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      油乳劑疫苗及其制備方法

      文檔序號:997672閱讀:1090來源:國知局
      專利名稱:油乳劑疫苗及其制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及禽用油乳劑疫苗及其制備方法。
      背景技術(shù)
      我國禽肉產(chǎn)品屢遭封關(guān),1996年8月1日至2001年5月24日,歐盟以我國出口的 禽肉中含有動物疫病和農(nóng)藥、獸藥殘留等為由對我國封關(guān)5年。2004年歐盟又以禽流感為 由全面禁止進口我國禽肉產(chǎn)品,直到2008年8月才宣布解除我國禽肉產(chǎn)品禁令。剛解除禁 令又遇“配額”難題。解決所有問題的先決條件就是要提高我國禽產(chǎn)品質(zhì)量。為減少禽病 害發(fā)生,同時為避免長期應(yīng)用抗生素、激素類產(chǎn)品所造成的菌群失調(diào),耐藥菌株增加及藥物 殘留等負面影響,以發(fā)展優(yōu)質(zhì),無公害的禽產(chǎn)品,保證我國家禽產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展并參與國 際市場的競爭,具有良好免疫效果的疫苗將起極其重要的作用。目前,預(yù)防和控制家禽傳染病除生物安全措施外,主要依靠疫苗免疫,特別是通過 油乳劑疫苗的免疫。油性佐劑疫苗是已公認的可有效強化免疫性的疫苗。油乳劑疫苗的生 物安全性高,具有用最小量的抗原,最少的接種次數(shù),延長免疫刺激時間,使機體產(chǎn)生足夠 量的抗體的特點,所以乳化品質(zhì)優(yōu)良的油乳劑苗是保證免疫效果的前提。在現(xiàn)有的油乳劑 疫苗(簡稱“油苗”)生產(chǎn)過程中,通常添加2%的硬脂酸鋁來增加其穩(wěn)定性,但其粘度較大 引起免疫注射的應(yīng)激反應(yīng)較大,如導(dǎo)致嚴重接種反應(yīng)、形成無菌性化膿損害和接種部位周 圍形成肉芽腫等,可產(chǎn)生外部可見的浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死。而且人們懷疑在接種部位有 殘留的可能,這便妨礙了疫苗的使用,這種現(xiàn)象在肉雞免疫中表現(xiàn)得尤為明顯?;谶@個原 因,使用含有礦物油的油性佐劑的疫苗有時是受到一定限制的。對于油性佐劑疫苗而言,已知這種疫苗不僅在免疫強化作用方面,而且在疫苗的 穩(wěn)定性方面,都在相當大的程度上受到乳劑類型、所用油性成分以及所結(jié)合的表面活性劑 種類等因素的影響。尤其就滅活疫苗來說,制備出一種具有在較長時間內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生充分 免疫保護作用,并有著良好再現(xiàn)性的疫苗,是非常困難的。

      發(fā)明內(nèi)容
      有鑒于此,本發(fā)明的主要目的在于提供一種油乳劑疫苗,由體積百分比33. 3%的 水相與體積百分比66. 7%的油相構(gòu)成,其中水相由能夠誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的疫苗抗原、親 水性非離子型表面活性劑和水構(gòu)成,油相由礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和 親油性非離子型表面活性劑構(gòu)成。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的疫苗抗原為滅活的禽類病毒性微生物,包括新城疫病毒、禽 流感病毒、支氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒、法氏囊病毒或上述滅活病毒的任意一種病毒或 任意幾種病毒的混合物。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的親水性非離子型表面活性劑為吐溫-80。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的親油性非離子型表面活性劑為司盤-80。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的礦物油為白油佐劑。
