)保護(hù)氨基，特別是α-氨基。烷基(例如t-Bu,Me),cHex，芐基或烯丙基酯可以用來(lái)保護(hù)Asp或Glu的側(cè)鏈羧基。芐基，或者合適地被取代的芐基，三苯甲游基，Alloc或T-Bu基團(tuán)用來(lái)保護(hù)半胱氨酸的巰基，或者其它含有硫醇的殘基；或者Tyr,Ser或Thr的羥基。Cys和其它含硫的氨基酸也可以通過(guò)Acm基團(tuán)或者通過(guò)與硫代烷基(例如乙硫醇)或硫代芳基生成二硫化物來(lái)保護(hù)。芐基/芐基氧基甲基，或合適地被取代的芐基/芐基氧基甲基，Boc或甲?；梢杂脕?lái)保護(hù)His的咪唑基；Pmc，硝基，或合適地被取代的苯磺?；?例如Ts,Mts)用于保護(hù)胍氮或Arg。鄰苯二酰胺，Boc,Fmoc,Alloc，羧基芐基氧基或芐基，或者合適地被取代的芐基或芐基氧基可以用來(lái)保護(hù)賴氨酸的ε-氨基。芐氧羰基或芐基保護(hù)基合適的取代作用是用1-5個(gè)氯，溴，硝基，甲氧基或甲基，通常是在鄰位和/或?qū)ξ蝗〈?，并且用?lái)改變保護(hù)基的反應(yīng)性。這些保護(hù)基通過(guò)這樣的方法去除，如催化氫化，液氨中的鈉，肼，堿，TFA或HF處理，這是本領(lǐng)域公知的。選擇對(duì)側(cè)鏈保護(hù)基的選擇，使其在用來(lái)將在生成肽鏈的肽主鏈的偶聯(lián)反應(yīng)中使用的反應(yīng)官能團(tuán)(例如一般是α-氨基)去保護(hù)的條件下不被去除。反應(yīng)性官能團(tuán)的保護(hù)基在偶聯(lián)每一個(gè)順序氨基酸之前去除。
根據(jù)使用正交保護(hù)方案的本發(fā)明使用結(jié)構(gòu)單元(例如式Ⅳ中的G)的橋基，使得在不影響在側(cè)鏈上保護(hù)基團(tuán)或者從樹脂上裂解肽的條件下，選擇性去除這些保護(hù)基團(tuán)。這使得在優(yōu)選合成地樹脂上主鏈環(huán)化?；蛘咄耆Ｗo(hù)的肽可以從樹脂上去除，在選擇性去除結(jié)構(gòu)單元保護(hù)基后在溶液中進(jìn)行環(huán)化。
環(huán)化反應(yīng)通過(guò)選擇性偶聯(lián)一個(gè)結(jié)構(gòu)單元的橋基和另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元的橋基或氨基酸側(cè)鏈來(lái)進(jìn)行。作為舉例，PyBOP是生成酰胺鍵情況下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的特別有用的試劑。為了生成二硫橋，使用氧化條件。
在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中氨基酸序列骨架以來(lái)自具有促生長(zhǎng)素抑制素活性的天然或合成肽的已知的活性序列為基礎(chǔ)。因此通過(guò)使活性構(gòu)象剛性化有可能進(jìn)一步提高這些已知序列的活性。
某些位置上的氨基酸被主鏈環(huán)化作用結(jié)構(gòu)單元或者被天然的和非天然的三官能的氨基酸例如Asp,Glu,Cys,Hcys,Lys,Om和D對(duì)應(yīng)物置換。這樣的位置及結(jié)構(gòu)尋找通過(guò)改變環(huán)化作用的位置，環(huán)與主鏈的連接，環(huán)化作用位置處的手性，成環(huán)鍵，環(huán)的大小和環(huán)中鍵的準(zhǔn)確位置來(lái)進(jìn)行。也可以結(jié)合改變肽的氨基酸序列來(lái)進(jìn)行這些變化。促生長(zhǎng)素抑制素類似物庫(kù)的一般合成為了確定最佳化合物，產(chǎn)生不同受限類似物庫(kù)后進(jìn)行了篩選。用常規(guī)固相合成(本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的)在TentaGel酰胺樹脂(0.2-0.3mmol/g取代度)上合成肽庫(kù)。在大多數(shù)情況下用NMP為溶劑，少數(shù)情況下用DMF。合成規(guī)模是庫(kù)中或子庫(kù)中每一種肽0.2-2μmol。除非另有說(shuō)明，所有的反應(yīng)都是在室溫下進(jìn)行的。
在其中一個(gè)以上氨基酸被偶聯(lián)的每一偶聯(lián)步驟中，將樹脂分成合適的分?jǐn)?shù)，向各部分加入不同的氨基酸。進(jìn)行偶聯(lián)，對(duì)于每一位置，用3摩爾過(guò)量每種氨基酸，3摩爾過(guò)量PyBrop和6摩爾過(guò)量的DIEA偶聯(lián)1-16小時(shí)，偶聯(lián)兩次。所有的氨基酸用FMOC以其α-胺被保護(hù)。側(cè)鏈保護(hù)如下His(Trt)；Lys(Boc或Dde)；Orn(Boc)；Ser(tBu)；Thr(tBu)；Tyr(tBu)。
兩次偶聯(lián)后，洗滌樹脂部分，再化合，并且用20％哌啶的NMP溶液進(jìn)行FMOC去保護(hù)共20-40分鐘。另外洗滌后樹脂又被分開(如果需要)，用于下一個(gè)氨基酸(多個(gè)氨基酸)的偶聯(lián)。
環(huán)化之前，通過(guò)用溶解于含有2.5％AcOH和5％NMM的氯仿中的2摩爾當(dāng)量(1當(dāng)量用于肽中一個(gè)烯丙基/Alloc分子)的Pd(PPh3)4的溶液處理2-2.5小時(shí)或者處理1小時(shí)兩次，來(lái)去除結(jié)構(gòu)單元的胺和羧基的烯丙基/Alloc保護(hù)，用上述沒(méi)有鈀的溶液在處理前和處理后洗滌樹脂，另外在去除過(guò)程后用NMP洗滌樹脂。
用DCM洗滌后，通過(guò)用TFA70％,H2O5％,TIS1％,EDT2.5％,DCM(混合物A)或TFA70％,H2O5％,TIS1％，苯酚5％,DCM(混合物B)或TFA60％,H2O10％和30％DCM(混合物C)加另外用純TFA洗滌兩次處理，從樹脂部分裂解肽。將每種樹脂部分的三份裂解溶液收集在一起，用氮汽蒸發(fā)，向每個(gè)樣品中加入0.5-1ml水后凍干。然后在C-18 SEP-PAK(Millipore Corp.)上部分純化肽混合物，用0.1％乙酸或TFA水溶液為緩沖液A,50-80％于0.1％乙酸中的乙腈/水為緩沖液B，并凍干。
每個(gè)合成的子庫(kù)用質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)和氨基酸分析表征。
結(jié)構(gòu)單元縮寫成相應(yīng)的修飾過(guò)的氨基酸的三字母碼，后面接反應(yīng)基類型(N對(duì)于胺，C對(duì)于羧基)，和間隔亞甲基數(shù)目的指示。例如，Gly-C2指帶有羧基反應(yīng)基和兩個(gè)碳亞甲基間隔的修飾的Gly殘基，Phe-N3指帶有氨基反應(yīng)基和三個(gè)碳亞甲基間隔的修飾的苯丙氨酸基團(tuán)。促生長(zhǎng)素抑制素類似物的一般篩選合成的促生長(zhǎng)素抑制素類似物一般在體外測(cè)試其對(duì)天然肽(SRIF-14)結(jié)合其7-跨膜受體的抑制作用，和其對(duì)第二信使和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；和體內(nèi)測(cè)試對(duì)激素和酶分泌的抑制作用。
進(jìn)一步在體外測(cè)試類似物對(duì)環(huán)腺苷一磷酸(cAMP)水平，酪氨酸磷酸酶活性，生長(zhǎng)激素分泌和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。體內(nèi)對(duì)庫(kù)進(jìn)一步測(cè)試對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)激素釋放，淀粉酶，胃酸，胰島素和胰高血糖素分泌的抑制作用。作為選擇參數(shù)的代謝穩(wěn)定性測(cè)試通過(guò)在血清或組織勻漿中溫育，分離蛋白質(zhì)，并且在溫育之前和之后通過(guò)HPLC記錄肽峰，通過(guò)其對(duì)酶降解的抗性來(lái)測(cè)試類似物的穩(wěn)定性。不隨延長(zhǎng)的溫育時(shí)間變化的肽峰是最穩(wěn)定的。分離這些峰，并用質(zhì)譜，N-末端序列和與純化的肽峰的比較來(lái)表征。在該方法中快速鑒定了來(lái)自庫(kù)或子庫(kù)的最穩(wěn)定的肽。
