專利名稱：具有預(yù)塑性天然骨修復(fù)材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織工程學(xué)生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有預(yù)塑性的天然 骨修復(fù)材料的制備方法。
背景技術(shù)：
外傷、骨腫瘤等疾病會造成各部位不同程度的骨缺損，而骨移植是治療骨缺損的 主要方法之一，通常自體骨移植的效果最好。但由于自體骨的來源受限，且會增加病人的痛 苦及手術(shù)并發(fā)癥，因此采用一些人工骨移植材料應(yīng)用于臨床治療。例如高分子多聚體、生物 陶瓷、磷酸鈣骨水泥、及金屬材料等，而這些材料都有不同的缺點，限制了它們在臨床上的 應(yīng)用。高分子多聚體由于在人體內(nèi)的降解速度過快，不能與骨的重建速度相適應(yīng)，并且 會產(chǎn)生酸性降解產(chǎn)物，造成炎性反應(yīng)，不利于骨組織愈合。金屬材料是最傳統(tǒng)的骨修復(fù)材料，以其優(yōu)越的機(jī)械性能，在大段的骨缺損修復(fù)中 廣泛使用。其弊端也是顯而易見的，由于材料本身不降解，長期作為異物存在于體內(nèi)，影響 患者的生活質(zhì)量；材料溶解出的金屬離子，會造成人體生理功能的紊亂；并且須按患者缺 損的情況臨床制備樣品，進(jìn)行個性治療，無法大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。生物陶瓷類材料，主要有羥基磷灰石、磷酸三鈣；這類材料是利用自身能夠提供組 織礦化所必須的鈣離子來刺激骨組織的重建。由于材料成分與正常人骨成分的差異較大 (人骨無機(jī)成分為碳酸根豐富的弱結(jié)晶羥基磷灰石)，不能夠模擬體內(nèi)正常骨的重建過程， 影響骨愈合；且這類材料為顆粒狀或塊狀產(chǎn)品，顆粒狀材料只能松散地填充到缺損部位，缺 損位點材料的不穩(wěn)定會導(dǎo)致移植失?。粔K狀產(chǎn)品需在臨床使用時削切成缺損部位的形狀， 由于材料本身不具有彈性，不能與植床很好地吻合，且塊狀材料中心部位因體液流通不暢， 有形成壞死腔的可能，隨著臨床要求的提高，這類材料將被逐漸淘汰。為了使移植材料能與植床很好地吻合，生物陶瓷類材料與骨水泥混合形成的磷酸 鈣骨水泥材料，在臨床使用中能夠按患者骨缺損部位的形狀塑形，方便了臨床使用，具有移 植位點材料穩(wěn)定、能與植床很好吻合的優(yōu)點。但該類材料并沒有改變磷酸鈣陶瓷的成分，還 引入了骨水泥，其降解會產(chǎn)生酸性的微環(huán)境，產(chǎn)生非菌性炎性反應(yīng)，不利于骨組織重建；實 驗證實，該類材料參與的骨重建速度并未有顯著改善。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，理想的骨移植材料應(yīng)該與天然人骨成分一致，在體內(nèi)降解速 度應(yīng)與骨重建速度相匹配；且能在缺損部位自我穩(wěn)定，具有很好的親水性，能夠吸附周圍血 液形成血凝塊(血凝塊是骨形成的第一步)，加速骨形成；在臨床使用中能按患者缺損部位 的實際形狀快速塑形，便于操作；并有誘導(dǎo)新骨形成的活性蛋白分子。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種具有預(yù)塑性的天然骨修復(fù)材 料的制備方法；所制備的骨修復(fù)材料是由天然成分組成，使材料的降解速度能夠與新骨的形成速度相匹配，并能夠誘導(dǎo)新骨形成，提高成骨效率；所制備材料結(jié)構(gòu)的疏松，使用中可 根據(jù)需要任意切割塑形，在植入缺損位點后能夠吸附周圍組織的血液，形成血凝塊，加速成 骨；其穩(wěn)定性有利于快速形成新骨。本發(fā)明所提出具有預(yù)塑性天然骨修復(fù)材料的制備方法，其特征在于，是將煅燒骨 顆粒與骨膠原溶液混勻后，經(jīng)低溫凍干制備而成；所述的骨膠原溶液中加有促進(jìn)骨形成的 蛋白和生長因子；通過調(diào)整骨顆粒與骨膠原的質(zhì)量比能改變骨修復(fù)材料的強(qiáng)度。