專利名稱：一種靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)診斷藥物領(lǐng)域，涉及納米影像藥物，具體涉及一種靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物。本發(fā)明包括熒光/磁性多模式納米藥物的合成及表征，體外細(xì)胞毒性檢測，癌細(xì)胞內(nèi)吞效率，活體內(nèi)受體介導(dǎo)的跨越血腦屏障功能評價，納米影像藥物對原位腦腫瘤的被動及主動受體介導(dǎo)靶向效率，以及在腦腫瘤多模式示蹤過程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是腦腫瘤中最常見(總發(fā)生率的69% )和最致命(平均5年存活率為5%)的一類腫瘤，其具有高惡性和高復(fù)發(fā)性特點(diǎn)。手術(shù)切除是目前治療腦膠質(zhì)瘤的最主要手段。但由于腦膠質(zhì)瘤的彌漫性和浸潤性等特點(diǎn)，手術(shù)前對腫瘤的無創(chuàng)精確定位及手術(shù)過程中對腫瘤的準(zhǔn)確切除變得十分困難。磁共振顯像(MRI)是目前手術(shù)前腦膠質(zhì)瘤定位的主要手段。但臨床上使用MRI準(zhǔn)確描繪腫瘤的邊界受到現(xiàn)有釓造影劑循環(huán)時間短、無靶向特異性和血腦屏障穿透能力差等因素的限制。研究顯示，多數(shù)早期膠質(zhì)瘤和20-30%的晚期膠質(zhì)瘤血腦屏障并未明顯破壞， 現(xiàn)有造影劑對此類腫瘤難以有效地實現(xiàn)準(zhǔn)確示蹤。有研究發(fā)現(xiàn)多肽angiop印-2做為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)的配體表現(xiàn)出比轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)和抑肽酶(ApoE)等腦靶向配體更強(qiáng)的跨血腦屏障效率[Demeule，M et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008,324,1064 ；Demeule, M et al, J. Neurochem. 2008,106,1534 ；Ke, W et al, Biomaterials 2009，30，6976]。更重要的是， LRP不僅在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，它在膠質(zhì)瘤中也高度表達(dá)[Maletinska，L et al, Cancer Res. 2000，60，2300]。現(xiàn)有技術(shù)表明多肽angiop印-2作為靶向基團(tuán)能夠有效地提高基因藥物對完好 BBB 的穿越效率[Jiang, C. et al, Biomaterials，2008，29，238 Jiang, C. et al. ,Biomaterials, 2009, 30,6976]并取得良好的治療效果。因此標(biāo)記有angiop印-2 的影像藥物有望通過受體介導(dǎo)作用穿越血腦屏障并對實現(xiàn)對腦膠質(zhì)瘤的靶向性示蹤。樹枝狀大分子(dendrimers)具有高度支化、結(jié)構(gòu)規(guī)整、單分散、多位點(diǎn)修飾，有單一的分子量等特點(diǎn)。聚乙二胺樹枝狀大分子(PAMAM dendrimer)做為一種新的藥物載體可以標(biāo)記多個影像基團(tuán)或靶向基團(tuán)(標(biāo)記位點(diǎn)的多少取決于PAMAM的代數(shù))以達(dá)到更高的靶向性和成像靈敏度。已有文獻(xiàn)報道標(biāo)記有釓配合物的低代數(shù)樹枝狀高分子，包括G2( 二代，直徑3nm)、G3(三代，5nm)和G4(四代，6nm)其在體內(nèi)循環(huán)時間較短并通過腎臟快速排泄出體外，但由于減少了血管外滲，與小分子造影劑如Gd-DTPA(二乙烯三胺五乙酸螯合的釓劑)，Gd-DOTA (1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4，7，10-四乙酸螯合的釓劑)相比，它們能更好地顯示血管結(jié)構(gòu)；中等代數(shù)的樹枝狀高分子造影劑，包括Gd-DTPA標(biāo)記的G5 (五代， 7nm)和G6(六代，9nm)樹枝狀高分子，其體內(nèi)循環(huán)時間延長到30分鐘以上并通過腎臟和肝膽管共同排泄出體外；而對于G7(七代，llnm)和G8(八代，13nm)等高代數(shù)樹枝狀高分子而言，其幾乎完全是通過肝膽系統(tǒng)排泄；更高代數(shù)的樹枝狀高分子則被肝脾等的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所捕獲而很難用于影像示蹤用途。