部分以已知的生物活性肽的數(shù)目的序列為基礎(chǔ)或者以事先不知道的新的序列為基礎(chǔ)構(gòu)成的構(gòu)象受限的促生長(zhǎng)素抑制素類似物在下面的實(shí)施例中說(shuō)明。
下面的實(shí)施例是為了詳細(xì)說(shuō)明怎樣制備和使用這些化合物和本發(fā)明方法，在任何方面不作為一種限制。實(shí)施例合成實(shí)施例合成不同系列促生長(zhǎng)素抑制素類似物，或者作為獨(dú)立的主鏈環(huán)化的肽或者作為庫(kù)。
分別合成和表征本發(fā)明相應(yīng)于通式(Ⅴa)的三系列Octreotide促生長(zhǎng)素抑制素類似物，并且測(cè)試其生物活性。
1)第一系列化合物相應(yīng)于通式(Ⅴa)，其中R5是(D)Phe；R7是Phe；R10是Thr；R12是Thr。因此該系列包括下式化合物H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-R11-Thr-NH2其中R6和R11是Nαω-官能化的亞烷基氨基酸結(jié)構(gòu)單元。
2)第二系列化合物相應(yīng)于通式(Ⅴa)，其中R5是(D)Phe；R7是Phe；R10不存在；R11是Thr。因此該系列包括下式化合物H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R11-Thr-NH2其中R6和R11是Nαω-官能化的亞烷基氨基酸結(jié)構(gòu)單元。
3)第三系列化合物相應(yīng)于通式(Ⅴa)，其中R5是(D)Phe；R7是Phe。因此該系列包括下式化合物H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2其中R6和R11是Nαω-官能化的亞烷基氨基酸結(jié)構(gòu)單元。
這些其中插入Nαω-官能化氨基酸結(jié)構(gòu)單元的新的合成的肽類似物的結(jié)構(gòu)總結(jié)在表1,2和3中。在這三個(gè)系列中，使用的結(jié)構(gòu)單元甘氨酸結(jié)構(gòu)單元，其中改變了通過(guò)α氮與肽主鏈連接的橋基。
為了簡(jiǎn)化起見(jiàn)，這三個(gè)系列在這里分別記為SST Gly6,Gly11；SST Gly6,Gly10；及SST Gly6Gly11R10R1-。
在各系列中，環(huán)化點(diǎn)的位置是不變的；在第一和第二系列中，改變了橋的長(zhǎng)度和取向，而在第三系列中，橋不變而改變了位置10和12處的殘基。因此，C2,N2指由酰胺鍵組成的橋，其中羰基緊鄰肽的氨基端，其在橋酰胺和橋中包括的主鏈氮的每一個(gè)之間含有兩個(gè)碳原子的亞甲基。
肽的裝配可以用人工或者用自動(dòng)肽合成儀(Applied,BiosystemsModel 433A)進(jìn)行。肽裝配之后，生成環(huán)化臂的橋基的去保護(hù)在烯丙基/Alloc保護(hù)基情況下用Pd(PPh3)4(四三苯基膦鈀)進(jìn)行，或者在tBu/Boc保護(hù)基情況下用TFA進(jìn)行。為了獲得非環(huán)類似物，在該階段從樹脂上裂解肽。用PyBOP進(jìn)行肽的環(huán)化。從聚合物載體上裂解肽根據(jù)使用的肽的類型用合適的試劑進(jìn)行，例如對(duì)于Rink酰胺類型樹脂用TFA，對(duì)mBHA(對(duì)-甲基二苯甲基胺)型樹脂用HF。粗產(chǎn)物用HPLC分析表征。通過(guò)制備反相HPLC純化肽。純化的產(chǎn)物用HPLC分析，質(zhì)譜，和氨基酸分析來(lái)表征。
表1 SST Gly6,Gly11類似物
*線性指帶有R6和R11位置沒(méi)有衍生物化的Gly殘基的相同的序列。**NA指沒(méi)有得到。表1方法1)在mBHA樹脂上人工合成。HF裂解。
2)在Rapp TentaGel樹脂上人工合成。TFA裂解。
3)Rink樹脂；在自動(dòng)肽合成儀中裝配，0.1mmol規(guī)模。
表2 SST Gly6,Gly10類似物
線性指帶有R6和R10位置Gly殘基的相同的序列。**這些類似物由其中N末端D-Phe5不存在和N-末端?；南嗤腟ST序列組成。表2方法1)在自動(dòng)肽合成儀中裝配，0.1mmol規(guī)模。(HBTU)。
2)人工合成；PyBrop。
3)在自動(dòng)肽合成儀中裝配，0.25mmol規(guī)模。(HBTU)。
表3．以H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2為基礎(chǔ)的促生長(zhǎng)素抑制素類似物<
實(shí)施例41.SST Gly6,Gly10N3,C2類似物的詳細(xì)合成在裝備有燒結(jié)玻璃底的反應(yīng)器中用N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶脹5克Rink酰胺樹脂(NOVA)(0.49mmol/g)，并且置于搖動(dòng)器上。通過(guò)用20％哌啶的NMP溶液反應(yīng)(10分鐘2次，每次25ml)從樹脂上去除Fmoc保護(hù)基。在290nm處紫外吸收測(cè)定監(jiān)測(cè)去除Fmoc。室溫下，用NMP(20ml)中Fmoc-Thr(OtBu)-OH(3當(dāng)量)PyBrop(3當(dāng)量)DIEA(6當(dāng)量)進(jìn)行偶聯(lián)循環(huán)2小時(shí)。通過(guò)定性水合茚三酮測(cè)試(Kaiser測(cè)試)監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。偶聯(lián)后，用NMP洗滌肽-樹脂(用25mlNMP7次，每次2分鐘)。通過(guò)肽-樹脂與乙酸酐(封端混合物HOBt 400mg,NMP20ml，乙酸酐10ml,DIEA4.4ml)在室溫下反應(yīng)0.5小時(shí)進(jìn)行封端。封端后，如上所述進(jìn)行NMP洗滌(7次，每次2分鐘)。如上所述進(jìn)行Fmoc去除。以相同方式偶聯(lián)Fmoc-Phe-OH,并且如上所述去除Fmoc基團(tuán)。肽樹脂與Fmoc-Gly-C2(烯丙基)結(jié)構(gòu)單元反應(yīng)偶聯(lián)條件和上述一樣。如上進(jìn)行Fmoc去除。通過(guò)與HATU(3當(dāng)量)和DIEA(6當(dāng)量)在室溫下反應(yīng)過(guò)夜后在50E反應(yīng)1小時(shí)將Fmoc-Lys(Boc)-OH偶聯(lián)到肽樹脂上。反應(yīng)期間加入另外的DIEA以保持堿性介質(zhì)(如pH試紙測(cè)定是大約9)。重復(fù)偶聯(lián)。通過(guò)Fmoc測(cè)試監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全(取肽樹脂并稱重，如上去除Fmoc，并且測(cè)定紫外吸收)。如上所述，用PyBrop將Fmoc-D-Trp-OH與肽樹脂偶聯(lián)。去除Fmoc后，以相同方式偶聯(lián)Fmoc-Phe-OH。用1/5肽樹脂繼續(xù)合成。
去除Fmoc后，引入第二個(gè)結(jié)構(gòu)單元如上所述，用PyBrop反應(yīng)Fmoc-Gly-N3(Alloc)-OH。如上所述進(jìn)行封端。去除Fmoc后，將肽樹脂分為兩個(gè)相等的部分。用這些部分之一繼續(xù)合成。如上對(duì)于Fmoc-Lys(Boc)-OH所述，通過(guò)用HATU反應(yīng)偶聯(lián)Fmoc-D-Phe-OH。如上所述進(jìn)行封端。