其具體方 法包括以下步驟步驟一、煅燒骨顆粒制備1)去除有機(jī)質(zhì)將動物股骨或椎骨的松質(zhì)骨去除表面軟組織，機(jī)械粉碎成粒徑 1 5mm大小的碎骨塊，用純水清洗；以碎骨塊2倍體積的乙醚溶液震蕩清洗20分鐘，再用 濃度為0. 5 2g/L的胰酶溶液消化1 3天，用純水清洗后在IM尿素溶液中攪拌清洗6 小時，接著在IM的NaOH溶液中超聲波處理2 4小時，每0. 5 1小時更換NaOH溶液，純 水清洗至中性，37°C干燥12小時。2)煅燒并制備骨顆粒將干燥后的碎骨塊置于馬弗爐中，升溫到500 900°C后恒 溫煅燒2 6小時(煅燒溫度與時間以能將骨塊完全煅燒至白色，根據(jù)煅燒的量選擇煅燒 溫度與時間，一般低溫煅燒時間長，高溫時間短)，自然降溫后機(jī)械粉碎為粒徑0. 1 0. 5mm 的顆粒，備用；步驟二、配制骨膠原緩釋溶液將骨膠原用濃度的乙酸溶液配制成5 40mg/ ml的骨膠原溶液，在其中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白50 200 μ g/ml，血小板衍生生長因子5 20ng/ml ；步驟三、骨膠原與煅燒骨顆粒復(fù)合調(diào)整骨膠原溶液的PH值至7. 4 ；按骨顆粒與骨 膠原溶液的質(zhì)量/體積比(g/ml)為9 2 1的比例，將制備好的煅燒骨顆粒加入骨膠原 溶液中，充分混勻，在37°C條件下放置，待骨膠原溶液凝固后，放入-80°C環(huán)境預(yù)凍半小時， 再經(jīng)低溫真空凍干骨膠原與煅燒骨復(fù)合材料，得到塊狀天然骨修復(fù)材料。本發(fā)明制備的天然骨修復(fù)材料由天然骨無機(jī)礦化成分、天然骨膠原成分及能夠促 進(jìn)骨形成的活性蛋白成分組成；其中的天然礦化成分是由動物松質(zhì)骨經(jīng)過理化處理后煅燒 而成，天然骨膠原成分是由動物長骨組織提取獲得，膠原中加入商品化的骨源性活性蛋白。 本發(fā)明制備的天然骨修復(fù)材料中的膠原成分相互連接形成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，天然無機(jī)骨顆粒 被緊密包裹在這個立體網(wǎng)中，這種空間結(jié)構(gòu)賦予該材料一定的抗壓強(qiáng)度和空間穩(wěn)定性。膠 原形成的三維立體網(wǎng)結(jié)構(gòu)，具有較大的吸水性，材料含水后呈現(xiàn)海綿樣形態(tài)，能夠根據(jù)臨床 病人骨缺損區(qū)域的實際形狀，任意塑形，方便醫(yī)生操作，也使材料能夠充分與植床整合，有 利于骨組織重建。本發(fā)明所制備的骨修復(fù)材料來自于動物骨組織，具有與人骨一致的天然骨成分， 材料的降解速度與人骨重建的速度相契合；骨膠原形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與天然無機(jī)骨緊密 結(jié)合，保證了材料的空間穩(wěn)定性，植入缺損部位后能夠自我穩(wěn)定；骨膠原的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)賦 予該材料一定的彈性、韌性，能夠根據(jù)需要塑形，方便臨床操作；所制備材料中含有骨形態(tài) 發(fā)生蛋白、血小板衍生生長因子兩種具有促進(jìn)骨形成作用的活性蛋白，骨膠原提供了緩釋 成骨活性因子的三維空間結(jié)構(gòu)，能夠長時間持續(xù)釋放成骨活性因子。本發(fā)明方法通過煅燒骨顆粒與骨膠原溶液不同的質(zhì)量/體積比來控制材料的力
4學(xué)性狀，在質(zhì)量比大于5 1時，材料具有較高的力學(xué)強(qiáng)度，可支撐缺損位點，親水后性狀類 似海綿，可任意切割塑形，具有彈性；在質(zhì)量比低于5 1時，材料親水后性狀類似軟泥，可 直接填塞至缺損位點，操作方便。本發(fā)明制備的材料中，膠原成分與天然無機(jī)骨成分緊密結(jié)合，保證了材料在移植 區(qū)域的穩(wěn)定性，有利于快速形成新骨。通過大量的動物實驗證實，本發(fā)明所制備材料的骨修 復(fù)速度明顯快于其他人工骨修復(fù)材料。本發(fā)明制備方法簡單，原料來源廣泛且低廉，適于大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，降低醫(yī)療 成本，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。附圖及其說明附

