專利名稱：一種生長抑素的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽合成方法的改進(jìn)，具體是指一種生長抑素的合成方法改進(jìn)。
背景技術(shù)：
生長抑素的英文名Somatostatin，Stilamin結(jié)構(gòu)式 分子式及分子量C76H104N18O19S2，1637.9。
生長抑素是下丘腦的正中隆起和胰島的δ細(xì)胞合成的。1973年由Burgus和Brazean等人首先由下丘腦分離得到并闡明其結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)為分子內(nèi)帶有一對二硫鍵的十四肽。其生物功能可抑制腺體釋放生長激素、抑制促甲狀腺和腎上腺皮質(zhì)激素、抑制胰腺的內(nèi)分泌與外分泌、抑制胃粘膜釋放胃泌素、抑制腸粘膜釋放腸促胰激素和腎臟釋放腎素，降低門靜脈壓力、松弛膽道口括約肌、刺激單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)而減輕內(nèi)毒素血癥，抑制血小板活化因子的釋放，直接或間接調(diào)節(jié)細(xì)胞因子鏈產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用，并可增強(qiáng)抗癌藥物的抗增殖作用。臨床常應(yīng)用于嚴(yán)重急性食管靜脈曲張破裂出血，嚴(yán)重急性胃、十二指腸潰瘍出血，急性糜爛性胃炎或出血性胃炎，胰、膽和腸屢的輔助治療，糖尿病酮癥酸中毒的輔助治療。
在國外，合成的生長抑素早已成為商品用于臨床，并于1997年收載入歐洲藥典。瑞士的Serono公司生產(chǎn)的生長抑素，其商品名為施他寧(Stilamin)，迄今為止也是世界上唯一的生產(chǎn)公司，目前獨(dú)占我國市場，注冊證號為，X930471。
現(xiàn)有合成方法為選用Wang樹脂作為起始物，采用片段固相縮合法合成。文獻(xiàn)主要有《片段固相縮合法合成生長激素釋放抑制素》“生物化學(xué)與生物物理學(xué)報”17，1，1985，128-137。但該法需預(yù)先制備四個片段肽，反應(yīng)周期較長，操作較繁瑣。
國外文獻(xiàn)的有關(guān)合成方法；Solid phase synthesis of partially protected and freepeptides containing disulphide bonds by simultaneous cysteine oxidation-releasefrom 2-chlorotrityl resin(Int.J.Peptide Protein Res.38，1991，562-568)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種生長抑素的合成方法，此方法操作簡便，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
一.采用Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸的方法。其中1.制備Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂取12-15gWang樹脂(1.01mmol/g樹脂，12.12mmol)裝入反應(yīng)容器中，用150mlDMF浸泡、洗滌。
加入1 7.92g(FW585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.82g(FW321，30.6mmol)TBTU、4.68g(FW153，30.6mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，用DMF洗滌三次，濾干。
Kaiser方法檢測氨基為陰性。若顯陽性加入，則應(yīng)用上述量的1/2量補(bǔ)接一次。
加入150ml的封頭試劑，25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。同上洗滌，濾干。
2.制備Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加入13.50g(FW383.4，30mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入150ml脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘，同上洗滌，濾干。
3.制備Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.9-13.9g(FW397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入150ml脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
4.制備Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.6-13g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
5.制備Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.9-13.9g(FW397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
6.制備Fmoe-Lts(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.9-15g(FW468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
7.制備Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加12.83-14.83g(FW427.5，30mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
8.制備Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.6-13.6g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
9.制備Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.6-13.6g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
10.制備Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加17.90-19.0g(FW596.7，30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
11.制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lts(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.9-15.0g(FW468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
12.制備Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加17.6-19.6(FW585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
13.制備Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加8.92-9.92g(FW297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
14.制備Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加9.34-10.34g(FW311.3，30mmol)Fmoc-Ala-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。其余操作同上。
接肽反應(yīng)結(jié)束后用DCM、DMF、無水乙醇分別洗滌三次。濾干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得保護(hù)的十四肽樹脂約26-30g(8.372mmol)，接肽總收率約為86.13％-87％，每步接肽收率在98％-99％。
二.采用切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS＝94∶2.5∶2.5∶1)進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法。其中取26-30g保護(hù)十四肽樹脂轉(zhuǎn)移到500ml茄形瓶中，加入切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)180-185ml，25-35℃攪拌1.5-2小時。濾去樹脂，樹脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并濾液及洗滌液，加入1000ml乙醚沉淀，離心收集，用無水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得還原型生長抑肽粗品11.5-13g(FW1640，7.02mmol)。收率72.3％-74.5％(以Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂的9.72mmol計)。
三.采用在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空氣氧化的方法(二硫鍵的形成)。
將粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在攪拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH7.8，于15-20℃下，通空氣氧化24小時。用50％冰醋酸調(diào)至pH4.5-5.0，加活性碳攪拌30分鐘，過濾。
四.采用C18柱進(jìn)行分離純化，流動相為0.1MNH4Ac∶乙腈(6-8∶2-4)；檢測波長為280nm的方法。
濾液分批經(jīng)C18柱(50×250mm)純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為50ml/min；檢測波長為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后凍干，約得3.5-4.5g白色疏松塊狀物成品。后處理收率30.5％-31.2％，總收率約為22.1％～22.9％。
本發(fā)明雖然總收率較低，但是操作簡單，生產(chǎn)成本降低明顯，有利于本品的國產(chǎn)化生產(chǎn)。


附圖為Wang樹脂制備生長抑素的合成路線工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1).制備Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂取12.0gWang樹脂(1.01mmol/g樹脂，12.12mmol)裝入反應(yīng)容器中，用150mlDMF浸泡、洗滌。加入17.92g(FW585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.82g(FW321，30.6mmol)TBTU、4.68g(FW153，30.6mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)1小時。濾干，用DMF洗滌三次，濾干。Kaiser方法檢測氨基為陰性。若顯陽性加入，則應(yīng)用上述量的1/2量補(bǔ)接一次。加入150ml的封頭試劑，25℃反應(yīng)1小時。同上洗滌，濾干。
(2).制備Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加入11.50g(FW383.4，30mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入150ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)10分鐘，同上洗滌，濾干。
(3).制備Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.9g(FW397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入150ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
(4).制備Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.6g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(5).制備Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.9g(FW397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(6).制備Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.9g(FW468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(7).制備Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加12.83g(FW427.5，30mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(8).制備Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.6g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(9).制備Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加11.6g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(10).制備Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加17.90g(FW596.7，30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(11).制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.9g(FW468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(12).制備Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加17.6(FW585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(13).制備Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加8.92g(FW297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
(14).制備Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加9.34g(FW311.3，30mmol)Fmoc-Ala-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時。其余操作同上。
接肽反應(yīng)結(jié)束后用DCM、DMF、無水乙醇分別洗滌三次。濾干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得保護(hù)的十四肽樹脂約26g(8.372mmol)，接肽總收率約為86.13％，每步接肽收率在98％。
取26g保護(hù)十四肽樹脂轉(zhuǎn)移到500ml茄形瓶中，加入切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)180ml，25℃攪拌2小時。濾去樹脂，樹脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并濾液及洗滌液，加入1000ml乙醚沉淀，離心收集，用無水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得還原型生長抑肽粗品11.5g(FW1640，7.02mmol)。收率72.3％(以Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂的9.72mmol計)。
將粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在攪拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH7.8，于15℃下，通空氣氧化24小時。用50％冰醋酸調(diào)至pH5.0，加活性碳攪拌30分鐘，過濾濾液分批經(jīng)C18柱(50×250mm)純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為50ml/min；檢測波長為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后凍干，約得3.5g白色疏松塊狀物成品。3.5÷1638＝2.14mmol
后處理收率30.5％，總收率約為22.1％。
實(shí)施例2(1).制備Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂取15.0gWang樹脂(1.01mmol/g樹脂，12.12mmol)裝入反應(yīng)容器中，用150mlDMF浸泡、洗滌。加入17.92g(FW585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.82g(FW321，30.6mmol)TBTU、4.68g(FW153，30.6mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，40℃反應(yīng)0.5小時。濾干，用DMF洗滌三次，濾干。Kaiser方法檢測氨基為陰性。若顯陽性加入，則應(yīng)用上述量的1/2量補(bǔ)接一次。加入150ml的封頭試劑，40℃反應(yīng)0.5小時。同上洗滌，濾干。
(2).制備Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加入13.50g(FW383.4，30mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入150ml脫帽試劑，40℃反應(yīng)5分鐘，同上洗滌，濾干。
(3).制備Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.9g(FW397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入150ml脫帽試劑，40℃反應(yīng)5分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