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近年來，近紅外熒光(Near-Infrared Fluorescence)探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用悄然興起?；铙w組織對波長范圍在700 IOOOnm的近紅外光吸收較弱，因此近紅外熒光能夠穿透較深的組織，從而得到靈敏度更高，且信噪比更好的圖像。與光學(xué)成像技術(shù)相比，磁共振成像(MRI)具有高空間/時間分辨率，無探測深度和角度限制，易臨床轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度較低。綜上所述，研制一類在手術(shù)前可對腦腫瘤的位置、形態(tài)及邊緣無創(chuàng)示蹤的，并且在手術(shù)過程中可實現(xiàn)影像指導(dǎo)下腦腫瘤準(zhǔn)確切除的影像藥物對膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療將具有重要的意義；構(gòu)建能夠在完整血腦屏障條件下對腦腫瘤實現(xiàn)準(zhǔn)確示蹤的影像藥物對膠質(zhì)瘤的早期診斷和手術(shù)準(zhǔn)確切除顯得尤為重要。目前尚未見有關(guān)以angiop印-2為BBB跨越基團(tuán)同時標(biāo)記有光學(xué)和順磁性雙功能影像基團(tuán)的納米探針的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，尤其涉及具有跨越血腦屏障(B B B)能力并標(biāo)記有光學(xué)和磁性雙功能影像基團(tuán)的納米影像藥物，其用于原位腦膠質(zhì)瘤的無創(chuàng)動態(tài)示蹤，尤其對血腦屏障未受破壞條件下的神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有靶向示蹤功能。本發(fā)明所述的血腦屏障未受破壞條件下的神經(jīng)膠質(zhì)瘤包括血腦屏障未破壞的毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤(I級)；低度彌漫型星形細(xì)胞瘤(II級)；間變型星形細(xì)胞瘤(III級) 和多型性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(IV級)。具體而言，本發(fā)明的一種靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，選擇 G5做為探針載體優(yōu)化目標(biāo)影像藥物的血循環(huán)時間和被動靶向性(enhanced permeability and retention effect)，通過下述方法制備將近紅外熒光基團(tuán)Cy5. 5 (羰花青類近紅外熒光染料5. 5)和Gd-DOTA順磁性基團(tuán)標(biāo)記在G5樹枝狀高分子上，通過雙功能的聚乙二醇PEG連接angiop印-2多肽和G5樹枝狀高分子，制成具有跨越血腦屏障(BBB)能力并標(biāo)記有光學(xué)和磁性雙功能影像基團(tuán)的納米影像藥物。本發(fā)明的納米影像藥物能達(dá)到較好的腫瘤示蹤信噪比和靈敏度。本發(fā)明中，具有跨BBB功能的目標(biāo)納米探針Den-angio和不具備跨BBB功能的參比探針合成路線如下
權(quán)利要求
1.一種靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，選擇G5做為探針載體優(yōu)化目標(biāo)影像藥物的血循環(huán)時間和被動靶向性，通過下述方法制備將近紅外熒光基團(tuán)和Gd-DOTA順磁性基團(tuán)標(biāo)記在G5樹枝狀高分子上，通過雙功能的聚乙二醇PEG連接 angiopep-2多肽和G5樹枝狀高分子，制成具有跨越血腦屏障能力并標(biāo)記有光學(xué)和磁性雙功能影像基團(tuán)的納米影像藥物。
2.按權(quán)利要求1所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的目標(biāo)影像藥物的結(jié)構(gòu)為 Den-(NIRP)x-(MRI CA)y-(PEG-angiopep-2) z ；其中，Den 代表作為影像藥物載體的樹枝狀高分子，NIRP為近紅外熒光基團(tuán)，X代表標(biāo)記在載體上熒光基團(tuán)數(shù)目，MRI CA為Tl加權(quán)磁共振造影基團(tuán)，y代表標(biāo)記在載體上磁共振基團(tuán)數(shù)目，PEG為聚乙二醇，angiopep-2為可跨越血腦屏障并靶向腦腫瘤的肽鏈， ζ代表標(biāo)記在載體上的PEG-angiop印-2數(shù)目。
