專(zhuān)利名稱(chēng)：Sj16蛋白在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種新型的免疫抑制藥物。
背景技術(shù)：
免疫抑制劑(immunosuppressant，ISA)是一類(lèi)具有免疫抑制作用的藥物，主要功 能為抑制機(jī)體異常的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療自身免疫性疾病，抗腫瘤，抗器官移植排斥等 目的。免疫抑制劑主要的作用機(jī)理是，通過(guò)抑制與免疫反應(yīng)有關(guān)細(xì)胞(T細(xì)胞和B細(xì)胞等免 疫細(xì)胞)的增殖和功能，達(dá)到降低機(jī)體的免疫反應(yīng)的目的。免疫抑制劑大致可分為四代。第 一代以腎上腺皮質(zhì)激素、雷公藤多苷片、硫唑嘌呤和抗淋巴細(xì)胞球蛋白為代表；第二代以環(huán) 孢素和他克莫司為代表；第三代以單克隆抗體雷帕霉素(抗T淋巴細(xì)胞單克隆抗體)、霉酚 酸脂(MycophenolateMofetiLMMF)為代表；第四代以抗IL_2受體單克隆抗體為代表。但 以上的免疫抑制劑藥物均有一定的毒性，增加宿主對(duì)感染和腫瘤的易感性；另外也無(wú)法抑 制慢性排斥反應(yīng)，是移植器官難以在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定存活的主要原因。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，使從微生物病原體等生物資源中尋找研發(fā)有 別于現(xiàn)有免疫抑制劑機(jī)制的、低毒高效的原創(chuàng)性新的型免疫抑藥物成為可能。特別是隨著 對(duì)免疫逃避機(jī)制的研究深入，發(fā)現(xiàn)了一批與免疫逃避有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)分子，與寄生蟲(chóng)主動(dòng) 調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答相關(guān)，為從微生物病原體中尋求新的免疫抑制劑奠定了基礎(chǔ)。眾所周知，血吸蟲(chóng)是一種多細(xì)胞生物，它能在廣泛分布免疫細(xì)胞的人體血液系 統(tǒng)中存活而不被功能完善的免疫系統(tǒng)清除，提示血吸蟲(chóng)在和人類(lèi)長(zhǎng)期共進(jìn)化的過(guò)程中，可 以產(chǎn)生一些可調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答功能的物質(zhì)，下調(diào)宿主免疫反應(yīng)，借以逃避宿主的免疫應(yīng) 答。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血吸蟲(chóng)尾蚴侵入宿主體內(nèi)的過(guò)程中，在皮膚停留2-3d轉(zhuǎn)化為童蟲(chóng)，在此過(guò) 程中血吸蟲(chóng)只引起輕微的炎癥反應(yīng)，而死的血吸蟲(chóng)尾蚴或皮內(nèi)注射死蟲(chóng)的提取物卻可以引 起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。這提示，活的血吸蟲(chóng)可能合成、分泌抑制炎癥反應(yīng)的物質(zhì)，而這種物質(zhì) 可能有抑制炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)功能。SJ16是從血吸蟲(chóng)的分泌物中尋找到一種分子量為 16. 8kDa的蛋白質(zhì)。我們于1999年，克隆到SJ16的編碼基因，并構(gòu)建了重組表達(dá)體系，其純 化表達(dá)產(chǎn)物rSjl6可降低和減輕角叉菜膠引起的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚足趾腫脹。同時(shí)rSjl6可引 起實(shí)驗(yàn)小鼠的腹腔毛細(xì)血管通透性增加，白細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，及耳廓腫脹的縮小。這些研究提 示SJ16是具有確切抗炎作用的蟲(chóng)源性分子。但尚未有人對(duì)SJ16在免疫抑制作用方面進(jìn)行 研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對(duì)SJ16在免疫抑制作用方面進(jìn)行了研究。其目的在于提供一種低毒高效 的新型生物免疫抑制藥物。