通過(guò)在氬氣下在室溫下，用Pd(PPh3)4和乙酸5％，于氯仿中的嗎啉2.5％反應(yīng)2小時(shí)，去除烯丙基和Alloc。如上所述用NMP洗滌肽樹脂。取2/3樹脂用于環(huán)化。用PyBOP 3當(dāng)量，DIEA6當(dāng)量，于NMP中進(jìn)行環(huán)化作用，在室溫下過(guò)夜。洗滌肽樹脂并干燥。通過(guò)用TFA81.5％，苯酚5％，水5％,EDT2.5％,TIS(三異丙基-硅烷)1％，和5％二氯甲烷在0EC下反應(yīng)15分鐘和在室溫下在氬氣下反應(yīng)2小時(shí)，從樹脂上裂解肽?；旌衔镞^(guò)濾到冷的醚(30ml,OEC)中，樹脂用少量TFA洗滌。濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，并且去除所有的揮發(fā)成分。得到油狀產(chǎn)物。用乙醚研制并且潷析乙醚，三次。得到白色粉末。干燥該粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物的重量是93mg。
根據(jù)式Ⅴb的另一系列新的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物是各個(gè)合成的，包括如下1)七肽系列NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe-Thr-NH22)七肽系列NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-R10-NPhe-R12-NH23)七肽系列NPhe-Phe-Trp-Lys-Gly-NPhe-R12-NH2在第一系列中(表4)，改變橋的長(zhǎng)度和取向，而在第二系列中(表5)和在第三系列中(表6)，改變位置10和/或12處的殘基。
表4．以R6-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-R11-Thr-NH2為基礎(chǔ)的七肽促生長(zhǎng)素抑制素類似物
*PTR-3046表5．以R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2為基礎(chǔ)的另外的七肽促生長(zhǎng)素抑制素類似物
表6．以R6-Phe-Trp-Lys-Gly-R11-R12-NH2為基礎(chǔ)的七肽促生長(zhǎng)素抑制素類似物
實(shí)施例61．PTR3046的詳細(xì)合成在裝備有燒結(jié)玻璃底的反應(yīng)器中在NMP中溶脹1克Rink酰胺MBHA樹脂(NOVA)(0.55mmol/g)，并且置于搖動(dòng)器上。通過(guò)用20％哌啶的NMP溶液反應(yīng)(15分鐘2次，每次5ml)從樹脂上去除Fmoc保護(hù)基。用水合茚三酮測(cè)試監(jiān)測(cè)Fmoc的去除。室溫下，用NMP(5ml)中Fmoc-Thr(OtBu)-OH(4當(dāng)量)PyBrop(4當(dāng)量)DIEA(12當(dāng)量)進(jìn)行偶聯(lián)循環(huán)0.5小時(shí)。通過(guò)定性水合茚三酮測(cè)試(Kaiser測(cè)試)監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。偶聯(lián)后，用NMP洗滌肽-樹脂(用5ml NMP 3次，每次2分鐘)。通過(guò)肽-樹脂與乙酸酐(封端混合物HOBt 40mg,NMP 5ml，乙酸酐1ml,DIEA 0.5ml和DNAP(cat))在室溫下反應(yīng)0.5小時(shí)進(jìn)行封端。封端后，如上所述進(jìn)行NMP洗滌。如上所述進(jìn)行Fmoc去除。偶聯(lián)Fmoc-Phe(C3)-烯丙基BU(BU 2當(dāng)量，PyBrop 2當(dāng)量DIEA6當(dāng)量，NMP 5ML,0.5小時(shí))，并且如上所述去除Fmoc基團(tuán)。如上洗滌肽樹脂。肽樹脂通過(guò)雙偶聯(lián)與Fmoc-Val-Cl(4當(dāng)量，colidingl 2當(dāng)量，1小時(shí)，38C)反應(yīng)。根據(jù)二肽至三肽的轉(zhuǎn)化監(jiān)測(cè)偶聯(lián)完全(裂解肽樹脂樣品，使粗三肽進(jìn)行HPLC(0.1％水/乙腈))。如上進(jìn)行Fmoc去除。通過(guò)和對(duì)于Fmoc-Thr(OtBu)-OH一樣的反應(yīng)條件(參見(jiàn)上文)將Fmoc-Lys(Boc)-OH偶聯(lián)到肽樹脂上。通過(guò)水合茚三酮測(cè)試監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。如上所述，用PyBrop將Fmoc-D-Trp-OH與肽樹脂偶聯(lián)。去除Fmoc后，以相同方式偶聯(lián)Fmoc-Tyr(tBu)-OH。去除Fmoc后，引入第二個(gè)結(jié)構(gòu)單元如上對(duì)于Fmoc-Phe(C3)-烯丙基B所述，用PyBrop反應(yīng)Fmoc-Phe-N2(Alloc)-OH。通過(guò)用Pd(PPh3)4和乙酸5％，N-甲基嗎啉2.5％于氯仿中在氬氣下在室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)，去除烯丙基和Alloc保護(hù)基。如上所洗滌肽樹脂。用PyBOP 3當(dāng)量，DIEA 6當(dāng)量，于NMP中進(jìn)行環(huán)化作用，在室溫下反應(yīng)0.5小時(shí)。如上洗滌肽樹脂。去除Fmoc后，洗滌肽樹脂(DCM3×5ml)，干燥，并且通過(guò)用TFA94％，水2.5％,EDT2.5％,TIS(三異丙基-硅烷)1％在0℃下反應(yīng)15分鐘和在室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)，從樹脂上裂解肽?；旌衔镞^(guò)濾，樹脂用少量TFA洗滌。濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，并且去除所有的揮發(fā)成分。得到油狀產(chǎn)物。用乙醚研制并且潷析乙醚。得到黃色粉末。干燥該粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物的重量是290mg。各促生長(zhǎng)素抑制素類似物的其它實(shí)施例表7中總結(jié)了本發(fā)明制備的新的促生長(zhǎng)素抑制素類似物的另外的各實(shí)施例。
表7．合成的其它促生長(zhǎng)素抑制素類似物
促生長(zhǎng)素抑制素類似物庫(kù)促生長(zhǎng)素抑制素序列中氨基酸的位置數(shù)目是以天然的促生長(zhǎng)素抑制素肽為基礎(chǔ)的(SRIF-14,Raynor等，上文)。實(shí)施例68VH-SST1庫(kù)將該庫(kù)設(shè)計(jì)成5個(gè)最后子庫(kù)中含有40個(gè)主鏈環(huán)肽，每一個(gè)包含8個(gè)不同的肽。
在最后偶聯(lián)步驟之前(R5)，將樹脂分成5部分，對(duì)于每部分用不同的AA進(jìn)行偶聯(lián)，得到不同的子庫(kù)用于下面步驟。這5個(gè)部分是表8中描述的子庫(kù)，其表明用于產(chǎn)生40個(gè)類似物的每個(gè)位置所使用的全部殘基。
表8．VH-SST1庫(kù)的組成
實(shí)施例69IG-SST1庫(kù)在該庫(kù)中，帶有Gly-C2的位置6和帶有Gly-N2的位置10之間的橋是不變的。庫(kù)包含在4個(gè)子庫(kù)中的36個(gè)肽其R5殘基不同。該庫(kù)的組成見(jiàn)表9。