圖1為采用本發(fā)明方法制備的天然骨修復(fù)材料的大體照片，照片中為 1X1X0. 5cm規(guī)格的白色塊狀天然骨修復(fù)材料外觀。附圖2為圖1所示材料局部掃描的電子 顯微鏡微觀照片，可見片狀的骨膠原成分所形成三維連接的網(wǎng)狀整體，將塊狀的天然無機(jī) 骨包裹在其中。附圖3為大鼠顱骨左右兩側(cè)各8mm直徑的圓形缺損修復(fù)后6個月microCT 觀察照片；左側(cè)為空白對照組，即制造8mm直徑缺損后未進(jìn)行任何方式修復(fù)；右側(cè)為材料修 復(fù)組，即采用本發(fā)明制備的天然骨修復(fù)材料進(jìn)行修復(fù)；可見材料修復(fù)組的骨缺損已全部愈 合，而空白對照組的未見明顯的骨愈合。
具體實施例方式以下結(jié)合實例對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施例1、1.去除有機(jī)質(zhì)取牛股骨骨骺端松質(zhì)骨，去除表面的軟組織后，機(jī)械加工成粒徑 1 5mm大小碎骨塊，純水?dāng)嚢枨逑?0分鐘；以骨塊2倍體積的乙醚溶液震蕩清洗20分鐘， 再將碎骨塊置入濃度為0. 5g/L胰酶溶液常溫下消化70h，純水?dāng)嚢枨逑?0分鐘后置于IM 尿素溶液中攪拌清洗6小時，接著在IM的NaOH溶液中超聲波清洗2小時，每半小時更換溶 液一次，純水?dāng)嚢枨逑粗林行裕?7°C干燥箱內(nèi)12小時。2.煅燒并制備骨顆粒將干燥后的碎骨塊放入坩堝中，在馬弗爐中煅燒；升溫到 800°C后恒溫煅燒3小時，將爐內(nèi)溫度降至室溫，取出煅燒骨，機(jī)械粉碎為粒徑0. 1 0. 25mm 的顆粒，備用。3.配制骨膠原溶液將骨膠原溶于濃度(V/V)的乙酸溶液中，配制成10mg/ml 骨膠原溶液，在骨膠原溶液中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白50 μ g/ml，血小板衍生生長因子IOng/ ml ο4、骨膠原與煅燒骨顆粒復(fù)合采用IM的NaOH溶液調(diào)整骨膠原溶液的pH值到7. 4， 將制備的煅燒骨顆粒加入骨膠原溶液中，充分混勻。骨顆粒與骨膠原溶液的質(zhì)量/體積比 為3 1，在37°C放置20分鐘，待骨膠原溶液凝固后，放入-80°C低溫冰箱預(yù)凍；半小時后， 再經(jīng)低溫真空凍干骨膠原與煅燒骨復(fù)合材料，滅菌消毒后，即得到可在臨床使用的具有預(yù) 塑性的骨修復(fù)材料。此方法制備的骨修復(fù)材料，親水后，性狀似泥巴，可用于由骨腫瘤引起的缺損修 復(fù)，將材料直接填充至缺損位點，通過按壓使材料與植床充分吻合，操作方便，材料植入后 能夠迅速吸收周圍血液形成血凝塊。
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實施例2、1.去除有機(jī)質(zhì)取牛股骨骨骺端松質(zhì)骨，去除表面軟組織后，機(jī)械加工成粒徑1 3mm大小碎骨塊，純水清洗30分鐘；以骨塊2倍體積的乙醚溶液震蕩清洗20分鐘，再將碎 骨塊置入濃度為lg/L胰酶溶液常溫下消化46h，純水清洗10分鐘后置于IM尿素溶液中攪 拌清洗6小時，接著在IM的NaOH溶液中超聲波清洗3小時，每半小時更換溶液一次，純水 攪拌清洗至中性，37°C干燥箱內(nèi)干燥12小時。2.煅燒并制備骨顆粒將干燥后的碎骨塊放入坩堝，在馬弗爐中煅燒；升溫到 600°C后恒溫煅燒5小時，將爐內(nèi)溫度自然降至室溫，取出煅燒骨，機(jī)械粉碎為粒徑0. 25 0. 5mm的顆粒，備用。3.配制骨膠原溶液將骨膠原溶于濃度(V/V)的乙酸溶液中，配制成20mg/ml 骨膠原溶液，在骨膠原溶液中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白100μ g/ml，血小板衍生生長因子15ng/ ml ο4、骨膠原與煅燒骨顆粒復(fù)合采用IM的NaOH溶液調(diào)整骨膠原溶液的pH值到 7. 