      優(yōu)選地,本發(fā)明所述的異甘露醇單油酸脂通過以下方式制備油酸甲酯、異甘露醇 與甲醇鈉在25 50mmHg真空度下加熱至100°C,保持lh,冷至室溫,加入己烷,過濾除去異 甘露醇,在218°C 220°C及0. 175mmHg大氣壓力下蒸餾得到異甘露醇單油酸脂。優(yōu)選地,本發(fā)明所述的油乳劑疫苗,由以下體積百分比組分構(gòu)成水相為 29. 33% 32%疫苗抗原、0. 44% 1. 33%親水性非離子型表面活性劑、0. 89% 2. 67% 水;油相為0. 67% 3. 33%的卵磷脂、0. 67% 3. 33%的丙二醇、0. 67% 3. 33%的異甘 露醇單油酸脂、1. 33% 10%的親油性非離子型表面活性劑、46. 68% 63. 33%礦物油。本發(fā)明的另一目的在于提供一種油乳劑疫苗的制備方法,包括以下步驟1)水相的制備將親水性非離子型表面活性劑用水以3倍體積稀釋,然后121°C高 壓滅菌30min后冷卻至室溫,混合均勻備用,再加入疫苗抗原使親水性非離子型表面活性 劑最終占總體積的2. 67 % 8 %,疫苗抗原最終占總體積的88 % 96 % ;2)油相的制備將礦物油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂混合均勻為佐劑, 再與親油性非離子型表面活性劑混勻做為油相,經(jīng)121°C高壓滅菌30min后冷卻至室溫, 使親油性非離子型表面活性劑最終占總體積的2% 15%、丙二醇最終占總體積的 5%、卵磷脂最終占總體積的 5%、異甘露醇單油酸脂最終占總體積的 5% ;3)乳化按油相水相=2 1的體積比,先將油相倒入乳化罐,攪拌轉(zhuǎn)速為 9,000 13,OOOrpm,溫度10 20°C的情況下,將水相以0. 6ml/s的速度加入油相中,再繼 續(xù)以速度13,500 17,500rpm乳化3 7min,獲得油乳劑疫苗。技術(shù)效果本發(fā)明的禽用油乳劑疫苗,通過不斷的探索研究,確定了添加了丙二醇、卵磷脂和 異甘露醇單油酸脂三種成份,并以合適的比例構(gòu)成,達到了替代硬脂酸鋁的目的,降低了疫 苗粘度更利于吸收,從而減少留存,在接種部位表現(xiàn)出優(yōu)異的局部安全性,并且在較長時間 內(nèi)表現(xiàn)出較強的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力。通過調(diào)整油相和水相的配方及其比例,減少了免疫注 射引起的應(yīng)激反應(yīng),且不影響疫苗的穩(wěn)定性及免疫效果,從而也就提高了疫苗質(zhì)量。這種疫 苗即使在低粘度區(qū)域穩(wěn)定性也較高,副反應(yīng)較小,誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生能力以及保持高水平的抗 體產(chǎn)生的能力都很強。根據(jù)本發(fā)明實施例的結(jié)果,本發(fā)明油乳劑疫苗既使不含硬脂酸鋁,它所顯示的免 疫作用也與含硬脂酸鋁疫苗的作用相當,且與含硬脂酸鋁的油苗相比,本發(fā)明的疫苗有更 好的局部吸收能力。此外,本發(fā)明實施例的結(jié)果也表明,按照本發(fā)明的方法制備的油乳劑疫 苗同樣具有高穩(wěn)定性,在長時間內(nèi)顯示出極好的功效,同時粘度更低,易于注射,注射引起 的應(yīng)激反應(yīng)更小,對動物體更安全,而且不會產(chǎn)生常規(guī)油佐劑疫苗所引起的較大應(yīng)激反應(yīng), 如常見的免疫注射部位浮腫、腫脹、硬結(jié)和壞死等問題都得以解決。另一方面,由于疫苗黏 度降低,在接種家禽后,更容易吸收,不會產(chǎn)生藥物殘留的情況,符合食品安全的要求,有利 于禽類產(chǎn)品的出口。