表9．IG-SST1庫(kù)的組成
實(shí)施例70YS-SST1庫(kù)該庫(kù)代表在如表10所述的4個(gè)子庫(kù)中的16個(gè)類似物。通過(guò)4個(gè)不同的橋基(位置R6和位置R11或R10之間)定義了這些子庫(kù)，每個(gè)子庫(kù)包含4個(gè)類似物。
表10．YS-SST1庫(kù)的組成<
實(shí)施例71YS-SST2庫(kù)該庫(kù)包含4個(gè)子庫(kù)中的48個(gè)肽。該子庫(kù)其R7殘基不同，并且每個(gè)子庫(kù)包含12個(gè)肽。這些庫(kù)的組成見(jiàn)表11。
表11．YS-SST2庫(kù)的組成<
實(shí)施例72YS-SST3庫(kù)該庫(kù)包含2個(gè)子庫(kù)中的12個(gè)肽。這些子庫(kù)其R6結(jié)構(gòu)單元不同，并且每個(gè)子庫(kù)包含6個(gè)肽。該庫(kù)的組成見(jiàn)表12。
表12．YS-SST3庫(kù)的組成<
實(shí)施例73YS-SST4庫(kù)該庫(kù)包含2個(gè)子庫(kù)中的48個(gè)肽。這些子庫(kù)B不同于A，如表13所示在R5位置存在Thr。
表13．YS-SST3庫(kù)的組成
實(shí)施例74YS-SST5A和B庫(kù)設(shè)計(jì)這些庫(kù)用來(lái)優(yōu)化位置6和11之間橋的大小和取向，同時(shí)確定位置5處各種萘基丙氨酸殘基的影響。YS-SST-5A庫(kù)由4個(gè)子庫(kù)組成，每個(gè)子庫(kù)有16個(gè)肽。代表子庫(kù)C和D的簡(jiǎn)單合成方案的YS-SST-5B庫(kù)由8個(gè)子庫(kù)組成，每個(gè)子庫(kù)有4個(gè)肽。下面的圖示中詳述了肽的合成。Ys5A庫(kù)
Ys5B庫(kù)
實(shí)施例75YS-SST6庫(kù)表14描述了包含24個(gè)六肽的該庫(kù)。在位置R6插入兩個(gè)不同的Phe-結(jié)構(gòu)單元，在位置R7,R8和R9處有另外的變化。肽在主鏈之間位置R6和R10之間環(huán)化。缺失了位置5和12處的氨基酸。
表14．VH-SST6庫(kù)的組成
實(shí)施例76VH-SST7和VH-SST7A庫(kù)這些庫(kù)各包含45個(gè)子庫(kù)中的280304個(gè)主鏈環(huán)化的肽。在非裂解樹脂(TentaGel-NH2)上合成肽，得到連接小球的肽，用于固相分析中的篩選。表Ⅲ中描述了這些庫(kù)的組成。庫(kù)相互不同之處只是在于VH-SST7在位置8處包含Trp，而VH-SST7A在相同位置包含D-Trp。
表15．VH-SST7庫(kù)的組成
這些子庫(kù)對(duì)于其確定的位置定為A1,A2,…An,B1…Bn,…H1…Hn。對(duì)于每一組，除定義外的位置包含混合的氨基酸。在各偶聯(lián)步驟中，每個(gè)沒(méi)有定義的位置得到在該位置存在的混合的氨基酸(為了促進(jìn)完成每一次氨基酸偶聯(lián)和為了減少動(dòng)力效果，各步驟中共1摩爾當(dāng)量氨基酸，得到不等呈現(xiàn)的肽)。在每一個(gè)A至H組中通過(guò)固相測(cè)試鑒定最活性的子庫(kù)，將從庫(kù)中存在的290304個(gè)肽中引出最活性環(huán)肽的組成。實(shí)施例77YS-SST6庫(kù)該庫(kù)包括表16所述的8個(gè)子庫(kù)中的128個(gè)主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物。應(yīng)用了兩個(gè)基礎(chǔ)的環(huán)化作用位置3與位置7和位置2與位置6。每個(gè)子庫(kù)不同在于橋的位置，橋的類型和取向或者位置1處的氨基酸(Ala或D2Nal)。
表16．YS-SST6子庫(kù)的結(jié)構(gòu)
實(shí)施例78IG-SST9庫(kù)為了更系統(tǒng)地測(cè)試SRIF序列中任何給定框架對(duì)于類似物的生物活性的必要性，平行合成出SRIF結(jié)構(gòu)跨不同部分相互不同的Octreotide類似物庫(kù)。每個(gè)Octreotide子庫(kù)一個(gè)殘基與下一個(gè)順序偏移。因此第一個(gè)子庫(kù)跨SRIF的殘基7-14，第二個(gè)子庫(kù)跨SRIF的殘基6-13，依此類推。該庫(kù)包括共14個(gè)搭接的主鏈環(huán)化的Octreotide，每個(gè)子庫(kù)之間有一個(gè)殘基位移。
通過(guò)從不同起點(diǎn)同時(shí)合成類似物來(lái)實(shí)現(xiàn)合成，使得結(jié)構(gòu)單元的偶聯(lián)對(duì)于所有子庫(kù)同時(shí)進(jìn)行。在所有這些子庫(kù)中，肽序列N末端遠(yuǎn)處的一個(gè)甘氨酸-C2單元和肽序列N末端近側(cè)的一個(gè)甘氨酸-N3單元之間完成主鏈環(huán)化作用。
下面的示意圖中表示了庫(kù)IG-SST9
IG-SST9庫(kù)
實(shí)施例79SST14庫(kù)在該庫(kù)中使用不同的苯丙氨酸結(jié)構(gòu)單元(PheBU:Phe-N2,Phe-N3,Phe-C2,Phe-C3)作為用于產(chǎn)生SRIF序列4-11主鏈環(huán)化的類似物(IG-SST9庫(kù)中子庫(kù)D)的橋臂。另外，非橋Phe殘基(位置6或7)被各種Phe和Nal衍生物取代DPhe,pNO2Phe,pCLPhe,pFPhe,(Phg),Dphg,L2Nal,D2Nal。這提供了18個(gè)組的庫(kù)和每個(gè)庫(kù)16個(gè)類似物，如下面表中所述表17．SST14庫(kù)的組成
實(shí)施例80YS-SST7庫(kù)該庫(kù)包含具有下面組成的48個(gè)類似物表18．YS-SST7庫(kù)的組成
實(shí)施例81YS-SST10庫(kù)該庫(kù)包含5個(gè)子庫(kù)，每個(gè)子庫(kù)24個(gè)肽，如下面圖中描述。
實(shí)施例82YS-SST12庫(kù)表19描述的該庫(kù)代表后主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物，并且由6個(gè)子庫(kù)組成，每個(gè)子庫(kù)有18個(gè)類似物。通過(guò)橋的類型(Phe-C2至Gly-N36或Phe-N311至Gly-C26)和位置R10處的殘基定義不同的子庫(kù)。
表19．YS-SST12庫(kù)的組成
實(shí)施例83YS-SST15庫(kù)該六肽庫(kù)由通過(guò)位置R6和R7處殘基定義的8個(gè)子庫(kù)中的96個(gè)類似物組成。
表20．YS-SST15庫(kù)的組成
生理實(shí)施例對(duì)本發(fā)明促生長(zhǎng)素抑制素類似物體外和體內(nèi)測(cè)試其在生物分析中的活性，與下面相比較天然的促生長(zhǎng)素抑制素肽，即SRIF；已知的促生長(zhǎng)素抑制素類似物Octreotide；非環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素衍生物和/或作為負(fù)對(duì)照的無(wú)關(guān)的肽。實(shí)施例84促生長(zhǎng)素抑制素的體外放射性配體結(jié)合試驗(yàn)對(duì)促生長(zhǎng)素抑制素類似物測(cè)試其對(duì)I-Tyr11-SRIF結(jié)合表達(dá)跨膜促生長(zhǎng)素抑制素受體(SSTR-1,2,3,4或5)的膜制劑的抑制作用的效力(根據(jù)Raynor等，分子藥理學(xué)(Molecular Pharmacology)43,838-844,1993描述的方法為基礎(chǔ))。用于該試驗(yàn)的受體制劑是來(lái)自在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中選擇性和穩(wěn)定表達(dá)的克隆受體或者來(lái)自天然表達(dá)SSTRs的細(xì)胞系。一般情況下，在Tris緩沖液中在蛋白酶抑制劑存在下將細(xì)胞膜勻漿，并且與不同濃度的試驗(yàn)樣品125I-Tyr11-SRIF溫育30-40分鐘。過(guò)濾結(jié)合反應(yīng)物，沖洗過(guò)濾器，并且在γ計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)結(jié)合的放射性。非特異性結(jié)合定義為在1μM未標(biāo)記的SRIF-14存在下保持結(jié)合的放射性。
