專(zhuān)利名稱(chēng)：一種魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)抑素(Somatostatin，縮寫(xiě)為SS)是一類(lèi)抑制動(dòng)物生長(zhǎng)的多肽類(lèi)激素，最早是 從羊的下丘腦提取液中分離得到。研究發(fā)現(xiàn)，這類(lèi)多肽廣泛存在于脊椎動(dòng)物中，主要分布于 中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)、腸、胃、胰腺和甲狀腺等組織。生長(zhǎng)抑素主要具有抑制機(jī)體生長(zhǎng)激素 分泌的作用，也具有抑制胃、腸、膽、胰腺的內(nèi)、外分泌和抑制胃腸運(yùn)動(dòng)等作用，是生物體內(nèi) 重要的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)。生長(zhǎng)抑素家族由結(jié)構(gòu)類(lèi)似的一類(lèi)SS多肽所組成，這些多肽在分子組成上也存在 某些差異，具有不同的氨基酸鏈長(zhǎng)度和氨基酸組成。這種差異主要源于兩個(gè)方面一是生物 體內(nèi)存在某一較長(zhǎng)的SS前體，加工的場(chǎng)所不同，形成的SS多肽的組成和結(jié)構(gòu)不同；二是生 物體內(nèi)存在多種SS基因，可編碼出不同形式的(pr印rosomatostatin，縮寫(xiě)為PSS)。生長(zhǎng) 抑素需經(jīng)過(guò)信號(hào)肽酶和前激素轉(zhuǎn)化酶等對(duì)前體蛋白進(jìn)行組織特異性的加工而成活性肽。SS 存在兩種生物活性類(lèi)型，一種為具有14個(gè)氨基酸的SS14，另一種在其N(xiāo)端多帶有14個(gè)氨基 酸的SS28。SS14在所有已知的脊椎動(dòng)物代表種中高度保守，具有相同的氨基酸序列。目前魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素的研究結(jié)果表明，硬骨魚(yú)類(lèi)至少含有2種編碼SS的基因，硬骨 魚(yú)類(lèi)體內(nèi)至少含有2種SS前體，分別由不同的PSS mRNA編碼。PSS都是較長(zhǎng)的蛋白質(zhì)多 肽，其C末端都含有某一特征性的肽段，這些PSS序列中包含一些特別位點(diǎn)，可自身斷裂，包 含C末端的那段多肽就是一種SS形式，或經(jīng)進(jìn)一步剪切加工形成SS。因此，在硬骨魚(yú)類(lèi)體 內(nèi)存在多種形式的SS多肽。魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)主要由生長(zhǎng)激素GH調(diào)控，SS在垂體水平對(duì)GH進(jìn)行調(diào)節(jié)。SS14對(duì)垂體 GH釋放的體內(nèi)體外抑制作用已在許多硬骨魚(yú)類(lèi)中得到證明。金魚(yú)3種類(lèi)型的SS均能抑制 金魚(yú)垂體GH體外釋放，金魚(yú)腦SS28對(duì)GH釋放的抑制作用更強(qiáng)些。SS14抑制虹鱒或羅非魚(yú) GH的釋放，但不抑制GH基因的轉(zhuǎn)錄，表明SS通過(guò)翻譯后調(diào)節(jié)作用影響GH蛋白的合成和分 泌。SS能抑制斜帶石斑魚(yú)腦垂體GH的釋放，并呈劑量依存關(guān)系，同時(shí)斜帶石斑魚(yú)與虹鱒、羅 非魚(yú)一樣，SS同樣也不抑制GH的轉(zhuǎn)錄。因此，采用生物工程的方法制備高活力的生長(zhǎng)抑素 抗體作為餌料添加劑，可以有效地促進(jìn)動(dòng)物個(gè)體的生長(zhǎng)，而目前在魚(yú)類(lèi)中尚未有相關(guān)的報(bào) 道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的生長(zhǎng)抑素基因具有不同生物學(xué)功能的特點(diǎn)，提供魚(yú) 類(lèi)中第一例生長(zhǎng)抑素成熟肽。本發(fā)明另一目的在于提供上述魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)通過(guò)分析魚(yú)類(lèi)基因組和EST數(shù)據(jù)庫(kù)，我們?cè)诙喾N魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)編碼生長(zhǎng)抑素的基因
3序列。用這些序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示，SS共聚為五大分枝，每個(gè)分枝都包括已知的直 系同源基因，表明進(jìn)化樹(shù)分析可用于識(shí)別SS直系同源基因。根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 (其核苷酸序列如SEQ ID NO 6 15所示)，結(jié)合RACE技術(shù)，我們?cè)隰~(yú)類(lèi)中分離得到五種 生長(zhǎng)抑素基因，其蛋白質(zhì)前體經(jīng)斷裂得到的成熟肽為SS1、SS2、SS3、SS4和SS5，其氨基酸序 列分別如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 所示。SS蛋白前體序列比對(duì)顯示，在五種硬骨魚(yú)類(lèi)中，由SSl和SS2的蛋白前體產(chǎn)生的 SS完全保守，由SS3和SS5的蛋白前體產(chǎn)生的SS存在2-3個(gè)氨基酸的變異，而由SS4蛋白 前體產(chǎn)生的SS變異較大。采用RT-PCR檢測(cè)五種SS基因在斑馬魚(yú)的組織中組織表達(dá)情況如圖3所示，它們 呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式SS1，SS2和SS3主要在腦中表達(dá)，如端腦、下丘腦和視頂蓋等區(qū)域； SS4主要在外周組織表達(dá)；SS5主要在卵巢，視頂蓋和后腦中表達(dá)。本發(fā)明魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽可用于魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育中，例如，根據(jù)本發(fā)明成熟肽制 備疫苗，該疫苗作用于魚(yú)類(lèi)時(shí)，可以抑制魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)抑素的產(chǎn)生，從而促進(jìn)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā) 育。本發(fā)明魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽可用于制備魚(yú)類(lèi)人工飼料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽具有抑制生長(zhǎng)激素釋放的功能，在魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育中有 著重要的作用，可以通過(guò)化學(xué)合成的方法進(jìn)行利用或開(kāi)發(fā)，使用方便，效果顯著。