(4).制備Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.6g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(5).制備Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.9g(FW397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(6).制備Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加15g(FW468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(7).制備Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加14.83g(FW427.5，30mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(8).制備Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.6g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(9).制備Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加13.6g(FW387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(10).制備Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加19.0g(FW596.7，30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(11).制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加15g(FW468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、10.0g(30mmol)TBTU、5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(12).制備Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加19.6(FW585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(13).制備Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加9.92g(FW297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
(14).制備Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加10.34g(FW311.3，30mmol)Fmoc-Ala-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。40℃反應(yīng)0.5小時。其余操作同上。
接肽反應(yīng)結(jié)束后用DCM、DMF、無水乙醇分別洗滌三次。濾干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得保護(hù)的十四肽樹脂約30g(8.372mmol)，接肽總收率約為87％，每步接肽收率在98.5％。
取30g保護(hù)十四肽樹脂轉(zhuǎn)移到500ml茄形瓶中，加入切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)185ml，35℃攪拌1.5小時。濾去樹脂，樹脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并濾液及洗滌液，加入1000ml乙醚沉淀，離心收集，用無水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得還原型生長抑肽粗品13.5g(FW1640，7.02mmol)。收率74.5％(以Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂的9.72mmol計)。
將粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在攪拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH10.0，于20℃下，通空氣氧化24小時。用50％冰醋酸調(diào)至pH4.5，加活性碳攪拌30分鐘，過濾濾液分批經(jīng)C18柱(50×250mm)純化，流動相0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為50ml/min；檢測波長為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后凍干，約得4.5g白色疏松塊狀物成品。后處理收率31.2％，總收率約為22.9％。
權(quán)利要求
1.一種生長抑素的合成方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)將Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸；(2)用切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀粗肽；(3)在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空氣氧化；(4)用C18柱進(jìn)行分離純化.
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Cys(Trt)-Wang樹脂；將Wang樹脂裝入反應(yīng)容器中，用DMF浸泡、洗滌，加Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，用DMF洗滌三次，濾干。加入封頭試劑，25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。同上洗滌，濾干。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘，同上洗滌，濾干。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Thr(tBu)-OH、BTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Trp(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Ph-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時，濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，25-40℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于制備Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang樹脂；在上述脫帽反應(yīng)后的樹脂中，加Fmoc-Ala-OH、TBTU、HOBT，用接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器。25-40℃反應(yīng)0.5-1小時。濾干，分別用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。加入脫帽試劑，2540℃反應(yīng)5-10分鐘濾干，用DMF、無水乙醇、DCM和DMF各洗滌三次，濾干。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于接肽反應(yīng)結(jié)束后用DCM、DMF、無水乙醇分別洗滌三次。濾干后，放入真空干燥器中干燥。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于切肽方法是將保護(hù)十四肽樹脂轉(zhuǎn)移到500ml茄形瓶中，加入切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS)25-35℃攪拌1.5-2小時。濾去樹脂，樹脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并濾液及洗滌液，加入適量乙醚沉淀，離心收集，用無水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得還原型生長抑肽粗品。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于將粗肽溶于10％冰醋酸，加一定量水，在攪拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH7.0-10.0，于15-20℃下，通空氣氧化12-24小時。用50％冰醋酸調(diào)至pH4.5-5.0，加活性碳攪拌30-60分鐘，過濾。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生長抑素的合成方法，其特征在于用C18柱進(jìn)行分離純化，流動相為0.1MNH4Ac∶乙腈(6-8∶2-4)；檢測波長為280nm，用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后凍干。
全文摘要
本發(fā)明公開一種生長抑素多肽的合成方法，將Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，逐個接上氨基酸，用切肽試劑(TFA/EDT/H
文檔編號C07K1/04GK1552728SQ0312895
公開日2004年12月8日 申請日期2003年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月29日
發(fā)明者周逸明 申請人:上海子能藥物研究有限公司