具體的技術(shù)方案如下我們猜測(cè)SJ16參與了血吸蟲(chóng)的免疫逃避，SJ16作為抗炎分子，很可能具有抑制宿 主免疫應(yīng)答的效應(yīng)或作用。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了以上猜測(cè)，證明Sjl6具有良好的免疫抑制功能。進(jìn)一步，我們對(duì)SJ16基因進(jìn)行分析，目的在于找出Sjl6免疫抑制功能的活性片段 及其基因表達(dá)序列。通過(guò)對(duì)SJ16蛋白全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO 4)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)核 定位序列肽段。分別將這兩個(gè)核定位序列肽段去除，或同時(shí)去除，得到了三個(gè)不同的活性成 分片段。在本發(fā)明中，對(duì)這三個(gè)活性片段分別命名為SJ16-1、SJ16-2、SJ16-3(對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 3 基因編碼見(jiàn)序列表)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，Sjl6及其活性成分片段或其任意組合物均具有抑制樹(shù)突狀細(xì) 胞的成熟、抑制T細(xì)胞增殖，下調(diào)IL-12等細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制TH1和增強(qiáng)TH2的細(xì)胞免 疫應(yīng)答的作用?？赏ㄟ^(guò)抑制淋巴細(xì)胞對(duì)組織，特別是對(duì)移植物的攻擊，或抑制炎癥細(xì)胞因子 的產(chǎn)生與其相關(guān)炎癥反應(yīng)；達(dá)到免疫抑制的目的。根據(jù)需要針對(duì)活性片段進(jìn)行重組表達(dá)，得到一系列具有免疫抑制作用的重組表達(dá) 產(chǎn)物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，在重組蛋白中，與SJ16蛋白或其活性片段具有70%以上的同一性的 功能性變體或這些功能性變體的組合物都具有較好的免疫抑制作用，其中更優(yōu)選的范圍是 具有80%以上的同一性的功能性變體或這些功能性變體的組合物。在對(duì)上述SJ16蛋白及其活性片段進(jìn)行重組多肽的研究結(jié)果也表明，含SJ16蛋白 活性氨基酸片段的數(shù)量為10以上的多肽的免疫抑制作用較好。在此研究的過(guò)程中，我們還提供了含有SJ16蛋白活性成分基因編碼所述的融合 蛋白的多核苷酸及該多核苷酸序列相應(yīng)的核酸構(gòu)建體系、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。居于上述研究，我們將上述活性物質(zhì)應(yīng)用于制備免疫抑制藥物。藥物的必要組成 性多肽序列可以包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2或 SEQ ID NO :3序列或與上述蛋白具有70%以上同一性的功能性變體中的一種或幾種。此類(lèi)藥物可應(yīng)用于免疫相關(guān)性疾病，包括免疫移植反應(yīng)、腫瘤、器官特異性自身免 疫病，系統(tǒng)性自身免疫病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、口眼干燥綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、結(jié) 節(jié)性多動(dòng)脈炎、Wegener肉芽腫病等。本發(fā)明可以用來(lái)制備注射用制劑、口服制劑或緩釋制劑等各種適合免疫治療的劑型。本發(fā)明與現(xiàn)有的免疫抑制藥物相比，有以下明顯的創(chuàng)新和優(yōu)點(diǎn)第一，本發(fā)明首次提出將SJ16應(yīng)用于制備免疫抑制藥物。第二，本發(fā)明提供的免疫制藥物來(lái)源于天然血吸蟲(chóng)蛋白，在長(zhǎng)期與宿主的共進(jìn)化 過(guò)程中發(fā)展出了一系列的免疫抑制和免疫逃避作用，通過(guò)免疫耐受機(jī)制及誘導(dǎo)，可以在很 大程度上避免現(xiàn)有的免疫抑制藥物的毒副作用，具有低毒高效的特點(diǎn)，這是本發(fā)明的最大 優(yōu)勢(shì)所在。第三，本發(fā)明提供的疫抑制藥物來(lái)源于病原體生物資源，具有極其廣闊的市場(chǎng)空 間和較好的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。