3.按權(quán)利要求2所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的Den 為2-8代的聚酰胺胺樹枝狀高分子。
4.按權(quán)利要求2所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的 NIRP以酰胺鍵形式標(biāo)記到樹枝狀高分子上。
5.按權(quán)利要求2所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的近紅外熒光基團(tuán)選自IR783或Cy5. 5羰花青類近紅外熒光染料。
6.按權(quán)利要求2所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的所述MRI CA為包括Gd-DOTA在內(nèi)的釓金屬配合物；所述CA以酰胺鍵形式標(biāo)記到樹枝狀高分子上。
7.按權(quán)利要求2所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的樹枝狀高分子和angiop印-2多肽通過雙功能化的PEG橋連在一起。
8.按權(quán)利要求2所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的雙功能化PEG的兩端分別是伯胺基和馬來酰亞胺；所述PEG上伯胺基與3-(2-吡啶二巰基) 丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)得到修飾有吡啶二巰基的PEG ；PEG上的馬來酰亞胺與樹枝狀高分子上伯胺基反應(yīng)得到Den-PEG中間產(chǎn)物。
9.按權(quán)利要求2所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的 angiopep-2 肽鏈其氨基酸序列為 TFFYGGSRGKRNNFKTEEY。
10.按權(quán)利要求2所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的 angiopep-2肽鏈在其C端引入半胱氨酸得到序列為TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC的肽鏈；該肽鏈半胱氨酸上的巰基與標(biāo)記在樹枝狀高分子上的2-吡啶二巰基縮合得到通過PEG橋連的 Den-PEG-angiop印-2 化合物。
11.按權(quán)利要求1所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的標(biāo)記在影像納米藥物上的angiop印-2特異性識別腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞上低密度脂蛋白相關(guān)受體。
12.按權(quán)利要求1所述的靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物，其特征在于，所述的納米影像藥物被磁共振成像和光學(xué)成像同時無創(chuàng)監(jiān)測。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)診斷藥物領(lǐng)域，涉及一種靶向示蹤的多模式診斷納米影像藥物。本發(fā)明選擇G5做為探針載體優(yōu)化目標(biāo)影像藥物的血循環(huán)時間和被動靶向性，通過將近紅外熒光基團(tuán)和Gd-DOTA順磁性基團(tuán)標(biāo)記在G5樹枝狀高分子上，通過雙功能的聚乙二醇PEG連接angiopep-2多肽和G5樹枝狀高分子，制成具有跨越血腦屏障能力并標(biāo)記有光學(xué)和磁性雙功能影像基團(tuán)的納米影像藥物。本發(fā)明中PEG鏈不但改善了納米探針的水溶性，適當(dāng)提高了其血液循環(huán)時間，同時減少了樹枝狀大分子由于立體位阻效應(yīng)對angiopep-2肽鏈的血腦屏障跨越效率的影響。本發(fā)明藥物可用于原位腦膠質(zhì)瘤的無創(chuàng)動態(tài)示蹤，尤其對血腦屏障未受破壞條件下的神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有良好的靶向示蹤功能。
文檔編號A61K49/00GK102406949SQ20101029294
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者嚴(yán)蕙蕙, 李聰, 魏勛斌 申請人:復(fù)旦大學(xué)