為了證實(shí)結(jié)合試驗(yàn)的正信號(hào)，和為了減少非特異性信號(hào)，用相同方法合成和操作的不相關(guān)的肽樣品例如GnRH作為負(fù)對(duì)照樣品在相同測(cè)試中試驗(yàn)。在所有的測(cè)試中這些樣品都沒(méi)有結(jié)合活性。實(shí)施例85環(huán)肽類似物的受體結(jié)合特異性認(rèn)為在不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中涉及不同的促生長(zhǎng)素抑制素受體亞型。關(guān)于選擇顯示出與和要治療的疾病相關(guān)的那些受體亞型特異性和選擇性結(jié)合的促生長(zhǎng)素抑制素類似物這將具有意義。根據(jù)Reisine和Bell的綜述(內(nèi)分泌評(píng)論(Endocrine Rev.)16,427-442,1995)，認(rèn)為幾種受體亞型的活性如下SSTR-1和SSTR-2激活導(dǎo)致EGF受體自身磷酸化的抑制的酪氨酸磷酸酶，一種與SST抗增殖作用相關(guān)的過(guò)程。
SSTR-2抑制生長(zhǎng)激素和促胃液素釋放，與治療肢端肥大癥和通過(guò)生長(zhǎng)因子的抗增殖作用相關(guān)的過(guò)程。
SSTR-5抑制胰島素，脂肪酶，淀粉酶釋放，與抑制鈣流入量相關(guān)的和與SST抗增殖作用相關(guān)的活性。
SSTR-3在血管發(fā)生中涉及。
體外在表達(dá)各種受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中測(cè)試實(shí)施例1-50代表性肽與不同的促生長(zhǎng)素抑制素受體的結(jié)合。表21給出了用環(huán)肽獲得的選擇性的實(shí)施例。出現(xiàn)的IC50值是抑制50％放射性碘化促生長(zhǎng)素抑制素(SRIF-14)結(jié)合所需要的濃度。
表21估算出通過(guò)選擇的主鏈環(huán)化的類似物抑制125I-SRIF-14結(jié)合克隆的SSTRs的IC50值(nM)。
通過(guò)在實(shí)施例84描述的放射配體結(jié)合測(cè)試中以10-6,10-7,10-8M濃度測(cè)試類似物來(lái)計(jì)算IC50值。
圖1給出了PTR3046(合成實(shí)施例No.42)對(duì)克隆SSTRs的親和性。PTR3046超過(guò)其它促生長(zhǎng)素抑制素類似物的出人意料的優(yōu)點(diǎn)是其選擇性。該類似物以高親和性結(jié)合人SSTR-5，而對(duì)其它SSTRs的結(jié)合小得多。
此外，PTR3046對(duì)大鼠和人SSTR5的親和性相類似，因此大鼠模型給出的藥物劑量可以預(yù)測(cè)對(duì)人的藥效。為比較起見(jiàn)，表22給出了PTR3046的親和性和已知SST類似物獲得的親和性。
表22．PTR3046對(duì)已知的SST類似物的對(duì)SSTR亞型的選擇性
*Reisine和Bell(1995)，內(nèi)分泌評(píng)論(Endocrine Rev.)16,427-442。**L.Buscail等(1995),PNAS92；1580-1584。
另一種環(huán)肽類似物表現(xiàn)出令人感興趣的選擇性曲線。該類似物表現(xiàn)出對(duì)受體亞型SSTR-1相對(duì)高的親和性和對(duì)于其它受體亞型非常低的親和性。PTR3040表現(xiàn)出對(duì)大鼠SSTR-5高度結(jié)合的同時(shí)，其對(duì)克隆的人受體的親和性明顯較低。
也對(duì)各種類似物測(cè)試了125I-SRIF結(jié)合小鼠垂體AtT20細(xì)胞的抑制作用。用PTR3046和PTR3040獲得的結(jié)果與SRIF-14相比較在圖2中給出。這些結(jié)果表示每種化合物每具體濃度的抑制百分率。實(shí)施例86環(huán)肽類似物庫(kù)的受體結(jié)合特異性體外在表達(dá)各種受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中測(cè)試實(shí)施例68-83代表性子庫(kù)肽與不同的促生長(zhǎng)素抑制素受體的結(jié)合。用環(huán)肽庫(kù)獲得的選擇性實(shí)施例在表23中給出。這些值表示放射性碘化促生長(zhǎng)素抑制素(SRIF-14)結(jié)合的抑制百分率。
表23．通過(guò)選擇的主鏈環(huán)化的子庫(kù)抑制125I-SRIF-14結(jié)合克隆的SSTRs的估算的IC50值(nM)
各子庫(kù)中不同肽的數(shù)。
以各子庫(kù)混合物中總的肽濃度為基礎(chǔ)計(jì)算估計(jì)的IC50值。但是，各子庫(kù)由不同的肽組成，它們可能具有不同的活性。在任何給定的子庫(kù)中最好的肽的活性因此可能更高(即低于IC50值)，到由每個(gè)子庫(kù)中數(shù)個(gè)肽瓜分的給定值的程度。另外，由于用來(lái)計(jì)算濃度的子庫(kù)的總重量中鹽和雜質(zhì)的存在，純化的各肽的活性值可能更好。體內(nèi)實(shí)施例體內(nèi)對(duì)選擇的類似物測(cè)試對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)激素釋放，淀粉酶，脂肪酶，促胃液素，胰島素，縮膽囊素(CCK),VIP和胰高血糖素分泌的抑制作用。生長(zhǎng)激素(GH)與肢端肥大癥有關(guān)。促胃液素分泌與促胃液素瘤(Zollinger-ellison綜合癥)和潰瘍有關(guān)。胰島素釋放與胰島瘤，高胰島素血癥，肥胖和NIDDM有關(guān)。胰高血糖素分泌與高血糖，NIDDM和血胰高血糖有關(guān)。淀粉酶和脂肪酶釋放與急性和慢性胰腺炎，腸皮膚性和胰腺瘺管和胰腺外科有關(guān)。VIP釋放與VIP瘤和分泌性腹瀉有關(guān)。另外，促生長(zhǎng)素抑制素的抗增殖作用可以是直接的或通過(guò)GH-IGF或CCK釋放的間接的。實(shí)施例87促生長(zhǎng)素抑制素生物活性測(cè)試(體內(nèi)測(cè)試)通過(guò)用商購(gòu)RIA試驗(yàn)藥盒測(cè)定這些激素的水平來(lái)測(cè)試SST類似物對(duì)生長(zhǎng)激素，胰島素和胰高血糖素釋放的體內(nèi)生物作用腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者SST的藥學(xué)效果需要測(cè)定5-羥基吲哚乙酸(對(duì)于類癌瘤)和VIP(對(duì)于VIP瘤)。靜脈內(nèi)給藥放射性碘化SST類似物后，進(jìn)行SST受體-陽(yáng)性腫瘤的體內(nèi)目測(cè)，如Lambert等所述(New England J.Med.,323:1246-1249，1990)。實(shí)施例88對(duì)SST類似物生物降解的抗性測(cè)定人血清中SST環(huán)肽類似物,PTR3002的體外穩(wěn)定性，并且與非環(huán)肽類似物(PTR3001)的相同序列，與Octreotide(SandostatinTM)，與天然促生長(zhǎng)素抑制素(SRIF)相比較。