      具體實施例方式本發(fā)明中試驗了滅活的禽類病毒性微生物做為疫苗抗原,優(yōu)選能夠通過收獲雞胚 尿囊液獲得病毒性抗原的禽類病毒;本發(fā)明試驗了滅活的禽流感病毒、新城疫病毒、支氣管 炎病毒、減蛋綜合癥病毒、法氏囊病毒或上述滅活病毒的兩種或幾種混合物,均可以本發(fā)明的方法制備油乳劑,上述幾種油乳劑疫苗均有良好的效果。而上述幾種禽類病毒制備獲得 的油乳劑疫苗只是抗原的成分有所不同,其它成分沒有任何差異,所以更換抗原對本發(fā)明 沒有任何的影響,均能達到本發(fā)明的目的,制備方法也完全相同,可視為對禽流感病毒、新 城疫病毒的等同替換。因此,在本發(fā)明實施例中僅以禽流感病毒、新城疫病毒為例對疫苗制 備與效果進行詳述,其他的禽類病毒的油乳劑疫苗的制備與效果均可參照禽流感病毒、新 城疫病毒的油乳劑疫苗的制備與效果的實施例,在此不再贅述。本發(fā)明實施例中親水性非離子型表面活性劑使用了吐溫-80,本發(fā)明還可使用其 他本領(lǐng)域常見的親水性非離子型表面活性劑,如吐溫-85。本發(fā)明實施例中親油性非離子型表面活性劑使用了司盤-80,本發(fā)明還可使用其 他本領(lǐng)域常見的親油性非離子型表面活性劑,如司盤-85 ;本發(fā)明實施例中礦物油使用了白油佐劑,本發(fā)明還可使用其他本領(lǐng)域常見的礦物 油,如弗氏不完全佐劑。本發(fā)明試驗了由以下體積百分比組分構(gòu)成的油乳劑疫苗水相為29. 33% 32%疫苗抗原、0. 44% 1. 33%親水性非離子型表面活性劑、0. 89% 2. 67%水;油相為 0. 67% 3. 33%的卵磷脂、0. 67% 3. 33%的丙二醇、0. 67% 3. 33%的異甘露醇單油酸 脂、1. 33% 10%的親油性非離子型表面活性劑、46. 68% 63. 33%礦物油。
      本發(fā)明實施例中的新城疫疫苗、禽流感疫苗的組成為 水相
      新城疫疫苗(或禽流感疫苗)抗原29. 33 % 32 %
      親水性非離子型表面活性劑0. 44% 1. 33%
      水0.89% 2.67%
      油相
      卵磷脂
      丙二醇
      異甘露醇單油酸脂 親油性非離子表面活性劑 礦物油
      0. 67% 3. 33% 0. 67% 3. 33%
      0.67% 3. 33%
      1.33% 10% 46. 68% 63. 33%
      為使本發(fā)明更加容易理解,下面結(jié)合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍,下列實施例中未提及的具體實驗 方法,通常按照常規(guī)實驗方法進行。本發(fā)明實施例中,除另有說明外,所有份數(shù)和百分比均按體積計算。實施例1本發(fā)明方法與常規(guī)方法制備新城疫疫苗及其比較試驗一.本發(fā)明方法制備新城疫抗原油乳劑疫苗1.將親水性非離子型表面活性劑吐溫-80,加水以3倍體積稀釋,然后在121°C高 壓滅菌30min后冷卻至室溫備用;取血球凝集(HA)效價為81og2的新城疫抗原與經(jīng)3倍體 積水稀釋121°C滅菌30min的吐溫-80混合均勻為水相。2.將白油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂混合均勻為佐劑,再與司盤-80混 勻為油相,經(jīng)121°C高壓滅菌30min,冷卻至室溫備用。3.按油相水相=2 1的體積比例,先將油相倒入乳化罐,攪拌轉(zhuǎn)速為11,OOOrpm,溫度18°C的情況下,水相加入油相的速度為0. 6ml/s,再繼續(xù)以速度15,500rpm 乳化5min,制備三批疫苗,批號分別為0901、0902和0903。制備的油乳劑疫苗0901、0902和0903,組成成分(百分比均為體積比)如下表1 表1新城疫抗原油乳劑疫苗各批次組成比例
      權(quán)利要求