具體實(shí)施方式

實(shí)施例1
根據(jù)日本血吸蟲(chóng)SJ16基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCRDESIGN軟件分析，由上海生工生 物工程公司合成，引物P1為5，GCCATATGAACATGACTTTAATTAAC，引入Ndel酶切位點(diǎn)；引物P2 為5，ACTTAATACTTTGTAGAATTCGAACC，引入Hindlll酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增出全長(zhǎng)SJ16基因。實(shí)施例2SJ16全長(zhǎng)的表達(dá)和鑒定及純化利用所設(shè)計(jì)的一對(duì)引物(P1、P2)成功擴(kuò)增。將其克隆到PGEX-4T-1載體上，挑 取篩選到的pGEX-4T-l-Sjl6-l重組質(zhì)粒的DNA，以其為模板，用PI、P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 獲取的特異性條帶；雙酶切驗(yàn)證其大小與預(yù)期序列一致；將所篩選的重組質(zhì)粒送TaKaRa 公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果無(wú)誤。獲得的重組質(zhì)粒確實(shí)為pGEX-4T-l-Sjl6-l重組質(zhì)粒。將 PGEX-4T-1-SJ16-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，15% SDS-PAGE電泳顯示在 分子量約46kDa處出現(xiàn)一明顯蛋白條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在誘導(dǎo)前后以及重組質(zhì)粒工程菌 在誘導(dǎo)前后均無(wú)此條帶的出現(xiàn)，表明此蛋白條帶可能為目的蛋白條帶。菌體裂解上清上亦 有此蛋白條帶的出現(xiàn)，顯示該蛋白為可溶性表達(dá)。將裂解上清經(jīng)過(guò)GST親和層析柱，經(jīng)過(guò) thrombin酶酶切以后，可以得到分子量為19kDa左右的單一蛋白。pGEX-4T BL21轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)后出現(xiàn)一分子量約為26kDa明顯表達(dá)帶，此為GST蛋 白。pGEX-4T-l轉(zhuǎn)化的BL 21-DE3菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，較誘導(dǎo)前于約40Da出現(xiàn)一條明顯的融 合蛋白表達(dá)條帶。免疫印跡分析，該蛋白能特異地被抗GST抗體(1 500稀釋)識(shí)別，于 約40Da位置有一條條帶，pGEX24T-l轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)于約26kDa處有一條條帶為pGEX_4T_l 轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)GST蛋白能特異地被抗GST抗體識(shí)別。GST柱親和層析純化。實(shí)施例3SJ16-1、SJ16-2、SJ16-3 的表達(dá)和鑒定根據(jù)SJ16-1的蛋白序列直接合成相應(yīng)的DNA序列，命名為SJ16-1序列。根據(jù) SJ16-2、SJ16-3之間引入柔性臂(-GGAGGA-)，使SJ16-2、SJ16-3融合；再根據(jù)其蛋白序列設(shè) 計(jì)相應(yīng)的核酸序列。分別將其克隆到PGEX-4T-1載體上，挑取篩選到的pGEX-4T-l-Sjl6-l、 pGEX-4T-l-Sjl6-2、pGEX-4T-l-Sjl6_3重組質(zhì)粒的DNA,以其為模板，用相應(yīng)引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增獲取的特異性條帶；雙酶切驗(yàn)證其大小與預(yù)期序列一致；將所篩選的重組 質(zhì)粒送TaKaRa公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果無(wú)誤。獲得的重組質(zhì)粒確實(shí)為pGEX_4T_ 1 _S j 16-1、 pGEX-4T-l-Sj 16-2-3 重組質(zhì)粒。