在該項(xiàng)測(cè)試中，本發(fā)明環(huán)肽和Octreotide一樣穩(wěn)定，比相應(yīng)的非環(huán)肽結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，比SRIF穩(wěn)定得多。該測(cè)試以作為對(duì)時(shí)間的函數(shù)的37℃血清中肽的降解的HPLC測(cè)定為基礎(chǔ)。實(shí)施例89SST類似物對(duì)生長(zhǎng)激素釋放的抑制作用根據(jù)公知方法，對(duì)大鼠進(jìn)行環(huán)肽SST類似物藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的體內(nèi)測(cè)定。對(duì)Sprague-Dawley雄性大鼠測(cè)定作為肽給藥結(jié)果的生長(zhǎng)激素(GH)釋放的抑制作用。在該項(xiàng)研究中，每組用4只大鼠，將SST環(huán)肽類似物活性與SRIF或與Octreotide相比較。測(cè)定不變?cè)囼?yàn)條件下對(duì)于GH釋放的時(shí)間函數(shù)曲線。方法沒(méi)有特異病原體(SPF)，重200-350g成年雄性Sprague-Dawley大鼠保持不變?nèi)?夜周期(光照自8:00至20:00小時(shí))，溫度(21±3℃)和相對(duì)濕度(55±10％)。隨意進(jìn)食實(shí)驗(yàn)室食物和自來(lái)水。在試驗(yàn)的這一天，用戊巴比妥(50mg/kg)麻。大鼠。用戊巴比妥麻醉的大鼠門靜脈血管中具有低促生長(zhǎng)素抑制素水平(Plotsky,P.M.，科學(xué)，230,461-463,1985)。從暴露的套了管的頸靜脈取一個(gè)血樣(0.6ml)，用于基礎(chǔ)GH水平測(cè)定(-15分鐘)。其后緊接著給予合適的肽處理。動(dòng)物接受了10mg/kg或者天然促生長(zhǎng)素抑制素(SRIF)，合成的類似物Octreotide(Sandostatin)，或者環(huán)肽類似物。給與生理鹽水溶液(0.9％氯化鈉)作為對(duì)照。以最終體積0.2ml皮下給與所有的肽。給藥肽后15,30,60和90分鐘再次取樣。將血樣收集到含有肝素的試管中(每毫升血15個(gè)單位)并且立即離心。分離血漿并且保持在-20℃下冷凍直到測(cè)試。
利用放射免疫測(cè)試藥盒(Amersham)測(cè)定大鼠生長(zhǎng)激素(rGH)[125I]的水平。該試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)物已經(jīng)對(duì)國(guó)際糖尿病消化病和腎病研究所得到的參考標(biāo)準(zhǔn)制劑(NIH-RP2)進(jìn)行了校正。所有的樣品重復(fù)測(cè)定。
這些試驗(yàn)結(jié)果表明Octreotide明顯抑制生長(zhǎng)激素的釋放，而不結(jié)合SSTR-2的環(huán)類似物PTR3046與該項(xiàng)試驗(yàn)中的鹽水沒(méi)有明顯區(qū)別，這一點(diǎn)正是對(duì)選擇用于SSTR-5受體亞型的促生長(zhǎng)素抑制素類似物所期望的。
這些研究數(shù)據(jù)總結(jié)在圖3中。實(shí)施例90環(huán)肽類似物沒(méi)有毒性劑量為1.5mg/kg的PTR3007在一次腹膜內(nèi)施用后耐受性很好。即使用4mg/kg劑量PTR3013對(duì)大鼠也沒(méi)有毒性。這兩個(gè)劑量是比達(dá)到期望的內(nèi)分泌作用所需要的劑量大得多的等級(jí)。溶解在鹽水中的肽對(duì)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，體溫和外周不產(chǎn)生副作用。給藥肽后對(duì)大鼠觀察4小時(shí)。PTR3007和3013不產(chǎn)生呼吸障礙，不導(dǎo)致刻板動(dòng)作行為的出現(xiàn)，或者肌緊張變化。3小時(shí)后，尸體解剖檢查在肝，腎，動(dòng)脈和靜脈，腸胃道，肺，生殖系統(tǒng)或脾都沒(méi)有檢查到任何不正常。實(shí)施例91促生長(zhǎng)素抑制素類似物對(duì)大鼠葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放的體內(nèi)作用以作為胰島素釋放抑制劑的天然促生長(zhǎng)素抑制素已知的方法學(xué)為基礎(chǔ)，進(jìn)行該項(xiàng)研究以評(píng)價(jià)主鏈環(huán)化類似物PTR3046對(duì)飯后胰島素分泌的作用。試驗(yàn)使用沒(méi)有特異病原體(SPF)，重200-220g成年雄性Wister大鼠。動(dòng)物保持不變?nèi)?夜周期(光照自8:00至20:00小時(shí))，溫度(21℃)和濕度(55％)。使動(dòng)物隨意進(jìn)食食物和水，直到實(shí)驗(yàn)前18-20小時(shí)，取走所有的食物(但是不取走水)。動(dòng)物豢養(yǎng)在帶有寬網(wǎng)線底的塑料籠中以防止食糞(食用糞便)。在試驗(yàn)的這一天，用戊巴比妥(60mg/kg IP)麻醉大鼠。用戊巴比妥麻醉后15分鐘將導(dǎo)管插入右外部靜脈中取血樣。用直腸溫度數(shù)字溫度計(jì)監(jiān)測(cè)體溫，除了自50cm的距離用兩個(gè)100W燈泡照射操作臺(tái)外，通過(guò)加熱大鼠下面的熱墊使溫度保持在不變水平(37-37.5∞C)。插入套管后，從頸靜脈取0.7ml血樣，并且轉(zhuǎn)移到事先加入20IU肝素溶液5000IU/ml的試管中。收集該血樣用于測(cè)定基礎(chǔ)胰島素水平。此后緊接著給與合適的肽預(yù)處理。
動(dòng)物接受了下面的肽10μg/kg的合成的類似物Octreotide(n=15)，7μg/kg的主鏈環(huán)化的肽PTR3046(n=18)。給與0.2ml鹽水(0.9％氯化鈉)作為對(duì)照(n=16)。所有的肽以0.2ml最終體積皮下給藥。給藥10分鐘后，以最終劑量0.5g/kgⅣ給與葡萄糖后緊接著取下一個(gè)血樣。在給與葡萄糖后2和5分鐘進(jìn)行進(jìn)一步的取樣。
采集各血樣后立即Ⅳ給與合適體積(0.7ml)鹽水。將血樣收集到含有肝素(每毫升血15個(gè)單位)的試管中并且立即離心(1500g)，分離血漿并在-20℃下冷凍保存(直到測(cè)試)利用大鼠胰島素RIA藥盒測(cè)定大鼠胰島素(rlns)[125I]水平。該藥盒使用特異性制備抗大鼠胰島素(Linco)的抗體。藥盒的靈敏性是0.1ng/ml。所有的樣品重復(fù)測(cè)定。結(jié)果與未處理的對(duì)照大鼠相比，給藥7μg/kgPTR3046導(dǎo)致胰島素釋放的明顯(p＜0.05)降低(43％)。該試驗(yàn)中Octreotide預(yù)處理大鼠胰島素水平的降低統(tǒng)計(jì)學(xué)上不明顯。
這些結(jié)果證明主鏈環(huán)化的肽PTR3046在體內(nèi)是有藥效的飯后胰島素釋放的抑制劑。以該研究和制備者對(duì)于Octreotide報(bào)道的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)(胰島素釋放的ED50是26μg/kg)，得出結(jié)論體內(nèi)PTR3046對(duì)胰島素釋放比Octreotide的效力大4倍。
高胰島素血癥是與肥胖癥和早期非胰島素依賴型糖尿病糖尿(NIDDM)的病理相關(guān)的病原學(xué)因素之一。因此，著眼于該新的SST類似物對(duì)胰島素分泌的高度抑制，PTR3046作為抗促分泌素對(duì)胰島素釋放的有潛力的應(yīng)用應(yīng)該被考慮。