      油乳劑疫苗,其特征在于,由體積百分比33.3%的水相與體積百分比66.7%的油相構(gòu)成,其中水相由能夠誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的疫苗抗原、親水性非離子型表面活性劑和水構(gòu)成,油相由礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和親油性非離子型表面活性劑構(gòu)成。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述油乳劑疫苗,其特征在于,所述疫苗抗原為滅活的禽類病毒性 微生物,包括新城疫病毒、禽流感病毒、支氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒、法氏囊病毒或上述 滅活病毒的任意一種病毒或任意幾種病毒的混合物。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述油乳劑疫苗,其特征在于,所述親水性非離子型表面活性劑為 吐溫-80。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述油乳劑疫苗,其特征在于,所述親油性非離子型表面活性劑為 司盤-80。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1所述油乳劑疫苗,其特征在于,所述礦物油為白油佐劑。
      6.按照權(quán)利要求1所述的油乳劑疫苗,其特征在于,所述異甘露醇單油酸脂通過以下 方式制備油酸甲酯、異甘露醇與甲醇鈉在25 50mmHg真空度下加熱至100°C,保持lh,冷 至室溫,加入己烷,過濾除去異甘露醇,在218°C 220°C及0. 175mmHg大氣壓力下蒸餾得到 異甘露醇單油酸脂。
      7.按照權(quán)利要求1所述的油乳劑疫苗,其特征在于,由以下體積百分比組分構(gòu)成水 相為29. 33 % 32 %疫苗抗原、0. 44 % 1. 33 %親水性非離子型表面活性劑、0. 89 % 2. 67%水;油相為0. 67% 3. 33%的卵磷脂、0. 67% 3. 33%的丙二醇、0. 67% 3. 33% 的異甘露醇單油酸脂、1. 33% 10%的親油性非離子型表面活性劑、46. 68% 63. 33%礦 物油。
      8.—種如權(quán)利要求1 7任意一項的油乳劑疫苗的制備方法,其特征在于,包括以下步驟1)水相的制備將親水性非離子型表面活性劑用水以3倍體積稀釋,然后121°C高壓滅 菌30min后冷卻至室溫,混合均勻備用,再加入疫苗抗原使親水性非離子型表面活性劑最 終占總體積的2. 67% 8%,疫苗抗原最終占總體積的88% 96% ;2)油相的制備將礦物油、丙二醇、卵磷脂和異甘露醇單油酸脂混合均勻為佐劑,再與 親油性非離子型表面活性劑混勻做為油相,經(jīng)121°C高壓滅菌30min后冷卻至室溫,使親油 性非離子型表面活性劑最終占總體積的2% 15%、丙二醇最終占總體積的 5%、卵 磷脂最終占總體積的 5%、異甘露醇單油酸脂最終占總體積的 5% ;3)乳化按油相水相=2 1的體積比,先將油相倒入乳化罐,攪拌轉(zhuǎn)速為9,000 13,OOOrpm,溫度10 20°C的情況下,將水相以0. 6ml/s的速度加入油相中,再繼續(xù)以速度 13,500 17,500rpm乳化3 7min,獲得油乳劑疫苗。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種禽用油乳劑疫苗及其制備方法,是一種油乳劑疫苗,水相的體積分數(shù)為33.3%,油相的體積分數(shù)為66.7%,其中水相含有疫苗抗原和親水性非離子型表面活性劑;油相含有礦物油、卵磷脂、丙二醇、異甘露醇單油酸脂和親油性非離子型表面活性劑。該疫苗不含硬脂酸鋁,能在較長時間內(nèi)保持較高的抗體產(chǎn)生能力,并解決注射疫苗引起的動物的應(yīng)激反應(yīng)以及疫苗殘留問題。
      文檔編號A61K39/295GK101933903SQ20101027321
      公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月28日
      發(fā)明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司
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