4，將制備好的煅燒骨顆粒加入骨膠原溶液中，充分混勻骨顆粒與骨膠原溶液，骨顆粒與 骨膠原溶液的質(zhì)量/體積比為7 1，在37°C條件下放置15分鐘，待骨膠原溶液凝固后，放 入-80°C低溫冰箱預(yù)凍；半小時后，再經(jīng)低溫真空凍干骨膠原與煅燒骨復(fù)合材料，滅菌消毒 后，即得到可在臨床使用的具有預(yù)塑性的骨修復(fù)材料。此方法制備的骨修復(fù)材料，親水后，性狀似海綿，彈性較好，具有一定的抗壓強(qiáng)度， 可用于拔牙窩填充，使用時根據(jù)拔牙窩的形狀修剪材料；材料的彈性能夠使其與周圍組織 充分接觸，并吸附周圍血液形成血凝塊，加速骨組織重建；手術(shù)后4 6個月，拔牙窩位置形 成大量的骨組織，這時，可在拔牙窩位置植入種植體，然后裝備義齒。而未經(jīng)材料填充的拔 牙窩會發(fā)生骨質(zhì)吸收，嚴(yán)重影響后期的種植體植入。
權(quán)利要求
一種具有預(yù)塑性天然骨修復(fù)材料的制備方法，采用有煅燒骨顆粒，其特征在于，是將煅燒骨顆粒與骨膠原溶液混勻后，經(jīng)低溫凍干制備而成；所述的骨膠原溶液中加有促進(jìn)骨形成的蛋白和生長因子；通過調(diào)整骨顆粒與骨膠原的質(zhì)量比改變骨修復(fù)材料的強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟步驟一、煅燒骨顆粒制備1)去除有機(jī)質(zhì)將動物股骨或椎骨的松質(zhì)骨去除表面軟組織，機(jī)械粉碎成粒徑1 5mm 大小的碎骨塊，用純水清洗；以碎骨塊2倍體積的乙醚溶液震蕩清洗20分鐘，再用濃度為 0. 5 2g/L的胰酶溶液消化1 3天，用純水清洗后在IM尿素溶液中攪拌清洗6小時，接 著在IM的NaOH溶液中超聲波處理2 4小時，每0. 5 1小時更換NaOH溶液，純水清洗 至中性，37°C干燥12小時；2)煅燒并制備骨顆粒將干燥后的碎骨塊置于馬弗爐中，升溫到500 900°C后恒溫煅 燒2 6小時，自然降溫后粉碎為粒徑0. 1 0. 5mm的顆粒；步驟二、配制骨膠原緩釋溶液將骨膠原用濃度的乙酸溶液配制成5 40mg/ml的 骨膠原溶液，在其中加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白50 200 μ g/ml，血小板衍生生長因子5 20ng/ ml ；步驟三、骨膠原與煅燒骨顆粒復(fù)合調(diào)整骨膠原溶液的PH值至7. 4 ；按骨顆粒與骨膠原 溶液的質(zhì)量/體積比為9 2 1的比例，將制備好的煅燒骨顆粒加入骨膠原溶液中，充分 混勻，在37°C條件下放置，待骨膠原溶液凝固后，放入-80°C環(huán)境預(yù)凍半小時，再經(jīng)低溫真 空凍干骨膠原與煅燒骨復(fù)合材料，得到塊狀天然骨修復(fù)材料。
全文摘要
一種具有預(yù)塑性天然骨修復(fù)材料的制備方法，本發(fā)明是將煅燒骨顆粒與骨膠原溶液混勻后，經(jīng)低溫凍干制備而成；并在骨膠原溶液中加有促進(jìn)骨形成的蛋白和生長因子。本發(fā)明所制備的骨修復(fù)材料為天然無機(jī)成分，膠原成分與天然骨成分緊密結(jié)合，保證了材料在移植區(qū)域的穩(wěn)定性，有利于快速形成新骨；所制備的材料能夠長時間持續(xù)釋放成骨活性因子，具有一定的彈性、韌性，能夠根據(jù)需要任意切割塑形，方便臨床操作；經(jīng)動物實驗證實，本發(fā)明制備材料的骨修復(fù)速度明顯快于其他人工骨修復(fù)材料。本發(fā)明制備方法簡單，原料來源廣泛且低廉，適于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，降低醫(yī)療成本，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
文檔編號A61L27/54GK101954122SQ20101028030
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者楊鷺, 王愛軍 申請人:陜西瑞盛生物科技有限公司