這些研究的數(shù)據(jù)總結(jié)在圖4中。實(shí)施例92促生長(zhǎng)素抑制素類似物對(duì)鈴蟾肽刺激的血漿淀粉酶和脂肪酶釋放的作用據(jù)報(bào)道(Reisine和Bell，上文)，對(duì)胰島素或淀粉酶釋放與對(duì)SST受體亞型SSTR-5的親和性高度相關(guān)，而對(duì)垂體生長(zhǎng)激素(GH)釋放，胰腺胰高血糖素，和胃酸分泌的抑制作用是SSTR-2介導(dǎo)的。上面(實(shí)施例85)給出的結(jié)合親和性數(shù)據(jù)證明與其對(duì)SSTR-1,2,3和4低親和性(＞1000nM)相比的環(huán)六肽PTR3046對(duì)hSSTR-5(親和性20nM)的選擇性。以這些結(jié)果為基礎(chǔ)，用鈴蟾肽刺激的脂肪酶和淀粉酶釋放的體內(nèi)模型評(píng)價(jià)PTR 3046的生理活性的初期評(píng)價(jià)。以三個(gè)不同的劑量，即3μg/kg,12.5μg/kg和25μg/kg給藥肽類似物后對(duì)大鼠測(cè)定PTR3046抑制淀粉酶和脂肪酶釋放的劑量效應(yīng)。這些劑量與以劑量10μg/kg給藥的合成的類似物SMS-201 995相比較。方法通過(guò)腹膜內(nèi)途徑(IP)用戊巴比妥(60m/kg)麻醉雄性Wister大鼠(重200-220g)。使動(dòng)物隨意進(jìn)食食物和水，直到實(shí)驗(yàn)前18小時(shí)，取走所有的食物(但是不取走水)。而且動(dòng)物豢養(yǎng)在帶有寬網(wǎng)線底的籠中以防止食糞(食用糞便)。采集樣品插入套管后，從頸靜脈取0.7ml血樣，并且轉(zhuǎn)移到含有20IU肝素溶液5000IU/ml的Eppendorf試管中。1分鐘后皮下給藥肽(SC，于0.2ml0.9％氯化鈉中)。用0.2ml0.9％氯化鈉預(yù)處理對(duì)照大鼠。0時(shí)(收集基礎(chǔ)血樣-1后5分鐘)對(duì)所有的動(dòng)物開始注入鈴蟾肽(50nmol/kg/hr)。在注入鈴蟾肽期間在60,90和120分鐘恒定的時(shí)間間隔收集另外的血樣。處理樣品將血樣收集到含有肝素(20IU/ml)的冰冷卻的試管中，并離心(1500g×10分鐘)。冷凍血漿樣品，并且在-20℃下冷凍保存直到用于測(cè)試淀粉酶和脂肪酶。分析-測(cè)試用商售(RaichemTM)淀粉酶試劑測(cè)定血漿中淀粉酶水平。
用商售藥盒(RandoxTM)測(cè)定血漿中脂肪酶水平。結(jié)論SST類似物抑制鈴蟾肽刺激的淀粉酶分泌對(duì)照(鹽水預(yù)處理)以50nmol/kg/hr的劑量I.V.注入鈴蟾肽導(dǎo)致血漿淀粉酶(在60和90分鐘高于基礎(chǔ)10倍)和脂肪酶(在60和90分鐘高于基礎(chǔ)14倍)時(shí)間依賴性增加。PTR3046用PTR3046預(yù)處理導(dǎo)致與對(duì)照大鼠相比的鈴蟾肽誘導(dǎo)的血漿淀粉酶釋放明顯的劑量依賴性抑制。對(duì)于3μg/kg劑量，抑制在90分鐘時(shí)是31％，在120分鐘時(shí)是23％，對(duì)于25μg/kg劑量，抑制在90分鐘時(shí)是60％，在120分鐘時(shí)是52％。用10μg/kg Octreotide預(yù)處理導(dǎo)致在這些時(shí)間點(diǎn)23％明顯抑制作用。SST類似物抑制鈴蟾肽刺激的脂肪酶分泌PTR3046用PTR3046預(yù)處理導(dǎo)致與對(duì)照大鼠相比的鈴蟾肽誘導(dǎo)的血漿脂肪酶釋放明顯的劑量依賴性抑制。對(duì)于3μg/kg劑量，抑制在90分鐘時(shí)是33％，在120分鐘時(shí)是26％，對(duì)于25μg/kg劑量，抑制在90分鐘時(shí)是51％，在120分鐘時(shí)是35％。而用10μg/kg SMS預(yù)處理在90和120分鐘分別導(dǎo)致27％和30％明顯抑制作用。
用PTR3010得到相似結(jié)果(數(shù)據(jù)沒(méi)有給出)。
這些結(jié)果證明，如在初期結(jié)合測(cè)試和酶和內(nèi)分泌分泌生理模型中所示，PTR3046是對(duì)于SSTR-5的選擇性類似物。
鈴蟾肽誘導(dǎo)的胰腺和胃分泌是評(píng)價(jià)鈴蟾肽拮抗劑，鈴蟾肽抗體和促生長(zhǎng)素抑制素類似物抗分泌作用的常用體內(nèi)模型。
鈴蟾肽在人幾種肺病和腸病中推斷的作用提示抑制鈴蟾肽，例如PTR3010和PTR3046的分泌作用的藥物可以用作與鈴蟾肽相關(guān)的各種治療靶物的藥物治療劑，所述疾病包括分泌性疾病，例如胰腺炎，鼻炎和胃泌素瘤；神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞增生疾病例如支氣管肺發(fā)育異常，和慢性支氣管炎和氣腫；增殖疾病例如前列腺肥大，前列腺癌，胰腺癌和胃癌。
此外，門靜脈高血壓，GI出血，和結(jié)腸直腸癌也可以是有效的應(yīng)用。實(shí)施例93．十二指腸胰腺灌注用鈴蟾肽或Caerulein模型的限制性是兩個(gè)試驗(yàn)都是以非直接檢測(cè)血清中酶的水平為基礎(chǔ)。因?yàn)榈矸勖缚梢詮耐僖汉虶I道中其它位點(diǎn)釋放，需要直接測(cè)定對(duì)酶的胰腺釋放的作用。為了達(dá)到該目的，對(duì)大鼠建立灌注模型。結(jié)果表明如在十二指腸灌注液中直接測(cè)定的，PTR3046和Sandostatin(通過(guò)Ⅳ注入給藥)兩者都抑制酶的胰腺釋放。
排出胰腺釋放的十二指腸段近側(cè)與胃無(wú)關(guān)，遠(yuǎn)側(cè)與空腸無(wú)關(guān)。用生理鹽水灌注該腸段，以15分鐘時(shí)間間隔收集灌注液。分別通過(guò)Ⅳ注入1nMol/kg/h或4nMol/kg/h鈴蟾肽或Caerulein。在灌注期間(酶的水平達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)之后)Ⅳ輸入藥物又2小時(shí)。測(cè)定灌注液樣品中胰腺肽水平。數(shù)據(jù)以鈴蟾肽誘導(dǎo)的平穩(wěn)狀態(tài)的平均酶百分含量表示。實(shí)施例94．抗增殖活性以對(duì)Caerulein(CCK類似物)誘導(dǎo)的外分泌釋放的抑制為基礎(chǔ)，并且因?yàn)镃CK是GI道中潛在的生長(zhǎng)因子，測(cè)試PTR3036對(duì)從GI腫瘤產(chǎn)生的癌細(xì)胞系的潛在的抗增殖活性是合理的。
發(fā)現(xiàn)PTR3036對(duì)人胰腺細(xì)胞系，MiaPaca-2的顯著的抗增殖作用(圖6)。
細(xì)胞在補(bǔ)加有10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。24小時(shí)后使細(xì)胞接觸平板。以10-5M至10-11M濃度范圍向培養(yǎng)基中加入藥物。施用藥物后24,48和72小時(shí)通過(guò)MTT測(cè)試評(píng)估細(xì)胞的增殖。
權(quán)利要求
1．具有通式(Ⅰ)的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
式(Ⅰ)其中a-c各自獨(dú)立地代表1-8或0的整數(shù)；(AA)代表氨基酸殘基，其中每條鏈中的氨基酸殘基可以相同或不同；Q代表H或?；?；E代表羥基，羧基保護(hù)基或氨基，或者末端羧基可以還原為CH2-OH；R1和R2各自代表任選與特定保護(hù)基團(tuán)鍵合的氨基酸側(cè)鏈；線代表下式橋基-(CH2)x-M-(CH2)v-；M選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；x和y各自獨(dú)立地代表1-10的整數(shù)。
2．具有通式(Ⅴa)的權(quán)利要求1的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