圖1是本發(fā)明的五種魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素蛋白前體進(jìn)化樹(shù)分析，進(jìn)化樹(shù)用MEGA3. 0軟件 鄰接法(neighbor-oining method)構(gòu)建,進(jìn)行 1000 次自舉重復(fù)(bootstrap replicates) 檢驗(yàn)；圖2是本發(fā)明魚(yú)類(lèi)SS1(A)、SS2(B)、SS3(C)、SS4(D)和SS5 (E)蛋白前體氨基酸序 列比對(duì)。序列比對(duì)用Clastal W進(jìn)行。信號(hào)肽用虛線(xiàn)顯示；成熟肽用陰影顯示；蛋白酶切割 位點(diǎn)用實(shí)線(xiàn)顯示；圖3是本發(fā)明的五種魚(yú)類(lèi)RF神經(jīng)肽基因在斑馬魚(yú)各個(gè)組織的表達(dá)分析，以管家基 因18s為內(nèi)參。0 卵巢；I 腸；S 脾臟；L 肝臟；H 心臟；G 鰓；Hy 下丘腦；HB 后腦；OTT 視頂蓋-丘腦；TE 端腦。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例11.斑馬魚(yú)腦總RNA的提取取健康斑馬魚(yú)，解剖后立即分離出腦組織。采用Trizol試劑法提取獲得斑馬魚(yú)腦 總RNA，其0D26(1/28(1 = 1.85,電泳結(jié)果顯示，28S rRNA, 18S rRNA條帶清晰，28S條帶亮度為 18S的兩倍，表明所得總RNA未被蛋白質(zhì)、酚和基因組DNA污染，純度高。2. cDNA第一鏈的合成
4
取5 μ g斑馬魚(yú)腦總RNA樣品進(jìn)行DNA酶處理以去除基因組DNA的污染，與RNA Oligo dT(序列如SEQ ID N0:16所示)混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所的產(chǎn)物置于_20°C保存?zhèn)溆谩?.斑馬魚(yú)SS基因cDNA全序列的克隆通過(guò)分析魚(yú)類(lèi)基因組和EST數(shù)據(jù)庫(kù)，我們根據(jù)在斑馬魚(yú)(zebrafish，Danio rerio)、中發(fā)現(xiàn)編碼SS蛋白前體序列。根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO 6 15所示)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物上樣至1. 8wt%瓊脂糖凝膠，以低電壓電泳 分離DNA片段，從凝膠中純化回收目的產(chǎn)物。將純化后的目的產(chǎn)物連接至pGEM-T Easy 載體，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。Blast同源分析表明，目的產(chǎn)物為SS基因 (其核苷酸序列如SEQ IDNO 17 21所示)。實(shí)施例2斑馬魚(yú)SS基因的序列比對(duì)分析通過(guò)序列比對(duì)分析，SS蛋白前體序列比對(duì)顯示，由SSl和SS2蛋白前體產(chǎn)生的SS 完全保守，由SS3和SS5產(chǎn)生的SS存在2-3個(gè)氨基酸的變異，而由SS4蛋白前體產(chǎn)生的SS 變異較大(圖2)。實(shí)施例5斑馬魚(yú)SS基因的組織表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè)五種SS基因在斑馬魚(yú)的組織中組織表達(dá)情況如圖3所示，它們 呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式SS1，SS2和SS3主要在腦中表達(dá)，如端腦、下丘腦和視頂蓋等區(qū)域； SS4主要在外周組織表達(dá)；SS5主要在卵巢，視頂蓋和后腦中表達(dá)。
權(quán)利要求
一種魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示。
2.權(quán)利要求1所述魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽在魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽在制備魚(yú)類(lèi)人工飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽及其應(yīng)用。本發(fā)明魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示。本發(fā)明魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)抑素成熟肽具有抑制生長(zhǎng)激素釋放的功能，在魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育中有著重要的作用，可以通過(guò)化學(xué)合成的方法進(jìn)行利用或開(kāi)發(fā)，使用方便，效果顯著。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101948527SQ20101026589
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者劉云, 劉曉春, 盧丹琪, 張勇, 張海發(fā), 李水生, 林浩然, 蒙子寧, 陳華譜 申請(qǐng)人:中山大學(xué)