將 pGEX_4T-l-Sjl6-l、pGEX-4T-l_Sj 16-2-3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，15% SDS-PAGE電泳顯示其分別在分子量約40kDa、84kDa處 出現(xiàn)一明顯蛋白條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在誘導(dǎo)前后以及重組質(zhì)粒工程菌在誘導(dǎo)前后均無(wú)此 條帶的出現(xiàn)，表明此蛋白條帶可能為目的蛋白條帶。菌體裂解上清上亦有此蛋白條帶的出 現(xiàn)，顯示該蛋白為可溶性表達(dá)。將裂解上清經(jīng)過(guò)GST親和層析柱，經(jīng)過(guò)thrombin酶酶切以 后，可以得到分子量為14kDa、36kDa左右的單一蛋白pGEX-4T-l轉(zhuǎn)化的BL21-D E3菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，較誘導(dǎo)前于約40kDa、84kDa出現(xiàn) 一條明顯的融合蛋白表達(dá)條帶。免疫印跡分析，該蛋白能特異地被抗GST抗體(1 500稀 釋)識(shí)別，于約40kDa、84kDa位置有一條條帶，pGEX24T 21轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)于約26kDa處有 一條條帶為PGEX-4T-1轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)GST蛋白能特異地被抗GST抗體識(shí)別。
GST柱親和層析純化。實(shí)施例4內(nèi)毒素測(cè)定通過(guò)利用鱟試劑法檢測(cè)重組蛋白Sjl61mg/ml中的內(nèi)毒素含量，并利用AffinityP akTMDetoxi-GelTMEndotoxin Removing Gel去除重組蛋白中的內(nèi)毒素，并用鱟試劑法最后 檢測(cè)內(nèi)毒素含量，保證reSjl6的內(nèi)毒素含量小于0. 2EU/Kg(0. 2內(nèi)毒素含量每千克)。實(shí)施例5SJ16的抗炎作用不同劑量的Sjl6(l，5，10i!g/kg)均可以明顯減輕二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和毛 細(xì)血管通透性增加，抑制角叉菜膠所致大鼠足跖腫脹，明顯抑制實(shí)驗(yàn)性腹膜炎小鼠腹腔毛 細(xì)血管通透性增高，且具有一定的劑量+賴(lài)關(guān)系(見(jiàn)表1)。表lreSjl6對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹作用和毛細(xì)血管通透性改變的影響
權(quán)利要求
1.SJ16蛋白在制備免疫治療藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫治療藥物，其特征在于該藥物的必要組成性多肽序列包 含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 3序列 或與上述蛋白具有70%以上同一性的功能性變體中的一種或幾種。
3.如權(quán)利要求2所述的免疫治療藥物，其特征在于所述功能性變體的同一性為80% 以上。
4.如權(quán)利要求2所述的免疫治療藥物，其特征在于該藥物的必要組成性多肽包含權(quán) 利要求2所述的任一蛋白序列的數(shù)量為10以上。
5.如權(quán)利要求1所述的免疫治療藥物，其特征在于該藥物應(yīng)用于制備免疫移植反應(yīng)、 腫瘤、器官特異性自身免疫病或系統(tǒng)性自身免疫病的藥物。
6.如權(quán)利要求1所述的免疫治療藥物，其特征在于該藥物制成適合免疫治療的各種 劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了SJ16蛋白在制備免疫抑制藥物中的應(yīng)用方法。該藥物的必要組成性多肽序列包含SJ16蛋白或SJ16蛋白的活性片段SEQ IDNO1或SEQ ID NO2或SEQ ID NO3序列或與上述蛋白具有70％以上同一性的功能性變體中的一種或幾種。本發(fā)明是首次提出將SJ16應(yīng)用于制備免疫抑制藥物。該藥物來(lái)源于病原體生物資源天然血吸蟲(chóng)蛋白，較之現(xiàn)有的同類(lèi)藥物具有低毒高效的優(yōu)點(diǎn)，具有很好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61P37/06GK102000323SQ20101050176
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者劉靈輝, 卞國(guó)武, 呂志躍, 吳忠道, 孫希, 楊琳琳, 胡少敏, 阮志燕 申請(qǐng)人:中山大學(xué)