式(Ⅴa)其中m和n是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是Gly,(D)-或(L)-Ala,Phe,Nal和β-Asp(Ind)；R6和R11獨(dú)立地是Gly或(D)-或(L)-Phe；R7是Phe或Tyr；R10不存在或者是Gly,Abu,Thr或Val；R12不存在或者是Val,Thr或Nal，和Y2選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
3．具有通式(Ⅴb)的權(quán)利要求2的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
式(Ⅴb)其中m和n是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R6和R11獨(dú)立地是Gly或(D)-或(L)-Phe；R7是Phe或Tyr；R10不存在或者是Gly,Abu,Thr或Val；和Y2選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
4．具有下面結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求3的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物環(huán)[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
5．具有下面結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求4的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
6．具有下面結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求3的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物環(huán)[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
7．具有下面結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求6的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
8．具有通式(Ⅺ)的權(quán)利要求1的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物式Ⅺ
其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是(D)-Phe或(L)-Phe,Ala或Lys；R6不存在或者是Phe；R7是Tyr或Phe；R10不存在或者是Thr,Val,Ser或Abu；R11是Phe,Gly或Ala；R12是Trp,Thr,Val,2-Nal或(D)-2-Nal；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
9．具有通式(Ⅻ)的權(quán)利要求1的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
式Ⅻ其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是Phe,(L)2-Nal或(D)-2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是(D)Phe,pCl(D)Phe,pNH2Phe或(D)Tyr；R10是(D)Thr,(D)Val,(D)Ala,(D)Leu或(D)Glu；R11是Phe,Gly或Ala；R12不存在或者是Thr或Val；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
10．具有通式(ⅩⅢ)的權(quán)利要求1的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
式ⅩⅢ其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是(D)Phe或2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是(D)Phe,pCl(D)Phe,pNH2Phe或(D)Tyr；R8是(D)或(L)Trp；R10是(D)Thr,(D)Val,(D)Ala,(D)Leu或(D)Glu；R11是Phe，Gly或Ala；R12是Thr,Val,Ala,β-Ala,(L)2-萘基丙氨酸或(D)2-萘基丙氨酸；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
11．具有通式(ⅩⅣ)的權(quán)利要求1的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物
式ⅩⅣ其中i和j獨(dú)立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R1是Ala或(D)-2-Nal；R3是Phe,Gly,Ala或Lys；R4是Lys或Arg；R5是(L)Asn或(D)Asn；R7是Phe,Gly,Ala或Lys；和Y1選自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
12．藥物組合物，含有權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的促生長(zhǎng)素抑制素類似物和制藥可接受載體或稀釋劑。
13．權(quán)利要求12的藥物組合物，其中促生長(zhǎng)素抑制素類似物是環(huán)[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
14．單位劑量形式的權(quán)利要求13的藥物組合物。
15．權(quán)利要求12的藥物組合物，其中促生長(zhǎng)素抑制素類似物是環(huán)[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
16．單位劑量形式的權(quán)利要求15的藥物組合物。
17．治療內(nèi)分泌失調(diào)，腫瘤或代謝失調(diào)的方法，包括對(duì)需要治療的個(gè)體施用治療有效量的權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的促生長(zhǎng)素抑制素類似物。
18．權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的促生長(zhǎng)素抑制素類似物在制備治療內(nèi)分泌失調(diào)，腫瘤或代謝失調(diào)的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的肽類似物。新的肽是構(gòu)象受限的主鏈環(huán)化的促生長(zhǎng)素抑制素類似物。也公開了合成這些促生長(zhǎng)素抑制素類似物及制備這些促生長(zhǎng)素抑制素類似物庫(kù)的方法。此外,還公開了含有該促生長(zhǎng)素抑制素類似物的藥物組合物,以及應(yīng)用這樣的組合物治療內(nèi)分泌失調(diào),腫瘤和代謝失調(diào)的方法。
文檔編號(hào)C07K1/04GK1231672SQ97198197
公開日1999年10月13日 申請(qǐng)日期1997年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月31日
發(fā)明者V·霍尼克, A·塞里-利維, G·蓋勒曼, C·吉洛 申請(qǐng)人:佩普特有限公司, 耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)伊森姆研究發(fā)展公司